同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法，該方法包括：將多種核酸樣本分別依次進(jìn)行接頭連接、第一PCR擴(kuò)增、末端磷酸化和DNA連接；將多種DNA連接產(chǎn)物進(jìn)行混合；將混合DNA連接產(chǎn)物進(jìn)行3’末端添加堿基A；將3’末端添加堿基A的連接產(chǎn)物連接測(cè)序接頭；將測(cè)序接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行第二PCR擴(kuò)增，以便獲得多種核酸樣本的混合測(cè)序文庫；將混合測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序；以及對(duì)所述測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分類，以便分別獲得多種核酸樣本各自的核酸序列。利用該方法能夠同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序，并且測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性好，成本低，效率高，對(duì)測(cè)序通量利用充分，該方法尤其適用于血液游離DNA樣本。
【專利說明】同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是測(cè)序【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，本發(fā)明涉及同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]以Illumina Hiseq系列為代表的第二代深度測(cè)序技術(shù)在近年來得到了長(zhǎng)足發(fā)展，其通過對(duì)上百萬條DNA短片段的同時(shí)的平行測(cè)序，使得在短時(shí)間內(nèi)就能夠完成每個(gè)堿基的測(cè)序，且相對(duì)于傳統(tǒng)測(cè)序成本大幅度降低、準(zhǔn)確度提高。但是，至今仍沒有成本更低且準(zhǔn)確度高的同時(shí)對(duì)多個(gè)核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法。
[0003]因而，目前同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種成本低、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法。
[0005]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟:將多種核酸樣本分別進(jìn)行接頭連接，以便獲得連接接頭的核酸樣本，其中，針對(duì)不同的核酸樣本采用不同的接頭；將所述連接接頭的核酸樣本分別進(jìn)行第一PCR擴(kuò)增，以便獲得多種第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；將所述多種第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行末端磷酸化，以便獲得多種經(jīng)過末端磷酸化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；針對(duì)每一種核酸樣本，分別將所述經(jīng)過末端磷酸化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA連接，以便獲得多種DNA連接產(chǎn)物；將所述多種DNA連接產(chǎn)物進(jìn)行混合，以便獲得混合DNA連接產(chǎn)物；將所述混合DNA連接產(chǎn)物進(jìn)行3’末端添加堿基A，以便獲得3’末端添加堿基A的連接產(chǎn)物；將所述3’末端添加堿基A的連接產(chǎn)物連接測(cè)序接頭，以便獲得測(cè)序接頭連接產(chǎn)物；將所述測(cè)序接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行第二 PCR擴(kuò)增，以便獲得第二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述第二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)成所述多種核酸樣本的混合測(cè)序文庫；將所述混合測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序，以便獲得測(cè)序結(jié)果；以及基于所述測(cè)序結(jié)果中與所述接頭相對(duì)應(yīng)的序列，對(duì)所述測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分類，以便分別獲得所述多種核酸樣本各自的核酸序列。
[0006]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法能夠同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序，并且測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性好，成本低，效率高，對(duì)測(cè)序通量利用充分。此外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法尤其適用于血液游離DNA樣本，進(jìn)而該方法能夠有效用于產(chǎn)前診斷，通過同時(shí)對(duì)多種血液游離DNA樣本進(jìn)行測(cè)序，實(shí)現(xiàn)低成本測(cè)序、跨平臺(tái)兼容、軟件自動(dòng)化，提高可以開展產(chǎn)前診斷的范圍。 [0007]另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法，還可以具有如下附加的技術(shù)特征:
[0008]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸樣本來源于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，更優(yōu)選人的外周血。[0009]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述核酸為DNA或RNA。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述核酸為游離DNA。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在進(jìn)行所述接頭連接之前，進(jìn)一步包括:將所述多種核酸樣本分別進(jìn)行末端修復(fù)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述末端修復(fù)是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶進(jìn)行的。