專利名稱：多種蛋白酶水解蛋清蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品加工領(lǐng)域，涉及利用蛋白酶水解雞蛋清蛋白的方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱，按水解多肽方式可將蛋白酶分成內(nèi)肽酶和外肽酶兩大類。內(nèi)肽酶從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部將肽鍵切斷，外肽酶從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基末端逐個將肽鍵水解，而游離出氨基酸，前者為氨基肽酶，后者為羧基肽酶。按其活性中心和最適PH值，又可將蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等。按其反應(yīng)的最適PH值，分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的蛋白酶，主要是內(nèi)肽酶。蛋白酶廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實和微生物中，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。蛋白酶對所作用的底物有專一性，一種蛋白酶只水解蛋白質(zhì)中特定肽鍵，如胰蛋白酶催化水解堿性氨基酸所形成的肽鍵。工業(yè)上蛋白酶制劑生產(chǎn)以利用枯草桿菌、棲土曲霉等發(fā)酵制取為主。蛋白酶具有特異性，由于不同蛋白酶的酶解位點不同，同樣的蛋白質(zhì)在不同的水解酶作用下可產(chǎn)生不同的肽片段，雖能根據(jù)原料蛋白的組成和酶的專一性作為參考，但仍存在較大的盲目性。許多生物活性肽用胃腸道蛋白酶水解，常用的胃蛋白酶和胰蛋白酶，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性肽、鈣結(jié)合磷酸肽，常用胰蛋白酶來制取。目前商業(yè)用酶以微生物酶為主，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及復(fù)合酶等。植物蛋白酶及少量動物蛋白酶也有應(yīng)用。針對不同的底物，選擇蛋白酶應(yīng)考慮到的因素:1、避免水解過程中產(chǎn)生苦味肽；2、能有效的降低游離氨基酸數(shù)量；3、水解反應(yīng)結(jié)束后蛋白酶易于變性失活；4、蛋白酶安全性與經(jīng)濟性。雞蛋蛋白主要在雞蛋清中，蛋清中除水分外，主要成分是蛋白質(zhì)，含有人體所必需的多種氨基酸，包括賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、蘇氨酸等，氨基酸配比均衡性好，是機體利用率最高的一種蛋白質(zhì)，雞蛋蛋白一般被認(rèn)為是全價蛋白質(zhì)，常用作評價其它食物蛋白營養(yǎng)價值的參比蛋白。蛋清蛋白本身的某些性質(zhì)，如不耐熱及易凝固，限制了其在食品加工中的應(yīng)用范圍。雞蛋清蛋白質(zhì)作為一種全價蛋白，其序列中以非活性狀態(tài)存在具有生物活性的肽段，采用適當(dāng)?shù)乃夥椒▽⑦@些生物活性肽釋放出來并發(fā)揮生理調(diào)節(jié)作用，同時改善蛋清蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，拓寬其應(yīng)用范圍，也是生產(chǎn)蛋白飲料的一種加工手段。蛋白質(zhì)水解一般分為酸法水解和酶法水解。酸法水解雖水解迅速徹底，但會產(chǎn)生腐黑質(zhì)，而且如色氨酸、絲氨酸等氨基酸被破壞。酶對蛋白質(zhì)的水解是一種不完全、不徹底的水解反應(yīng)，其水解產(chǎn)物主要是肽而不是氨基酸，水解過程中不產(chǎn)生消旋作用，氨基酸未被破壞，與基因工程、化學(xué) 合成等方法相比，酶法水解安全性極高、反應(yīng)條件溫和、易于控制水解度，而且水解產(chǎn)物除氨基酸外，還含有大量生物活性肽，國內(nèi)外已有利用蛋清蛋白肽液生產(chǎn)功能性飲料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用多種蛋白酶同時或分階段水解雞蛋清蛋白的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是:首先獲取雞蛋清并加熱變性，然后利用復(fù)合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase)、堿性蛋白酶(Alcalase)和風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)中的兩種或以上進(jìn)行同時或者分階段水解雞蛋清蛋白(酶來自諾維信公司)，制得雞蛋清蛋白水解液。當(dāng)采用同時水解方法時，其步驟為:(1)先將新鮮雞蛋洗凈，然后分離出蛋清，蛋清與滅菌蒸餾水按照體積比1:3混合后在95°C加熱變性20分鐘，得酶水解用的原料；(2)以上述蛋清原料為酶水解底物,先后加入喊性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶:調(diào)節(jié)蛋清體積:蒸餾水體積為1: 3，ρΗ7.5，水浴預(yù)熱到550C，加入堿性蛋白酶4.0%，ρΗ7.5，反應(yīng)4小時，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，溫度55°C，加入風(fēng)味蛋白酶2%，反應(yīng)2小時；進(jìn)行分步水解，獲得雞蛋清的蛋白水解液。當(dāng)采用分階段水解時，可按前述步驟(I)制得酶水解用的原料；然后先后加入復(fù)合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase)、堿性蛋白酶(Alcalase)和風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)中的至少兩種進(jìn)行分步水解；各種酶的水解條件可按各自的酶解條件進(jìn)行調(diào)控。