專利名稱：基于核酸外切酶Ⅰ保護(hù)分析檢測(cè)有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)相互作用的可視傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種檢測(cè)有機(jī)小分子與結(jié)合蛋白相互作用的生物傳感方法，包括末端有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA鏈與蛋白質(zhì)相互作用及其核酸外切酶I保護(hù)分析和基于標(biāo)記有有機(jī)小分子寡核苷酸DNA鏈修飾的Au納米顆粒進(jìn)行保護(hù)的比色檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
有機(jī)小分子與結(jié)合蛋白相互作用、藥物與化學(xué)毒素等有機(jī)小分子以及小分子結(jié)合蛋白的快速篩查與檢測(cè)對(duì)于臨床診斷、醫(yī)學(xué)研究、食品與公共安全、藥物篩選、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有極其重要的意義。目前常用的有機(jī)小分子與結(jié)合蛋白相互作用法的檢測(cè)技術(shù)主要有表面等離子共振、酶互補(bǔ)片段免疫分析以及熒光各向異性分析等。這些檢測(cè)技術(shù)需要復(fù)雜的操作，精密的儀器，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種基于核酸外切酶1保護(hù)分析檢測(cè)有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)相互作用的可視傳感方法，此方法對(duì)DNA序列沒有依賴性，操作簡(jiǎn)單，只需要把標(biāo)記有機(jī)小分子的DNA鏈通過Au-S鍵相互作用修飾到Au納米顆粒上，核酸外切酶I作用后Au納米顆粒在不同程度上發(fā)生團(tuán)聚，使溶液的顏色和紫外吸光度都會(huì)有很大變化，通過此方法可檢測(cè)小分子和結(jié)合蛋白相互作用、也可以檢測(cè)結(jié)合蛋白，或通過競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)檢測(cè)小分子；該方法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏，可直接目視進(jìn)行定性分析。
本發(fā)明的技術(shù)方案是，所述基于核酸外切酶I保護(hù)分析檢測(cè)有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)相互作用的可視傳感方法包括 (l)Au納米顆粒上末端有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA單鏈與蛋白質(zhì)的相互作用以及核酸外切酶I的保護(hù)分析； (2)Au納米顆粒上修飾的標(biāo)記有機(jī)小分子的寡核苷酸DNA單鏈在保護(hù)分析過程中
進(jìn)行定性分析和定量檢測(cè)。 以下對(duì)本發(fā)明做出進(jìn)一步說明。 本發(fā)明中，所述Au納米顆粒上末端有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA單鏈與蛋白質(zhì)的相互作用以及核酸外切酶I的保護(hù)分析為 對(duì)于有機(jī)小分子與結(jié)合蛋白的相互作用以及核酸外切酶I的保護(hù)分析，檢測(cè)步驟是取所述用有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA單鏈標(biāo)記的Au納米顆粒的儲(chǔ)備液置于微量管中；在微量管中加入包含有小分子結(jié)合蛋白的樣品溶液；然后加入核酸外切酶I反應(yīng)，得末端保護(hù)后的Au納米顆粒的溶液； 對(duì)于有機(jī)小分子的檢測(cè)以及核酸外切酶I的保護(hù)分析，采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)檢測(cè)步驟是取所述用有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA單鏈標(biāo)記的Au納米顆粒的儲(chǔ)備液置于微量管中；再加包含有待測(cè)小分子的樣品溶液，均勻混合后加入小分子結(jié)合蛋白或單克隆抗體溶液；再加入核酸外切酶I，得末端保護(hù)后的Au納米顆粒的溶液； Au納米顆粒上修飾的標(biāo)記有機(jī)小分子的寡核苷酸DNA單鏈在保護(hù)分析過程中進(jìn) 行定性分析和定量檢測(cè)；定性分析為采用直接目視觀察顏色的改變，定量檢測(cè)為采用標(biāo)準(zhǔn) 的紫外分光光度計(jì)對(duì)保護(hù)前后納米金的紫外吸收進(jìn)行檢測(cè)。 