由此，末端修復(fù)效果好，效率高，有利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用T4DNA連接酶進(jìn)行所述接頭連接。由此，能夠高效地連接接頭，有利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用T4多核苷酸激酶進(jìn)行所述末端磷酸化。由此，提高了接頭連接的效率，有利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用PE接頭和T4DNA連接酶進(jìn)行所述DNA連接。由此，能夠高效地實(shí)現(xiàn)DNA連接，有利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在獲得多種DNA連接產(chǎn)物之后，以及將所述多種DNA連接產(chǎn)物進(jìn)行混合之前，進(jìn)一步包括對(duì)所述多種DNA連接產(chǎn)物進(jìn)行片段選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，通過切膠回收或磁珠捕獲進(jìn)行所述片段選擇。由此，能夠有效地實(shí)現(xiàn)片段選擇，獲得目的片段。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用Klenow(3’ _5’ exo-)進(jìn)行所述3’端添加堿基A。由此，能夠高效地實(shí)現(xiàn)3’端添加堿基A，有利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行所述測(cè)序。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過選自Illumina的His eq、GA系列測(cè)序儀、Life tech的1n系列測(cè)序儀和羅氏公司的454系列測(cè)序儀的至少一種進(jìn)行所述測(cè)序，優(yōu)選Illumina Miseq0由此，能夠有效降低測(cè)序成本，并提高測(cè)序質(zhì)量。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述測(cè)序接頭連接產(chǎn)物的長(zhǎng)度不大于測(cè)序儀的最長(zhǎng)讀長(zhǎng)。由此，能夠在保證測(cè)序準(zhǔn)確度的前提下，充分利用測(cè)序儀的測(cè)序通量。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括:對(duì)測(cè)序之前的各步驟的產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。由此，能夠有效提高各步驟產(chǎn)物的純度，減少雜質(zhì)干擾，有利于后續(xù)步驟的進(jìn)行，從而能夠提高混合測(cè)序文庫的質(zhì)量，最終提高測(cè)序的準(zhǔn)確性。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，通過磁珠法或PCR純化試劑盒進(jìn)行所述純化回收。由此，能夠有效提高純化回收的效率，獲得高純度的純化產(chǎn)物。
[0019]此外，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，當(dāng)核酸樣本數(shù)多于接頭數(shù)時(shí)，進(jìn)一步包括:將所述核酸樣本進(jìn)行分組，以便使各組的核酸樣本數(shù)不大于接頭數(shù)；以及針對(duì)每一組核酸樣本，分別進(jìn)行各步驟。由此，利用較少的接頭即可實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)量眾多的多種核酸樣本的測(cè)序，從而既能夠保證測(cè)序質(zhì)量，提高測(cè)序效率，又能夠有效降低測(cè)序成本。
[0020]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0022]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法的流程示意圖；
[0023]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的測(cè)序接頭連接產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0025]需要說明的是，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多種”的含義是兩種或兩種以上。
[0026]如前所述，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，參照?qǐng)D1，該方法包括以下步驟:
[0027]SlOO:針對(duì)每一種核酸樣本，分別依次進(jìn)行接頭連接、第一 PCR擴(kuò)增、末端磷酸化和DNA連接，獲得多種DNA連接產(chǎn)物
[0028]具體地:
[0029]首先，將多種核酸樣本分別進(jìn)行接頭連接，以便獲得連接接頭的核酸樣本，其中，針對(duì)不同的核酸樣本采用不同的接頭。由此，能夠通過不同的接頭對(duì)各核酸樣本進(jìn)行區(qū)分。
[0030]其中，根據(jù) 本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸樣本的來源不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述核酸樣本可以來源于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，更優(yōu)選人的外周血。由此，利用本發(fā)明的方法能夠有效實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多種核酸樣本的測(cè)序。
[0031 ] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸的種類不受特別限制，DNA和RNA均適用本發(fā)明的方法。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述核酸為DNA或RNA。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，優(yōu)選地所述核酸為游離DNA (即血液游離DNA)。由此，本發(fā)明的方法能夠有效用于血液游離DNA樣本的測(cè)序，進(jìn)而能夠有效用于產(chǎn)前診斷，并且基于通過該方法能夠同時(shí)對(duì)多種孕婦外周血游離DNA樣本進(jìn)行測(cè)序，從而將該方法用于產(chǎn)前診斷時(shí)能夠在保證診斷結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，有效提高產(chǎn)前診斷的效率，降低診斷成本。
