一種鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的方法，具體涉及一種新的鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法。該方法通過對凝結(jié)芽孢桿菌基因特異的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物：HFQ1/HFQ2，用該引物對待測樣品的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，可以將凝結(jié)芽孢桿菌菌株鑒定到種的水平。本發(fā)明將為凝結(jié)芽孢桿菌鑒定提供一種更加準(zhǔn)確、更易于操作的實(shí)用方法，有利于凝結(jié)芽孢桿菌菌株的分類及研究工作。
【專利說明】一種鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生物額鑒定方法，具體涉及一種鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的方法，屬于分子生物學(xué)的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)呈桿狀,兩端鈍圓,革蘭氏陽性菌,過氧化氫酶陽性，芽胞端生，無鞭毛。最適生長溫度為45~50°C,最適pH值為6.6~7.0。其能分解糖類生成L-乳酸，為同型乳酸發(fā)酵菌。是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的一種“普遍認(rèn)為安全”的桿菌類乳酸菌。凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是近年來益生菌領(lǐng)域的后起之秀,其除具有乳酸菌和雙歧桿菌等保健功效外，還具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性，且具有較強(qiáng)的抑制腸道致病菌能力。
[0003]在國外已廣泛應(yīng)用于保健、醫(yī)療、食品和畜牧等領(lǐng)域，但在我國關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌的研究和開發(fā)才剛剛起步。凝結(jié)芽孢桿菌是造成罐頭食品平蓋酸敗的一種重要微生物。
[0004]綜上所述，不論是作為益生菌來利用，還是作為酸敗的罪魁禍?zhǔn)?，都需要一種快速的鑒定方法，而傳統(tǒng)的生化鑒定操作繁瑣、檢測時間長，已經(jīng)不能滿足各個領(lǐng)域的需求，因而，對凝結(jié)芽孢桿菌快速檢測的研究是很有必要的。PCR方法具有檢測速度快、靈敏度高、成本低的優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前細(xì)菌鑒定中一種快速有效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，提供一種鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺點(diǎn)和不足。本發(fā)明提供一種檢測速度快、成本低的快速檢測凝結(jié)芽孢桿菌到種的PCR方法。
[0006]本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0007]作為本發(fā)明的第一方面，一種鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物，其特征在于，所述引物是一對特異性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物HFQl序列與SEQ IDN0.1 相同，為:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列與 SEQ ID N0.2 相同，為:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
[0008]作為本發(fā)明的第二方面，一種特異性引物鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0009](I)提取凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans),準(zhǔn)備對照菌株；
[0010](2)以步驟⑴中的細(xì)菌DNA為模板，用HFQ1/HFQ2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；和
[0011] (3)用I %瓊脂糖凝膠電泳對上述PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
[0012]步驟(2)中，正向引物HFQl 序列與 SEQ ID N0.1 相同，為:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ；反向引物 HFQ2 序列與 SEQ ID N0.2 相同，為:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
[0013]步驟(2)中，PCR擴(kuò)增體系為:20μ1 由 2 μ 110 XBufferwith MgCl2、I μ ldNTP2.5mmol/L、I μ I HFQ11 Ommo I/L、I μ I HFQ2I Ommo I/L、0.I μ I TaqDNAPolymerase5U/ μ 1、I μ I DNA 模板，13.9 μ I ddH20 ；
[0014]PCR 擴(kuò)增條件為:預(yù)變性 94°C 5min，變性 94°C 35s，退火 50°C 40s，延伸 72°C 40s，30個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。
[0015]作為本發(fā)明的第三方面，一種鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物的用途，其特征在于:用于凝結(jié)芽孢桿菌的分子檢測。
[0016]本發(fā)明的有益效果:
[0017]1、較傳統(tǒng)鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的16sDNA擴(kuò)增、測序、比對、生理生化試驗(yàn)等繁雜步驟來說，本發(fā)明的方法可以直接鑒定出是否是凝結(jié)芽孢桿菌，極大程度上節(jié)省了實(shí)驗(yàn)資源，可用于大規(guī)模樣品的鑒定凝結(jié)芽孢桿菌。
[0018]2、本發(fā)明的引物是根據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌特異保守基因而設(shè)計(jì)的，應(yīng)用本發(fā)明的引物HFQ1/HFQ2可從各類樣品DNA中直接擴(kuò)增出長度大約為290bp的凝結(jié)芽孢桿菌目的片段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為實(shí)施例1中HFQ1/HFQ2引物對種細(xì)菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
