一種木聚糖酶雜合酶工程菌株的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種木聚糖酶雜合酶工程菌株的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是催化水解木聚糖的一類(lèi)多功能酶的總稱(chēng)。木聚糖酶廣泛 分布于自然界中，如動(dòng)物、植物和微生物等，且種類(lèi)繁多，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛。目前，微生物來(lái)源 的木聚糖酶研究報(bào)道很多，研究得最多的是來(lái)源于細(xì)菌和真菌的木聚糖酶。其中，細(xì)菌可以 產(chǎn)生堿性和酸性木聚糖酶，而真菌可以產(chǎn)生堿性木聚糖酶。目前，木聚糖酶主要由真菌和細(xì) 菌等微生物發(fā)酵生產(chǎn)而來(lái)。
[0003] 隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，木聚糖酶的研究開(kāi)發(fā)備受關(guān)注。在工業(yè)應(yīng)用方面，木聚 糖酶具有很大的工業(yè)應(yīng)用潛力和價(jià)值，它是一種重要的工業(yè)酶制劑，廣泛應(yīng)用于食品加工、 釀造、紙漿漂白、制藥、飼料添加劑、醫(yī)藥、紡織、生物轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域。木聚糖酶在使用過(guò)程中對(duì) 外界物化條件極為敏感，在工業(yè)進(jìn)程中的高溫、重金屬離子、氧化劑和極端pH等條件下，都 會(huì)使木聚糖酶構(gòu)象遭到破壞，從而限制了酶的應(yīng)用環(huán)境。因此，提高木聚糖酶穩(wěn)定性已成為 研究者廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，通過(guò)生物信息學(xué)分析比對(duì)木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，氫鍵、離 子鍵數(shù)目、鹽橋、N端以及α-螺旋處區(qū)域等與木聚糖酶的穩(wěn)定性密切相關(guān)。很多人以此為依 據(jù)，通過(guò)基因工程和酶工程等手段研究木聚糖酶的穩(wěn)定性，并取得了良好的成果。
[0004]目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)影響木聚糖酶熱穩(wěn)定性的諸多因素，但國(guó)內(nèi)外對(duì)于木聚糖酶分子熱 穩(wěn)定性突變位點(diǎn)的報(bào)道相對(duì)較少。一般來(lái)說(shuō)所有的二硫鍵在蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性方面都起 著關(guān)鍵的作用，且與蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性密切相關(guān)。Ν端二硫鍵的引入對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響國(guó) 內(nèi)外已有報(bào)道，但C端引入二硫鍵對(duì)木聚糖酶熱穩(wěn)定性有無(wú)影響，未見(jiàn)報(bào)道。
[0005] 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)糖基化對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定有一 定的作用。糖基化是在酶的控制下，蛋白質(zhì)或脂質(zhì)附加上糖類(lèi)的過(guò)程，發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在糖 基轉(zhuǎn)移酶作用下將糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)，和蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基形成糖苷鍵。目前，對(duì)于蛋白 質(zhì)糖基化修飾研究主要是Ν-糖基化和0-糖基化。研究發(fā)現(xiàn)，Ν-糖基化多發(fā)生在Asn-Xaa-Ser/Thr序列的Asn殘基上，0-糖基化多發(fā)生β-轉(zhuǎn)角區(qū)域。另外，通過(guò)糖基化修飾來(lái)提高木聚 糖酶穩(wěn)定性的研究相對(duì)較少，因此，有一定的探索空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種木聚糖酶雜合酶工程菌株的構(gòu) 建方法，首先利用生物信息學(xué)比對(duì)木聚糖酶XynZF-2基因序列（GenBank Accession No. JQ700382)與耐熱木聚糖酶EvXynl 1基因序列(GenBank AccessionNo.EU591347)的同源 性，通過(guò)N-端替換將XynZF-2的N-端48個(gè)氨基酸替換成木聚糖酶EvXynllN-端的34個(gè)氨基 酸，并引入芳香族氨基酸P9Y和H14F，進(jìn)而在XynZF-2酶C端繼續(xù)引入二硫鍵Cys38-Cysl91、 α-螺旋及cord區(qū)域分別引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I以及V111A、G109A，最后引入 糖基化修飾位點(diǎn)E42N和F17S，構(gòu)建多位點(diǎn)突變雜合酶XynZL，期望雜合酶XynZL的熱穩(wěn)定性 有所改善。
[0007] 其技術(shù)方案如下：
[0008] -種木聚糖酶雜合酶工程菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0009] 步驟1、木聚糖酶結(jié)構(gòu)分析
