專利名稱：一株產(chǎn)喜樹堿的喜樹內(nèi)生細(xì)菌-ly214及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株喜樹內(nèi)生細(xì)菌的分離、培養(yǎng)及其用途，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
喜樹堿(CPT)是由色胺和裂環(huán)馬錢子苷縮合形成的萜類吲哚生物堿，最早從我國特有植物喜樹(Camptotheca acuminata)樹皮中分離獲得，后來陸續(xù)在多種植物中發(fā)現(xiàn)，如夾竹桃科的海木狗牙花(Ervatamia heyneana)、茶茱萸科的臭味假柴龍樹(Nothapodytesfoetida)以及菌草科的短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)等。喜樹堿抗腫瘤機(jī)制獨(dú)特,通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I而發(fā)揮抗腫瘤活性。喜樹堿系列衍生物對胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腸癌、子宮頸癌、胃癌 和血液腫瘤等均有效，是全球抗腫瘤藥物市場上的主要品種。喜樹堿的來源主要有I)從植物中提取；2)化學(xué)合成；3)植物細(xì)胞培養(yǎng)。從植物中提取喜樹堿是目前采用的主要方式。然而，喜樹堿在植物中的含量較低(一般為0.1-0.2%左右，在新鮮樹葉中含量稍高，達(dá)0.4-0.5%)，其提取、分離、純化、制備過程繁瑣、較為困難；另外產(chǎn)喜樹堿植物的生長周期均較長，并且喜樹堿的積累進(jìn)程緩慢。我國是喜樹堿的主要生產(chǎn)國和出口國，單純從植物中提取勢必造成對植物資源和生態(tài)環(huán)境的巨大破壞。此外，提取過程中大量有機(jī)溶劑的使用導(dǎo)致環(huán)境污染大、步驟繁瑣。喜樹堿的化學(xué)全合成是通過不同的建環(huán)方法合成，例如拆分法、不對稱氧化法等，多數(shù)方法存在路線過長，總產(chǎn)率過低等不足，較難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)高附加值的植物次生代謝產(chǎn)物(如喜樹堿及其衍生物)一度被認(rèn)為是一條很有希望的替代途徑，但也因植物細(xì)胞生長緩慢、培養(yǎng)過程中異質(zhì)化嚴(yán)重、產(chǎn)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)成本等因素致使實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)困難重重?？傊?，喜樹堿的來源有限，根本不能滿足市場需求(國際市場每年喜樹堿需求量3000kg，但是全球喜樹堿年產(chǎn)量僅600kg)，需要發(fā)現(xiàn)和研發(fā)替代資源及技術(shù)。植物內(nèi)生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙的真菌或細(xì)菌。鑒于部分內(nèi)生菌能夠促使藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成，產(chǎn)生與宿主相同或相似的藥用活性成分，無論從生態(tài)還是經(jīng)濟(jì)的角度來看，利用植物內(nèi)生菌作為資源，尋找與共生植株相同或相似的天然活性物質(zhì)，尤其是抗腫瘤天然藥物將是一項(xiàng)永不枯竭的資源。此外，微生物生長迅速，易于培養(yǎng)，成本相對低廉，同時(shí)，微生物易于通過基因工程等生物技術(shù)進(jìn)行定向改造，具有良好的發(fā)展前景。迄今已有關(guān)于從不同種屬的植物如喜樹、臭味假柴龍樹和柴龍樹(Apodytesdimidiata E.Mey.ex Arn)等植物中分離獲得產(chǎn)喜樹堿及其類似物的內(nèi)生真菌的相關(guān)報(bào)道(見表1)，這些研究表明利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)喜樹堿成為一種可能，并且采用植物內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)喜樹堿無疑是解決喜樹堿原料來源的綠色途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是首次提供了一種從喜樹中分離、培養(yǎng)獲得的喜樹內(nèi)生細(xì)菌Paenibacillus polymyxa LY214,及其應(yīng)用，即用于制備喜樹堿。為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:本發(fā)明提供了一種喜樹內(nèi)生細(xì)菌，其命名為Paenibacillus polymyxa LY214。本發(fā)明所述的喜樹內(nèi)生細(xì)菌Paenibacillus polymyxa LY214是從珙桐科植物喜樹樹皮中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌。經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，該菌屬于多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。該菌已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏日期2012年11月19日，保藏編號CGMCC 6841。