以市售的酸性木聚糖酶制備煙草加工的輔助酶制劑及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于煙草復(fù)烤前添加的可提高煙草品級的酶制劑。 技術(shù)背景
[0002] 木聚糖酶(xylanase)是專一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的 總稱，主要有:① β-l，4-D-木聚糖內(nèi)切酶(EC3.2.1.8)，簡稱木聚糖酶，功能是水解木聚糖主 鏈內(nèi)部的1，4_糖苷鍵作用于木聚糖無側(cè)枝區(qū)產(chǎn)生低聚糖和有側(cè)枝的寡聚糖，水解產(chǎn)物主要 是木二糖和木寡糖，可使木聚糖溶液的粘度迅速下降。②β-l，4-D-外切木聚糖酶 (EC3.2.1.92 )，從木聚糖的非還原性末端，以單個木糖單位(糖基)為切割單位，水解將木糖 殘基(糖基)使之成為木糖，使反應(yīng)體系因木糖量的增加而還原性也增加。③β-D-木糖苷酶 (EC3.2.1.37)為外切酶，是木聚糖類半纖維素徹底降解為單糖的關(guān)鍵酶之一，從木聚糖水 解后的產(chǎn)物低聚木糖和木二糖的非還原性末端逐一水解切下木糖苷單位形成木糖。該酶能 夠水解對-硝基苯-β-D-木糖基(PNPX)等人工底物。因 β-l，4_木聚糖外切酶(EC3.2.1.92)也 能水解低聚木糖和木二糖使木聚糖徹底降解為木糖，在這點上與β-木糖苷酶(EC3.2.1.37) 同屬外切酶的功能相同。在多數(shù)資料中未將兩種酶分列說明，僅少數(shù)資料明確木糖苷酶 (EC3.2.1.37)是水解低聚木糖和木二糖的。木糖苷酶存在于細(xì)菌和真菌中，一般不分泌到 細(xì)胞外為胞內(nèi)酶（劉士清，張無敵，尹芳，等。沼氣發(fā)酵實驗教程。北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2013，ρ114-126,127-138)。大多數(shù)微生物產(chǎn)生的木聚糖酶的最適作用pH值在6~7,其中一 些微生物能夠產(chǎn)生在較低pH條件下保持較高酶活力和穩(wěn)定性的耐酸或酸性木聚糖酶，即酸 性木聚糖酶，這些微生物的木聚糖酶顯示的酸穩(wěn)定性，提供了以工業(yè)化生產(chǎn)的微生物酸性 木聚糖酶市售商品的來源（田永，等，酸性木聚糖酶的應(yīng)用研究進(jìn)展，糧油加工，2008，（5): 110 ~113)〇
[0003] 相關(guān)專利文獻(xiàn)中，"一種復(fù)合酶制劑及將該復(fù)合酶制劑用于煙梗生產(chǎn)的工藝"（戴 麗君等，ZL2005101044436)研究了淀粉酶、果膠酶和木聚糖酶復(fù)合酶制劑，經(jīng)復(fù)合酶處理后 的煙梗、梗膏和再造煙葉的水溶性糖含量有較大的變化。但不是單一的酸性木聚糖酶制品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在提供以商品化的酶源制備單一的酸性木聚糖酶，用于新鮮煙草烘烤 后，對復(fù)烤前的片煙用水稀釋替代片煙復(fù)烤的自然陳化時原有的第二潤葉用水的煙草活性 添加劑，更好地降解煙草中的半纖維素，達(dá)到提高煙草品質(zhì)的作用。
[0005] 本發(fā)明上述目的通過以下方法實現(xiàn)： (一)以市售的酸性木聚糖酶制備煙草加工的輔助酶制劑 該制劑酸性木聚糖酶的酶活力在50°C和pH4.5下為3000~4000U/mL。
[0006] 優(yōu)選的，所述的酶制劑的酸性木聚糖酶的最佳酶活力為3500U/mL。
[0007] (二)制備本發(fā)明輔助酶制劑的方法 包括以下步驟： (1) 用pH4.5緩沖液溶解蛋白酶活性抑制劑PMSF，PMSF在緩沖液中的濃度為0.0 lmo 1/L， 再按緩沖液與水的體積比1:4稀釋緩沖液;將市售的酸性木聚糖酶固體物酶源與稀釋緩沖 液該兩者按重量體積比1 g: 10~20mL混勻得混合液，加入NaCl攪拌溶解，混合液與NaCl的 重量體積比為〇. 75g /L;過濾，收集濾液作為待精制處理的粗酶液，靜置。
[0008] 上述緩沖液為Britton-Robinsion緩沖液； 上述在市售的酸性木聚糖酶固體物酶源中加入PH4.5的稀釋緩沖液的量與酶源的原始 酶活力呈正相關(guān)； (2) 步驟（1)靜置lh的粗酶液，加入(NH4)2S〇4，（NH4)2S〇4濃度為25 %，緩慢攪拌溶解，靜 置2h;繼續(xù)按上清液體積加入(NH4)2S〇4濃度為至80%，靜置過夜。離心要沉淀。收集的上清液 中補加 l〇%(NH4)2S〇4,再過夜，重復(fù)離心得二次沉淀，合并兩次沉淀； 所述(NH4)2S〇4濃度為重量體積比； (3) 配制濃度為0.1%的EDTA溶液，該溶液與沉淀的體積比為1:2; 將步驟(2)收集的沉淀與pH4.5的稀釋緩沖液按體積比2:1混勻后加入以上EDTA溶液， 靜置，離心，得到去除金屬離子的酶上清液； (4) 往酶上清液加入濃度為0.01%的蔗糖低聚物，酶上清液與蔗糖低聚物的體積比為 100:1，作為初制品，-8 °C冷凍干燥濃縮至初制品的1/8~1/10倍，得酶活力為3000~4000U/ mL濃縮的酸性木聚糖酶原液制劑，其中，濃縮的酸性木聚糖酶原液制劑的最佳酶活力為 3500U/mL； 所述蔗糖低聚物濃度為重量體積比。
