多酶納米復(fù)合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供具有至少兩種不同酶和錨定于所述酶的至少一種的聚合網(wǎng)狀物的納米復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，所述酶的活性催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
【專利說明】多酶納米復(fù)合物
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的引用
[0002]本申請(qǐng)根據(jù)美國(guó)法典第35篇第119條(e)款要求2011年7月6日提交的名稱為“ORAL DELIVERY OF ENZYMES BY NANOCAPSULES FOR TARGETED METABOLISM OF ALCOHOL ORTOXIC METABOLITES”的共同待決美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/504，975和2011年8月31日提交的名稱為“MULTIPLE-ENZYME NAN0C0MPLEXES”的共同待決美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/529，767的權(quán)利，所述各專利申請(qǐng)的內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0003]政府資助的聲明
[0004]本發(fā)明是在由美國(guó)國(guó)防部國(guó)防威脅降低局頒發(fā)的授予號(hào)HDTRA1-09-1-0001下在政府資助下完成。政府享有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本公開大體上涉及含有協(xié)同執(zhí)行其酶功能的多種酶的納米結(jié)構(gòu)。也公開制備和使用所述結(jié)構(gòu)的方法。
【背景技術(shù)】
[0006]酶是介導(dǎo)活生物體中的每一生物過程的精巧生物催化劑。在真核生物細(xì)胞中，大多數(shù)酶不在胞質(zhì)液內(nèi)自由擴(kuò)散，而是在空間上限定在亞細(xì)胞細(xì)胞器內(nèi)或連同其它蛋白質(zhì)一起以酶復(fù)合 物形式緊密共定位(參見例如Conrado等人，Curr OpinBiotechl9, 492-499，(2008) ;Yan 等人，J Proteomics72, 4-11, (2009))。在由多種酶催化的連續(xù)反應(yīng)中，所述緊密限定使中間體在各酶間的擴(kuò)散最小，從而增強(qiáng)總體反應(yīng)效率和特異性(參見例如 Yan 等人,J Proteomics72, 4-11, (2009))。
[0007]通常在體內(nèi)，在代謝過程期間產(chǎn)生的毒性中間體由旨在降解所述毒素且共定位在限定結(jié)構(gòu)內(nèi)的鄰近酶迅速消除(參見例如Kristensen等人，Natl AcadSci USA102，1779-1784，(2005))。舉例而言，過氧化物酶體持有具有重要代謝和分解代謝功能的多種氧化酶；毒性中間體，如過氧化氫(H2O2)(參見例如Wanders等人，Annu Rev Biochem75, 295-332，(2006)；和 Schrader 等人，Histochem CellBioll22, 383-393, (2004))。有趣的是自然界通過在過氧化物酶體內(nèi)并入催化酶(Cat)來繞過這個(gè)難題。催化酶在分解H2O2方面具有高度活性和特異性；快速消除所產(chǎn)生的H2O2會(huì)防止其從過氧化物酶體擴(kuò)散出來且防止其對(duì)其它細(xì)胞組分的損害(參見例如Fujiwara 等人，J Biol Chem275, 37271-37277，(2000);和 Sheikh 等人，P Natl Acad SciUSA95, 2961-2966，(1998))。
[0008]盡管多酶構(gòu)造通常存在于自然界中，但包括酶催化和治療的當(dāng)前酶基應(yīng)用仍然局限于使用單一酶或其混合物(參見例如Leader等人，Nat RevDrug Discov7,21-39, (2008) ； I so 等人，J Microencapsul6, 165-176, (1989)；Nouaim1-Bachmann 等人，Biotechnol Bioeng96, 623-630, (2007);和 Mateo 等人，EnzymeMicrob Tech40，1451-1463，(2007))。已廣泛研究并有多種酶的無機(jī)和聚合材料；然而，酶以薄膜或大粒子(直徑約lOOym)形式隨機(jī)固定在這些材料內(nèi)，從而排斥其治療應(yīng)用(參見例如 Srere 等人，P Natl Acad Sci USA70, 2534-2538，(1973) ；Mansson
等人，P Natl Acad Sc1---Biol80, 1487-1491，(1983) ；Kochschmidt 等人，Eur J
Biochem81, 71-78，(1977);和 Sheldon 等人，Adv Synth Catal349, 1289-1307，(2007))。
[0009]融合蛋白技術(shù)提供一種構(gòu)建多酶構(gòu)造的策略(參見例如Riedel等人，Mo IMicrobi0 I 28，767-775，(1998) ； Sh ibuya 等人，Biosci BiotechBioch56, 884-889，(1992)；和 Mao 等人，J Biol Chem270, 18295-18300，(1995)。理想的是具有可設(shè)計(jì)功能的所述構(gòu)造可通過審慎工程改造轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中的基因組輸入物來達(dá)成；然而，這個(gè)方法常導(dǎo)致酶特異性和活性損失或降低(參見例如Stempfer 等人，Nat Biotechnoll4, 481-484，(1996)；和 Seo 等人，Appl EnvironMicrob66, 2484-2490，(2000))。此外，找到適合宿主細(xì)胞及設(shè)計(jì)適合間隔子進(jìn)一步在融合蛋白的構(gòu)建中施加障礙(參見例如Bulow等人，Bio-Technol3，821-823，(1985))。近來，翻譯后裝配用于構(gòu)建酶復(fù)合物；然而，所述裝配過程僅依賴于酶組分之間的特異性結(jié)合且缺乏一般適用性(參見例如 Mingardon 等人，Appl Environ Microb73, 7138-7149, (2007)；Fierobe 等人，JBiol Chem276, 21257-21261，(2001)；和 Fierobe 等人，J BiolChem277, 49621-49630，(2002))。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本文公開的本發(fā)明提供具有可編程功能的強(qiáng)健人工酶納米復(fù)合物。如以下詳細(xì)論述，通過使用簡(jiǎn)單濕 式化學(xué)方法，可針對(duì)廣泛范圍的功能性應(yīng)用來產(chǎn)生且特定設(shè)計(jì)新型酶納米復(fù)合物。
[0011]本公開提供含有至少兩種不同酶及錨定于所述酶的至少一種的聚合物網(wǎng)狀物的納米復(fù)合物。所述多酶復(fù)合物使得酶能夠協(xié)同執(zhí)行其活性。在一些實(shí)施方案中，酶的活性催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外，復(fù)合物的功能可通過簡(jiǎn)單化學(xué)方法來編程。如實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例中所證明，這些酶復(fù)合物(稱為“酶納米復(fù)合物(EN) ”)展現(xiàn)催化效率增強(qiáng)以及穩(wěn)定性增加。同時(shí)，這些酶復(fù)合物可被設(shè)計(jì)來分解特定化合物，例如在體內(nèi)環(huán)境中可具有毒性的那些化合物(例如過氧化氫)。
[0012]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供一種多酶納米復(fù)合物，所述多酶納米復(fù)合物包含至少兩種不同酶及錨定于所述至少兩種不同酶的至少一種的聚合網(wǎng)狀物。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物錨定于全部至少兩種不同酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩種不同酶的活性催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
[0013]在一些實(shí)施方案中，至少兩種不同酶彼此共價(jià)或非共價(jià)連接。一方面，共價(jià)鍵聯(lián)在體內(nèi)可降解。另一方面，至少兩種不同酶不彼此連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物包含主要由至少一種單體單元組成的聚合物。在另一實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物包含主要由至少兩種不同單體單元組成的聚合物。在一些實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物進(jìn)一步包含交聯(lián)劑。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，也提供一種多酶納米復(fù)合物，所述多酶納米復(fù)合物包含至少兩種不同酶和可滲透外殼，所述外殼包含錨定于至少兩種不同酶的至少一種的聚合網(wǎng)狀物。在另一實(shí)施方案中，本公開進(jìn)一步提供一種多酶納米復(fù)合物，所述多酶納米復(fù)合物主要由聚合網(wǎng)狀物和至少兩種不同酶組成，所述聚合網(wǎng)狀物共價(jià)錨定于所述至少兩種不同酶的至少一種且提供圍繞所述至少兩種不同酶的可滲透外殼。
[0015]本發(fā)明的另一實(shí)施方案是包括被設(shè)計(jì)來促進(jìn)多個(gè)酶促反應(yīng)的要素和構(gòu)造(例如要素的特定3維構(gòu)象)的多酶納米復(fù)合物系統(tǒng)。本文公開的系統(tǒng)的工作實(shí)施方案包括在與第一底物的第一酶促反應(yīng)中產(chǎn)生過氧化氫的第一酶、在第二酶促反應(yīng)中使過氧化氫轉(zhuǎn)化成水的第二酶、和被配置來形成囊封所述第一酶和所述第二酶的外殼的聚合網(wǎng)狀物。在所述系統(tǒng)實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物展現(xiàn)足以允許第一底物從外殼外部的外部環(huán)境擴(kuò)散至第一酶以便產(chǎn)生過氧化氫的滲透性且進(jìn)一步展現(xiàn)足以允許過氧化氫從第一酶擴(kuò)散離開且到達(dá)第二酶以便產(chǎn)生水的滲透性。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，第一酶偶合于第二酶。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物偶合于第一酶的多肽或第二多肽的多肽。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，也提供用于通過例如以下方式來產(chǎn)生本文公開的多酶納米復(fù)合物的方法:(a)使至少兩種不同酶彼此連接；(b)使通過(a)產(chǎn)生的所連接酶丙烯酸化；以及(c)使用至少一種單體單元和任選交聯(lián)劑來原位(就地，in situ)聚合通過(b)產(chǎn)生的丙烯酸化的酶。一方面，方法進(jìn)一步包括(d)除去鍵聯(lián)。在本發(fā)明的某些方法實(shí)施方案中，連接包括(i)使對(duì)各酶具有特異性的配體綴合于單一核酸；(ii)實(shí)現(xiàn)綴合于所述核酸的所述配體結(jié)合所述酶；以及(iii)提供發(fā)生核酸雜交所處的條件。一方面，連接包括使酶綴合于可彼此雜交的單一核酸鏈。另一方面，(a)中的連接包括使用連接子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]在整篇附圖和申請(qǐng)中，酶納米復(fù)合物(EN)表示為η(酶)，其中括號(hào)內(nèi)的酶是指納米復(fù)合物的核心內(nèi)的酶。舉例而言，n(Cat)是指含有催化酶(Cat)的ΕΝ。呈相同風(fēng)格的η (HRP-GOx-Ιην)是指含有辣根過氧化酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)和轉(zhuǎn)化酶(Inv)的ΕΝ。