從喜樹中分離得到的上述內(nèi)生細(xì)菌Paenibacillus polymyxa LY214的16S rDNA喊基序列如SEQ ID N0.1所不為:AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGGGTTGATTAGAAGCTTGCTTCTAATCAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGACGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGTCTTGTAGAGTAACTGCTACAAGAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAAC ACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGACCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAATCGCGAGGTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCCGCAAGGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGTAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC。測序結(jié)果遞交NCBI (網(wǎng)址為 http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast)進(jìn)行比對，根據(jù)BLAST結(jié)果并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征得出結(jié)論，確證該菌株屬于多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。本發(fā)明還提供了一種從喜樹中分離多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)LY214的方法，該方法包括:將喜樹植物材料按照常規(guī)操作切段、清洗、消毒后接種到5%水瓊脂固體培養(yǎng)基，280C ±2°C恒溫培養(yǎng)2 3周，待植物材料長出菌絲，挑取菌絲移至沙氏瓊脂固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，最后經(jīng)純化后得到內(nèi)生細(xì)菌多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214。其中，該步中，按照接種的一般操作方法，經(jīng)切段、清洗、消毒的喜樹植物材料可以在接種前先切斷，并將新切面接種到5%水瓊脂固體培養(yǎng)基。其中，所述喜樹植物材料是喜樹樹根或樹皮或果實(shí)或樹葉或樹枝。本發(fā)明還提供了一種上述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)LY214在制備喜樹堿中的應(yīng)用。具體地,上述利用多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) LY214來制備喜樹堿的用途中，其中多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) LY214來制備喜樹堿的方法包括多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)LY214菌株發(fā)酵培養(yǎng)步驟和喜樹堿提取步驟。其中，在所述發(fā)酵培養(yǎng)步驟中，將多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)LY214菌株接種到沙氏瓊脂液體培養(yǎng)基，搖床160 土 20rpm，28 ± 2°C，發(fā)酵培養(yǎng)8 15d，得到發(fā)酵混合·物；在所述喜樹堿提取步驟中，將發(fā)酵混合物經(jīng)4000rpm離心15min，過濾，分別收集濾液與菌絲體；所述濾液經(jīng)氯仿-甲醇(V/V=4:1)混合溶劑萃取，有機(jī)相于40°C減壓濃縮至干得到發(fā)酵液提取物；所述菌絲體研磨破碎，甲醇浸泡過夜，等體積氯仿-甲醇(V/V=4:l)混合溶劑萃取，有機(jī)相40°C減壓濃縮得到菌絲體提取物；發(fā)酵液提取物或菌絲體提取物加入氯仿-甲醇(V/V=4:1)溶解，經(jīng)針頭過濾器過濾得到喜樹堿粗提物。另外,在上述利用多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) LY214來制備喜樹堿的方法中，依照常規(guī)操作必要時(shí)可以在多粘類芽孢桿菌Paen ibac i 11us po I ymyxa LY214菌株發(fā)酵培養(yǎng)步驟前有多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214菌株種子液制備步驟。其中該種子液制備步驟包括菌種活化與種子培養(yǎng)。其中菌種活化中，活化培養(yǎng)基為沙氏固體培養(yǎng)基，28±2°C,培養(yǎng)時(shí)間5 7d ;種子培養(yǎng)中，培養(yǎng)基為沙氏液體培養(yǎng)基，28±2°C，搖床 160±20rpm 培養(yǎng) 2 3d。多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)制得的發(fā)酵液提取物或菌絲體提取物的成分分析顯示，喜樹堿主要存在于發(fā)酵液提取物中，菌絲體提取物中僅含有痕量喜樹堿。本發(fā)明的有益效果:(I)從喜樹植物中分離出新的喜樹內(nèi)生菌多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa LY214，為喜樹堿新藥源的開發(fā)提供了一株新的微生物；(2)多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214具有產(chǎn)喜樹堿特性,能夠應(yīng)用于制備喜樹堿；(3)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述對象為細(xì)菌，具有生長繁殖迅速，易培養(yǎng)、發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)(見表I); (4)多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214分離方法簡單易控制；(5)利用多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214獲得喜樹堿的方法簡單易控制。表I本發(fā)明喜樹內(nèi)生細(xì)菌與現(xiàn)有報(bào)導(dǎo)的比較
