檢測(cè)攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)用于檢測(cè)攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒內(nèi)包括有：序列表中引物核苷酸序列SEQID№1和SEQID№2，探針核苷酸序列SEQID№3，BCO2基因CC基因型核酸序列SEQID№4和BCO2基因TT基因型核酸序列SEQID№5。本發(fā)明與已有檢測(cè)BCO2基因突變位點(diǎn)方法相比，具有分型鑒定方法準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、成本低、實(shí)用，具有很好的實(shí)用價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】檢測(cè)攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種獸醫(yī)用遺傳疾病檢測(cè)試劑盒，特別是一種可用于檢測(cè)攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]消費(fèi)者單純憑借視覺(jué)就可對(duì)肉類(lèi)外在的脂肪顏色品質(zhì)做出直觀的評(píng)價(jià)，因此脂肪顏色是肉質(zhì)的主要感官指標(biāo)，也是人們選擇肉品首要和主要的依據(jù)。美國(guó)、加拿大、澳大利亞和日本等國(guó)已將牛肉的脂肪顏色作為其胴體分級(jí)系統(tǒng)(Carcass grading systems)中的重要組成部分。澳大利亞肉類(lèi)品質(zhì)規(guī)格管理局(AUS-MEAT)將黃脂的黃色程度分為十個(gè)等級(jí)，O為“白色”，9為“特別黃”；規(guī)定黃脂的程度由經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的評(píng)價(jià)師比對(duì)AUS-MEAT標(biāo)準(zhǔn)顏色芯片(Standard colour chips)判定。愛(ài)爾蘭等一些歐洲國(guó)家卻將黃脂的黃色程度分為五個(gè)等級(jí)，I為“非常白”，5為“特別黃”。家畜屠宰后有些胴體的脂肪組織呈淡黃色或黃色的現(xiàn)象，稱為黃脂。類(lèi)似黃脂的現(xiàn)象在牛、馬、豬、綿羊、狐貍、水貂、貓、鼬鼠、雞和兔等動(dòng)物中都有報(bào)道[梅步俊，李亞珍，吉日嘎拉，汪長(zhǎng)壽，馬惠茹.反芻動(dòng)物黃脂研究進(jìn)展.草食家畜，2013，(04): 1-5.]。加拿大1995-1996年牛肉品質(zhì)調(diào)查中，4%胴體存在黃脂現(xiàn)象。墨西哥的研究報(bào)道牛肉的黃脂發(fā)生率為12.9%[ M6ndez RD, Meza CO, BerruecosJM, Garces P, Delgado EJ, Rubio MS.A survey of beef carcass quality and quantityattributes in Mexic0.Anim Sci, 2009, 87(11): 3782-3790.]。劉曉牧等在山東省部分屠宰企業(yè)的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)高檔牛肉黃脂檢出率也為4%左右，每公斤高檔牛肉中含有黃色脂肪的肉價(jià)格比白色脂肪低40元左右[劉曉牧，吳乃科，宋恩亮，等.牛肉黃脂研究進(jìn)展.中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2006，32(2):31-33.]。在國(guó)內(nèi)綿羊中，盧振鴻、吳心華、孫淑萍、韓合國(guó)、張建華等在寧夏靈武市狼皮梁子鄉(xiāng)、白土崗子鄉(xiāng)、鹽池縣王樂(lè)井鄉(xiāng)、內(nèi)蒙古前旗、遼寧沈陽(yáng)、山西大同等地出現(xiàn)羊育肥期結(jié)束屠宰時(shí)發(fā)現(xiàn)脂肪變成黃色的現(xiàn)象，不能銷(xiāo)售，發(fā)病率達(dá)10%[劉寶山，姚龍泉，魏振波，吳波.育肥羊謹(jǐn)防黃脂病.畜牧與獸醫(yī)，2011，(02): 107-108.盧振鴻.育肥羊黃脂癥的病因分析及防治措施.2010中國(guó)羊業(yè)進(jìn)展，2010:369-370.孫淑萍，陶占軍，盧振鴻，黃麗紅.育肥羊黃脂癥的病因分析及防治措施.當(dāng)代畜牧，2010，(03):24-25.吳心華，趙洪喜，陳紹淑，李?lèi)?ài)華，謝琴，扈登強(qiáng)，余四九.育肥羊黃脂癥的診治.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，(02):94.韓合國(guó).育肥羊黃脂癥的調(diào)查分析與防治.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2013，(10):49-50.張建華.育肥綿羊黃脂病的病例報(bào)告及預(yù)防措施.當(dāng)代畜牧，2012，(07):32-33.]。
[0003]綿羊黃脂病的研究始于20世紀(jì)40年代，1934年Castle首次報(bào)道了冰島綿羊群體中的黃脂現(xiàn)象[Castle, ff.E.Yellow fat in sheep.Journal of Heredity ,1934,25:246-247.]。通過(guò)對(duì)綿羊黃脂病的研究首次發(fā)現(xiàn)黃脂中至少包含三種黃色素:黃體素，葉黃素5、6環(huán)氧化物和葉黃呋喃素，綿羊黃脂遺傳病主要是由于類(lèi)胡蘿卜素在脂肪組織中過(guò)量的沉積所造成。[A.H.Kirton, Brenda Crane, D.J.Paterson N.T.Clare.Yellow fat in lambs caused by carotenoid pigmentation.New Zealand Journal ofAgricultural Research, 1975，18(3):267-272.]。很多因素都會(huì)影響脂肪顏色，包括飼料、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境、飼養(yǎng)管理、品種、性別、年齡，很多研究表明綿羊脂肪的黃色程度也是由遺傳因素控制的。