[0009] 所述步驟（1)中的酶源原始酶活力5，000U/g，酸性木聚糖酶固體物與pH4.5的稀釋 緩沖液該兩者按重量體積比1 g: 10mL:酶源的原始酶活力10，000U/g，酸性木聚糖酶固體物 與pH4.5的稀釋緩沖液該兩者按重量體積比1 g: 20mL。
[0010]所述步驟(4)中可以濃度為0.01%的β-環(huán)糊精替代蔗糖低聚物，酶上清液與β-環(huán)糊 精的體積比為100:1，作為初制品，-8°c冷凍干燥濃縮至初制品的1/8~1/10倍，得酶活力為 3000~4000U/mL濃縮的酸性木聚糖酶原液制劑。
[0011 ]進(jìn)一步，其中原液制劑的酶活力是以PH4.5的稀釋緩沖液中加有Ca(N〇3)2、MgS〇4、 ZnS〇4和FeS〇4,其中，Ca(N03)2、MgS〇4、ZnS〇4和FeS〇4分別與緩沖液的重量體積比為0.3g / 100mL，以恢復(fù)酸性木聚糖酶酶活力，及在50°C下所測定的酶活力。
[0012] (三)應(yīng)用酸性木聚糖酶作為煙草加工輔助添加的酶制劑的方法 該酶制劑以戊聚糖含量在11%~19%的煙草作為適宜的處理對象。
[0013] 所述的應(yīng)用方法是:將酶活力為3000~4000U/mL的濃縮的酸性木聚糖酶制劑稀釋 250倍作為片煙復(fù)烤前的第二次潤葉用水，其使用的酶活力范圍為12~16U/mL。
[0014] 優(yōu)選的，所述的應(yīng)用方法是:將酶活力為3500U/mL的濃縮的酸性木聚糖酶制劑稀 釋250倍作為片煙復(fù)烤前的第二次潤葉用水，其最佳酸性木聚糖酶酶活力為14U/mL。
[0015] 本發(fā)明的進(jìn)步及意義是： 本發(fā)明中所用的起始酶源主要來源于市售的酸性木聚糖酶商品，該商品的酶活力為 5000U/g或10000U/mL，價格低，來源廣。本發(fā)明產(chǎn)品為單一的酸性木聚糖酶產(chǎn)品，質(zhì)量有保 障、應(yīng)用易控制，效果穩(wěn)定和良好。
[0016] 本發(fā)明以商品酶生產(chǎn)酸性木聚糖酶，商品酶源中有調(diào)制穩(wěn)定其質(zhì)量的填充物等； 酶源中還存在的金屬離子、酶及蛋白質(zhì)等雜物，這些雜物破壞了酸性木聚糖酶的產(chǎn)品質(zhì)量 及處理煙草的效果，本發(fā)明通過純化、濃縮的精制工藝盡可能地除去雜物，作為用于煙葉烘 烤后，在復(fù)烤前的加工過程中輔助添加的酶制劑。
[0017] 本發(fā)明煙草活性添加劑為一種能破壞煙葉中細(xì)胞壁，降解半纖維素，改善與提高 煙草品質(zhì)的單一酸性木聚糖酶，酸性木聚糖酶的酶活力在3000~4000U/mL，最佳酶活力為 3500U/mL，性狀為濃縮液酶制劑，適用于處理煙葉中戊聚糖(半纖維素)含量在11%~19%范 圍內(nèi)不同等級和不同產(chǎn)地的大多數(shù)品種煙草。
[0018] 本發(fā)明使用時將產(chǎn)品用水稀釋250倍，代替片煙復(fù)烤時的第二次潤葉用水，極其簡 易，改善煙葉內(nèi)在品質(zhì)，提尚煙葉品級。
[0019] 本發(fā)明也可用于自然陳化但結(jié)果不理想的煙草，以及用于煙支制成前的改善。按 照本發(fā)明控制測定方法，酸性木聚糖酶產(chǎn)品具有2年以上穩(wěn)定的商品特性。
[0020] 本發(fā)明在過氧化物相關(guān)的系列酶類并形成穩(wěn)定產(chǎn)品的基礎(chǔ)上，進(jìn)行著水解酶類的 研究和開發(fā)，提高和改善了煙草品質(zhì)，具有廣泛應(yīng)用前景。
[0021] 以下結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
【附圖說明】
[0022] 圖1為酶源粗品酶而進(jìn)行精制的具體制備方法。
【具體實施方式】
[0023] ( - )用市售的酸性木聚糖酶固體物生產(chǎn)酸性木聚糖酶發(fā)酵液 實施例1: (1)將原始酶活力為10,000U/g的酸性木聚糖酶固體粗制品按粗酶重50g與PH4.5的緩 沖液lOOOmL混勾得混合液;所述緩沖液是按1^;[1:1:011-1?013；[118；[011緩沖液2001111^與水8001111^稀 釋的緩沖液，即二者體積比為1: 4。在混合液中按重量體積比為0.7 5 g / L加入0.7 8 7 5 g NaCl，攪拌充分溶解，過濾，收集濾液，靜置lh待后續(xù)處理。
[0024]或者，將原始酶活力為5，000U/g的酸性木聚糖酶固體粗制品按粗酶重100g與 pH4.5的緩沖液1000mL混勾得混合液;所述緩沖液是按Britton-Robinsion緩沖液200mL與 水800mL稀釋的緩沖液，即二者體積比為1:4。在混合液中按重量體積比為0.7