專利名稱:實時pcr檢測中抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的熒光探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類熒光探針，特別是涉及一種實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測中能夠抵抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的一類熒光探針。
背景技術(shù)：
實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR，簡稱實時PCR)是指擴(kuò)增與檢測同步進(jìn)行，通過檢測擴(kuò)增循環(huán)中熒光信號的變化以指示核酸擴(kuò)增過程。
與常規(guī)PCR一樣，實時PCR需要使用高溫聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。多數(shù)情況下，實時PCR使用普通的高溫聚合酶Taq。Taq酶除了具有聚合酶活性外，還具有5′→3′核酸外切酶活性。在少數(shù)情況下，人們會使用經(jīng)基因改造去除了5′→3′核酸外切酶活性的Taq如KlenTaq等。當(dāng)需要高保真擴(kuò)增時，則經(jīng)常使用具有校正能力的高溫聚合酶如Pfu等。后者除了具有聚合酶活性外，還具有3′→5′核酸外切酶活性。另外，在進(jìn)行長片段擴(kuò)增時，經(jīng)常使用上述Taq或者KlenTaq和具有3′→5′核酸外切酶活性如Pfu等兩種酶的混合物(美國專利號US5436149，專利授予日期1995年7月25日)。
目前，根據(jù)是否使用熒光探針，實時PCR可以分為探針式和非探針式兩種形式。由于探針式實時PCR由于增加了對模板特異識別的探針，比非探針式實時PCR檢測結(jié)果更加特異。探針式實時PCR還可以通過對不同的靶序列探針標(biāo)記不同的熒光染料，達(dá)到同時檢測多個靶序列的目的，因此探針式實時PCR相對更為常用。
探針式實時PCR使用的探針有多種，包括TaqManTM探針、TaqMan-MGBTM探針、分子信標(biāo)探針(Molecular Beacons)、熒光能量共振轉(zhuǎn)移探針(又稱LightCyclerTM探針)、置換探針、UT探針(Zhang Y.，Nucleic Acids Research，2003，31(20)，e123)、蝎子引物(Scorpions)、LUXTM引物(Invitrogen)和AmplifierTM引物(Nazarenko，I.Q.，et al，Nucleic Acids Research，1997，15(1)，2518-2521)等。這些熒光探針可以分為依賴聚合酶5′→3′外切核酸活性的探針(如TaqManTM探針等)和不依賴聚合酶5′→3′外切核酸活性的探針(如分子信標(biāo)探針和置換探針等)。
原理上，無論是依賴聚合酶5′→3′外切核酸活性的探針還是不依賴聚合酶5′→3′外切核酸活性的探針，在實時PCR中，若與模板雜交后產(chǎn)生熒光，則該熒光能真實反映特異靶序列的擴(kuò)增，這種熒光稱作特異信號。相反，若未與靶序列結(jié)合時即產(chǎn)生熒光，則該熒光不能真實反映把序列的擴(kuò)增，這種熒光稱作非特異信號。非特異熒光信號會干擾特異信號的測定，降低測定的效果。
然而在目前的實時PCR檢測領(lǐng)域，對于非特異信號的產(chǎn)生以及對特異信號的影響情況，人們了解的并不是很多。Wilhelm等(Wilhelm J.，et al，BioTechniques，301052-1062，2001)觀察到使用LightCyclerTM探針時，采用具有5′→3′外切核酸活性的Taq酶會引起探針的酶切，導(dǎo)致擴(kuò)增效率的下降和檢測信號的降低，而改用不具有5′→3′外切酶活性的Taq酶的Stoffel片段，則會明顯改善上述情況。
美國專利US6395518B1(專利授予日期2002年5月28日)公開了一種使用TaqManTM探針但使用缺乏5′→3′外切酶活性的聚合酶進(jìn)行檢測的方法。在這種情況下，熒光信號的產(chǎn)生完全依賴TaqManTM探針雜交前后熒光強(qiáng)度的變化。該專利的目的是為了拓展TaqManTM探針的應(yīng)用范圍，使之不完全依賴于Taq酶的5′→3′外切活性。然而，作為單鏈線性探針的TaqManTM，雜交前后熒光信號變化有限。迄今，在實際檢測中并未見到使用該專利的報道。實際上，已經(jīng)觀察到，當(dāng)使用TaqManTM探針時，如果采用缺乏5′→3′外切酶活性聚合酶，可能導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)抑制的發(fā)生(Yu，D.，et al，BioTechniques 23714-720，1997)。
