一種應(yīng)用于蛋白芯片定量檢測(cè)的陽(yáng)性參照及制備方法
【專利摘要】一種應(yīng)用于蛋白芯片定量檢測(cè)的陽(yáng)性參照，于生物芯片上依次為：1)FLAG包被抗體；2)HA-FLAG多肽；3)HA生物素標(biāo)記抗體。本發(fā)明還公開了制備上述陽(yáng)性參照的方法。本發(fā)明能表征從抗原與抗體反應(yīng)到顯色整個(gè)實(shí)驗(yàn)成功與否，并做為參比物質(zhì)對(duì)血清中的目標(biāo)物進(jìn)行定量分析，解決了以往方法存在的可靠性差及無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化的缺陷。
【專利說明】一種應(yīng)用于蛋白芯片定量檢測(cè)的陽(yáng)性參照及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于蛋白芯片定量檢測(cè)的陽(yáng)性參照。
[0002]本發(fā)明還涉及制備上述陽(yáng)性參照物的方法。

【背景技術(shù)】
[0003]蛋白芯片的技術(shù)原理最早由Roger Ekin在上世紀(jì)80年代就已提出，它將大量蛋白質(zhì)分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體表面形成微陣列，根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，構(gòu)建微流體生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。蛋白芯片技術(shù)主要用于基于芯片的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，其特點(diǎn)是高通量，即在一個(gè)只有幾十平方毫米的片基上標(biāo)記成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)用于檢測(cè)其他目的蛋白。其基本原理就是利用抗體分子能與抗原分子特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將游離的雜蛋白和結(jié)合于固相載體的目的蛋白分離，并利用特殊的標(biāo)記物對(duì)其進(jìn)行定量分析。蛋白芯片有著廣泛的應(yīng)用范圍，包括，藥物篩選，疾病診斷治療、司法鑒定等領(lǐng)域。
[0004]現(xiàn)有的生物芯片檢測(cè)方法包括發(fā)光檢測(cè)方法和非發(fā)光檢測(cè)方法兩類，最廣泛應(yīng)用的還是發(fā)光檢測(cè)方法，其中又主要包括熒光檢測(cè)法、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法和復(fù)合光照射檢測(cè)法。而近年發(fā)展起來的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法因其快速、精確、重現(xiàn)性好及試劑安全無(wú)毒的特點(diǎn)，顯示出很好的應(yīng)用前景。用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，為了降低背景值以及實(shí)驗(yàn)體系對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物定量的影響，一般要設(shè)置一個(gè)參照點(diǎn)，將測(cè)得的目標(biāo)物的發(fā)光值與參照點(diǎn)的發(fā)光值相比得到相對(duì)值。
[0005]目前蛋白芯片參照點(diǎn)通常是將某種(些)特異的蛋白直接進(jìn)行酶標(biāo)記或者生物素標(biāo)記等直接包被于芯片表面。這類參照點(diǎn)的作用是用來指示化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的正常進(jìn)行，或者對(duì)芯片點(diǎn)樣位置進(jìn)行確定。這類參照點(diǎn)盡管也曾被用于作為待測(cè)物質(zhì)的參比點(diǎn)。但由于結(jié)合不牢固，容易被洗液沖洗掉，影響了對(duì)目標(biāo)物定量的準(zhǔn)確性。而且這類參照點(diǎn)只能表征雜交反應(yīng)中從生物素與辣根過氧化物酶(HRP)反應(yīng)到顯色反應(yīng)，無(wú)法表征抗原-抗體的反應(yīng)，也影響了對(duì)目標(biāo)物定量的準(zhǔn)確性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用于蛋白芯片定量檢測(cè)的陽(yáng)性參照。
[0007]本發(fā)明的又一目的是提供一種制備上述陽(yáng)性參照物的方法
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目，本發(fā)明提供的應(yīng)用于蛋白芯片定量檢測(cè)的陽(yáng)性參照，于生物芯片上依次為:
[0009]I) FLAG 包被抗體；
[0010]2) HA-FLAG 多肽；
[0011]3)HA生物素標(biāo)記抗體。
[0012]本發(fā)明提供的制備上陽(yáng)性參照的方法:
[0013]a)將FLAG包被抗體固定于生物芯片上；
[0014]b)在生物芯片上加入含有多肽的樣品和各個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)抗原；
[0015]c)除去抗原物質(zhì)，除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)；
[0016]d)加入生物標(biāo)記抗體；
[0017]e)除去多余的抗體。
[0018]其中，F(xiàn)LAG包被抗體以矩陣形式固定于生物芯片上。
[0019]其中，為FLAG包被抗體為AFP、CEA、t-PSA以及Flag包被抗體。
[0020]其中，HA-FLAG多肽的基礎(chǔ)序列為:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK。
[0021]本發(fā)明的陽(yáng)性參照可以監(jiān)控蛋白芯片免疫反應(yīng)的每個(gè)階段，與樣本檢測(cè)同步，有效的降低了人為操作或儀器誤差給蛋白芯片檢測(cè)帶來的誤差。