[0032]此外，需要說明的是，在本文中所使用的術(shù)語“接頭”是人造的序列，一般為18~20個(gè)堿基組成，通過互補(bǔ)的方式結(jié)合成雙鏈的DNA接頭，一般通過連接反應(yīng)將接頭連接到核酸樣本兩側(cè)，然后通過PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得經(jīng)過擴(kuò)增的接頭連接產(chǎn)物。如前所述，而當(dāng)存在多種核酸樣本時(shí)，針對(duì)不同的核酸樣本連接不同的接頭，由此，基于接頭序列的不同，可以容易地區(qū)分各個(gè)核酸樣本。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，可以在接頭序列兩頭引入12個(gè)堿基的隨機(jī)序列，以便用于去除由于PCR擴(kuò)增引入的偏倚(偏向性)，由此，能夠使每一個(gè)核酸樣本都有一個(gè)唯一的序列標(biāo)簽，而且同一個(gè)分子的兩側(cè)標(biāo)簽序列是不同的，從而能夠有效消除后續(xù)樣本制備過程引入的偏倚(偏向性bias)，以便控制由于增加了樣本制備步驟而造成的問題，并充分發(fā)揮深度測(cè)序的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)本發(fā)明一些具體示例，采用5 對(duì)接頭:M13 (-20)、M13 (-40)、M13 (-47)、M13 (-24)和 M13 (-48))進(jìn)行所述接頭連接，各接頭的序列如SEQ ID NO:1-10所示,具體見下表:
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種同時(shí)對(duì)多種核酸樣本進(jìn)行測(cè)序的方法，其特征在于，包括以下步驟: 將多種核酸樣本分別進(jìn)行接頭連接，以便獲得連接接頭的核酸樣本，其中，針對(duì)不同的核酸樣本采用不同的接頭； 將所述連接接頭的核酸樣本分別進(jìn)行第一 PCR擴(kuò)增，以便獲得多種第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 將所述多種第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行末端磷酸化，以便獲得多種經(jīng)過末端磷酸化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 針對(duì)每一種核酸樣本，分別將所述經(jīng)過末端磷酸化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA連接，以便獲得多種DNA連接產(chǎn)物； 將所述多種DNA連接產(chǎn)物進(jìn)行混合，以便獲得混合DNA連接產(chǎn)物； 將所述混合DNA連接產(chǎn)物進(jìn)行3’末端添加堿基A，以便獲得3’末端添加堿基A的連接產(chǎn)物； 將所述3’末端添加堿基A的連接產(chǎn)物連接測(cè)序接頭，以便獲得測(cè)序接頭連接產(chǎn)物；將所述測(cè)序接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行第二 PCR擴(kuò)增，以便獲得第二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述第二PCR擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)成所述多種核酸樣本的混合測(cè)序文庫； 將所述混合測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序，以便獲得測(cè)序結(jié)果；以及 基于所述測(cè)序結(jié)果中與所述接頭相對(duì)應(yīng)的序列，對(duì)所述測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分類，以便分別獲得所述多種核酸樣本各自的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸樣本來源于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，更優(yōu)選人的外周血， 任選地，所述核酸為DNA或RNA， 任選地，所述核酸為游離DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行所述接頭連接之前，進(jìn)一步包括: 將所述多種核酸樣本分別進(jìn)行末端修復(fù)， 任選地，所述末端修復(fù)是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶進(jìn)行的， 任選地，利用T4DNA連接酶進(jìn)行所述接頭連接， 任選地，利用T4多核苷酸激酶進(jìn)行所述末端磷酸化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用PE接頭和T4DNA連接酶進(jìn)行所述DNA連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在獲得多種DNA連接產(chǎn)物之后，以及將所述多種DNA連接產(chǎn)物進(jìn)行混合之前，進(jìn)一步包括對(duì)所述多種DNA連接產(chǎn)物進(jìn)行片段選擇， 任選地，通過切膠回收或磁珠捕獲進(jìn)行所述片段選擇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用KlenOW(3’-5’eXO-)進(jìn)行所述3’端添加喊基A。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行所述測(cè)序， 任選地，通過選自Illumina的Hiseq、GA系列測(cè)序儀、Life tech的1n系列測(cè)序儀和羅氏公司的454系列測(cè)序儀的至少一種進(jìn)行所述測(cè)序,優(yōu)選Illumina Miseq0
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述測(cè)序接頭連接產(chǎn)物的長(zhǎng)度不大于測(cè)序儀的最長(zhǎng)讀長(zhǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括: 對(duì)測(cè)序之前的各步驟的產(chǎn)物進(jìn)行純化回收， 任選地，通過磁珠法或PCR純化試劑盒進(jìn)行所述純化回收。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)核酸樣本數(shù)多于接頭數(shù)時(shí)，進(jìn)一步包括: 將所述核酸樣本進(jìn)行分組，以便使各組的核酸樣本數(shù)不大于接頭數(shù)；以及 針對(duì)每一組核酸樣本，分`別進(jìn)行各步驟。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103602726SQ201310495699
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】田埂, 方建火, 郎繼東, 張麗娜 申請(qǐng)人:田埂