通過(guò)分析33只公羊的半同胞后裔數(shù)據(jù)，估計(jì)出的綿羊黃脂肉的遺傳力為0.18[Baker, R.L., Steine, T., Vabeno, A.ff., Breines, D.: The inheritance and incidenceof yellow fat in Norwegian sheep Acta Agriculturae Scandinavica 1985, 35:389-397.Gedde-Dahl Tff.Reduction of the yellow fat incidence by different breeding plansfor sheep.Nord Vet Med.1972, 24(12):620-30.F.Hill.Xanthophyll pigmentation insheep fat.Nature.1962,194:865-6.]。進(jìn)一步表明:綿羊黃脂遺傳病其特征是胭體脂肪呈黃色，由一對(duì)隱性純合子所控制[Baker, R.L., Steine, T., Vabeno, A.ff.Breines, D.The inheritence and incidence of yellow fat in Norweigian sheep.Acta AgriculturaeScandinavica.1985, (35):389-397.馬衛(wèi)東.綿羊的先天性缺陷.國(guó)外畜牧學(xué)(草食家畜)，1991，06:31-33.]。最近研究表明，在綿羊脂肪組織中，由β —胡蘿卜素氧化合成為維生素A的關(guān)鍵非對(duì)稱裂解酶-BC02酶基因的突變位點(diǎn)(c.196C>T)引起蛋白質(zhì)翻譯的提前終止，使得BC02酶由原來(lái)的575個(gè)氨基酸變?yōu)?5個(gè)氨基酸，從而引起B(yǎng)C02酶功能的喪失，使得β —胡蘿卜素的在脂肪組織的沉積引進(jìn)黃脂遺傳病?；键S脂遺傳病的羊只均攜帶BC02 c.196突變純合基因型ΤΤ，部分?jǐn)y帶BC02 c.196野生/突變雜合基因型CT，健康羊只均攜帶 BC02 c.196 野生純合基因型 CC [Vage DI, Boman IA.A nonsense mutation in thebeta-carotene oxygenase 2 (BC02) gene is tightly associated with accumulation ofcarotenoids in adipose tissue in sheep (Ovisaries).BMC Genet.2010，11:10-15.]。因此我們可應(yīng)用遺傳檢測(cè)手段對(duì)BC02酶基因的突變(c.196C>T)進(jìn)行基因分型，剔除攜帶突變純合基因型TT和突變雜合基因型CT，從而降低綿羊黃脂遺傳病的發(fā)病率。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)BC02酶基因的突變位點(diǎn)(c.196C>T)進(jìn)行基因分型主要技術(shù)為PCR-RFLP 和 Mass ARRAY [Vage DI, Boman IA.A nonsense mutation in the beta-caroteneoxygenase 2 (BC02) gene is tightly associated with accumulation of carotenoids inadipose tissue in sheep (Ovis aries).BMC Genet.2010，11:10-15.],現(xiàn)有技術(shù)中 BC02 酶基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)分型鑒定方法在PCR擴(kuò)增后不僅需要進(jìn)行一輪延伸反應(yīng)或進(jìn)行限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染等技術(shù)難度大、重復(fù)性差的技術(shù)環(huán)節(jié)，而且還需要電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)等大中型設(shè)備的依賴，因此每一基因SNP檢測(cè)成本很高，因此并不適合于在我國(guó)畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用，難以廣泛的推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種中可克服現(xiàn)有技術(shù)不足，可用于檢測(cè)綿羊是否攜帶黃脂遺傳病基因的試劑盒及其使用方法。
[0006]本發(fā)明的檢測(cè)攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒內(nèi)包括有:序列表中引物核苷酸序列SEQ ID Na I和SEQID Na 2，探針核苷酸序列SEQ ID Na 3 , BC02基因CC基因型核酸序列SEQ ID Na 4和BC02基因TT基因型核酸序列SEQ ID Ns 5。
[0007]為方便使用，本發(fā)明的試劑盒內(nèi)還有分別放置的PCR緩沖液、d NTP混合液、TaqDNA聚合酶，以及IXLCGreen PLUS+飽和熒光染料。[0008]本發(fā)明試劑盒的使用方法是在待檢羊DNA中加入所述試劑盒中的引物核苷酸序列和探針核苷酸序列，以及PCR緩沖液、d NTP混合液、Taq DNA聚合酶、LCGreen PLUS+飽和熒光染料，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率熔解曲線分析儀中進(jìn)行熔解曲線分析，得到熔解曲線中的T、C峰分布情況，根據(jù)熔解曲線中的T、C峰可預(yù)測(cè)待檢羊只是否攜帶綿羊黃脂遺傳病基因情況。
[0009]本發(fā)明試劑盒的最佳使用方法是:
在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增條件為-M0C 5分鐘，94°C 45秒，60.(TC 30秒，720C 20秒，72 0C 10分鐘，共進(jìn)行50個(gè)循環(huán)；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn)行2個(gè)95 °C 2分鐘，25°C 30秒的變性和復(fù)性的循環(huán)；
所得PCR產(chǎn)物在高分辨率熔解曲線分析儀中進(jìn)行熔解曲線分析時(shí)將PCR產(chǎn)物以0.30C/秒的速度從40°C升溫到90°C過(guò)程中，獲得樣品的熔解曲線，依據(jù)熔解曲線獲得待測(cè)羊只BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)的基因型。