【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明提供的應(yīng)用于蛋白芯片定量檢測(cè)的陽(yáng)性參照，是利用抗體分子能與抗原分子特異性結(jié)合的特點(diǎn)，在樣品中(特別是血清)混入一種人工合成的多肽，將多肽與抗體物質(zhì)結(jié)合的發(fā)光值作為參照，用測(cè)得的目標(biāo)物發(fā)光值與其比較，得到相對(duì)值，以此進(jìn)行樣品中目標(biāo)物的定量分析。
[0023]本發(fā)明的的陽(yáng)性參照包括以下幾個(gè)部分:
[0024]I) FLAG 包被抗體；
[0025]2) HA-FLAG 多肽，其基礎(chǔ)序列為:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK
[0026]3) HA生物素標(biāo)記抗體
[0027]由以上三種組成一個(gè)“三明治”的復(fù)合物。
[0028]本發(fā)明舉實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不限于下述實(shí)施例。
[0029]1、檢測(cè)血清中腫瘤標(biāo)志物AFP、CEA、t-PSA的濃度
[0030]a)將AFP、CEA、t_PSA包被抗體以及Flag包被抗體用點(diǎn)樣儀以矩陣形式固定于生物芯片上；
[0031]b)在封閉好的芯片上加入含有人工合成多肽的血清樣品和各個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，反應(yīng)1-1.5小時(shí)；
[0032]c)除去抗原物質(zhì)，用洗液(1XTBS/1%甘油/0.1 % BSA/0.05%吐溫)除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)；
[0033]d)加入生物標(biāo)記的AFP、CEA、t-PSA抗體以及HA抗體，反應(yīng)25_40min ；
[0034]e)用洗液(1XTBS/1%甘油/0.1% BSA/0.05%吐溫)除去多余的抗體；
[0035]f)加入 HRP (1/10000)，反應(yīng) 30min ；
[0036]g)用洗液(1XTBS/1%甘油/0.1% BSA/0.05%吐溫)除去多余的HRP ；
[0037]h)加入發(fā)光液，顯色；
[0038]i)收集AFP、CEA、t-PSA發(fā)光值以及陽(yáng)性參照點(diǎn)發(fā)光值；
[0039]j)將AFP、CEA、t-PSA發(fā)光值除以陽(yáng)性參照發(fā)光值，得到CEA的相對(duì)值；
[0040]k)將AFP、CEA、t_PSA各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)抗原的相對(duì)發(fā)光值與理論濃度做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將血清中AFP、CEA、t-PSA的相對(duì)值帶入血清中，得到中AFP、CEA、t_PSA在血清中的濃度。
[0041]本發(fā)明的特點(diǎn)在于，經(jīng)過Blast比對(duì)后，沒有發(fā)現(xiàn)人體蛋白質(zhì)組中有與其同源的蛋白，不易被血清中的酶類降解，由人工合成純化后純度能達(dá)到95%以上，價(jià)格較低，能夠表征從抗原與抗體反應(yīng)到顯色整個(gè)實(shí)驗(yàn)成功與否，并做為參照點(diǎn)對(duì)血清中的目標(biāo)物進(jìn)行定量分析，解決了以往方法存在的可靠性差及無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化的缺陷，以實(shí)現(xiàn)免疫雜交技術(shù)在體外診斷中的成功應(yīng)用。
[0042]通過表1和表2的對(duì)比數(shù)據(jù)可以看出，以HA-FLAG為參照點(diǎn)所測(cè)得的數(shù)據(jù)從準(zhǔn)確性和重復(fù)性兩方面都要優(yōu)于C-myc帶有生物素的蛋白，說明以HA-FLAG為參照點(diǎn)監(jiān)控整個(gè)免疫雜交過程，這樣的參照點(diǎn)所測(cè)出的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性較好，準(zhǔn)確性較高。

【權(quán)利要求】
1.一種應(yīng)用于蛋白芯片定量檢測(cè)的陽(yáng)性參照，于生物芯片上依次為: DFLAG包被抗體；
2)HA-FLAG 多肽； 3)HA生物素標(biāo)記抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽(yáng)性參照，其中，F(xiàn)LAG包被抗體以矩陣形式固定于生物芯片上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的陽(yáng)性參照，其中，為FLAG包被抗體為AFP、CEA、t-PSA以及Flag包被抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽(yáng)性參照，其中，HA-FLAG多肽的基礎(chǔ)序列為:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK。
5.制備權(quán)利要求1所述陽(yáng)性參照的方法: a)將FLAG包被抗體固定于生物芯片上； b)在生物芯片上加入含有多肽的樣品和各個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)抗原； c)除去抗原物質(zhì)，除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)； d)加入生物標(biāo)記抗體； e)除去多余的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，F(xiàn)LAG包被抗體以矩陣形式固定于生物芯片上。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中，為FLAG包被抗體為AFP、CEA、t-PSA以及Flag包被抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，HA-FLAG多肽的基礎(chǔ)序列為:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104198738SQ201410471782
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】丁立功, 馬君蘭, 臧百盛, 宮曉艷 申請(qǐng)人:北京九州泰康生物科技有限責(zé)任公司