[0018]其它縮寫包括:Α0χ:醇氧化酶；ssDNA:單鏈DNA ；EDAC:1_乙基_3-(3_ 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺；NAS:N-羥基丁二酰亞胺酯；DLS:動(dòng)態(tài)光散射；TEM:透射電子顯微術(shù)。
[0019]圖1是通過DNA定向裝配和納米囊封來合成三酶納米復(fù)合物的圖解說明。1.(A)轉(zhuǎn)化酶(Inv)、(B)葡萄糖氧化酶(GOx)和(C)辣根過氧化酶(HRP)與含有其相應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑: (a)乳糖酸、(b)葡糖胺和(C) 4-二甲基氨基安替比林的抑制劑-DNA骨架的自發(fā)裝配，從而導(dǎo)致形成三酶構(gòu)造。I1.通過在空間上收縮酶納米復(fù)合物的薄網(wǎng)狀聚合物的就地增長(zhǎng)進(jìn)行三酶構(gòu)造的穩(wěn)定化；II1.除去DNA骨架，從而導(dǎo)致形成具有顯著增強(qiáng)的穩(wěn)定性和緊密鄰近限定的三酶納米復(fù)合物。所述緊密鄰近構(gòu)造使得它們的反應(yīng)中間體能夠在酶之間主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致反應(yīng)效率顯著增強(qiáng)。
[0020]圖2包括用以顯示酶納米復(fù)合物的結(jié)構(gòu)以及增強(qiáng)的活性和穩(wěn)定性的影像和圖，(a)具有均一尺寸的n(HRP-GOx)的透射電子顯微(TEM)影像。(b)從分別用單一金納米粒子標(biāo)記的HRP和GOx制備的n (HRP-GOx)的TEM影像，所述TEM影像確認(rèn)雙酶納米復(fù)合物構(gòu)造。(c)n(HRP-GOx)以及n(HRP)與n(G0x)的具有相同蛋白質(zhì)含量的混合物的熒光光譜。GOx和HRP分別用FITC和RhB預(yù)先標(biāo)記。在使用Ex=450nm下記錄光譜。(d) (i)n(FITC標(biāo)記的 GOx) (Ex=488nm, Em=510 ~530nm)、(ii)n(RhB 標(biāo)記的 HRP) (Ex=532nm, Em=570 ~600nm)、以及用 FITC 標(biāo)記的 GOx 和 RhB 標(biāo)記的 HRP 合成的 n (HRP-GOx) (Ex=488nm, Em=570 ~600nm)的共焦顯微影像。(e) n (HRP-GOx)、η (HRP-GOx-Ιην)以及它們的天然酶混合物對(duì)應(yīng)物在65°C下的酶穩(wěn)定性的比較。(f)n(HRP-GOx)和η (HRP-GOx-Ιην) (EN)與它們的分別表示為2酶系統(tǒng)和3酶系統(tǒng)的天然酶混合物對(duì)應(yīng)物(游離酶)的轉(zhuǎn)換速率比較。相對(duì)于相應(yīng)天然酶混合物的那些轉(zhuǎn)換速率來歸一化轉(zhuǎn)換速率。(g)在遞增聚(乙二醇)(PEG)濃度下，n (HRP-GOx)與天然HRP和GOx的具有相同酶含量的混合物在磷酸鹽緩沖液(50mM，pH=7.0)中的活性比較。(h)在遞增PEG濃度下，n (HRP-GOx-1nv)與天然HRP、G0x和Inv的具有相同酶含量的混合物的活性比較。用相同酶含量和PEG濃度下的游離酶混合物的活性使相對(duì)活性歸一化。
[0021]圖3呈現(xiàn)含有催化酶的酶納米復(fù)合物的體內(nèi)解毒能力。(a和b)在用n(G0x)、n(GOx)與n(Cat)的混合物、以及n(GOx-Cat)處理之后的細(xì)胞活力測(cè)定。用未處理細(xì)胞的那些細(xì)胞增殖速率使細(xì)胞增殖速率歸一化。通過在37°C下孵育處理的細(xì)胞與CellTiterBlue3小時(shí)來進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定，其中活細(xì)胞還原CellTiter Blue，從而展現(xiàn)高度熒光微紅色。(c和d)用PBS、n (Cat)、H2O2、n (GOx)和n (GOx-Cat)在不同部位處經(jīng)皮注射的小鼠的照片以及從各注射部位獲得的相應(yīng)皮膚組織切片:(i)小鼠皮膚組織切片的蘇木精和曙紅(H&E)染色(原始放大40x)。(ii)小鼠皮膚組織切片中的細(xì)胞凋亡。通過用Cy3綴合的單克隆a-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體(紅色)鑒定的TUNEL染色(綠色)確定細(xì)胞凋亡。DAPI用于核染色(藍(lán)色)。用螢光顯微術(shù)(原始放大200x)評(píng)估和攝影免疫染色的切片。
[0022] 圖4呈現(xiàn)用以顯示經(jīng)口 n (AOx-Cat)醇解毒劑的功效的比較圖。(a)在用單獨(dú)酒精、和酒精連同天然A0x、n (Cat)、n (AOx)、n (AOx)與n (Cat)的混合物、或n (AOx-Cat) 一起管飼之后的小鼠血液酒精濃度(BAC)。用酒精測(cè)試試劑盒測(cè)定BAC。對(duì)于用n(AOx-Cat)處理的小鼠，相較于僅用酒精(EtOH)喂送的小鼠，BAC在3小時(shí)內(nèi)顯著降低(*P〈0.05 ;**P〈0.01)。各組中使用四只小鼠。(b)小鼠的相應(yīng)血漿丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。對(duì)照組中的小鼠用正常食物喂送，其它組小鼠用含有乙醇以及PBS、天然A0x、n(Cat)、n (AOx)、n (AOx)與n(Cat)的混合物、或n (AOx-Cat)的液體飲食管飼。
[0023]圖5顯示用于合成n (HRP-GOx) (a)和n (HRP-GOx-1nv) (b)的DNA-抑制劑骨架。
[0024]圖6顯示在用抑制劑進(jìn)行5’修飾之前(黑色)和之后(灰色)的DNA的MALD1-T0F質(zhì)譜。(a) ssDNA-1和4-氨基安替比林(4-AAP)修飾的ssDNA_l。(b) ssDNA-2和葡糖胺修飾的 ssDNA-2。(c) ssDNA-1 和葡糖胺修飾的 ssDNA-1。(d) ssDNA-1I 和 4-AAP 修飾的 ssDNA-1I。(e) ssDNA-1II 和乳糖酸修飾的 ssDNAIII。(f) ssDNA-1V。
[0025]圖7呈現(xiàn)(a) n (HRP-GOx)(灰色)和n (HRP-GOx-1nv)(黑色)的尺寸分布圖。
[0026]圖8顯示用EtOH和n (AOx-Cat)處理的細(xì)胞與用天然AOx以及n (AOx)與n (Cat)的混合物處理的細(xì)胞的活力比較。
[0027]與圖4類似的圖9顯示也在通過尾部靜脈注射的動(dòng)物中獲得BAC降低。(a)在注射含有 AOx 的納米膠囊(n (AOx)、n (Cat)、n (AOx) +n (Cat)以及 n (AOx-Cat))或天然 AOx之后的小鼠BAC。對(duì)于用n (AOx-Cat)處理的小鼠，BAC在3小時(shí)之前顯著降低(*P〈0.05 ；**P〈0.01 ;相較于僅用酒精(EtOH)喂送的小鼠；在EtOH喂送組中，n=4只小鼠)。(b)用EtOH和納米膠囊處理的小鼠中的ALT。對(duì)照組中的小鼠用正常食物喂送，其它組小鼠用不同樣本(PBS、天然 AOx、n (Cat)、n (AOx)、n (AOx) +n (Cat)混合物以及 n (AOx-Cat))注射，隨后喂送含有EtOH的液體飲食。
[0028]圖10.雙核心酶納米膠囊的結(jié)構(gòu)表征。a.HRP-GOx雙核心納米膠囊的TEM影像。HRP與GOx兩者均用1.4nm金納米粒子單一標(biāo)記。b.包括染料對(duì)的HRPGOx雙核心納米膠囊的熒光光譜。在=490~630nm之后在=450nm(FITC的相應(yīng)消光波長(zhǎng))下記錄光譜。對(duì)應(yīng)于若丹明B的熒光的在=585nm (峰B)下的發(fā)射由在=585nm (峰A)下的FTIC的熒光激發(fā)。c.包括染料對(duì)的HRP-GOx雙核心納米膠囊的共焦顯微術(shù)影像。HRP和GOx分別用若丹明B和FITC標(biāo)記。1.雙核心納米膠囊中的GOx-FITC的熒光影像。在510~530nm下的FITC的熒光之后，通過在=450nm下的FITC的消光來記錄影像。i1.雙核心納米膠囊中的HRP-RhB的熒光影像。在570~600nm下的RhB的熒光之后，通過在=540nm下的RhB的消光來記錄影像。ii1.雙核心納米膠囊中的HRP-RhB(FRET)的熒光影像。在570~600nm下的RhB的熒光之后，通過在=450nm下的FITC的消光來記錄影像。
[0029]圖11.在多核心酶納米膠囊與游離酶系統(tǒng)之間的活性和穩(wěn)定性比較。a.游離酶(黑色)和多核心酶納米膠囊(紅色)的相對(duì)轉(zhuǎn)換速率。在游離酶(對(duì)于雙酶系統(tǒng)而言是HRP/G0X，對(duì)于三酶系統(tǒng)而言是HRP/GOx/Inv)或多核心酶納米膠囊(分別為HRP/GOx雙核心酶納米膠囊和HRP/GOx/Inv三核心酶納米膠囊)存在下,通過各種濃度的底物(對(duì)于雙酶系統(tǒng)而言是葡萄糖且對(duì)于三酶系統(tǒng)而言是蔗糖)，用ODS的氧化速率來確定各系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換速率。游離酶系統(tǒng)和多核心納米膠囊中的酶的濃度與比率兩者均精確相同。所有測(cè)定都在IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)中進(jìn)行b和C。雙酶系統(tǒng)b與三酶系統(tǒng)c在各種濃度的PEG3000磷酸鹽緩沖液(50mM, pH=7.0)中的活性比較。d.[模型]。e和f.游離酶系統(tǒng)和多核心酶納米膠囊在65°C下的熱去活(e.HRP/GOx, f.HRP/GOx/Inv)。
[0030]圖12.a.在尿酸(1.2mg/mL，所有圖片中的黑色晶體KPBSaOyL，用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，i)單獨(dú)尿酸酶(10 μ L，0.0013mg/mL, ii)尿酸酶和催化酶(總計(jì)10 μ L，UOx0.0013mg/mL, Cat0.0026mg/mL, iii)以及尿酸酶-催化酶雙核心納米膠囊(10 μ L, UOx0.0013mg/mL,Cat0.0026mg/mL, iv)存在下，在37°C下孵育2.5h的HeLa細(xì)胞的光學(xué)顯微術(shù)影像。b.單獨(dú)尿酸酶、游離尿酸酶和催化酶以及尿酸酶-催化酶雙核心納米膠囊的相對(duì)轉(zhuǎn)換速率。通過尿酸氧化來測(cè)定轉(zhuǎn)換速率。各系統(tǒng)中的所有尿酸酶濃度都相同，且游離UOx/Cat系統(tǒng)和UOx/Cat雙核心納米膠囊中的催化酶濃度也相同。c.由蛋白酶(胰蛋白酶)對(duì)游離UOx/Cat系統(tǒng)(黑色)和UOx/Cat雙核心納米膠囊(紅色)的去活。d.僅有UOx的系統(tǒng)、游離UOx/Cat系統(tǒng)和UOx/Cat雙核心納米膠囊的細(xì)胞毒性。
【具體實(shí)施方式】
[0031]在描述組合物和方法之前，應(yīng)了解本發(fā)明不限于所述特定方法、方案、細(xì)胞系、測(cè)定和試劑，因?yàn)檫@些可變化。也應(yīng)了解本文所用的術(shù)語(yǔ)意圖描述本發(fā)明的特定實(shí)施方案，且決不意圖限制如隨附權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明的范圍。
[0032]除非另外定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常所理解相同的含義。盡管在實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明中可使用與本文所述的那些方法和材料類似或等效的任何方法和材料，但現(xiàn)將描述優(yōu)選方法、裝置和材料。本文引用的所有技術(shù)和專利出版物均以引用的方式整體并入本文。本文中沒有內(nèi)容應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明由于先前發(fā)明而無權(quán)先于所述公開。
[0033]當(dāng)術(shù)語(yǔ)“約”置于數(shù) 值指示之前時(shí)，所述數(shù)值指示變化⑴或㈠10%、5%或1%。當(dāng)“約”在例如以mg計(jì)的某一數(shù)量之前使用時(shí)，其指示重量值可變化⑴或(_)10%、5%或1%。
