一種基于核酸外切酶的microRNA多色檢測探針及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學和核酸化學領域，涉及一種基于核酸外切酶的microRNA 多色檢測探針及檢測方法。
【背景技術】
[0002] MicroRNA(miRNA)是近年來在多種真核生物細胞中發(fā)現(xiàn)的一類來源于內(nèi)源性染色 體上的非編碼單鏈RNA，長度約為20-24個核苷酸的短序列。MicroRNA是以單個基因或基 因簇的形式分布在基因組上，大多數(shù)microRNA基因在RNA聚合酶II的作用下形成初級轉(zhuǎn) 錄本（pri-miRNA)，pri_miRNA長度約為300-1000個堿基，pri-miRNA需要經(jīng)過二次剪切才 能形成成熟的microRNA，首先在細胞核內(nèi)pri-miRNA被Dorsha酶剪切，形成約70個堿基的 microRNA前體，即pre-miRNA;然后，pre-miRNA由轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5運輸?shù)郊毎|(zhì)中， 再次經(jīng)Dicer酶識別并剪切，形成成熟microRNA。成熟microRNA結(jié)合到RNA誘導的沉默復 合體中，介導轉(zhuǎn)錄后基因表達沉默或者抑制基因表達。
[0003] MicroRNA的生物學特性主要表現(xiàn)為：高度保守性，時序性和組織特異性。 microRNA不僅在結(jié)構(gòu)上保守，而且在物種間具有高度的進化保守性。細胞特異性和組織特 異性是microRNA表達的主要特點。成熟的microRNA，5'端為磷酸基團，3'端為羥基，這一 特點使它與大多數(shù)寡核苷酸和功能RNA的降解片段區(qū)別開來。
[0004] 目前已發(fā)現(xiàn)1000種以上microRNA，科學家提出在生物的整個發(fā)育過程中 microRNA可能調(diào)節(jié)細胞早期發(fā)育，參與細胞分化和組織發(fā)育，最為人們關注的是調(diào)控基因 的表達。下游靶基因是發(fā)現(xiàn)microRNA調(diào)控基因表達的最直接手段，已有研究證明Lin-4、 Let-7 的革巴基因是ras信號通路（SignalingPathway)的蛋白；Lin-41、hbl_l、Lin-14 和 lin-28調(diào)控時序發(fā)育；miR-375在哺乳動物中的靶基因為Mtpn對胰島素分泌進行調(diào)節(jié)。 這些結(jié)果證實，多個microRNA可協(xié)同作用于同一個革E1基因的表達，同時單個microRNA可 以作用于多個靶基因的翻譯，因此同時對多種microRNA的檢測顯得非常必要。此外，研究 發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞和正常細胞的microRNA表達譜具有明顯的差異，且多數(shù)microRNA位于與 腫瘤形成相關性脆弱基因位點，因此推測microRNA與腫瘤形成密切相關，并且在癌癥的發(fā) 生發(fā)展過程中扮演重要的角色，可能作為抑癌基因或者致癌基因。相關研究發(fā)現(xiàn)位于染色 體13ql4區(qū)段的miRNA-15和miRNA-16的局部丟失與慢性淋巴性白血病相關，首次證明 了microRNA的失調(diào)與腫瘤之間有著密切的關系。另外，miRNA-21位于染色體17q23. 2上 的空泡膜蛋白基因的3'UTR區(qū)，該區(qū)域經(jīng)常發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和神經(jīng)細胞瘤中 表達增強，研究表明與正常的乳腺組織相比，miRNA-21在乳腺癌組織中高表達，并且發(fā)現(xiàn) anti-miRNA-21介導的細胞生長的抑制與細胞凋亡的增加和細胞增殖的降低相關，研究結(jié) 果表明，miRNA-21作為癌基因通過對Bcl2的調(diào)節(jié)來調(diào)控腫瘤的發(fā)生，并且可以作為治療和 診斷的靶點。對腫瘤特定microRNA表達水平的研究和序列分析不僅有利于闡明腫瘤的發(fā) 生發(fā)展機制，更為腫瘤的診斷、治療和預后提供了新的方向和策略。
[0005] 隨著對microRNA功能的深入研究，MicroRNA日益成為一種非常重要的腫瘤和疾 病的標志物，對其檢測成為科學家們研究的熱點。目前檢測microRNA的方法如northern blot方法、RT-PCR的方法和芯片的方法，這些方法耗時長，需要昂貴的儀器，資源成本和 經(jīng)濟成本都較高，還有一類基于電化學和納米顆粒的檢測方法，這些方法需要前期制備電 極或者納米顆粒，耗時耗力。因此發(fā)展一種簡單、快速、低成本、并且能達到同時檢測多種 microRNA的新方法顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種基于核酸外切酶的 microRNA多色檢測探針以及檢測方法。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏低成本快速簡單同時檢測多 種microRNAs〇
