定點(diǎn)引入不配對(duì)區(qū)域的高效保真pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種定點(diǎn)引入不配對(duì)區(qū)域的高效保真PCR方法，定點(diǎn)引入不配對(duì)區(qū)域的高效保真的2步PCR方法，分別使用不同性質(zhì)的聚合酶,在各自最優(yōu)化的緩沖體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：先使用保真性低而具備高擴(kuò)增能力的tag酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，解決引物與模板不配對(duì)的問題，得到具有與原始模板不配對(duì)的區(qū)域（含酶切位點(diǎn)的引物區(qū)域或點(diǎn)突變區(qū)域）的產(chǎn)物；繼而專用高保真Pfu酶以前一步產(chǎn)物為模板，完全匹配地進(jìn)行擴(kuò)增，很好解決了這類具不配對(duì)區(qū)域的PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增效率與高保真的問題。
【專利說明】定點(diǎn)引入不配對(duì)區(qū)域的高效保真PCR方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及PCR擴(kuò)增方法，特別是涉及在指定位點(diǎn)引入與模板不配對(duì)區(qū)域的PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在定點(diǎn)引入不配對(duì)區(qū)域的PCR過程中，如引物5 ’端增加酶切位點(diǎn)的PCR、定點(diǎn)突變是分子生物學(xué)中常用技術(shù)，對(duì)PCR過程有極高的要求:原有配對(duì)區(qū)要求高保真、而定點(diǎn)不配對(duì)區(qū)則要求能做到定向突變、產(chǎn)物要求高效擴(kuò)增。但是在實(shí)際操作過程中實(shí)驗(yàn)操作者很難做到保真性、特異性突變和效率兼顧；除了引物設(shè)計(jì)、退火溫度等因素外，PCR過程中所使用的聚合酶及Mg2+濃度也是與特異性、保真性、擴(kuò)增效率、突變兼容性密切相關(guān)的因素。
[0003]高擴(kuò)增效率的低保真PCR聚合酶(熱啟動(dòng)酶,如Tag酶,Roche的fast starTag,等等)一擴(kuò)增效率高但是突變率高；且突變位點(diǎn)隨機(jī)，得到和目標(biāo)產(chǎn)物完全一致的序列幾率低，增加測序次數(shù)、成本、時(shí)間。
[0004]高保真酶(具有3’ 一 5’外切酶活性的酶,如promega公司的Pfu等)一降低堿基錯(cuò)配率，當(dāng)發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，可將錯(cuò)配堿基切除，保真性高但擴(kuò)增效率低，在引物與模板有一定的不配對(duì)性的情況下而擴(kuò)增能力更低(表1)。
[0005]
【權(quán)利要求】
1.一種定點(diǎn)引入不配對(duì)區(qū)域的高效保真PCR方法，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)根據(jù)目標(biāo)基因⑶NA序列及所需引入不配對(duì)堿基設(shè)計(jì)引物，其規(guī)則為:5，端一3，端:不配對(duì)區(qū)+18個(gè)堿基以上的⑶NA上游配對(duì)區(qū)； (2)選取保真性不高但擴(kuò)增效率高的低保真PCR聚合酶，酶用量按理論要求所需最低用量，實(shí)驗(yàn)體系按其使用說明建立緩沖體系，按配對(duì)堿基數(shù)計(jì)算PCR退火溫度，進(jìn)行3-5個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增得到具有與原始模板不配對(duì)的區(qū)域的第一階段產(chǎn)物； (3)取第一步產(chǎn)物為模板，取高保真PCR聚合酶(如Pfu酶，錯(cuò)誤率7*10_7，對(duì)目標(biāo)分子擴(kuò)增一百萬倍，理論所需循環(huán)數(shù)為30個(gè))，按其使用說明建立實(shí)驗(yàn)緩沖體系，并根據(jù)配對(duì)堿基數(shù)的增加可相應(yīng)提高退火溫度，按擴(kuò)增效率選擇循環(huán)數(shù)，以高保真酶擴(kuò)增得到第二階段產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定點(diǎn)引入不配對(duì)區(qū)域的高效保真PCR方法，其特征在于，步驟(1)所述不配對(duì)的區(qū)域?yàn)樘囟ㄎ稽c(diǎn)的定向堿基突變，包括含酶切位點(diǎn)的引物區(qū)域或點(diǎn)突變區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定點(diǎn)引入不配對(duì)區(qū)域的高效保真PCR方法，其特征在于，步驟(3)所取產(chǎn)物做模板的體積小于等于第二步驟反應(yīng)體系的1/10。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104031907SQ201410245609
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月4日
【發(fā)明者】王貝貝 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)