一種共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集方法
【專利摘要】一種共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集方法，包括生物富集培養(yǎng)基的制備、生產(chǎn)用菌種的制備、共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集等步驟，得到 c 9, t 11, c 15-共軛亞麻酸異構(gòu)體。本發(fā)明所得產(chǎn)品中 c 9, t 11, c 15-共軛亞麻酸異構(gòu)體的含量大于質(zhì)量百分比0.36%，底物的轉(zhuǎn)化率大于90%，通過(guò)生物富集培養(yǎng)，不僅得到富含 c 9, t 11, c 15-共軛亞麻酸異構(gòu)體的抗癌功能產(chǎn)品，脫脂大豆中的蛋白質(zhì)和纖維素也被乳酸菌分解成多肽和可溶性膳食纖維等具有保健功能的活性因子，產(chǎn)物的保健功能顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步拓寬了該產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。
【專利說(shuō)明】一種共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]共軛亞麻酸是亞麻酸的共軛異構(gòu)體，是一組十八碳共軛三烯酸的統(tǒng)稱，有多種位置異構(gòu)和幾何異構(gòu)體，如ill, cl5-共軛亞麻酸和ilO，cl2, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體等。研宄表明共軛亞麻酸具有抗癌、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、減肥等生理功能，且其生理活性具有異構(gòu)體特異性，如:c9，ill, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體具有抗癌和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用。在自然界中，共軛亞麻酸主要存在于反芻動(dòng)物的奶和肉中的脂肪中，主要由c9，ill，cl5-共軛亞麻酸和少量￠9, ill, cl5-共軛亞麻酸等異構(gòu)體構(gòu)成，但其含量通常十分低，無(wú)法滿足以保健和醫(yī)療為目的的開發(fā)應(yīng)用。
[0003]為實(shí)現(xiàn)共軛亞麻酸的大量制備，人們已對(duì)生物合成共軛亞麻酸進(jìn)行了一些研宄。但文獻(xiàn)報(bào)道的共軛亞麻酸產(chǎn)量通常均小于lmg/mL，且存在發(fā)酵周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)。發(fā)明專利CN200410060670.9報(bào)道了通過(guò)干酪乳桿菌CGMCC 1.574來(lái)特異性生物合成c9, ill, cl5_共軛亞麻酸異構(gòu)體的方法，雖然產(chǎn)物純度高，但是在乳酸菌常用培養(yǎng)基MRS和脫脂奶中的產(chǎn)量約為lmg/mL。在生物合成過(guò)程中，只有增加底物亞麻酸的量，產(chǎn)物c9, ill, cl5_共軛亞麻酸異構(gòu)體的量才能增加，而當(dāng)?shù)孜锏暮砍^(guò)lmg/mL時(shí)，乳酸菌在常用培養(yǎng)基MRS和脫脂奶中的生長(zhǎng)就會(huì)收到抑制，從而限制了 c9，ill, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體的合成。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種共軛亞麻酸異構(gòu)體的高效生物富集方法，顯著提高共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物合成量。
[0005]本發(fā)明包括以下步驟。
[0006](I)生物富集培養(yǎng)基的制備:將低溫脫脂大豆浸泡，經(jīng)磨漿機(jī)先粗磨后精磨，再經(jīng)膠體磨處理得到混合乳濁液，煮沸，調(diào)整蛋白質(zhì)含量為質(zhì)量百分比5-15%，優(yōu)選8%，經(jīng)巴氏滅菌后得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0007](2)生產(chǎn)用菌種的制備:將干酪乳桿菌CGMCC 1.574保藏菌種接入用于生物富集的培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h，經(jīng)三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后，得到生產(chǎn)用菌種。
[0008](3)共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集:向生物富集培養(yǎng)基中接入質(zhì)量百分比5%的步驟(2)的生產(chǎn)用菌種，同時(shí)加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基質(zhì)量百分比0.3-0.6%的亞麻酸底物，優(yōu)選0.4%，混勻后于28-40°C，優(yōu)選37°C，發(fā)酵培養(yǎng)12-36h，優(yōu)選24h，得到說(shuō),til, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體。