具有3′→5′外切活性的所謂高保真高溫聚合酶如Pfu，Vent，Deep Vent和UlTma等對線性單鏈DNA都具有一定的剪切作用(Janice Cline，J.，Nucleic Acids Research，24，18，3546-3551，1996)。TaqManTM探針屬線性單鏈結(jié)構(gòu)，本身就是這些聚合酶的3′→5′外切活性的底物，因此TaqManTM探針在高保真酶體系中會發(fā)生非特異酶切，從而產(chǎn)生非特異信號。公開號為US 2006/0088855 A1的美國專利申請(
公開日2006年4月27日)公開了一種使用能夠抗3′→5′外切酶活性的熒光能量轉(zhuǎn)移探針的方法，這樣的探針可用于高保真PCR。該專利發(fā)現(xiàn)一些3′端標(biāo)記的淬滅劑如BHQ1等具有抗高保真聚合酶3′→5′外切酶活性的能力，因此可以直接采用這些3′端標(biāo)記的熒光探針用于高保真PCR中。而一些常用的淬滅劑如DABCYL和TAMRA等卻不具備這種能力，因而無法用于高保真擴(kuò)增。
可以看出，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在實時PCR檢測中聚合酶的外切酶活性對于檢測性能是有影響的，并且針對具體的情況采取了相應(yīng)的措施，包括使用不具有5′→3′外切酶活性的聚合酶，或者利用獨(dú)特的淬滅劑克服3′→5′外切酶活性。然而對于核酸外切酶活性與探針之間直接作用是否產(chǎn)生非特異熒光信號，這些非特異信號在實時PCR檢測中對特異信號產(chǎn)生的影響如何，以及克服這些影響的方式等仍然缺乏深入的理解。
早期的大量研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，高溫聚合酶的5′→3′活性對于靶核酸的作用具有結(jié)構(gòu)趨向性(Michael W.Kaiser，The Journal of Biological Chemistry，274，30，21387-21394，1999；Longley，M.J.，Nucleic Acids Research，18(24)7317-7322，1990；Landre，T.A.et al，Biochemistry，34，4994-5002，1995；Auer，T.，et al，Biochemistry，34，4994-5002，1995；Lyamichev，V.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，6143-6148，1999等)。根據(jù)這些研究結(jié)果，可以判斷TaqManTM探針是線性單鏈結(jié)構(gòu)，不是高溫聚合酶的5′→3′外切酶活性的合適底物，因此TaqManTM探針在實時PCR檢測中很難產(chǎn)生非特異信號。
我們發(fā)現(xiàn)，具有二級結(jié)構(gòu)的熒光探針如置換探針(Li，Q.，Nucleic Acids Research，30，2，e5，2002)、分子信標(biāo)(Tyagi，S.，Nature Biotechnology，14，303-308，1996)等則可以是高溫聚合酶5′→3′外切活性識別的底物，會在實時PCR中產(chǎn)生非特異信號，造成對特異性擴(kuò)增信號的干擾。
另外，如前所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)屬于線性單鏈結(jié)構(gòu)TaqManTM探針是高溫聚合酶的3′→5′外切酶活性的底物(Janice Cline，J.，Nucleic Acids Research，24，18，3546-3551，1996)。因此TaqManTM探針在高保真酶體系中會發(fā)生非特異酶切，從而產(chǎn)生非特異信號(美國專利公開號US 2006/0088855 A1，
公開日期2006年4月27日)。
我們發(fā)現(xiàn)，具有二級結(jié)構(gòu)的熒光探針如置換探針和分子信標(biāo)等同樣是高溫聚合酶的3′→5′外切活性的底物，會在實時PCR中產(chǎn)生非特異信號，造成對特異性擴(kuò)增信號的干擾。
因此，對于具有二級結(jié)構(gòu)的熒光探針，無論使用具有5′→3′外切活性還是3′→5′外切活性高溫聚合酶，都要求這些探針具有抵抗外切酶活性的能力，以消除其在實時PCR中產(chǎn)生的非特異信號。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的熒光探針被外切酶酶切的問題，提供在實時PCR檢測中能夠抵抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的一類熒光探針。