權(quán)利要求
1.一種從珙桐科植物喜樹中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌，其特征在于該內(nèi)生細(xì)菌的分類命名為Paenibacillus polymyxa LY214,屬多粘類芽孢桿菌，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC6841。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)生細(xì)菌，其特征在于，該內(nèi)生細(xì)菌，其特征在于該內(nèi)生細(xì)菌Paenibacillus po lymyxa LY214 的 16S rDNA 喊基序列 1517bp,如 SEQ ID N0.1 所不。
3.權(quán)利要求1所述的一種從珙桐科植物喜樹中分離得到內(nèi)生細(xì)菌多粘類芽孢桿菌Paenibacillus po lymyxa LY214的方法,其特征在于,該方法包括: 將喜樹植物材料按照常規(guī)操作切段、清洗、消毒后接種到5%水瓊脂固體培養(yǎng)基，280C ±2°C恒溫培養(yǎng)2 3周，待植物材料長出菌絲，挑取菌絲移至沙氏瓊脂固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，最后經(jīng)純化后得到內(nèi)生細(xì)菌多粘類芽孢桿菌Paenibacillus po lymyxa LY214。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述喜樹植物材料是喜樹樹根或樹皮或果實(shí)或樹葉或樹枝。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa LY214在制備喜樹堿中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，利用珙桐科植物喜樹內(nèi)生細(xì)菌多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214獲得喜樹堿的方法包括多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214菌株發(fā)酵培養(yǎng)步驟和喜樹堿粗提物步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述方法中的發(fā)酵培養(yǎng)步驟中，將多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214菌株接種到沙氏瓊脂液體培養(yǎng)基,搖床160±20rpm，28±2°C，發(fā)酵培養(yǎng)8 15d，得到發(fā)酵混合物； 在所述方法中的的喜樹堿提取步驟中，將發(fā)酵混合物經(jīng)4000rpm離心15min，過濾，分別收集濾液與菌絲體；所述濾液經(jīng)V/V=4:l的氯仿-甲醇混合溶劑萃取，有機(jī)相于40°C減壓濃縮至干得到發(fā)酵液提取物；所述菌絲體研磨破碎，甲醇浸泡過夜，等體積的V/V=4:1的氯仿-甲醇混合溶劑萃取，有機(jī)相40°C減壓濃縮得到菌絲體提取物；發(fā)酵液提取物或菌絲體提取物加入V/V=4:1的氯仿-甲醇溶解，經(jīng)針頭過濾器過濾得到喜樹堿粗提物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，依照常規(guī)操作必要時(shí)可以在多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214菌株發(fā)酵培養(yǎng)步驟前有多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214菌株種子液制備步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,所述的多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa LY214菌株種子液制備步驟包括菌種活化與種子培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的菌種活化中，活化培養(yǎng)基為沙氏固體培養(yǎng)基，28±2°C，培養(yǎng)時(shí)間5 7d ;種子培養(yǎng)中，培養(yǎng)基為沙氏液體培養(yǎng)基，28±2°C，搖床160±20rpm培養(yǎng)2 3d。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株從珙桐科植物喜樹(Camptotheca acuminata)中分離純化得到的喜樹內(nèi)生細(xì)菌及其用途。本發(fā)明所涉及的喜樹內(nèi)生細(xì)菌LY214經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為多粘芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2012年11月19日，保藏編號CGMCC 6841。本發(fā)明的顯著特征是經(jīng)高效液相色譜、紫外光譜和質(zhì)譜分析表明，喜樹內(nèi)生細(xì)菌LY214菌株經(jīng)液體發(fā)酵能產(chǎn)生抗腫瘤活性成分喜樹堿。本發(fā)明首次公開了從喜樹中分離培養(yǎng)出產(chǎn)喜樹堿的內(nèi)生細(xì)菌，為喜樹堿的制備提供了一條新途徑。
文檔編號C12P17/18GK103146614SQ201310081808
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者羅應(yīng)剛, 蒲祥, 陳菲, 屈細(xì)興, 張國林 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所