復(fù)合蛋白酶(Protamex)的最佳水解條件為:溫度55°C、pH7.0、酶量為7%、蛋清濃度為1:5，Protamex6h酶解物的蛋白殘留率為6.82%，水解度達(dá)7.40%。中性蛋白酶(Neutrase)最佳水解條件為溫度55°C、pH6.0、酶量為5%、蛋清濃度為1:5, Neutrase6h酶解物的蛋白殘留率為24.28%，水解度達(dá)3.71%。堿性蛋白酶(Alc a lase)最佳水解條件為溫度55°C、pH7.5、酶量為6%、蛋清濃度為1:3或1:4，Alcalase6h酶解物的水解度可達(dá)18.73%。風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)最佳水解條件為溫度55°C、pH6.5、酶量為6%、蛋清濃度為1:5，F(xiàn)lavourzyme6h酶解物的蛋白殘留率為27.68%，水解度達(dá)38.75%。例如，先后加入堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行分步水解，獲得雞蛋清的蛋白水解液的步驟是:以上述經(jīng)變性的蛋清原料為酶水解底物，調(diào)節(jié)蛋清濃度為1:5 (純蛋清體積:蒸餾水體積)，ρΗ7.5，水浴預(yù)熱到55°C，加入堿性蛋白酶2.0%，ρΗ7.5，反應(yīng)4小時，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，溫度55°C，加入風(fēng)味蛋白酶4.0%，反應(yīng)2小時。由于單一的蛋白酶水解蛋白質(zhì)具有專一性，單一使用只能使底物中相應(yīng)的肽鍵斷裂，當(dāng)聯(lián)合使用不同的酶，在酶作用位點方面可以產(chǎn)生互補性，提高水解度，增加蛋清蛋白肽得率。
具體實施例方式I)獲得酶水解用的底物原料將新鮮雞蛋洗凈，然后分離蛋清蛋黃，獲得蛋清，蛋清與滅菌蒸餾水水按照體積比I: 3混合，95°C加熱變性20分鐘，得酶水解用的原料。實例1:以此蛋清原料為酶水解底物，加入復(fù)合蛋白酶(Protamex)中性蛋白酶(Neutrase )、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme )同時水解,獲得雞蛋清的蛋白水解液。
調(diào)節(jié)蛋清濃度為1:5 (蛋清體積:蒸餾水體積)，用HCl調(diào)節(jié)到pH6.5，水浴預(yù)熱到55 °C,加入復(fù)合蛋白酶(Protamex) 1.5%、中性蛋白酶(Neutrase) 1.5%、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)3.0% (占稀釋后蛋清重量的比),于恒溫水浴振蕩器(120r/min)中進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解反應(yīng)期間用PH計監(jiān)測蛋清液的pH，并通過滴加NaOH溶液來調(diào)節(jié)pH，使pH保持在6.5，反應(yīng)6小時后，收集蛋清蛋白水解液,置沸水浴中滅活酶20min，使酶解反應(yīng)終止。凱氏定氮法測水解物總含氮量，甲醛滴定法測定水解物游離氨基酸含量。
權(quán)利要求
1.一種多種蛋白酶水解蛋清蛋白的方法，其特征在于首先獲取雞蛋清并加熱變性，然后利用復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶中的兩種或以上進(jìn)行同時或者分階段水解雞蛋清蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)先將新鮮雞蛋洗凈，然后分離出蛋清，蛋清與滅菌蒸餾水按照體積比1:3混合后在95°C加熱變性20分鐘，得酶水解用的原料； (2)以上述蛋清原料為酶水解底物，調(diào)節(jié)蛋清與蒸餾水體積比為1:4，按稀釋后蛋清的重量比加入復(fù)合蛋白酶1.5%、中性蛋白酶3.0%、風(fēng)味蛋白酶1.5%同時水解；在pH 6.5，55°C條件下反應(yīng)5小時，獲得雞蛋清的蛋白水解液。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)先將新鮮雞蛋洗凈，然后分離出蛋清，蛋清與滅菌蒸餾水按照體積比1:3混合后在95°C加熱變性20分鐘，得酶水解用的原料； (2)以上述蛋清原料為酶水解底物，先后加入堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶:調(diào)節(jié)蛋清體積:蒸餾水體積為1:3，pH 7.5，水浴預(yù)熱到55°C，加入堿性蛋白酶4.0%，pH 7.5，反應(yīng)4小時，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，溫度55°C，加入風(fēng)味蛋白酶2%，反應(yīng)2小時；進(jìn)行分步水解，獲得雞蛋清的 蛋白水解液。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品加工領(lǐng)域，涉及利用蛋白酶水解雞蛋清蛋白的方法。該方法是首先獲取雞蛋清并加熱變性，然后利用復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶中的兩種或以上進(jìn)行同時或者分階段水解雞蛋清蛋白。本發(fā)明聯(lián)合使用不同的酶，在酶作用位點方面可以產(chǎn)生互補性，提高水解度，增加蛋清蛋白肽得率。
文檔編號C12P21/06GK103146791SQ201310080858
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者趙國琦, 袁宇, 霍永久, 林淼, 徐嗣昌, 金曉君, 鄧波波 申請人:揚州大學(xué)