本發(fā)明的第二個目的是提供一類經(jīng)修飾使其在實時PCR檢測中能夠抵抗高溫聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針。
本發(fā)明的第三個目的是提供一類經(jīng)修飾使其在高保真實時PCR檢測中能夠抵抗高溫聚合酶3′→5′核酸外切酶活性，且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針。
本發(fā)明的第四個目的是提供一類經(jīng)修飾使其在長片段實時PCR擴(kuò)增檢測中能夠同時抵抗5′→3′核酸外切活性和3′→5′核酸外切酶活性(比如使用Taq和Pfu的混合物)，也可以是只抵抗3′→5′核酸外切酶活性(比如使用KlenTaq和Pfu的混合物)，且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針。
本發(fā)明所述的實時PCR檢測中抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的一類熒光探針是指具有二級結(jié)構(gòu)即包含互補(bǔ)序列的熒光探針。
所述的具有二級結(jié)構(gòu)即包含互補(bǔ)序列的熒光探針包括置換探針、分子信標(biāo)探針、蝎子引物、雙鏈引物、AmplifluorTM引物、LUXTM引物、UT探針等。置換探針由兩條互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸組成，其互補(bǔ)部分形成二級結(jié)構(gòu)。分子信標(biāo)探針具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其莖部形成二級結(jié)構(gòu)；蝎子引物由一條延伸引物分子信標(biāo)組合而成，莖部分形成二級結(jié)構(gòu)；雙鏈引物與置換探針類似，由兩條互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸組成，其互補(bǔ)部分形成二級結(jié)構(gòu)；AmplifluorTM引物和LUXTM引物包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)，莖部分形成二級結(jié)構(gòu)；UT探針與引物的5′端互補(bǔ)，形成二級結(jié)構(gòu)。
目前已經(jīng)證明，二級結(jié)構(gòu)直接影響了這些探針的特異性。在多數(shù)情況下，具有二級結(jié)構(gòu)的探針可以獲得比線性單鏈探針更高的雜交特異性。
所述的具有二級結(jié)構(gòu)的熒光探針的共同特點是，在與靶序列雜交后，會產(chǎn)生熒光信號。也就是說，所產(chǎn)生的熒光來自于與靶序列雜交，熒光信號的強(qiáng)度在一定條件下能夠反映靶序列的量。我們將這種熒光信號稱之為特異信號。若在其它與把序列無關(guān)的因素作用下，發(fā)生了探針二級結(jié)構(gòu)的破壞，引起熒光信號的產(chǎn)生，則熒光信號的強(qiáng)度與靶序列的量無關(guān)，我們將這種熒光信號稱之為非特異信號。
所述的具有二級結(jié)構(gòu)的熒光探針用于實時PCR檢測時，即可以用作模板的定量，也可用于模板序列的檢測。
所述的實時PCR檢測中能夠抵抗高溫聚合酶的核酸外切酶活性的一類熒光探針是一種經(jīng)修飾使其在實時PCR檢測中能夠抵抗高溫聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針。所述的修飾，其中一種方式是指能夠抵抗高溫DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性的各種修飾，優(yōu)選的方式是使探針的5′端能抗核酸聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，修飾方式包括修飾5′端堿基之間的連接，采用修飾的堿基衍生物(如使用鎖定核酸，locked nucleic acids，LNA)或者是增加化學(xué)功能團(tuán)等。一種優(yōu)選的方式是修飾5′端堿基之間的連接，例如采用硫代磷酸化(phosphorothioate)連接，甲基磷酸鍵(methylphosphonate)連接，硼酸磷酸(boranophosphate)化連接，肽核酸(peptide nucleicacid)連接等抗核酸外切活性的連接。優(yōu)選的方式是采用硫代磷酸化連接修飾，這種修飾僅限于5′端的第一個堿基和第二個堿基之間。