[0009]本發(fā)明所述的步驟(I)也可以再向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分比0%〈低聚糖(6%，優(yōu)選1%的低聚果糖，經(jīng)巴氏滅菌后得到用于生物富集的培養(yǎng)基。
[0010]在優(yōu)化條件下，通過(guò)該方法富集后，發(fā)酵物中c9, ill, Cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體的含量為質(zhì)量百分比0.37%，亞麻酸的轉(zhuǎn)化率為92.5%。
[0011]本發(fā)明所用的乳酸菌是干酪乳桿菌(L3cic^aci77i/5.casei)，保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為CGMCC 1.574，該菌能產(chǎn)生特異性的異構(gòu)酶，通過(guò)生物異構(gòu)化將亞麻酸轉(zhuǎn)化成c9，ill, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體。
[0012]本發(fā)明針對(duì)生物合成共軛亞麻酸時(shí)存在產(chǎn)量低和發(fā)酵周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和條件，有效克服了高濃度亞麻酸底物對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)和合成共軛亞麻酸的影響，大大提高了發(fā)酵產(chǎn)品中共軛亞麻酸異構(gòu)體的富集水平。本發(fā)明以脫脂大豆為基本培養(yǎng)基原料，將脫脂大豆用水浸泡后，經(jīng)粗磨、精磨和膠體磨處理后得到的混合乳濁液，再通過(guò)添加低聚糖得到乳酸菌生物富集共軛亞麻酸異構(gòu)體的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基中高濃度蛋白質(zhì)、纖維素能有效降低亞麻酸對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的抑制作用，亞麻酸的添加量可以達(dá)到培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比0.6%O
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
在本發(fā)明優(yōu)選條件下，產(chǎn)品中c9，ill, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體的含量大于質(zhì)量百分比
0.36%，底物的轉(zhuǎn)化率大于90%。與該菌株在MRS和脫脂奶培養(yǎng)基中共軛亞麻酸異構(gòu)體的富集水平低于質(zhì)量百分比0.1%相比，產(chǎn)品中c9，ill, C15-共軛亞麻酸異構(gòu)體的含量顯著增加，可以滿足保健品和醫(yī)藥產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明通過(guò)生物富集培養(yǎng)，不僅得到富含c9，ill, cl5_共軛亞麻酸異構(gòu)體的抗癌功能產(chǎn)品，脫脂大豆中的蛋白質(zhì)和纖維素也被乳酸菌分解成多肽和可溶性膳食纖維等具有保健功能的活性因子。所得產(chǎn)物的保健功能顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步拓寬了該產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為本發(fā)明所制備c9，ill, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體的毛細(xì)管電泳圖。
[0016]圖2為亞麻酸濃度與c9，ill, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體合成的關(guān)系。

【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步地說(shuō)明。
[0018]實(shí)施例1。
[0019]將I份低溫脫脂大豆用4份水浸泡6h后，經(jīng)磨漿機(jī)先粗磨后精磨I次，再經(jīng)膠體磨處理2次后得到的混合乳濁液，煮沸后調(diào)整其中的蛋白質(zhì)含量為質(zhì)量百分比8%，得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分比1%的低聚果糖，經(jīng)巴氏滅菌后得到生物富集的培養(yǎng)基。向生物富集培養(yǎng)基中接入質(zhì)量百分比5%的干酪乳桿菌casef)CGMCC 1.574生產(chǎn)用菌種，同時(shí)加入質(zhì)量百分比0.4%的亞麻酸底物，混勻后于37°C培養(yǎng)24h?通過(guò)該方法富集后，產(chǎn)物在268nm處有特征吸收峰，表明產(chǎn)物是共軛亞麻酸，并通過(guò)毛細(xì)管電泳分析進(jìn)一步確認(rèn)該異構(gòu)體是c9，ill, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體。底物亞麻酸的濃度對(duì)產(chǎn)物共軛亞麻酸的合成有顯著影響，在優(yōu)化條件下，亞麻酸的添加量是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比0.4%，發(fā)酵物中c9, ill, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體的含量為質(zhì)量百分比0.37%，亞麻酸的轉(zhuǎn)化率為92.5%ο通過(guò)該方法，大大提高了產(chǎn)品中c9，til, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體的含量，能滿足抗癌、防治心腦血管疾病產(chǎn)品開發(fā)的需要。此外，在生物發(fā)酵過(guò)程中，脫脂大豆中的蛋白質(zhì)和膳食纖維被水解成多肽和可溶性膳食纖維，這些保健功能因子進(jìn)一步增加產(chǎn)品的保健功能和應(yīng)用前景。