[0034]定義[0035]根據(jù)本發(fā)明且如本文所用，除非另外明確陳述，否則以下術(shù)語(yǔ)是用以下含義加以定義。
[0036]除非上下文另外明確規(guī)定，否則如在本說明書和權(quán)利要求書中所用，單數(shù)形式“一”和“所述”包括復(fù)數(shù)個(gè)提及物。舉例而言，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”包括復(fù)數(shù)個(gè)細(xì)胞，包括其混合物。
[0037]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包含”意圖意味組合物和方法包括所述要素，但不排除其它要素?！爸饕伞M成”在用于定義組合物和方法時(shí)將意味排除具有為組合所必需的任何意義的其它要素。舉例而言，主要由如本文定義的要素組成的組合物將不排除不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響所要求的發(fā)明的基本和新型特征的其它要素?！坝伞M成”將意味排除超過痕量的其它成分和所述實(shí)質(zhì)性方法步驟。由這些過渡術(shù)語(yǔ)的各者定義的實(shí)施方案在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0038]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“納米復(fù)合物”是指在至少一維中的尺寸在一納米與數(shù)百納米之間的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，其是指含有任選與聚合物連接的有限數(shù)目的化學(xué)和/或生物分子的結(jié)構(gòu)。
[0039]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“空間約束”是指如酶的粒子相對(duì)于如聚合物網(wǎng)狀物的另一對(duì)象在空間上定位相對(duì)受限。在一些實(shí)施方案中，其是指兩個(gè)或更多個(gè)粒子相對(duì)于彼此具有大致上固定位置。
[0040]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“聚合網(wǎng)狀物”或者“聚合網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)”是指互相連接在彼此內(nèi)和/或之間以形成網(wǎng)或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的一種或多種聚合物。在一些實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物在一個(gè)或多個(gè)位置處錨定于一個(gè)或多個(gè)粒子。
[0041]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“協(xié)同”是指兩種或更多種酶以協(xié)調(diào)方式起作用。一個(gè)實(shí)例是兩種或更多種酶形成酶復(fù)合物，或者同時(shí)與同一底物反應(yīng)以執(zhí)行其活性。在另一實(shí)施方案中，一種酶首先與底物反應(yīng)，從而產(chǎn)生產(chǎn)物，所述產(chǎn)物又是與另一酶反應(yīng)的底物。
[0042]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“代謝路徑”是指發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的一系列化學(xué)反應(yīng)。在各路徑中，通過一系列化學(xué)反應(yīng)來使主要化學(xué)品改性。代謝路徑的清單可從例如KEGG路徑數(shù)據(jù)庫(kù)(在WWW.genome, jp/kegg/pathway.html處可用)公開獲得。此外，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“代謝物”是指的中間體和產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)代謝物通常局限于小分子。代謝物具有各種功能，包括燃料、結(jié)構(gòu)、信號(hào)傳導(dǎo)、對(duì)酶的刺激和抑制作用、其從身的催化活性(通常作為酶的輔因子)、防御以及與其它有機(jī)物(例如色素、氣味劑和信息素)相互作用。初級(jí)代謝物直接涉及于正常生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖中。醇為利用工業(yè)微生物學(xué)大規(guī)模生產(chǎn)的初級(jí)代謝物的一實(shí)例。I生代謝物不盲接渉及于那1?寸稈中，佰通常具有重要生態(tài)學(xué)功能。實(shí)例包括抗生素和色素，如樹脂和萜烯等。一些抗生素使用初級(jí)代謝物作為前體，所述抗生素如從初級(jí)代謝物色氨酸產(chǎn)生的放線菌素。
[0043]多酶納米復(fù)合物
[0044]本公開提供顯示催化效率增強(qiáng)及穩(wěn)定性增加，且同時(shí)在必要時(shí)可降低釋放可對(duì)環(huán)境有毒的中間體的多酶納米復(fù)合物或酶納米復(fù)合物(EN)。
[0045]本文公開的本發(fā)明具有許多實(shí)施方案。本發(fā)明的實(shí)施方案包括含有至少兩種不同酶和聚合物網(wǎng)狀物的納米復(fù)合物。通常，聚合物網(wǎng)狀物錨定于至少一種酶。所述多酶復(fù)合物使得酶能夠協(xié)同執(zhí)行其活性。如實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例中所證明，這些酶復(fù)合物(稱為“酶納米復(fù)合物(EN) ”)展現(xiàn)催化效率增強(qiáng)以及穩(wěn)定性增加。同時(shí)，這些酶復(fù)合物可被設(shè)計(jì)來分解特定化合物，例如在體內(nèi)環(huán)境中可具有毒性的那些化合物(例如過氧化氫)。在一些實(shí)施方案中，酶的活性催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外，復(fù)合物的功能可通過簡(jiǎn)單化學(xué)方法來編程。
[0046]本發(fā)明的實(shí)施方案包括一種包含至少兩種不同酶和聚合網(wǎng)狀物的多酶納米復(fù)合物。通常，聚合物網(wǎng)狀物錨定于至少兩種不同酶的至少一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物錨定于全部至少兩種不同酶。在其它實(shí)施方案中，納米復(fù)合物中的不同酶例如通過互補(bǔ)多核苷酸鏈錨定在一起。
[0047]在本發(fā)明的說明性實(shí)施方案中，至少兩種不同酶彼此共價(jià)或非共價(jià)連接。一方面，共價(jià)鍵聯(lián)在體內(nèi)可降解。另一方面，至少兩種不同酶不彼此連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物包含主要由至少一種單體單元組成的聚合物。在另一實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物包含主要由至少兩種不同單體單元組成的聚合物。在一些實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物進(jìn)一步包含交聯(lián)劑。
[0048]本發(fā)明的實(shí)施方案包括一種多酶納米復(fù)合物，所述多酶納米復(fù)合物包含至少兩種不同酶和可滲透外殼，所述外殼包含錨定于至少兩種不同酶的至少一種的聚合網(wǎng)狀物。在另一實(shí)施方案中，本公開進(jìn)一步提供一種多酶納米復(fù)合物，所述多酶納米復(fù)合物主要由聚合網(wǎng)狀物和至少兩種不同酶組成，所述聚合網(wǎng)狀物共價(jià)錨定于所述至少兩種不同酶的至少一種且提供圍繞所述至少兩種不同酶的可滲透外殼。
[0049]本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案包括一種多酶納米復(fù)合物，所述多酶納米復(fù)合物包含至少兩種不同酶和錨定于所述至少兩種不同酶的至少一種的聚合網(wǎng)狀物，其中所述聚合物網(wǎng)狀物包含交聯(lián)劑。在某些實(shí)施方案中，交聯(lián)劑是可降解交聯(lián)劑。任選地，交聯(lián)劑是包括N, ^-亞甲基雙(丙烯酰胺)、1，4-雙(丙烯酰基)哌嗪、乙二醇二丙烯酸酯、N，N’-(l，2-二羥基-亞乙基)雙丙烯酰胺或聚(乙二醇)二丙烯酸酯的可降解交聯(lián)劑。在某些實(shí)施方案中，交聯(lián)劑是非可降解交聯(lián)劑。任選地，交聯(lián)劑是包含N，N’-雙(丙烯?；?胱胺、甘油二甲基丙烯酸酯、雙[2_( 基丙烯?；趸?乙基]磷酸酯或雙丙烯?；嚯牡姆强山到饨宦?lián)劑。
[0050]本發(fā)明的另一實(shí)施方案是包括以被設(shè)計(jì)來促進(jìn)某些酶促反應(yīng)的方式組合在一起的要素和構(gòu)造(例如要素的特定三維構(gòu)象)的多酶納米復(fù)合物系統(tǒng)。示例性實(shí)施方案包括多酶納米復(fù)合物系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含在與第一底物的第一酶促反應(yīng)中產(chǎn)生第一產(chǎn)物的第一酶、在第二酶促反應(yīng)中與所述第一產(chǎn)物反應(yīng)的第二酶、和被配置來形成囊封所述第一酶和所述第二酶的外殼的聚合網(wǎng)狀物。通常在所述系統(tǒng)中，聚合網(wǎng)狀物展現(xiàn)足以允許第一底物從外殼外部的外部環(huán)境擴(kuò)散至第一酶以便產(chǎn)生第一產(chǎn)物的滲透性。在所述系統(tǒng)中，聚合網(wǎng)狀物也可展現(xiàn)足以允許第一產(chǎn)物擴(kuò)散離開第一酶且到達(dá)第二酶以便發(fā)生第二酶促反應(yīng)的滲透性。在常見系統(tǒng)實(shí)施方案中，第一酶偶合于第二酶，或聚合網(wǎng)狀物偶合于第一酶的多肽或第二酶的多肽。
[0051]本文公開的系統(tǒng)的說明性工作實(shí)施方案包括在與第一底物的第一酶促反應(yīng)中產(chǎn)生過氧化氫的第一酶、在第二酶促反應(yīng)中使過氧化氫轉(zhuǎn)化成水(H2O)和/或氧氣(O2)的第二酶、和被配置來形成囊封所述第一酶和所述第二酶的外殼的聚合網(wǎng)狀物。在所述系統(tǒng)實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物展現(xiàn)足以允許第一底物(例如乙醇)從外殼外部的外部環(huán)境擴(kuò)散至第一酶以便產(chǎn)生過氧化氫的滲透性。這個(gè)實(shí)施方案中的聚合物網(wǎng)狀物被設(shè)計(jì)來進(jìn)一步展現(xiàn)足以允許過氧化氫擴(kuò)散離開第一酶且到達(dá)第二酶以便產(chǎn)生水的滲透性。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，第一酶偶合(偶聯(lián))于第二酶。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，聚合網(wǎng)狀物偶合于第一酶的多肽或第二酶的多肽。
[0052]在本發(fā)明的典型系統(tǒng)中，聚合網(wǎng)狀物以當(dāng)多酶納米復(fù)合物安置于體內(nèi)環(huán)境中時(shí)足以抑制第一酶或第二酶降解的方式囊封第一酶和第二酶。在常見實(shí)施方案中，任選例如通過使用化學(xué)連接子或系鏈(tether)來使第一酶和第二酶偶合在一起。在本文公開的本發(fā)明的某些工作實(shí)施方案中，第一酶和第二酶通過互補(bǔ)多核苷酸鏈偶合在一起。
[0053]廣泛多種酶可用于本發(fā)明的各種實(shí)施方案中。在本文公開的一個(gè)工作實(shí)施方案中，第一酶是醇氧化酶；且第二酶是催化酶。在本文公開的另一工作實(shí)施方案中，第一酶是葡萄糖氧化酶；且第二酶是辣根過氧化酶。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括囊封在聚合網(wǎng)狀物內(nèi)的第三酶(例如醛脫氫酶、醇脫氫酶等)。
[0054]如上所指示，廣泛多種酶可用于本發(fā)明的各種實(shí)施方案中。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括可催化過氧化氫分解成水和/或氧氣的催化酶。催化酶也可通過過氧化氫催化各種代謝物和毒素的氧化，所述代謝物和毒素包括甲醛、甲酸、酚、乙醛和醇。催化酶通常根據(jù)以下反應(yīng)來進(jìn)行此舉:
[0055]H202+H2R — 2H20+R
[0056]可用于本發(fā)明的實(shí)施方案中的許多催化酶多肽在本領(lǐng)域中是熟知的；例如源于以下的催化酶多肽:人紅細(xì)胞(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)C3556)、牛肝(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)C1345)、野牛肝(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)C9447)、黑曲霉(Aspergillus niger)(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)C3515)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)(例如 SIGMA-ALDRICH 產(chǎn)品編號(hào) 02071)、溶壁微球菌(Micrococcus Iysodeikticus)(例如 SIGMA-ALDRICH 產(chǎn)品編號(hào) 60634)等。
[0057]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括過氧化酶。過氧化酶(EC編號(hào)1.11.1.x)是通常催化以下形式的反應(yīng)的酶:
[0058]R00R’ + 電子供體(2e_) +2H+ — ROH+R’ OH
[0059]對(duì)于這些酶中的許多酶，最優(yōu)底物是過氧化氫，但其它酶對(duì)如脂質(zhì)過氧化物的有機(jī)氫過氧化物更具活性。過氧化酶可在其活性位點(diǎn)中含有血紅素輔因子或者氧化還原活性半胱氨酸或硒代半胱氨酸殘基?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案中的許多過氧化酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如源于辣根的過氧化酶多肽(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)P8375)、源于人紅細(xì)胞的谷胱甘肽過氧化酶(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)G4013)等。
[0060]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括醇氧化酶。典型醇氧化酶(EC1.1.3.13)催化化學(xué)反應(yīng):
[0061]伯醇+O2—醛+H2O2
[0062]在這個(gè)說明中，這個(gè)酶的兩種底物是伯醇和O2，且其兩種產(chǎn)物是醛和H202。可用于本發(fā)明的實(shí)施方案中的許多醇氧化酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如源于以下的那些:酵母(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)A6941)、多形漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)(例如SIGMA-ALDRICH目錄編號(hào)A0438)、巴斯德畢赤酵母(Pichea pastoris)(例如MPBIOMEDICALS 目錄編號(hào):190155)等。
[0063]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括醛氧化酶。典型醛氧化酶例如通過在氧氣和水存在下催化醛轉(zhuǎn)化成酸和過氧化氫來自醛產(chǎn)生羧酸:
[0064]醛+H20+02〈=> 羧酸根 +H202+H+[0065]可用于本發(fā)明的實(shí)施方案中的許多醛氧化酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如人重組多肽(例如CYPEX產(chǎn)品編號(hào)CYP150、LABOME產(chǎn)品編號(hào)TP319221)等。
[0066]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括葡萄糖氧化酶。葡萄糖氧化酶是催化葡萄糖氧化成過氧化氫和D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯的氧化還原酶?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案中的許多葡萄糖氧化酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如源于以下的那些:黑曲霉(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)G7141)、樹狀指孢霉(Dactylium dendroides)(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)G7907)等。
[0067]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括例如催化蔗糖水解的轉(zhuǎn)化酶?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案中的許多轉(zhuǎn)化酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如從如酵母的生物體純化的轉(zhuǎn)化酶多肽(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)14504)等。
[0068]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括尿酸氧化酶。尿酸氧化酶或尿酸酶(EC1.7.3.3)是一種催化尿酸酶促氧化成水溶性更大的尿囊素(allantoin)的過氧化物酶體肝酶。尿酸氧化酶是一種見于大多數(shù)哺乳動(dòng)物中但不見于人中的內(nèi)源性酶。尿酸氧化酶在人中用于控制患有急性腫瘤溶解綜合征的患者在接受化學(xué)療法之后的血清尿酸增加。拉布立酶(Rasburicase) (SR29142)作為一種在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)的重組尿酸氧化酶已在處于急性腫瘤溶解綜合征的風(fēng)險(xiǎn)下的兒科和成人患者的隨機(jī)化試驗(yàn)中被證明在控制尿酸方面優(yōu)于別嘌呤醇。此外，尿酸氧化酶用于治療痛風(fēng)?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案中的許多尿酸氧化酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如重組形式(例如拉布立酶)以及源于以下的形式:黃曲霉(Aspergillus flavus)(例如PROSPEC BIO產(chǎn)品編號(hào)ENZ-312)、酵母(例如 WORTHINGTON BIOCHEMICAL 產(chǎn)品編號(hào) LS003857)等。
[0069]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括如乙醛脫氫酶的醛脫氫酶。乙醛脫氫酶(EC1.2.1.10)是催化乙醛轉(zhuǎn)化成乙酸的脫氫酶。乙醛氧化成乙酸可如下加以概述:
[0070]CH3CH0+NAD++CoA —乙?；?CoA+NADH+H+
[0071]在人中，存在許多編碼這個(gè)酶活性的基因，包括ALDH1A1、ALDH2和ALDH1B1 (也稱為ALDH5)。這些酶是更大類別的醛脫氫酶的成員。這個(gè)類型的酶的CAS編號(hào)是[9028-91-5]。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括例如催化醛氧化(脫氫)的醛脫氫酶?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案中的許多醛脫氫酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如重組人醛脫氫酶多肽(例如R&D SYSTEMS產(chǎn)品編號(hào)5869-DH)以及從如酵母的生物體純化的醛脫氫酶多肽(例如 SIGMA-ALDRICH 產(chǎn)品編號(hào) A6338)等。
[0072]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括例如在還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+至NADH)下促進(jìn)醇與醛或酮之間相互轉(zhuǎn)化的醇脫氫酶?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案中的許多醇脫氫酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如純化人醇脫氫酶多肽(例如ARP AMERICANRESEARCH PRODUCTS INC.產(chǎn)品編號(hào)01-1746)、重組人醇脫氫酶多肽(例如MYB10S0URCE目錄編號(hào)MBS203604)以及源于以下的醇脫氫酶多肽:馬科動(dòng)物肝(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)05646)、釀酒酵母(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)A7011)、食清潔劑細(xì)小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)(例如 SIGMA-ALDRICH 產(chǎn)品編號(hào) 75449)等。
[0073]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括例如催化甲酸鹽氧化成碳酸氫鹽的甲酸脫氫酶?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案中的許多甲酸脫氫酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如重組多肽(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)75274)以及從如酵母的生物體純化的甲酸脫氫酶多肽(例如SIGMA-ALDRICH 產(chǎn)品編號(hào) F8649)等。
[0074]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括例如以產(chǎn)生磷酸基團(tuán)和游離葡萄糖的方式水解葡萄糖-6-磷酸的葡萄糖-6-磷酸酶?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案中的許多葡萄糖-6-磷酸酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如從兔肝純化的葡萄糖-6 -磷酸酶多肽(例如SIGMA-ALDRICH 產(chǎn)品編號(hào) G5758)等。
[0075]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括葡萄糖苷酶，例如適用于使糖原降解成葡萄糖者(例如酸性麥芽糖酶)?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案中的許多a-葡萄糖苷酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如重組人a-葡萄糖苷酶a (例如N0VUSB10L0GICALS產(chǎn)品編號(hào)H00023193-P01)以及從如酵母的生物體純化的葡萄糖苷酶多肽(例如SIGMA-ALDRICH產(chǎn)品編號(hào)G0660)等。
[0076]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括糖原分支酶，例如適用于使葡萄糖轉(zhuǎn)化成糖原者?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案中的許多糖原分支酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如重組人a-葡萄糖苷酶a (例如NOVUS B10L0GICALS產(chǎn)品編號(hào)H0002632-P01)以及從如大腸桿菌的生物體純化的葡萄糖苷酶多肽(例如PR0Z0MIX產(chǎn)品編號(hào)PR0-E0406)等。