所述的實時PCR檢測中能夠抵抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的一類熒光探針是一種經(jīng)修飾使其在長片段實時PCR擴(kuò)增檢測中能夠抵抗高溫聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針。所述的修飾，一種方式是夠抵抗高溫DNA聚合酶3′→5′核酸外切酶活性的各種修飾，優(yōu)選的方式是使探針的3′端能抗核酸聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性，修飾方式包括修飾3′端堿基之間的連接，采用修飾的堿基衍生物(如使用鎖定核酸，locked nucleic acids，LNA)，或者是增加化學(xué)功能團(tuán)等。一種優(yōu)選的方式是修飾3′端堿基之間的連接，例如采用硫代磷酸化連接，甲基磷酸鍵連接，硼酸磷酸化連接，肽核酸連接等抗核酸外切活性的連接。優(yōu)選的方式是采用硫代磷酸化連接修飾，而且這種修飾僅限于3′端的第一個堿基和第二個堿基之間。
所述的實時PCR檢測中能夠抵抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的一類熒光探針是一種經(jīng)修飾使其在長片段實時PCR擴(kuò)增檢測中能夠同時抵抗5′→3′核酸外切活性和3′→5′核酸外切酶活性(比如使用Taq和Pfu的混合物)，也可以是只抵抗3′→5′核酸外切酶活性(比如使用KlenTaq和Pfu的混合物)，且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針。所述的修飾，另一種方式是能夠同時抵抗高溫DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性和3′→5′核酸外切酶活性的各種修飾。優(yōu)選的方式是使探針的5′端能抵抗核酸聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，3′端能抗核酸聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性。修飾方式包括修飾5′端以及3′端堿基之間的連接，采用修飾的堿基衍生物(如使用鎖定核酸，locked nucleic acids，LNA)，或者是增加化學(xué)功能團(tuán)等。一種優(yōu)選的方式是修飾5′端以及3′端堿基之間的連接，例如采用硫代磷酸化連接，甲基磷酸鍵連接，硼酸磷酸化連接，肽核酸連接等抗核酸外切活性的連接。優(yōu)選的方式是采用硫代磷酸化連接修飾，而且這種修飾僅限于5′端以及3′端的第一個堿基和第二個堿基之間。
利用本發(fā)明提供的經(jīng)過修飾能夠抵抗高溫DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性的熒光探針，可以有效消除使用具有5′→3′核酸外切酶活性的高溫聚合酶進(jìn)行實時PCR檢測時產(chǎn)生的非特異信號，顯著改善熒光探針在實時PCR檢測中的性能。
利用本發(fā)明提供的經(jīng)過修飾能夠抵抗高溫DNA聚合酶3′→5′核酸外切酶活性的熒光探針，可以有效消除使用具有3′→5′核酸外切酶活性的高溫聚合酶進(jìn)行實時PCR檢測時產(chǎn)生的非特異信號，該修飾探針的用途之一是高保真實時PCR擴(kuò)增檢測，另一個用途是用于長片段的擴(kuò)增體系，該擴(kuò)增體系是將具有3′→5′核酸外切酶活性的高溫聚合酶如Pfu等摻入到去除5′→3′核酸外切酶活性的高溫聚合酶如KlenTaq中。
利用本發(fā)明提供的經(jīng)過修飾能夠同時抵抗高溫DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性和3′→5′核酸外切酶活性的熒光探針，可以有效消除混合使用具有5′→3′核酸外切酶活性和具有3′→5′核酸外切酶活性的高溫聚合酶進(jìn)行實時PCR檢測時產(chǎn)生的非特異信號，該修飾探針用途之一是用于長片段的擴(kuò)增體系，該擴(kuò)增體系是將具有3′→5′核酸外切酶活性的高溫聚合酶如Pfu等摻入到具有5′→3′核酸外切酶活性的高溫聚合酶如Taq中。



圖1表示使用AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶擴(kuò)增淀粉狀前體蛋白基因，分別用未經(jīng)修飾的置換探針和5′端硫代磷酸修飾的置換探針進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增檢測的結(jié)果。在圖1中，左圖使用的置換探針未經(jīng)修飾；右圖使用的置換探針的正鏈5′第一個堿基和第二個堿基之間的連接為硫代磷酸修飾。