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：
[0008] -種基于核酸外切酶的microRNA多色檢測探針，為發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA，包含三個 部分：莖末端區(qū)、loop環(huán)狀區(qū)和5'、3'末端標記的熒光基團和相對應的淬滅基團；所述的 loop環(huán)狀區(qū)包含待測microRNA的互補序列以及在該互補序列5'和/或3'方向的小段單 鏈序列，本發(fā)明中的小段長度是相對microRNA序列長度而言，長度為10個堿基以下為小 段。
[0009] 所述的莖末端區(qū)的長度優(yōu)選為8-10個堿基對，以保證發(fā)卡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
[0010] 所述的小段單鏈序列的長度優(yōu)選為4-7個堿基，以保證發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
[0011] 所述的熒光基團包括6-羧基熒光素（FAM)、Cy5、6-羧基四甲基羅丹明（Tamra)、 TexasRed等；所述的淬滅基團包括BHQ1和BHQ2。5'及3'末端標記的熒光基團和相對應 的淬滅基團在折疊狀態(tài)時能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)，使熒光基團的熒光被淬滅。 [0012] 更優(yōu)選的，所述的檢測探針為：
[0013] / 熒光基團/-CCCAACCCA(N)"TTACTAGT6GeTTGGG_/ 淬滅基團 /，
[0014] 其中，雙下劃線部分為莖末端區(qū)序列，（吣"為loop環(huán)狀區(qū)與待測microRNA互補的 序列，單下劃線部分為loop環(huán)狀區(qū)的小段單鏈序列。
[0015] -種基于核酸外切酶同時多色檢測多種microRNAs的方法，包括如下步驟：
[0016] (1)根據(jù)待測microRNA設計本發(fā)明檢測探針，選取不同熒光基團和相對應的淬滅 基團分別進行5'或3'末端標記。
[0017] (2)將包含待檢microRNA、檢測探針和核酸外切酶I(ExoI)的體系進行孵育。
[0018] (3)通過熒光儀檢測孵育后體系相應熒光基團的發(fā)射光譜，激發(fā)波長為熒光基團 的最大激發(fā)波長，根據(jù)熒光信號的有無和強度來判斷是否含有待測microRNA以及其濃度。
[0019] 步驟（2)中所述的體系優(yōu)選為50iiL，檢測探針的濃度為100nM，核酸外切酶I的 用量為20U。
[0020] 步驟⑵中所述的孵育的條件優(yōu)選為37°C孵育50min。
[0021] 本發(fā)明的檢測探針在不加靶標microRNA的情況下發(fā)卡結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，5'及3'末 端標記的熒光基團和相對應的淬滅基團彼此靠近，熒光被淬滅。在靶標microRNA存在的 條件下，通過堿基互補配對識別，探針的環(huán)結(jié)構(gòu)與靶標結(jié)合后發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開形成DNA-RNA 雜合體，其5'與3'端莖末端區(qū)部分裸露出來，露出來的單鏈DNA的3'端能被核酸外切酶 I(ExoI)識別并被降解，ExoI從3'端到5'端方向降解單鏈DNA，使得3'端標記的淬滅 基團從雜合體中脫落，使熒光恢復，從而可檢測到靈敏的熒光信號，且熒光信號的強度和靶 標microRNA的濃度成線性相關性。根據(jù)檢測標靶的不同而設計相對應的探針，并且標記不 同的熒光基團淬滅基團對，能實現(xiàn)多種microRNAs的同時檢測。本發(fā)明基于核酸外切酶的 3'到5'方向降解單鏈DNA的性質(zhì)，用不同熒光基團和相應淬滅基團標記的發(fā)卡探針達到檢 測目的。
[0022] 本發(fā)明的檢測探針的特異性設計，只有靶標與探針完全互補配對時其發(fā)卡結(jié)構(gòu)才 會被打開從而恢復熒光。探針的末端區(qū)8-10個堿基對，環(huán)狀結(jié)構(gòu)24-31個堿基設計，使探 針穩(wěn)定性好，探針的兩端能夠完全互補配對，5'或3'端沒有裸露出單鏈DNA，不能被核酸外 切酶識別進而降解。這樣的設計也使得在無靶標microRNA存在條件下，5'末端標記的熒光 基團的熒光能夠被3'末端標記的淬滅基團淬滅，檢測背景低，性噪比高。本發(fā)明的設計策 略具有很好的特異性，并且多個靶標和多個探針的混合體系之間并不會交叉相互影響，只 需對各個探針標記不同的熒光基團和相對應的淬滅基團就能達到多色檢測的目的。本發(fā)明 的設計原理如圖1