[0010] BLAST和DNAMAN6.0同源序列比對(duì)與木聚糖酶XynZF-2同源性較高的耐熱木聚糖酶 基因，PR0SITE(http : //prosite · expasy · org)預(yù)測(cè)木聚糖酶功能位點(diǎn)，利用Phyre2 (http ://www. sbg.bio · ic .ac .uk/phyre2/html/page · cgi?id = index)對(duì)木聚糖酶建模，并 通過(guò)DS ViewerPro6.0分析木聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)。采用DiANNA l.l(http:// 13；[0；[11；1^01'1]1&1：；[08.13(3.6(111/(310七61&13/01厶順厶/)分析二硫鍵位點(diǎn)，利用如七呢15^1.0 (http://www· cbs · dtu · dk/services/NetNGlyc/)對(duì)木聚糖酶XynZF-2糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù) 測(cè)；
[0011]步驟2、目的基因的合成及重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0012]設(shè)計(jì)好的雜合酶基因 xynZL序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；
[0013] 參考雜合酶基因 xynZL基因序列以及真核表達(dá)載體PPIC9K的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)以 下兩條引物：YS: 5 ' -CCGGAATTCTTCCCCACGACTCTGTCG-3 '（EcoR 頂每切位點(diǎn)）
[0014] γχ: 5 ' -ATAAGAATGCGGCCGCTTACTGAACACAGATGGACG-3 '（Not I )，引物由蘇州金唯智 生物科技有限公司合成；
[0015] 以xynZL基因?yàn)槟０?，YS、YX為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，與對(duì)應(yīng)表達(dá)載 體經(jīng)雙酶切、回收、連接，連接液轉(zhuǎn)化E. co 1 i DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液分別涂布含Amp的LB 平板，陽(yáng)性克隆子篩選后，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切及PCR驗(yàn)證，最終獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-XynZL。
[0016] 優(yōu)選地，步驟2中的進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件均為:94°C預(yù)變性2min; 94°C變性30s， 67°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 10min。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0018] 本發(fā)明為提高來(lái)源于黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S的中溫木聚糖酶XynZF-2 熱穩(wěn)定性，通過(guò)N-端替換將XynZF-2的N-端48個(gè)氨基酸替換成木聚糖酶EvXynl IN-端的34個(gè) 氨基酸，并引入芳香族氨基酸P9Y和H14F。在此突變基因基礎(chǔ)上，C端引入二硫鍵Cys38-Cysl91、a-螺旋及 cord區(qū)域分別引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I以及V111A、G109A， 然后引入糖基化修飾位點(diǎn)E42N和F17S，構(gòu)建多位點(diǎn)突變基因 xynZL，并與pPIC9K表達(dá)載體連 接，轉(zhuǎn)化畢赤酵母，構(gòu)建了雜合酶工程菌GS115/pPIC9K-xynZL，重組雜合酶酶學(xué)性質(zhì)分析顯 示，雜合酶最適溫度較原酶有了較大幅度的提升。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是雜合木聚糖酶XynZL的三維結(jié)構(gòu)，其中，圖la為雜合酶三維結(jié)構(gòu)的正面圖，圖 lb為雜合酶三維結(jié)構(gòu)的反面圖；
[0020] 圖2是重組酶最適作用溫度示意圖；
[0021 ]圖3是重組酶溫度穩(wěn)定性示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0023] 1材料與方法
[0024] 1.1菌株、質(zhì)粒與試劑
[0025] 黑曲霉（Aspergillus niger)XZ_3S，大腸桿菌（Escherichia coli)JM109、DH5a由 作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；真核表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K及畢赤酵母（Pichia pastoris)GSl 15購(gòu)自 Invitrogen公司。DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；氨節(jié)青霉素(Amp)購(gòu) 自Sangon公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Sangon公司；溴化乙錠（Ethidium bromi de)購(gòu)自Amr e sco公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂糖均購(gòu)自BBI公司;G418、無(wú)氨基酵母氮源 (YNB)購(gòu)自Amresco公司;樺木木聚糖購(gòu)自Sigma公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純 廣品。
[0026] 1.2木聚糖酶結(jié)構(gòu)分析
[0027] BLAST和DNAMAN6.0同源序列比對(duì)與木聚糖酶XynZF-2同源性較高的耐熱木聚糖酶 基因，PR0SITE(http : //prosite · expasy · org)預(yù)測(cè)木聚糖酶功能位點(diǎn)，利用Phyre2 (http ://www. sbg.bio ·