圖2表示使用PfuDNA聚合酶擴(kuò)增淀粉狀前體蛋白基因，分別用未經(jīng)修飾置換探針和3′端硫代磷酸修飾置換探針進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增檢測的結(jié)果。在圖2中，左圖使用的置換探針未經(jīng)修飾；右圖使用的置換探針的負(fù)鏈3′端第一個堿基和第二個堿基之間為硫代磷酸修飾。
圖3表示使用EX Taq DNA聚合酶擴(kuò)增淀粉狀前體蛋白基因，分別用未經(jīng)修飾置換探針，5′端和3′端硫代磷酸修飾置換探針進(jìn)行長片段實時PCR擴(kuò)增檢測的結(jié)果。在圖3中，左圖使用的置換探針未經(jīng)修飾；右圖使用的置換探針的正鏈5′和負(fù)鏈3′端的第一個堿基和第二個堿基之間的連接為硫代磷酸修飾。
在圖1～3中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)(Cycle number)，縱坐標(biāo)為熒光值(Fluorescence)；黑色實線代表陰性控制(Negative)，灰色虛線代表陽性標(biāo)本(Positive)。
具體實施方式
通過下面給出的本發(fā)明的具體實施例可以進(jìn)一步了解本發(fā)明。
實施例1AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶擴(kuò)增淀粉狀前體蛋白基因，用未修飾置換探針和正鏈5′端硫代磷酸修飾置換探針實時檢測。
淀粉狀前體蛋白(APP)基因位于人類21號染色體上，該基因的異常表達(dá)跟一些疾病如唐氏綜合癥、阿爾茨海默病等相關(guān)。
本實施例APP基因為靶基因，設(shè)計引物和靶特異性置換探針進(jìn)行實時PCR檢測，所用引物為Primer1和Primer2，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長為100bp，檢測所用探針為Probe1或Probe2(序列見表1，下同)。
25μL反應(yīng)液中含10XPCR Gold buffer 2.5μL，2.0mM MgCl2，200μM dNTP，1.0U AmpliTaqGoldTMDNA聚合酶，10pmol上游引物，10pmol下游引物(序列見表1，下同)，10pmolprobe1或probe2，5μL人類全血基因組模板或超純水(陰性控制)。反應(yīng)條件95℃ 3min，循環(huán)周期為94℃ 15s，55℃ 20s，72℃ 20s共40個循環(huán)，每次在退火時實時采集FAM頻道的熒光數(shù)據(jù)。利用MX 3000P實時PCR儀進(jìn)行檢測。
實時PCR檢測結(jié)果見圖1，左圖檢測所用的置換探針為Probe1，右圖檢測所用的置換探針為Probe2。未修飾置換探針進(jìn)行實時PCR檢測時，即使是陰性控制，實時檢測曲線也不是一條平直的線，其熒光值從一開始就慢慢增加，產(chǎn)生非特異熒光信號，這說明置換探針在PCR過程中被具有5′→3′端外切酶活性的AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶酶切，而采用正鏈5′末端硫代磷酸修飾的置換探針進(jìn)行檢測時，則不會出現(xiàn)這種情況，這說明AmpliTaqGoldTM通過切除正鏈5′端來導(dǎo)致熒光的增加，而正鏈5′末端硫代磷酸修飾的置換探針能抵制AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶的外切活性，使探針檢測靶基因能得到理想的結(jié)果。
表1引物和探針序列


“*”代表硫代磷酸化連接實施例2pfuDNA聚合酶擴(kuò)增淀粉狀前體蛋白基因，用未修飾置換探針和負(fù)鏈3′端硫代磷酸修飾置換探針實時檢測。
本實施例靶基因和引物與實例1相同，檢測所用探針為Probe1或Probe3。
25μL反應(yīng)液中含10×Pfu反應(yīng)緩沖液(含20mM MgCl2)2.5μL，200μM dNTP，1.0Upfu DNA聚合酶，10pmol上游引物，10pmol下游引物，10pmol probe1或probe3，5μLPCR產(chǎn)物稀釋模板或超純水(陰性控制)。反應(yīng)條件95℃ 3min，循環(huán)周期為94℃ 15s，55℃ 20s，72℃ 20s共40個循環(huán)，每次在退火時實時采集FAM頻道的熒光數(shù)據(jù)。利用MX 3000P實時PCR儀進(jìn)行檢測。