[0010]本發(fā)明是利用HRM (High Resolution Melt)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。HRM中文譯為“高分辨率熔解”是近幾年來(lái)在國(guó)外興起的最新的SNP及突變研究工具。HRM分析技術(shù)是2002年由猶他大學(xué)和愛(ài)德華科技公司合作開(kāi)發(fā)，最初應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)(Single NucleotidePolymorphism, SNP)檢測(cè)分析的一項(xiàng)新技術(shù)。它是在PCR結(jié)束后，根據(jù)不同堿基序列構(gòu)成核苷酸熔解溫度不同這一物理性質(zhì)，在同一容器中直接進(jìn)行高分辨率熔解，利用飽和染料監(jiān)控核苷酸的熔解過(guò)程，得到特征性熔解曲線，再根據(jù)熔解曲線的形態(tài)變化來(lái)判斷核苷酸性質(zhì)的差異。目前，HRM的應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)擴(kuò)展到突變掃描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等諸多方面，近年來(lái)已成為生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)技術(shù)。
[0011]本發(fā)明即是一種利用高分辨率熔解曲線分析儀對(duì)BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)進(jìn)行分型鑒定的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的新手段。本發(fā)明改進(jìn)了現(xiàn)有技術(shù)中BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)分型鑒定中的缺點(diǎn)。在本發(fā)明的BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)分型鑒定過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)樣本基因組DNA應(yīng)用本發(fā)明中試劑盒中的特異引物和探針進(jìn)行擴(kuò)增后，可直接應(yīng)用高分辨率熔解曲線分析儀進(jìn)行基因分型，而無(wú)需現(xiàn)有技術(shù)中BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)分型鑒定方法在PCR擴(kuò)增后還需要進(jìn)行一輪延伸反應(yīng)或限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染等技術(shù)難度大、重復(fù)性差的技術(shù)環(huán)節(jié)，從而擺脫了對(duì)電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)等大中型設(shè)備的依賴，使BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)分型簡(jiǎn)便易操作，并且可在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成1000個(gè)樣品的基因分型，因此應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)分型鑒定降低了每一基因鑒定的成本，提高了檢測(cè)速度?？傊?，本發(fā)明較上述已有BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)分型鑒定方法準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、成本低、實(shí)用，具有很好的實(shí)用價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1分別為實(shí)測(cè)的.pMD19-T BC02 (CC)、pMD19_T BC02 (TT)兩個(gè)載體基因的部分序列。
[0013] 圖2為待檢樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線，其中:樣品I的BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)的基因型為野生純合基因型CC ;樣品2的BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)的基因型為突變純合基因型TT ;樣品3的BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)的基因型為野生/突變雜合基因型CT。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】:
BC02基因克隆標(biāo)準(zhǔn)品的制備及BC02基因突變位點(diǎn)(c.196C>T)基因分型檢測(cè)(I).以下表1所列的本發(fā)明所使用的引物基因序列和探針序列均由上海生工生物工程科技發(fā)展有限公司合成。
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒，其特征是試劑盒內(nèi)包括有:序列表中引物核苷酸序列SEQ ID Na I和SEQID Na 2，探針核苷酸序列SEQ ID Na 3 , BC02基因CC基因型核酸序列SEQ ID Na 4和BC02基因TT基因型核酸序列SEQ ID Ns 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是試劑盒內(nèi)還有分別放置的PCR緩沖液、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶，以 及IXLCGreen PLUS+飽和熒光染料。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103993094SQ201410245526
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】岳耀敬, 郭婷婷, 秦哲, 楊博輝, 劉建斌, 郭健, 牛春娥, 孫曉萍, 馮瑞林 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所