[0020]M 泳道為標(biāo)準(zhǔn) DNA markerfOOO。
[0021]I號泳道為凝結(jié)芽孢桿菌的擴(kuò)增結(jié)果。
[0022]2號泳道為陰性對 照。
[0023]3-10號泳道分別為含有枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(Escherichia coli ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎雙球菌(Pneumococcus)和流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)的 DNA0
[0024]圖2為實(shí)施例2中HFQ1/HFQ2引物對不同樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
[0025]M 泳道為標(biāo)準(zhǔn) DNA marker2000。
[0026]I號泳道為凝結(jié)芽孢桿菌的擴(kuò)增結(jié)果。
[0027]2號泳道為陰性對照。
[0028]3號泳道為土壤A樣品DNA。
[0029]4號泳道為土壤B樣品DNA。
[0030]5-號泳道為番爺罐頭A樣品DNA。
[0031]6號泳道為番爺罐頭B樣品DNA。
【具體實(shí)施方式】
[0032]結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0033]實(shí)施例1
[0034]實(shí)驗(yàn)步驟
[0035]1、提取凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(Escherichia coli ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎雙球菌(Pneumococcus)和流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)的 DNA,上述菌種來源見表 I。
[0036]2、以步驟I中的細(xì)菌DNA為模板，用HFQ1/HFQ2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0037]PCR 擴(kuò)增體系為:20μ I 由 2μ 110 X Buffer (with MgCl2), I μ I dNTP (2.5mmol/L)、I μ I HFQl(IOmmoI/L)、I μ I HFQ2(IOmmoI/L)、0.I μ I TaqDNA Polymerase(5U/μ I)、I μ IDNA 模板，13.9 μ I ddH20。
[0038]PCR 擴(kuò)增條件為:預(yù)變性 94°C 5min,變性 94°C 35s，退火 50°C 40s,延伸 72°C 40s，30個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。
[0039]3、用I %瓊脂糖凝膠電泳對上述PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
[0040]實(shí)驗(yàn)結(jié)果 [0041]檢測結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出本實(shí)施方式用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物HFQ1/HFQ2能夠準(zhǔn)確的擴(kuò)增出凝結(jié)芽孢桿菌的靶標(biāo)序列片段，而未能從其他屬細(xì)菌DNA和空白對照中擴(kuò)增出核酸片段。將I號泳道對應(yīng)的擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，經(jīng)Blast比對分析，確定其為凝結(jié)芽孢桿菌特異基因序列。
[0042]表1菌種來源表
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物，其特征在于，所述引物是一對特異性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物 HFQl 序列與 SEQ ID N0.1 相同，為:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列與 SEQ ID N0.2 相同，為:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
2.一種如權(quán)利要求1所述的特異性引物鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans),準(zhǔn)備對照菌株； (2)以步驟⑴中的細(xì)菌DNA為模板，用HFQ1/HFQ2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；和 (3)用I%瓊脂糖凝膠電泳對上述PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
3.根據(jù)權(quán)利要求2述的方法，其特征在于:步驟(2)中，正向引物HFQl序列與SEQID N0.1 相同，為:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列與 SEQ ID N0.2 相同，為:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
4.根據(jù)權(quán)利要求2述的方法，其特征在于: 步驟(2)中，PCR擴(kuò)增體系為:20μ I 由 2μ 110XBufferwith MgCl2,1 μ ldNTP2.5mmol/LU μ I HFQ110mmol/L、l μ I HFQ210mmol/L、0.1 μ I Taq DNAPolymerase5U/μ 1、1 μ I DNA 模板，13.9μ I ddH20 ；
PCR擴(kuò)增條件為:預(yù)變性940C 5min,變性94°C 35s，退火50°C 40s,延伸72°C 40s, 30個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。
5.一種如權(quán)利要求1所述的鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物的用途，其特征在于:用于凝結(jié)芽孢桿菌的分子檢測。
【文檔編號】C12R1/07GK104004846SQ201410245441
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月4日
【發(fā)明者】符雷, 郗洪生, 施騰鑫, 陸亞怡 申請人:江蘇恒豐強(qiáng)生物技術(shù)有限公司