實時PCR檢測結(jié)果見圖2，左圖檢測所用的置換探針為Probe1，右圖檢測所用的置換探針為Probe3。未修飾置換探針進(jìn)行實時PCR檢測時，即使是陰性控制，實時檢測曲線也不是一條平直的線，其熒光值從一開始就迅速增加，最后接近平臺，產(chǎn)生非特異熒光信號，這說明置換探針在PCR過程中被具有3′→5′端外切酶活性的Pfu DNA聚合酶酶切，而采用負(fù)鏈3′末端硫代磷酸修飾的置換探針進(jìn)行檢測時，則不會出現(xiàn)這種情況，這說明Pfu通過切除負(fù)鏈3′端來導(dǎo)致熒光的增加，而負(fù)鏈3′末端硫代磷酸修飾的置換探針能抵制Pfu DNA聚合酶的外切活性，使探針檢測靶基因能得到理想的結(jié)果。
實施例3EX Taq DNA聚合酶擴(kuò)增淀粉狀前體蛋白基因，分別用未經(jīng)修飾置換探針，5′端和3′端硫代磷酸修飾置換探針進(jìn)行長片段實時PCR擴(kuò)增檢測。
本實施例APP基因為靶基因，所用引物Primer3和Primer4，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長1082bp，檢測所用探針為Probe1或Probe4。
25μL反應(yīng)液中含10×EX Taq反應(yīng)緩沖液2.5μL，2.0mM MgCl2，200μM dNTP，1.0UEX Taq酶，10pmol上游引物，10pmol下游引物，10pmol probe1或probe4，5μL基因組模板或超純水(陰性控制)。反應(yīng)條件95℃ 3min，循環(huán)周期為94℃ 15s，55℃ 30s，72℃ 45s共40個循環(huán)，每次在退火時實時采集FAM頻道的熒光數(shù)據(jù)。利用MX 3000P實時PCR儀進(jìn)行檢測。
實時PCR檢測結(jié)果見圖3，左圖檢測所用的置換探針為Probe1，右圖檢測所用的置換探針為Probe4。未修飾置換探針進(jìn)行實時PCR檢測時，即使是陰性控制，實時檢測曲線也不是一條平直的線，其熒光值從一開始就迅速增加，最后接近平臺，這說明置換探針在PCR過程中被EX Taq酶的外切酶活性所酶切，而采用正鏈5′末端和負(fù)鏈3′末端都硫代磷酸修飾的置換探針進(jìn)行檢測時，則不會出現(xiàn)這種情況，這說明正鏈5′末端和負(fù)鏈3′末端都硫代磷酸修飾的置換探針能抵抗EX Taq酶外切活性，使長片段實時PCR擴(kuò)增檢測得到理想的結(jié)果。需要說明的是，在本實施例中，我們只知道EX Taq具有長片段PCR擴(kuò)增能力，無法了解EX Taq的具體組成。它可能是將具有3′→5′核酸外切酶活性的高溫聚合酶如Pfu等摻入到具有5′→3′核酸外切酶活性的高溫聚合酶如Taq中，也可能是將具有3′→5′核酸外切酶活性的高溫聚合酶如Pfu等摻入到去除5′→3′核酸外切酶活性的高溫聚合酶如KlenTaq中。因此，我們使用了正鏈5′末端和負(fù)鏈3′末端均硫代磷酸修飾的置換探針進(jìn)行檢測，如屬第二種情況，該探針則僅需進(jìn)行負(fù)鏈3′末端硫代磷酸修飾。
權(quán)利要求
1.實時PCR檢測中抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的熒光探針，其特征在于是指具有二級結(jié)構(gòu)即包含互補(bǔ)序列的熒光探針。
2.如權(quán)利要求
1所述的實時PCR檢測中抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的熒光探針，其特征在于所述的具有二級結(jié)構(gòu)即包含互補(bǔ)序列的熒光探針包括置換探針、分子信標(biāo)探針、蝎子引物、雙鏈引物、AmplifluorTM引物、LUXTM引物、UT探針。
3.如權(quán)利要求
1所述的實時PCR檢測中抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的熒光探針，其特征在于是一種經(jīng)修飾使其在實時PCR檢測中能夠抵抗高溫聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針。
4.如權(quán)利要求
3所述的實時PCR檢測中抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的熒光探針，其特征在于所述的修飾的方式是指能夠抵抗高溫DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性的各種修飾，優(yōu)選的方式是使探針的5′端能抗核酸聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，修飾方式包括修飾5′端堿基之間的連接，采用修飾的堿基衍生物，使用鎖定核酸，locked nucleicacids，LNA或者是增加化學(xué)功能團(tuán)；或者是修飾5′端堿基之間的連接，采用硫代磷酸化連接，甲基磷酸鍵連接，硼酸磷酸化連接，肽核酸連接，優(yōu)選的方式是采用硫代磷酸化連接修飾，這種修飾僅限于5′端的第一個堿基和第二個堿基之間。