[0020]實(shí)施例2。
[0021]將I份低溫脫脂大豆用4份水浸泡過(guò)夜后，經(jīng)磨漿機(jī)先粗磨后精磨I次，再經(jīng)膠體磨處理2次后得到的混合乳濁液，煮沸后調(diào)整其中的蛋白質(zhì)含量為質(zhì)量百分比5%，加入質(zhì)量百分比3%的脫脂奶粉，得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分比1%的低聚果糖，經(jīng)巴氏滅菌后得到生物富集的培養(yǎng)基。向生物富集培養(yǎng)基中接入質(zhì)量百分比5%的干酪乳桿菌ILactobacillus casei) CGMCC 1.574生產(chǎn)用菌種，同時(shí)加入質(zhì)量百分比0.4%的亞麻酸底物，混勻后于37°C培養(yǎng)24h，產(chǎn)物中c9’ til, cl5_共軛亞麻酸異構(gòu)體的含量為質(zhì)量百分比0.38%。將發(fā)酵產(chǎn)物低溫噴霧干燥或冷凍干燥后，經(jīng)壓片、涂膜加工成片劑，可以有效防止c9，ill, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體在存放過(guò)程中發(fā)生氧化反應(yīng)，得到富含c9，ill, cl5_共軛亞麻酸異構(gòu)體、多肽和可溶性膳食纖維的保健功能產(chǎn)品，產(chǎn)品保質(zhì)期長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月。
【權(quán)利要求】
1.一種共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集方法，其特征是包括以下步驟: (1)生物富集培養(yǎng)基的制備:將低溫脫脂大豆浸泡，經(jīng)磨漿機(jī)先粗磨后精磨，再經(jīng)膠體磨處理得到混合乳濁液，煮沸，調(diào)整蛋白質(zhì)含量為質(zhì)量百分比5-15%，得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基，經(jīng)巴氏滅菌后得到用于生物富集的培養(yǎng)基； (2)生產(chǎn)用菌種的制備:將干酪乳桿菌CGMCC1.574保藏菌種接入用于生物富集的培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h，經(jīng)三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后，得到生產(chǎn)用菌種； (3)共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集:向生物富集培養(yǎng)基中接入質(zhì)量百分比5%的步驟(2)的生產(chǎn)用菌種，同時(shí)加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基質(zhì)量百分比0.3-0.6%的亞麻酸底物，混勻后于28-40°C，發(fā)酵培養(yǎng)12-36h，得到c9，ill, cl5-共軛亞麻酸異構(gòu)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集方法，其特征是所述的步驟(I)中調(diào)整蛋白質(zhì)含量為質(zhì)量百分比8%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集方法，其特征是所述的步驟(I)中向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分比0%〈低聚糖彡6%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集方法，其特征是向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分比1%的低聚果糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集方法，其特征是所述的步驟Cl)中向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分比1%的低聚果糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共軛亞麻酸異構(gòu)體的生物富集方法，其特征是所述的步驟(3)中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基質(zhì)量百分比0.4%的亞麻酸底物，混勻后于37°C，發(fā)酵培養(yǎng)24h。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK104480150SQ201410609389
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】劉曉華, 李海星 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)