[0077]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括輔酶A脫氫酶，例如適用于催化脂肪酸0 -氧化的各循環(huán)中的步驟者。可用于本發(fā)明的實(shí)施方案中的許多輔酶A脫氫酶多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如重組人輔酶A脫氫酶多肽(例如MYB10S0URCE目錄編號(hào)MBS142535)等。
[0078]本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包括有機(jī)陽(yáng)離子/肉毒堿(carnitine)轉(zhuǎn)運(yùn)體，例如適用作有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和/或鈉依賴性高親和力肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)體者。可用于本發(fā)明的實(shí)施方案中的許多0CTN2多肽在本領(lǐng)域中是已知的；例如重組人0CTN2 (例如NOVUS B10L0GICALSSLC22A5重組蛋白質(zhì)產(chǎn) 品編號(hào)H00006584-P01)等。
[0079]除以上公開的說明性酶之外，由已知基因(例如本文公開和GENBANK、UniProtKB/Swiss-Prot等中所列的那些)編碼的大量多肽的任一種都可易于通過可商購(gòu)重組蛋白質(zhì)服務(wù)(如由GENSCRIPT提供的那些服務(wù))來制備。
[0080]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物或系統(tǒng)實(shí)施方案配置在包括容器和使用多酶納米復(fù)合物系統(tǒng)的說明書的試劑盒中。任選在所述試劑盒中，系統(tǒng)與一種或多種適合用于經(jīng)口施用的制劑中的填充劑、粘合劑或緩沖劑組合。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)與一種或多種適合用于胃腸外施用的制劑中的填充劑、粘合劑或緩沖劑組合。
[0081]本發(fā)明的實(shí)施方案包括制品和/或試劑盒，例如含有適用于體內(nèi)分解如過氧化氫的某些化合物的物質(zhì)的那些制品和/或試劑盒。任選地，制品和/或試劑盒可含有適用于治療如急性醇中毒的病理學(xué)病狀的物質(zhì)。在本發(fā)明的典型實(shí)施方案中，試劑盒包括至少一個(gè)通常具有標(biāo)簽的容器。適合容器包括例如泡罩包裝、瓶、小瓶和試管。容器可由如金屬(例如金屬箔)、玻璃或塑料的多種材料形成。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)容器容納一種或多種具有有效用于成像技術(shù)中的活性劑的組合物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)容器容納一種或多種具有有效治療如急性醇中毒的病理學(xué)病狀的活性藥劑的組合物。通常，一個(gè)或多個(gè)容器上的標(biāo)簽指示一種或多種組合物用于治療某一病理學(xué)病狀。所述標(biāo)簽也可指示供體內(nèi)或體外使用的用法，如本文所述的那些用法。本發(fā)明的試劑盒也可包括上述一個(gè)或多個(gè)容器和包括緩沖劑的另一容器。試劑盒可進(jìn)一步包括從商業(yè)及使用者觀點(diǎn)看來合乎需要的其它材料，包括其它緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器和具有使用說明書的包裝插頁(yè)。
[0082]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本文公開的組合物或酶納米復(fù)合物系統(tǒng)被配制成被設(shè)計(jì)來改善或治療如醇毒性的病理學(xué)病狀的藥劑。舉例而言，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本文公開的組合物或酶納米復(fù)合物系統(tǒng)被配制成被設(shè)計(jì)來預(yù)防如醇毒性的病理學(xué)病狀的藥劑。藥劑可通過通常用于施用藥劑的常規(guī)途徑施用，所述途徑包括但不限于經(jīng)口、腸胃外(包括皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)和髓內(nèi))、腹膜內(nèi)、經(jīng)粘膜(包括經(jīng)鼻)、經(jīng)皮、經(jīng)直腸和表面(包括經(jīng)皮膚、經(jīng)頰、舌下和眼內(nèi))途徑。靜脈內(nèi)遞送可通過團(tuán)式注射或通過輸注來進(jìn)行；輸注可歷經(jīng)小于I分鐘至數(shù)小時(shí)至連續(xù)的范圍內(nèi)的時(shí)期進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，治療過程將涉及通過各途徑的組合來進(jìn)行施藥。
[0083]藥劑可通過靜脈內(nèi)途徑與經(jīng)口途徑的組合來施用以治療疼痛或另一病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，“裝載”劑量可靜脈內(nèi)(IV)施用以使藥物濃度達(dá)到所要治療含量，隨后通過經(jīng)口途徑施用一個(gè)或多個(gè)維持劑量來維持所述治療含量。藥劑可以多種形式以藥物組合物形式施用，所述多種形式包括但不限于液體、粉末、混懸液、片劑、丸劑、膠囊、噴霧劑和氣霧劑。藥物組合物可包括各種藥學(xué)上可接受的添加劑，包括但不限于載體、賦形劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、抗微生物劑、抗氧化劑、稀釋劑和/或補(bǔ)充劑。適合賦形劑和載體的實(shí)例例如描述于“Remington’s Pharmaceutical Sciences, ^ack Pub.C0.;第 17版 New Jersey (2011)中。在一些實(shí)施方案中，藥劑可以糖水溶液形式通過IV輸注施用。藥劑也可與促進(jìn)藥劑遞送的另一物質(zhì)締合。舉例而言，藥劑可被締合入脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體又可與如IgGFc受體的靶向物質(zhì)綴合。
[0084]適于經(jīng)口施用的本文公開的化合物的制劑可提供為如各自含有預(yù)定量的活性成分的膠囊、扁囊劑或片劑的離散單位；粉末或顆粒；在水性液體或非水性液體中的溶液或混懸液；或水包油液體乳劑或油包水液體乳劑?；钚猿煞忠部商峁橥鑴?bolus)，藥糖劑(electuary)或糊劑?？山?jīng)口使用的醫(yī)藥制劑包括片劑、由明膠制得的推-合(push-fit)膠囊以及由明膠和增塑劑(如甘油或山梨糖醇)制得的密封軟膠囊?？扇芜x與一種或多種輔助成分一起通過壓制或模制來制備片劑。壓制片劑可通過在適合機(jī)器中壓制任選與粘合劑、惰性稀釋劑、或潤(rùn)滑劑、表面活性劑或分散劑混合的，呈自由流動(dòng)形式(如粉末或顆粒)的活性成分來制備。模制片劑可通過在適合機(jī)器中模制用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的粉末狀化合物的混合物來制備。片劑可以任選被包覆或刻痕(scored)且可被配制以提供其中活性成分的緩慢或控制釋放。所有經(jīng)口施用的制劑都應(yīng)具有適合所述施用的劑量。推-合膠囊可含有活性成分與填充劑(如乳糖)、粘合劑(如淀粉)和/或潤(rùn)滑劑(如滑石或硬脂酸鎂)和任選穩(wěn)定劑的混合物。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或混懸于適合液體，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。此外，可添加穩(wěn)定劑。提供具有適合包衣的糖衣片核。為此，可使用濃縮糖溶液，其可任選含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡巴普凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和適合有機(jī)溶劑或溶劑混合物?？上蚱瑒┗蛱且缕轮刑砑尤玖匣蛏匾澡b定或表征活性化合物劑量的不同組合。
[0085]可配制用于通過注射(例如通過團(tuán)式注射或連續(xù)輸注)進(jìn)行腸胃外施用的化合物。用于注射的制劑可與添加的防腐劑一起以單位劑型例如提供在安瓿中或在多劑量容器中。組合物可采用如于油性或水性媒介物中的混懸液、溶液或乳劑的形式，且可含有配制齊?，如混懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。制劑可提供于單劑量或多劑量容器，例如密封安瓿和小瓶中，且可以粉末形式或以冷凍干燥(凍干)狀態(tài)儲(chǔ)存，僅需要在使用之前即刻添加無菌液體載體，例如生理鹽水或無菌無熱原水。即時(shí)注射溶液及混懸液可從先前所述種類的無圃粉末、顆粒和片劑制備。
[0086]用于腸胃外施用的制劑包括活性化合物的水性和非水性(油性)無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑和致使制劑與預(yù)定接受者的血液等張的溶質(zhì)；及水性和非水性無菌混懸液，其可包括混懸劑和增稠劑。適合親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油(如芝麻油)或合成脂肪酸酯(諸如油酸乙酯或三酸甘油酯)或脂質(zhì)體。水性注射混懸液可含有增加混懸液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，混懸液也可含有適合穩(wěn)定劑或增加化合物溶解性以允許制備高度濃縮溶液的試劑。
[0087]填充劑或稀釋劑的實(shí)例不加限制地包括乳糖、甘露糖醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、可壓制糖、微晶纖維素(MCC)、粉末狀纖維素、玉米淀粉、預(yù)膠凝淀粉、葡萄糖結(jié)合劑、葡聚糖、糊精、右旋糖、麥芽糖糊精、碳酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈣、硫酸鈣、碳酸鎂、氧化鎂、泊洛沙姆(poloxamer)(諸如聚氧化乙烯)及羥丙基甲基纖維素。填充劑可具有復(fù)合溶劑分子，如在所用乳糖為乳糖單水合物的情況下?？蛇m合與本文組合物的實(shí)施方案一起使用的崩解劑不加限制地包括淀粉乙醇酸鈉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、聚維酮、交聯(lián)聚維酮(聚乙烯聚吡咯烷酮)、甲基纖維素、微晶纖維素、粉末狀纖維素、低取 代的羥丙基纖維素、淀粉、預(yù)膠凝淀粉和海藻酸鈉。待用于本文組合物中的片劑粘合劑不加限制地包括阿拉伯膠、海藻酸、卡波姆(carbomer)、羧甲基纖維素鈉、糊精、乙基纖維素、明膠、瓜爾膠(guar gum)、氫化植物油、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、共聚維酮、甲基纖維素、液體葡萄糖、麥芽糖糊精、聚甲基丙烯酸酯、聚維酮、預(yù)膠凝淀粉、海藻酸鈉、淀粉、蔗糖、黃蓍和玉米蛋白(zein)。
[0088]添加如酸、堿或緩沖劑的pH調(diào)節(jié)劑也可是有益的，此會(huì)延緩或增強(qiáng)組合物的溶解速率，或者有助于提高組合物的化學(xué)穩(wěn)定性。此外，考慮到所述制劑的類型，本文提供的制劑可包括本領(lǐng)域中的其它常規(guī)試劑。適合制劑依賴于所選施藥途徑。當(dāng)適合時(shí)且如本領(lǐng)域中所了解，可使用任何熟知技術(shù)、載體和賦形劑；例如Remington (上文)中的技術(shù)、載體和賦形劑。藥物組合物可以自身已知的方式制造，例如借助于常規(guī)混合、溶解、?；?、糖衣片制備、磨細(xì)、乳化、囊封、包埋或壓制過程。
[0089]如由本發(fā)明的工作實(shí)施方案所示，緊密鄰近構(gòu)造賦予EN以顯著增強(qiáng)的催化效率。這由蔗糖和葡萄糖的由轉(zhuǎn)化酶(Inv)、葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根過氧化酶(HRP)介導(dǎo)的連續(xù)反應(yīng)所證明。通過GOx介導(dǎo)的反應(yīng)，直接添加在反應(yīng)介質(zhì)中或由Inv介導(dǎo)的蔗糖水解產(chǎn)生的葡萄糖被氧化，從而導(dǎo)致產(chǎn)生H202。產(chǎn)生的H2O2接著進(jìn)一步通過HRP介導(dǎo)的反應(yīng)使鄰聯(lián)茴香胺(o-dianisidine)氧化。本發(fā)明的構(gòu)造的獨(dú)特性不僅在納米復(fù)合物內(nèi)的多種酶能夠在空間上彼此限定方面，而且在所述空間限定協(xié)同地(協(xié)同地(synergistically))而非拮抗地起作用方面。
[0090]如實(shí)施例1中所示，n (HRP-GOx)和n (HRP-GOx-1nv)的轉(zhuǎn)換速率(鄰聯(lián)茴香胺氧化速率)相較于其具有相同酶含量的天然酶混合物的轉(zhuǎn)換速率分別提高5和15倍，從而確認(rèn)催化效率增強(qiáng)。如本公開整篇所用，酶納米復(fù)合物(EN)表示為n(酶)，其中括號(hào)內(nèi)的酶是指納米復(fù)合物的核心內(nèi)的酶。舉例而言，H(Cat)是指含有催化酶(Cat)的EN且n (HRP-GOx-1nv)是指含有辣根過氧化酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)和轉(zhuǎn)化酶(Inv)的EN。[0091]此外，在作為模擬細(xì)胞或血流內(nèi)的粘稠環(huán)境的條件的35wt_%聚乙二醇(PEG，Mw約3000)存在下，相較于相應(yīng)酶混合物，n (HRP-GOx)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)換速率增加34倍。類似地，n (HRP-GOx-1nv)顯示在PEG溶液中的相對(duì)轉(zhuǎn)換速率增強(qiáng)多達(dá)24倍。
[0092]此外，也已觀察到EN中的酶的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。如圖2e中所示，在65°C下孵育60分鐘之后，n (HRP-GOx)和n (HRP-GOx-1nv)分別保留70%和75%的殘余酶活性。在相同條件下，游離酶損失其活性超過98%。
[0093]更進(jìn)一步，EN釋放的中間體小于游離酶混合物。在GOx和Cat的情況下，中間體包括具有毒性且可對(duì)器官和組織造成損害的&02。實(shí)施例1中的體外數(shù)據(jù)顯示單獨(dú)GOx在與細(xì)胞一起孵育時(shí)，由于由GOx介導(dǎo)的葡萄糖氧化產(chǎn)生的H2O2而導(dǎo)致細(xì)胞活力損失90%。當(dāng)與Cat—起共孵育時(shí)，損失降低至58%。然而，在n (GOx-Cat)存在下，所述損失顯著降低至9%。也在體內(nèi)觀察到由皮膚損害量度的類似結(jié)果。
[0094]實(shí)施例1中也顯示含有醇氧化酶(AOx)和催化酶(Cat)的酶納米復(fù)合物n(AOx-Cat)以及所述納米復(fù)合物作為醇解毒劑的潛力。體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩者均顯示n(AOx-Cat)代謝醇和減輕醇誘導(dǎo)的肝損害，同時(shí)使毒性副產(chǎn)物H2O2的釋放最小的顯著作用。因此，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)明確顯示本公開的酶納米復(fù)合物(EN)實(shí)現(xiàn)催化效率增強(qiáng)和穩(wěn)定性增加，且同時(shí)在必要時(shí)可降低可對(duì)環(huán)境有毒的如H2O2的中間體的釋放。因此，本公開的一個(gè)實(shí)施方案提供一種納米復(fù)合物，所述納米復(fù)合物包含兩種或更多種包括第一酶和第二酶的酶以及錨定于所述酶的至少一種、或者至少兩者或三者或四者或五者或全部的聚合網(wǎng)狀物，其中所述酶在空間上由所述聚合網(wǎng)狀物約束且各酶協(xié)同地與底物反應(yīng)。
[0095]在一個(gè)實(shí)施方案中，協(xié)同地與底物反應(yīng)意圖意味酶以協(xié)調(diào)方式直接或間接與底物反應(yīng)。一方面，酶依序與底物反應(yīng)。在這個(gè)方面，第一酶可首先與底物反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化成一種或多種產(chǎn)物，如使底物與另一分子整合且使其降解成一個(gè)以上分子。第二酶接著與一種或多種產(chǎn)物反應(yīng)。換句話說，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一酶的產(chǎn)物是第二酶的底物。
[0096]或者，第一酶和第二酶可同時(shí)與底物反應(yīng)。本領(lǐng)域中熟知的是酶可形成復(fù)合物且通過復(fù)合物執(zhí)行其功能。在一些情況下，酶可仍然充當(dāng)基團(tuán)而不形成物理復(fù)合物，如酶和其輔因子。另一實(shí)例是許多酶同時(shí)與如DNA和RNA的核酸相互作用以實(shí)現(xiàn)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯，而彼此不具有直接物理或功能關(guān)系。就本公開而言，涵蓋所有這些酶組合。
[0097]在任何以上公開內(nèi)容中，納米復(fù)合物進(jìn)一步包括第三酶、第四酶和/或第五酶等。各額外酶可執(zhí)行與納米復(fù)合物中的另一酶的連續(xù)反應(yīng)，或同時(shí)與另一酶一起起作用。
[0098]在一些實(shí)施方案中，納米復(fù)合物中的兩種或更多種酶屬于代謝路徑。代謝路徑在本領(lǐng)域中是已知的且在本文中進(jìn)一步加以描述。代謝路徑的非限制性實(shí)例包括糖酵解/葡糖異生路徑、檸檬酸循環(huán)(tea循環(huán))路徑、戊糖磷酸路徑、戊糖和葡糖醛酸相互轉(zhuǎn)化路徑、果糖和甘露糖代謝路徑、半乳糖代謝路徑、抗壞血酸和醛糖二酸代謝路徑、淀粉和蔗糖代謝路徑、氨基糖和核苷酸糖代謝路徑、丙酮酸代謝路徑、乙醛酸和二羧酸代謝路徑、丙酸代謝路徑、丁酸代謝路徑、c5分支二元酸代謝路徑、肌醇磷酸代謝路徑、氧化磷酸化路徑、光合路徑、光合-觸角蛋白質(zhì)路徑、光合生物體路徑中的碳固定、原核生物路徑中的碳固定路徑、甲烷代謝路徑、氮代謝路徑、硫代謝路徑、脂肪酸生物合成路徑、脂肪酸延伸路徑、脂肪酸代謝路徑、酮體合成和降解路徑、角質(zhì)、軟木脂和蠟生物合成新！路徑、類固醇生物合成路徑、初級(jí)膽汁酸生物合成路徑、次級(jí)膽汁酸生物合成路徑、類固醇激素生物合成路徑、甘油脂質(zhì)代謝路徑、甘油磷酸脂質(zhì)代謝路徑、醚脂質(zhì)代謝路徑、鞘脂代謝路徑、花生四烯酸代謝路徑、亞麻油酸代謝路徑、a -次亞麻油酸代謝路徑和不飽和脂肪酸生物合成路徑。
[0099]代謝路徑的其它非限制性實(shí)例包括嘌呤代謝路徑、嘧啶代謝路徑、丙氨酸、天冬氨酸和合氨酸代謝路徑、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝路徑、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝路徑、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解路徑、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成路徑、賴氨酸生物合成路徑、賴氨酸降解路徑、精氨酸和脯氨酸代謝路徑、組氨酸代謝路徑、酪氨酸代謝路徑、苯丙氨酸代謝路徑、色氨酸代謝路徑、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成路徑、3 -丙氨酸代謝路徑、?；撬岷蛠喤；撬岽x路徑、膦酸和亞膦酸代謝路徑、硒基化合物代謝路徑、氰基氨基酸代謝路徑、D-谷氨酰胺和d-谷氨酸代謝路徑、D-精氨酸和d-鳥氨酸代謝路徑、D-丙氨酸代謝路徑和谷胱甘肽代謝路徑。
[0100]代謝路徑的其它非限制性實(shí)例包括n-聚糖生物合成路徑、各種類型的n-聚糖生物合成路徑、粘蛋白型O-聚糖生物合成路徑、其它類型的O-聚糖生物合成路徑、糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素路徑、糖胺聚糖生物合成-硫酸乙酰肝素路徑、糖胺聚糖生物合成-硫酸角質(zhì)素路徑、糖胺聚糖降解路徑、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨蛋白生物合成路徑、糖鞘脂生物合成-乳糖和新乳糖系列路徑、糖鞘脂生物合成-紅細(xì)胞系列路徑、糖鞘脂生物合成-神經(jīng)節(jié)系列路徑、脂多糖生物合成路徑、肽聚糖生物合成路徑、其它聚糖降解路徑、硫胺代謝路徑、核黃素代謝路徑、維生素B6代謝路徑、煙堿酸和煙堿酰胺代謝路徑、泛酸和CoA生物合成路徑、生物素代謝路徑、硫辛酸代謝路徑、葉酸生物合成路徑、通過葉酸路徑產(chǎn)生的一碳池、視黃醇代謝路徑、卟啉和葉綠素代謝路徑、以及泛醌和其它類萜-醌生物合成路徑。
[0101]此外，代謝路徑的其它非限制性實(shí)例包括類萜骨架生物合成路徑、類單萜生物合成路徑、類倍半萜生物合成路 徑、類二萜生物合成路徑、類胡蘿卜素生物合成路徑、油菜素類固醇(brassinosteroid)生物合成路徑、昆蟲激素生物合成路徑、玉米素生物合成路徑、檸檬烯和菔烯降解路徑、香葉醇(geraniol)降解路徑、I型聚酮結(jié)構(gòu)路徑、12、14和16元大環(huán)內(nèi)酯路徑、安沙霉素(ansamycin)生物合成路徑、II型聚酮骨架生物合成路徑、II型聚酮產(chǎn)物生物合成路徑、四環(huán)素生物合成路徑、聚酮糖單位生物合成路徑、非核糖體肽結(jié)構(gòu)路徑、鐵載體群組非核糖體肽生物合成路徑、萬古霉素群組抗生素生物合成路徑、類苯丙烷生物合成路徑、類苗(stilbenoid)、類二芳基庚燒(diarylheptanoid)和姜醇生物合成路徑、類黃酮生物合成路徑、黃酮和黃酮醇生物合成路徑、花青素生物合成路徑、異類黃酮生物合成路徑、吲哚生物堿生物合成路徑、異喹啉生物堿生物合成路徑、莨菪烷(tropane)、哌啶和吡啶生物堿生物合成路徑、吖啶酮生物堿生物合成路徑、咖啡堿代謝路徑、甜菜紅堿(betalain)生物合成路徑、葡糖異硫氰酸生物合成路徑、類苯并噁嗪生物合成路徑、青霉素和頭孢菌素生物合成路徑、(6-內(nèi)酰胺抗性路徑、鏈霉素生物合成路徑、丁酰苷菌素和新霉素生物合成路徑、棒酸(clavulanic acid)生物合成路徑、嘌呤霉素(puromycin)生物合成路徑和新生霉素生物合成路徑。
[0102]此為，代謝路徑的其它非限制性實(shí)例包括苯甲酸降解路徑、氨基苯甲酸降解路徑、氟苯甲酸降解路徑、氯烷和氯烯降解路徑、氯環(huán)己烷和氯苯降解路徑、甲苯降解路徑、二甲苯降解路徑、硝基甲苯降解路徑、乙苯降解路徑、苯乙烯降解路徑、莠去津(atrazine)降解路徑、己內(nèi)酰胺降解路徑、DDT降解路徑、雙酚降解路徑、二氧雜環(huán)己烯降解路徑、萘降解路徑、多環(huán)芳烴降解路徑、通過細(xì)胞色素P450實(shí)現(xiàn)的生物異源物質(zhì)代謝路徑以及藥物代謝-細(xì)胞色素P450路徑。
[0103]代謝路徑也可包括MAPK信號(hào)傳導(dǎo)路徑、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)路徑-蒼蠅路徑、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)路徑-酵母路徑、ErbB信號(hào)傳導(dǎo)路徑、wnt信號(hào)傳導(dǎo)路徑、notch信號(hào)傳導(dǎo)路徑、刺猬信號(hào)傳導(dǎo)路徑、TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)路徑、VEGF信號(hào)傳導(dǎo)路徑、Jak-STAT信號(hào)傳導(dǎo)路徑、鈣信號(hào)傳導(dǎo)路徑、磷脂酰肌醇信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)路徑、mTOR信號(hào)傳導(dǎo)路徑、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑、造血細(xì)胞譜系路徑、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)路徑、toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)路徑、NOD樣受體信號(hào)傳導(dǎo)路徑、RIG-1樣受體信號(hào)傳導(dǎo)路徑、細(xì)胞溶質(zhì)DNA感覺路徑、天然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性路徑、抗原加工和遞呈路徑、T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)路徑、B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)路徑、Fe ε RI信號(hào)傳導(dǎo)路徑、Fe Y R介導(dǎo)的吞噬路徑、白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移路徑、用于產(chǎn)生IgA的腸免疫網(wǎng)絡(luò)路徑以及趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)路徑。