5.如權(quán)利要求
1所述的實時PCR檢測中抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的熒光探針，其特征在于是一種經(jīng)修飾使其在實時PCR擴(kuò)增檢測中能夠抵抗高溫聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性，且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針。
6.如權(quán)利要求
5所述的實時PCR檢測中抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的熒光探針，其特征在于所述的修飾的方式是能抵抗高溫DNA聚合酶3′→5′核酸外切酶活性的各種修飾，優(yōu)選的方式是使探針的3′端能抗核酸聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性，修飾方式包括修飾3′端堿基之間的連接，采用修飾的堿基衍生物，使用鎖定核酸，locked nucleic acids，LNA，或者是增加化學(xué)功能團(tuán)，一種優(yōu)選的方式是修飾3′端堿基之間的連接，采用硫代磷酸化連接，甲基磷酸鍵連接，硼酸磷酸化連接，肽核酸連接，優(yōu)選的方式是采用硫代磷酸化連接修飾，而且這種修飾僅限于3′端的第一個堿基和第二個堿基之間。
7.如權(quán)利要求
1所述的實時PCR檢測中抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的熒光探針，其特征在于是一種經(jīng)修飾使其在長片段實時PCR擴(kuò)增檢測中能夠同時抵抗5′→3′核酸外切活性和3′→5′核酸外切酶活性，或只抵抗3′→5′核酸外切酶活性，且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針。
8.如權(quán)利要求
7所述的實時PCR檢測中抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的熒光探針，其特征在于所述的修飾的方式是能夠同時抵抗高溫DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性和3′→5′核酸外切酶活性的各種修飾，優(yōu)選的方式是使探針的5′端能抵抗核酸聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，3′端能抗核酸聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性，修飾方式包括修飾5′端以及3′端堿基之間的連接，采用修飾的堿基衍生物，或者是增加化學(xué)功能團(tuán)，一種優(yōu)選的方式是修飾5′端以及3′端堿基之間的連接，采用硫代磷酸化連接，甲基磷酸鍵連接，硼酸磷酸化連接，肽核酸連接，優(yōu)選的方式是采用硫代磷酸化連接修飾，而且這種修飾僅限于5′端以及3′端的第一個堿基和第二個堿基之間。
專利摘要
實時PCR檢測中抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的熒光探針，涉及一類熒光探針。提供在實時PCR檢測中能夠抵抗高溫聚合酶核酸外切酶活性的一類熒光探針。是一類具有二級結(jié)構(gòu)即包含互補(bǔ)序列的熒光探針，包含互補(bǔ)序列的熒光探針包括置換探針、分子信標(biāo)探針、蝎子引物等。給出經(jīng)修飾使其在實時PCR檢測中能抗高溫聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針、經(jīng)修飾使其在長片段實時PCR擴(kuò)增檢測中能抗高溫聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針和經(jīng)修飾使其在長片段實時PCR擴(kuò)增檢測中能同時抗5′→3′核酸外切活性和3′→5′核酸外切酶活性且不產(chǎn)生非特異信號的熒光探針。
文檔編號C12Q1/25GKCN1900312SQ200610036633
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月24日
發(fā)明者黃秋英, 李慶閣 申請人:廈門大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan