專利名稱：山梨醇脫氫酶診斷試劑盒及山梨醇脫氫酶活性濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè) 定山梨醇脫氫酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
山梨醇脫氫酶能可逆地催化D-山梨醇氧化為D-果糖。人體內(nèi)此酶 主要分布肝臟，腎、腦、心、脾等組織中含量極少，血清中此酶活力 很低，如酶活力升高，強(qiáng)烈提示肝損害。檢測(cè)血清SDH在反映肝損傷 方面較ALT可能更具特異性。
山梨醇脫氫酶測(cè)定方法國內(nèi)多采用終點(diǎn)法，此法無需特殊試劑和儀 器，適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，但操作繁瑣，需除蛋白，敏感性低，干擾 因素多，且不能用于自動(dòng)生化分析儀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定山梨醇脫氫酶活性濃度的方 法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的山梨醇脫氫酶診斷試劑 盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分 析儀上進(jìn)行山梨醇脫氫酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高， 因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明山梨醇脫氫酶活性濃度測(cè)定方法原理如下
山梨醇+輔酶 山梨醇脫氫酶 山梨糖+還原型輔酶
這種方法應(yīng)用山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase ; EC 1.1.99.21)
酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。山梨醇脫氫酶酶解山梨醇反應(yīng)，最終將輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)， 從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測(cè)量 340nm處吸光度上升的速度，可以測(cè)算山梨醇脫氫酶的活性濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，無論是單劑還是雙劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明山梨醇脫氫酶診斷
試劑較為理想
緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
山梨醇 30 mmol/L
本發(fā)明的山梨醇脫氫酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、山梨醇。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、山梨醇。 輔酶、山梨醇在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是
干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑還是雙劑，本發(fā)明測(cè)定山梨醇脫氫酶活性濃度的方法， 其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的山梨醇脫氫酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
山梨醇 30mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)山梨醇 脫氫酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))， 延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出山梨醇
脫氫酶的活性濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的山梨醇脫氫酶診斷試劑為雙試劑，包括:
試劑1
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
輔酶
100mmol/L
50 mmol/L
mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
山梨醇
100mmol/L 50 mmol/L 20 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)山梨醇 脫氫酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng) (上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論 K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出山梨醇 脫氫酶的活性濃度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的山梨醇脫氫酶診斷試劑為雙試劑，包括
訓(xùn)mmol/L 50 mmol/L 20 mmol/L
層mmol/L 50 mmol/L 2 mmol/L
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 山梨醇 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
測(cè)定山梨醇脫氫酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度 37°C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè) 試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)山梨醇脫氫酶樣品與試劑1、試劑2的體積比 例為4/40/10，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘 左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出山梨醇 脫氫酶的活性濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí) 施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法技術(shù)的山梨醇脫氫酶活性濃度測(cè)定方法，其方法原理如下山梨醇+輔酶 山梨醇脫氫酶 山梨糖+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出山梨醇脫氫酶的活性濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——50 mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L山梨醇 1- 50mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、山梨醇組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、山梨醇組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、山梨醇組成。 輔酶、山梨醇在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1－4000mmol/L或0.1％100％體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法技術(shù)的山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定山梨醇脫氫酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、山梨醇及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出山梨醇脫氫酶的活性濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N21/78GK101173896SQ200610097310
公開日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司