一種定量核酸外切酶i活性測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定量核酸外切酶I活性測(cè)定方法，所述方法包括以下步驟：首先提供與單鏈DNA模板互補(bǔ)的引物，隨后加入核酸外切酶I進(jìn)行外切反應(yīng)；外切反應(yīng)后，加入單鏈DNA模板并退火，形成單鏈DNA模板/引物復(fù)合物；其后加入聚合酶，合成雙鏈DNA；接著測(cè)定反應(yīng)體系中單鏈或雙鏈DNA的相對(duì)量，并由測(cè)定結(jié)果推導(dǎo)出核酸外切酶I活性程度，其中核酸外切酶I活性程度與反應(yīng)體系中雙鏈DNA的量成反比。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法無放射性污染，操作簡(jiǎn)單便捷，可以對(duì)核酸外切酶Ⅰ活性進(jìn)行定量的檢測(cè)分析。
【專利說明】一種定量核酸外切酶I活性測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說涉及一種定量核酸外切酶I活性測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 核酸外切酶I (Exonuclease I, ExoI)是單鏈特異性3' 一 5'核酸外切酶，從 ssDNA的3'-OH末端分解生成5'-單核苷酸。對(duì)單鏈DNA的特異性非常高，不分解雙鏈DNA 及 RNA。
[0003] 核酸外切酶I對(duì)單鏈DNA的高度特異性，使其成為分子生物學(xué)領(lǐng)域中一種非常重 要的工具酶，應(yīng)用非常廣泛。例如，在PCR反應(yīng)完成后，在產(chǎn)物中直接加入核酸外切酶I和 蝦堿性磷酸酶，降解剩余的引物和dNTP。消化過的PCR產(chǎn)物經(jīng)過80°C加熱后，即可直接進(jìn) 行測(cè)序反應(yīng)而不需要純化。
[0004] 標(biāo)準(zhǔn)的核酸外切酶I測(cè)活方法采用放射性同位素法。核酸外切酶I以3'末端[3H] 標(biāo)記的單鏈寡核苷酸為底物，生成帶[ 3H]標(biāo)記的dNTP。產(chǎn)物經(jīng)TCA沉淀后，用whatman濾 紙過濾，以實(shí)現(xiàn)[3H]標(biāo)記的dNTP和寡核苷酸的分離。通過測(cè)定酸可溶性產(chǎn)物中的放射性 同位素的量，計(jì)算核酸外切酶I的活性。放射性同位素法存在易產(chǎn)生放射性污染、步驟多、 周期長(zhǎng)的缺陷，難以實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于建立了一種簡(jiǎn)便、快速、非放射性且定量的核酸外切酶I測(cè)活 方法，其原理如圖1所示。
[0006] 具體來說，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種定量核酸外切酶I活性測(cè)定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：首先提供 與單鏈DNA模板互補(bǔ)的引物，隨后加入核酸外切酶I進(jìn)行外切反應(yīng)；外切反應(yīng)后，加入單鏈 DNA模板并退火，形成單鏈DNA模板/引物復(fù)合物；其后加入聚合酶，合成雙鏈DNA ;接著測(cè) 定反應(yīng)體系中單鏈或雙鏈DNA的相對(duì)量，并由測(cè)定結(jié)果推導(dǎo)出核酸外切酶I活性程度，其中 核酸外切酶I活性程度與反應(yīng)體系中雙鏈DNA的量成反比。
[0007] 優(yōu)選地，雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是利用熒光染料，通過熒光法測(cè)得的，并且 雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是以熒光強(qiáng)度表示的。更優(yōu)選，所采用的熒光染料是雙鏈DNA 特異性突光染料，例如可在市面上商購(gòu)獲得的picogreen染料。
[0008] 優(yōu)選地，所采用的單鏈DNA模板是單鏈環(huán)狀DNA模板。更優(yōu)選，所采用的單鏈DNA 模板是M13噬菌體單鏈DNA，以便于建立標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法。
[0009] 作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法的一個(gè)實(shí)例，所采用的聚合酶為Taq酶。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 1. 無放射性污染； 2. 操作步驟簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，反應(yīng)迅速； 3. 可以對(duì)核酸外切酶I活性進(jìn)行定量的檢測(cè)分析，便于操作。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明測(cè)定方法原理圖。
[0012] 圖2是核酸外切酶I活性-熒光強(qiáng)度曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明建立了一種簡(jiǎn)便、快速、非放射性且定量的核酸外切酶I測(cè)活方法，其原理 如圖1所示。
[0014] 如圖1所示，加入單鏈DNA，如M13 SSDNA后，單鏈DNA引物可與其形成匹配的模板 /引物復(fù)合物，如M13模板/引物復(fù)合物，Taq酶可以模板/引物復(fù)合物如M13模板/引物復(fù) 合物為底物，進(jìn)行聚合反應(yīng)，生成M13雙鏈DNA。M13雙鏈DNA可被雙鏈特異性的picogreen 染料結(jié)合，產(chǎn)生熒光。ExoI酶可降解單鏈DNA引物，從而減少M(fèi)13模板/引物復(fù)合物的量。 ExoI酶的活性在一定范圍內(nèi)同M13模板/引物復(fù)合物的量成反比；而在DNA聚合酶活性一 定的情況下，M13模板/引物復(fù)合物的量同熒光強(qiáng)度成正比。因此，本發(fā)明將ExoI酶的測(cè) 活體系同DNA聚合酶測(cè)活體系偶聯(lián)起來，在一定范圍內(nèi)，ExoI酶的活性同熒光強(qiáng)度成反比。
[0015] 本發(fā)明人進(jìn)一步證明了上述假設(shè)，從而建立了非放射性、簡(jiǎn)便、快速且可以定量的 核酸外切酶I測(cè)活方法。
[0016] 作為本發(fā)明測(cè)定方法的一個(gè)實(shí)例，一個(gè)采用M13單鏈DNA作為單鏈模板的本發(fā)明 測(cè)定方法包括如下基本步驟： M13 單鏈 DNA :M13mpl8 單鏈 DNA (NEB); 單鏈 DNA 引物：M13 引物 5' -aagccatccgcaaaa-3' ； 1. Exo I 反應(yīng)：

【權(quán)利要求】
1. 一種定量核酸外切酶I活性測(cè)定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：首先 提供與單鏈DNA模板互補(bǔ)的引物，隨后加入核酸外切酶I進(jìn)行外切反應(yīng)；外切反應(yīng)后，加入 單鏈DNA模板并退火，形成單鏈DNA模板/引物復(fù)合物；其后加入聚合酶，合成雙鏈DNA ;接 著測(cè)定反應(yīng)體系中單鏈或雙鏈DNA的相對(duì)量，并由測(cè)定結(jié)果推導(dǎo)出核酸外切酶I活性程度， 其中核酸外切酶I活性程度與反應(yīng)體系中雙鏈DNA的量成反比。
2. 如權(quán)利要求1所述的定量核酸外切酶I活性測(cè)定方法，其特征在于，雙鏈DNA或單 鏈DNA的相對(duì)量是利用熒光染料，通過熒光法測(cè)得的，并且雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是 以突光強(qiáng)度表不的。
3. 如權(quán)利要求2所述的定量核酸外切酶I活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的熒光 染料是雙鏈DNA特異性熒光染料。
4. 如權(quán)利要求3所述的定量核酸外切酶I活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的染料 是 picogreen 染料。
5. 如權(quán)利要求1所述的定量核酸外切酶I活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的單鏈 DNA模板是單鏈環(huán)狀DNA模板。
6. 如權(quán)利要求5所述的定量核酸外切酶I活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的單鏈 DNA模板是M13噬菌體單鏈DNA。
7. 如權(quán)利要求1所述的定量核酸外切酶I活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的聚合 酶為Taq酶。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293928SQ201410502152
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】曹林, 徐曉昱, 王靜 申請(qǐng)人:南京諾唯贊生物科技有限公司