[0104]在一特定實(shí)施方案中，兩種或更多種酶包括辣根過氧化酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOx)。在另一實(shí)施方案中，兩種或更多種酶包括辣根過氧化酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)和轉(zhuǎn)化酶(Inv)。在另一實(shí)施方案中，兩種或更多種酶包括葡萄糖氧化酶(GOx)和催化酶(Cat) ο在另一實(shí)施方案中，兩種或更多種酶包括醇氧化酶(AOx)和催化酶(Cat)。
[0105]在一些實(shí)施方案中，如沿納米復(fù)合物的最長(zhǎng)軸所測(cè)量，納米復(fù)合物的長(zhǎng)度是約5nm至約2000nm。尺寸可視納米復(fù)合物中的酶的尺寸和數(shù)目以及聚合物網(wǎng)狀物的特征而變化。在一些實(shí)施方案中，納米復(fù)合物的長(zhǎng)度是至少約10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、lOOnm、125nm、150nm、175nm、200nm、250nm、300nm、400nm 或 500nm。在某一實(shí)施方案中，納米復(fù)合物的長(zhǎng)度僅為約50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、250nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nml500nm 或2000nm。 [0106]視復(fù)合物中的酶的尺寸、形狀和數(shù)目而定，納米復(fù)合物可具有任何形狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，納米復(fù)合物是大致上圓形。在另一實(shí)施方案中，納米復(fù)合物是大致上卵形、球形、圓柱樣或金字塔樣。
[0107]在一些實(shí)施方案中，聚合物網(wǎng)狀物在總計(jì)至少1、2、3、4、5、7、10、15或20個(gè)位置處
錨定于酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物網(wǎng)狀物錨定于至少兩種酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物網(wǎng)狀物至少在2或3或4或6個(gè)位置處錨定于各酶。意圖不需要納米復(fù)合物中的每種酶都與聚合物網(wǎng)狀物錨定以有效約束納米復(fù)合物中的酶。舉例而言，對(duì)于三種或更多種酶，當(dāng)其中兩者與聚合物網(wǎng)狀物錨定時(shí)，其它酶可借助于其相對(duì)于所錨定酶的位置加以約束。所述特定約束可通過(但并不要求)酶之間的鍵結(jié)來增強(qiáng)。也意圖聚合物網(wǎng)狀物可僅錨定于納米復(fù)合物中的一種酶且仍然借助于其它酶與錨定于聚合物網(wǎng)狀物者的締合實(shí)現(xiàn)對(duì)納米復(fù)合物中的酶的空間約束。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物網(wǎng)狀物錨定于納米復(fù)合物中的每種酶。
[0108]聚合物網(wǎng)狀物可通過任何力，如但不限于共價(jià)鍵、氫鍵、離子力、疏水性鍵合和范德華(Van der Wall)力來錨定于酶。在某些實(shí)施方案中，錨定中涉及多種力。在一些實(shí)施方案中，并非所有錨定位置都采用相同類型的力。
[0109]出于錨定聚合物網(wǎng)狀物的目的，在一個(gè)實(shí)施方案中，納米復(fù)合物中的兩種或更多種酶具有多個(gè)可聚合基團(tuán)。可聚合基團(tuán)是在某些化學(xué)條件下聚合的化學(xué)部分。聚合條件的實(shí)例包括光聚合、自由基聚合和催化劑誘導(dǎo)的聚合。一般而言，可聚合基團(tuán)的類型并不關(guān)鍵，只要可聚合基團(tuán)能夠與用于形成納米復(fù)合物的單體聚合即可。可聚合基團(tuán)的實(shí)例包括通過光聚合或自由基聚合加以聚合的含雙鍵部分。在一些實(shí)施方案中，可聚合基團(tuán)是乙烯基、丙烯酰基、烷基丙烯酰基(即具有烷基取代基的丙烯?；缂谆；?。如本文所用，丙烯?；?烷基丙烯?；?、甲基丙烯?；?包括丙烯?；艴ヒ约氨；０?。在一些實(shí)施方案中，可聚合基團(tuán)是共價(jià)鍵結(jié)于酶的賴氨酸殘基的丙烯?；?br> [0110]酶可含有可易于修飾的許多不同表面氨基酸。舉例而言，賴氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、組氨酸、精氨酸、酪氨酸、脯氨酸和色氨酸可易于使用已知方法和程序進(jìn)行修飾。用于修飾蛋白質(zhì)的試劑將具有至少一個(gè)可聚合基團(tuán)和至少一個(gè)與蛋白質(zhì)表面上的氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)。用于與氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)的實(shí)例包括與含有胺(如賴氨酸)和羥基(如蘇氨酸或絲氨酸)的殘基反應(yīng)的活化酯(如酰鹵或N-羥基丁二酰亞胺酯)；與含有硫醇(如半胱氨酸)的殘基反應(yīng)的順丁烯二酰亞胺；以及當(dāng)用某些偶合試劑活化時(shí)與含有羧酸(如谷氨酸和天冬氨酸)的殘基反應(yīng)的胺。以這個(gè)方式，可聚合基團(tuán)共價(jià)鍵結(jié)于單一酶?？删酆匣鶊F(tuán)可直接鍵結(jié)或通過連接子連接。
[0111]離子鍵可用于由于存在某些氨基酸的正電荷或負(fù)電荷而在一或多種酶上錨定聚合物網(wǎng)狀物，所述氨基酸如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸和賴氨酸以及被修飾以具有電荷的氨基酸。
[0112]在一些實(shí)施方案中，連接子存在于酶與可聚合基團(tuán)之間。連接子是分隔可聚合基團(tuán)和酶的化學(xué)部分。用作連接子的試劑將具有由連接子分隔的至少一個(gè)可聚合基團(tuán)和至少一個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)。反應(yīng)性基團(tuán)通常通過與蛋白質(zhì)表面上的氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)，從而使可聚合基團(tuán)共價(jià)鍵結(jié)于單一酶(在它們之間具有連接子)來與酶反應(yīng)。
[0113]在一些實(shí)施方案中，連接子可為可降解的?？山到膺B接子是在某些條件下裂解的化學(xué)部分。舉例而言，可降解連接子可例如在某些PH值(高pH或低pH)下水解，或可被光解(即當(dāng)用某些波長(zhǎng)的光照射時(shí))、或在某些溫度下、在氧化還原條件下或以酶促方式(即通過蛋白酶)裂解?？墒褂萌魏芜m合可降解連接子，只要連接子具有與酶反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)和形成納米復(fù)合物的可聚合基團(tuán)即可?？山到膺B接子也應(yīng)在納米復(fù)合物聚合期間穩(wěn)定?？苫谶B接子將被裂解所處的條件選擇連接子的類型。眾多連接子是已知的，且將易于為一般技術(shù)人員顯而易知。
[0114]這些納米復(fù)合物中的酶比呈其天然非復(fù)合形式的酶更穩(wěn)定。測(cè)定就酶活性隨時(shí)間損失或酶降解或變性而言的穩(wěn)定性。在一些實(shí)施方案中，納米復(fù)合物對(duì)由蛋白酶進(jìn)行的降解具有抗性。聚合物網(wǎng)狀物使酶對(duì)蛋白酶的暴露降低。因此，在蛋白酶(例如在體內(nèi)、在血清中或在細(xì)胞中)存在下，酶活性比未保護(hù)的天然酶持續(xù)更久。聚合物網(wǎng)狀物使酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且防止酶聚集。因此，納米復(fù)合物對(duì)PH和溫度變化更具有抗性。舉例而言，在室溫或低溫(即冷藏或冷凍)下，納米復(fù)合物比天然酶具有更長(zhǎng)儲(chǔ)存壽命。同樣，在多個(gè)冷凍/解凍循環(huán)之后，納米復(fù)合物損失活性的可能性小于天然酶。因?yàn)槊傅慕Y(jié)構(gòu)由聚合物網(wǎng)狀物加以穩(wěn)定，所以納米復(fù)合物對(duì)有機(jī)溶劑和表面活化劑更具有抗性。
[0115]也可調(diào)整聚合物網(wǎng)狀物以增加在有機(jī)溶劑中的溶解性。可與納米復(fù)合物一起使用的有機(jī)溶劑和表面活化劑的實(shí)例包括尤其廣泛用于化妝品(即化妝)和醫(yī)藥中的甲醇、乙醇、異丙醇、二甲亞諷、四氫!咲喃、4_ 二氣苯、對(duì)二氣苯、1，4_ 二惡燒、1，4_ 二惡燒PEG、聚乙烯、聚乙二醇、聚氧化乙烯、十二烷基硫酸鈉或人參醇(oxynol)、聚山梨醇酯60、2_溴代_2_硝基丙烷-1, 3- 二醇、2- 丁氧基-1-乙醇、烷基苯氧基、聚乙氧基乙醇。其它有機(jī)溶劑將為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員顯而易知。因?yàn)榫酆衔锞W(wǎng)狀物防止聚集，所以納米復(fù)合物在未保護(hù)的酶傾向于聚集所處的界面(即氣體/液體或液體/固體)處更穩(wěn)定。
[0116]在一些實(shí)施方案中，納米復(fù)合物是兩種或更多種與單體單元共聚合的酶。單體單元是與單一酶聚合且形成共聚物，從而形成納米復(fù)合物的聚合物網(wǎng)狀物的化學(xué)部分。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)酶攜帶具有雙鍵的可聚合基團(tuán)，如乙烯基、丙烯酰基、烷基丙烯酰基或甲基丙烯?；鶗r(shí)，單體單元也具有具有雙鍵的可聚合基團(tuán)，如乙烯基、丙烯?；⒈０坊?、烷基丙烯?；⑼榛０坊?、甲基丙烯酰基或甲基丙烯酰胺基。酶的可聚合基團(tuán)與單體單元的可聚合基團(tuán)可相同或不同，只要其能夠在用于形成納米復(fù)合物的條件下形成共聚物即可。舉例而言，乙烯基和丙烯?；稍谧杂苫酆蠗l件下形成共聚物。
[0117]在一些實(shí)施方案中，納米復(fù)合物是兩種或更多種與兩種或更多種不同單體單元共聚合的酶。一般而言，許多不同單體單元可用于與酶形成共聚物，只要不同單體單元都能夠在用于形成納米復(fù)合物的條件下形成共聚物即可。具有不同側(cè)鏈的單體單元可用于改變納米復(fù)合物的表面特征。可通過調(diào)整不同單體單元之間的比率來控制表面特征。在一些實(shí)施方案中，單體可為中性、不帶電荷、親水性、疏水性、帶正電荷或帶負(fù)電荷的。在一些實(shí)施方案中，聚合物網(wǎng)狀物總體上是中性、不帶電荷、親水性、疏水性、帶正電荷或帶負(fù)電荷的?？衫缤ㄟ^改變帶電荷和不帶電荷、或親水性或疏水性單體單元之間的比率來調(diào)整納米復(fù)合物的溶解性。在一些實(shí)施方案中，納米復(fù)合物具有正電荷或負(fù)電荷。
[0118]在一些實(shí)施方案中，至少一種單體單元在生理pH(約7.4)下具有正電荷或負(fù)電荷。通過使用在pH=7.4下具有電荷的單體單元,可通過改變帶電荷和不帶電荷單體單元的比率來改變及調(diào)整納米復(fù)合物 的總體電荷。在一些實(shí)施方案中，單體單元在pH=7.4下具有正電荷。使用帶正電荷單體單元使得能夠形成具有正電荷的納米復(fù)合物。可通過改變中性和帶正電荷單體單元的比率來調(diào)整電荷。
[0119]在一些實(shí)施方案中，聚合物網(wǎng)狀物進(jìn)一步包括至少交聯(lián)劑。交聯(lián)劑是具有兩個(gè)或更多個(gè)可聚合基團(tuán)的化合物。一般而言，可使用任何交聯(lián)化合物，只要交聯(lián)劑上的可聚合基團(tuán)能夠在用于形成納米復(fù)合物的條件下在酶與至少一種單體單元之間形成交聯(lián)共聚物即可。交聯(lián)劑的實(shí)例包括具有兩個(gè)乙烯基、丙烯?；⑼榛；蚣谆；幕衔铩＞哂袃蓚€(gè)丙烯?；奶囟ń宦?lián)劑的實(shí)例包括N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和甘油二甲基丙稀Ife酷。
[0120]在一些實(shí)施方案中，交聯(lián)劑是可降解交聯(lián)劑?？山到饨宦?lián)劑在某些條件下裂解，從而導(dǎo)致納米復(fù)合物的至少一部分聚合物網(wǎng)狀物分解或除去。舉例而言，可降解交聯(lián)劑可在某一 pH (高或低)下水解，可由特定酶(如酯酶或肽酶)裂解，可在暴露于某些波長(zhǎng)后光解裂解，或在某些溫度下裂解。在降低的pH下水解的交聯(lián)劑的實(shí)例包括甘油二甲基丙烯酸酯，其在生理PH(約7.4)下穩(wěn)定，但在較低pH(約5.5)下水解?？山到饨宦?lián)劑的其它實(shí)例包括US7，056，901中所述的縮醛交聯(lián)劑，所述專利以引用的方式整體并入本文。
[0121]可降解交聯(lián)基團(tuán)的其它特定實(shí)例包括N，N’-亞甲基雙(丙烯酰胺)、1，4_雙(丙烯酰基)哌嗪、乙二醇二丙烯酸酯、N，N’-(1，2-二羥基-亞乙基)雙丙烯酰胺和聚(乙二醇)二丙烯酸酯。非可降解交聯(lián)基團(tuán)的其它實(shí)例包括N，N’_雙(丙烯?；?胱胺、甘油二甲基丙烯酸酯、雙[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]磷酸酯和雙丙烯酰基化多肽。
[0122]在一些實(shí)施方案中，聚合物網(wǎng)狀物是可滲透的。如本文所用，可滲透意味分子(例如乙醇)可通過聚合物網(wǎng)狀物中的孔或洞或通過擴(kuò)散穿過聚合物基質(zhì)來穿過聚合物網(wǎng)狀物。舉例而言，底物、輔因子和其它化學(xué)要素可穿過聚合物網(wǎng)狀物，從而允許納米復(fù)合物保留內(nèi)部酶活性。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)是由所選成分和/或在被設(shè)計(jì)來產(chǎn)生具有影響化合物擴(kuò)散穿過聚合物基質(zhì)的特定滲透選擇性性質(zhì)的基質(zhì)的所選條件下形成。
[0123]可降解交聯(lián)劑可除去或減小聚合物網(wǎng)狀物的密度且因此允許如輔因子和底物的各種對(duì)象穿過。舉例而言，在降低的PH下分解的可降解交聯(lián)劑可用于在納米復(fù)合物通過胞吞作用內(nèi)化至細(xì)胞中之后除去或減少聚合物涂層。熟知的是血清和晚期內(nèi)體分別具有PH值7.4和5.5。因此，在pH7.4下穩(wěn)定，但在pH5.5下降解的可降解交聯(lián)劑將僅在納米復(fù)合物已進(jìn)入細(xì)胞中之后除去或減少聚合物涂層。以這個(gè)方式，酶被保護(hù)免遭血清中存在的蛋白酶，但底物較大的酶可仍然有效遞送至細(xì)胞中。在減少聚合物涂層之后，酶活性仍然存在。然而，在減少聚合物涂層之后，酶變得易受由細(xì)胞內(nèi)蛋白酶進(jìn)行的降解，但這個(gè)缺點(diǎn)由納米復(fù)合物在血清中的穩(wěn)定性和對(duì)血清蛋白酶的抗性增加所抵消。
[0124]在某些實(shí)施方案中，納米復(fù)合物進(jìn)一步包括表面改性物。表面改性物是在形成納米復(fù)合物之后添加至納米復(fù)合物的表面中的化學(xué)部分。具有反應(yīng)性側(cè)鏈(或保護(hù)的反應(yīng)性側(cè)鏈)的單體單元可用于形成納米復(fù)合物，只要反應(yīng)性側(cè)鏈不干擾形成納米復(fù)合物即可。反應(yīng)性側(cè)鏈可(必要時(shí)在脫保護(hù)之后)與表面改性劑反應(yīng)以使表面改性物共價(jià)連接于納米復(fù)合物。表面改性劑可為小分子、聚合物、肽、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、多糖或抗體。表面改性物可改變納米復(fù)合物的溶解性，改變納米復(fù)合物的表面電荷，或?qū){米復(fù)合物賦予額外功能，如發(fā)光、細(xì)胞靶向或細(xì)胞滲透。當(dāng)相較于非靶細(xì)胞時(shí)，增強(qiáng)細(xì)胞靶向的表面改性物導(dǎo)致納米復(fù)合物向靶細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)增加。當(dāng)相較于缺乏細(xì)胞滲透增強(qiáng)劑的納米復(fù)合物時(shí)，增強(qiáng)細(xì)胞滲透的表面改性物導(dǎo)致納米復(fù)合物向細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)增加。一種以上表面改性物可存在于納米復(fù)合物上。小分子表面改性物的實(shí)例包括發(fā)光化合物(如熒光素或若丹明(rhodamine))或細(xì)胞靶向化合物(如葉酸)。聚合物包括用以增加溶解性的聚乙二醇。肽可用于細(xì)胞靶向，所述肽如針對(duì)特定細(xì)胞表面特征的抗體、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)或生長(zhǎng)激素。其它肽可用于增加納米粒子(如TAT或觸角同源結(jié)構(gòu)域(antennepedia homeodomain))的細(xì)胞滲透。在一些實(shí)施方案中，表面改性物是抗體。
[0125]制備多酶納米復(fù)合物的方法
[0126]本公開的多酶納米復(fù)合物可通過首先形成多酶核心且接著在所述核心周圍錨定聚合物網(wǎng)狀物來制備。
[0127]1.制備多酶核心
[0128]臨時(shí)多酶核心的制備方法說明于圖1中且描述于實(shí)施例1中。所述示例性程序的其它細(xì)節(jié)可見于實(shí)施例2中。
[0129]在示例性方法中，在第一步驟時(shí)，合成DNA-抑制劑骨架。如圖1中所說明，分別使各酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑綴合于具有設(shè)計(jì)序列的單鏈DNA(ssDNA);互補(bǔ)裝配DNA分子形成連接有三種抑制劑的DNA-抑制劑骨架(參見例如Feldkamp等人，Angew Chem IntEdit45, 1856-1876，(2006))。[0130]ssDNA與抑制劑的綴合可用本領(lǐng)域中已知的方法實(shí)現(xiàn)。舉例而言，綴合可發(fā)生在ssDNA的5’磷酸或5’胺C6T基團(tuán)處(參見例如實(shí)施例1章節(jié)3.1中的說明)。
[0131]一旦制備ssDNA-抑制劑，DNA-抑制劑骨架即可由于ssDNA上的互補(bǔ)序列而自我裝配。圖5a說明兩種ssDNA-抑制劑分子的裝配。因此,兩種ssDNA彼此共有互補(bǔ)序列。
[0132]在圖5b中，在另一方面，四種ssDNA序列可將3或4種抑制劑裝配在骨架上。在那里，ssDNA-Ι具有互補(bǔ)于ssDNA-1I的片段的序列，所述ssDNA-1I的片段又具有互補(bǔ)于ssDNA-1II的片段的序列，所述ssDNA-1II的片段又具有互補(bǔ)于ssDNA-1V的片段的序列，所述ssDNA-1V的片段又具有互補(bǔ)于ssDNA-Ι的片段的序列。
[0133]圖5b中說明的設(shè)計(jì)策略可易于應(yīng)用于通過將互補(bǔ)序列包括至ssDNA分子中來形成5種或6種或更多種ssDNA-抑制劑骨架。
[0134]一旦合成多抑制劑骨架，即可接著使酶結(jié)合于相應(yīng)抑制劑以形成酶-抑制劑-ssDNA核心。
[0135]熟練技術(shù)人員易于了解的是可用本領(lǐng)域中已知的其它方法制備多酶核心。舉例而言，一或多種抑制劑可被酶底物、配體或甚至識(shí)別酶的抗體取代。在另一方面，ssDNA可被錨定抑制劑、底物或抗體的聚合物置換。
[0136]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，也提供一種包含錨定于多種配體的聚合骨架的納米復(fù)合物，所述配體由多種酶識(shí)別，所述酶協(xié)同地與底物反應(yīng)。如本文所用的“配體”廣泛意圖涵蓋特異性識(shí)別酶或由酶識(shí)別或結(jié)合酶的任何分子。一方面，聚合骨架是核酸，如ssDNA。因此，所述聚合骨架 適用于制備多酶納米復(fù)合物。
[0137]在另一實(shí)施方案中，聚合骨架進(jìn)一步包括相應(yīng)酶。
[0138]2.制備多酶納米復(fù)合物
[0139]一旦制備多酶核心，即可接著將聚合物網(wǎng)狀物施加于核心。聚合物網(wǎng)狀物可共價(jià)或通過本文所述的其它力錨定于兩種或更多種酶，從而用至少一種可聚合基團(tuán)衍生酶；且接著使衍生化蛋白質(zhì)與單體單元共聚合。
[0140]示例性兩步程序可用于在酶周圍形成聚合物網(wǎng)狀物。首先，使可聚合基團(tuán)連接于酶表面。接著隨后官能性單體和任選交聯(lián)劑在緩沖溶液中聚合使兩種或更多種酶覆蓋以聚合物外殼。
[0141]一旦可聚合基團(tuán)連接于酶表面，即可使用單體來形成具有可調(diào)組成、結(jié)構(gòu)、表面性質(zhì)和官能性的聚合物涂層。室溫自由基聚合技術(shù)可用于確保保留酶活性。因?yàn)檫@些聚合物涂層充當(dāng)囊封的酶的人工膜，所以其展現(xiàn)適合機(jī)械強(qiáng)度以提供結(jié)構(gòu)完整性，具有允許底物快速轉(zhuǎn)運(yùn)的有效轉(zhuǎn)運(yùn)路徑，且含有特定官能性以提供底物選擇性和水分保留。
[0142]納米復(fù)合物不改變?nèi)缟纤甘究芍苯訌纳虡I(yè)來源或使用其它報(bào)道方法(例如重組方法，如由GENSCRIPT提供的那些方法)獲得的酶的功能。
[0143]用于衍生或修飾酶的試劑具有以下一般性結(jié)構(gòu)，其中可聚合基團(tuán)是在用于形成納米復(fù)合物的條件下與一種或多種單體和/或交聯(lián)劑形成共聚物的化學(xué)部分。在一些實(shí)施方案中，可聚合基團(tuán)是含雙鍵基團(tuán)，如乙烯基、丙烯?；?、烷基丙烯?；图谆；?。如先前所論述，丙烯?；?以及烷基丙烯酰基和甲基丙烯?；?包括丙烯?；ヅc丙烯酰胺兩者。
[0144]連接基團(tuán)是任選的且可存在于可聚合基團(tuán)與蛋白質(zhì)之間。連接基團(tuán)是使反應(yīng)性基團(tuán)與可聚合基團(tuán)分開的化學(xué)部分。連接基團(tuán)不限于任何特定化學(xué)結(jié)構(gòu)，但不應(yīng)干擾聚合反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，連接基團(tuán)是在某些條件下裂解的可降解連接基團(tuán)。舉例而言，縮醛、縮酮或酯可在某些PH下水解。具有這些官能團(tuán)的一種或多者的連接基團(tuán)可反應(yīng)于pH變化(例如內(nèi)體中的PH變化)而分解。
[0145]反應(yīng)性基團(tuán)是與氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)以使可聚合基團(tuán)共價(jià)連接于蛋白質(zhì)的化學(xué)部分。眾多反應(yīng)性基團(tuán)是已知的且用于與不同氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)。舉例而言，酰鹵或活化酯(如N-羥基丁二酰亞胺酯)與胺(例如賴氨酸上的胺)或羥基(例如絲氨酸或蘇氨酸上的羥基)反應(yīng)。異氰酸酯與胺反應(yīng)。環(huán)氧化物與胺或硫醇(例如半胱氨酸)反應(yīng)。順丁烯二酰亞胺與硫醇反應(yīng)。其它官能團(tuán)可在一種或多種偶合試劑(如碳化二亞胺試劑)存在下與氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)。舉例而言，胺可與羧酸氨基酸側(cè)鏈(例如谷氨酸或天冬氨酸上的羧酸氨基酸側(cè)鏈)反應(yīng)。其它反應(yīng)性基團(tuán)將易于為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員顯而易知。
[0146]在以上提及的蛋白質(zhì)修飾期間，為實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性控制修飾，遺傳重組技術(shù)可用于在空間上限定位置中引入特定氨基酸。這個(gè)技術(shù)允許準(zhǔn)確控制修飾的位點(diǎn)和密度。
[0147] 用于衍生蛋白質(zhì)的特定化合物的實(shí)例在本領(lǐng)域中是已知的，參見例如PCT申請(qǐng)
【發(fā)明者】Y.魯, 閆明, 劉陽(yáng) 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)