本發(fā)明中，所述單鏈寡核苷酸DNA末端有機(jī)小分子的修飾是通過現(xiàn)有的交聯(lián)反應(yīng) 技術(shù)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于帶有羧基的有機(jī)小分子，可以采用l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞 胺與琥珀酰亞胺交聯(lián)反應(yīng)技術(shù)與3'端NH2標(biāo)記的寡核苷酸DNA單鏈進(jìn)行交聯(lián)；交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn) 物可用透析純化。 本發(fā)明中，所述的有機(jī)小分子修飾的單鏈寡核苷酸DNA標(biāo)記的金納米顆粒通過文 獻(xiàn)成熟的標(biāo)記方法實(shí)現(xiàn)。修飾有小分子的單鏈寡核苷酸DNA鏈的另一端修飾有-SH官能團(tuán)， 通過Au-S鍵相互作用實(shí)現(xiàn)Au納米顆粒的修飾。通過離心去除未標(biāo)記的DNA鏈，離心后的 金納米顆粒懸浮于Exol標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液(67mM Glycine-KOH(pH 9. 5) ， 5mM MgCL2)備用。
進(jìn)一步地，在本發(fā)明中，所述Au納米顆粒上末端有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA 單鏈與蛋白質(zhì)的相互作用以及核酸外切酶I的保護(hù)分析采用以下步驟實(shí)現(xiàn)
a.對(duì)于有機(jī)小分子與結(jié)合蛋白的相互作用以及核酸外切酶I的保護(hù)分析，檢測(cè) 步驟是取5 L修飾有機(jī)小分子的單鏈寡核苷酸DNA標(biāo)記的金納米顆粒的儲(chǔ)備液于微量 管中，加入10iiL 5XExo1標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液，該緩沖溶液為67mM Glycine-KOH(pH 9. 5) ， 5mM MgCL2 ;再加入5 ii L包含待測(cè)小分子結(jié)合蛋白的溶液和30 ii L的滅菌水，37。C反應(yīng)30min，然 后加入0. 5ii L的核酸外切酶I，置于37t:反應(yīng)5min，得到核酸外切酶I處理后的納米金溶 液a。 b.對(duì)于有機(jī)小分子的檢測(cè)以及核酸外切酶I的保護(hù)分析，采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)檢測(cè)步驟 是取5 i！ L所述的修飾有機(jī)小分子的單鏈寡核苷酸DNA鏈標(biāo)記的金納米顆粒的儲(chǔ)備液于 微量管中，加入10iiL 5XExo1標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液，該溶液為67mM Glycine-KOH(pH 9. 5) ， 5mM MgCL2 ;再加入5 L包含待測(cè)小分子的樣品溶液，混合均勻后加入一定濃度的小分子的結(jié)合 蛋白或(鼠源)單克隆抗體3iiL，小分子的結(jié)合蛋白或(鼠源)單克隆抗體終當(dāng)量濃度為 加入的有機(jī)小分子修飾寡核苷酸DNA單鏈濃度的5倍；在37t:恒溫反應(yīng)0. 5小時(shí)；然后加 入0. 5 L核酸外切酶I，置于37t:反應(yīng)5分鐘，得核酸外切酶處理后的納米金溶液b。
注意，以上反應(yīng)條件為最優(yōu)條件，所述溶液體積均可成倍變化不改變最優(yōu)結(jié)果。改 變比例或試劑加入順序可使有機(jī)小分子修飾寡核苷酸DNA單鏈的保護(hù)效率在3% 100% 內(nèi)變化。 本發(fā)明中，所述的末端保護(hù)單鏈寡核酸DNA標(biāo)記的金納米顆?？刹捎玫臋z測(cè)方 法 (1)通過肉眼觀察酶切處理后的溶液a或b顏色從紅到紫到蘭的差異。
(2)吸收廣度法檢測(cè)直接檢測(cè)酶切處理后的溶液a或b納米金最大吸收處紫外
光吸光度的變化值。 本發(fā)明建立的基于核酸外切酶I端點(diǎn)保護(hù)分析檢測(cè)有機(jī)小分子與結(jié)合蛋白相互 作用的生物傳感技術(shù)，利用小分子修飾的單鏈寡核苷酸DNA鏈修飾的納米金在核酸外切酶 I作用下，沒有被保護(hù)的DNA鏈被核酸外切酶I降解，從而使納米金團(tuán)聚變色，但是被修飾的 小分子和結(jié)合蛋白相互作用后，被保護(hù)的DNA鏈仍能使納米金分散在溶液中，呈現(xiàn)酒紅色。因此，該技術(shù)可直接用于小分子結(jié)合蛋白的檢測(cè)，也可通過樣品溶液中小分子與小分子標(biāo)記的寡核苷酸DNA單鏈競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合間接檢測(cè)有機(jī)小分子。它靈敏度高，操作快速簡(jiǎn)便，可望為臨床診斷、藥物研發(fā)、藥毒物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等提供一個(gè)通用技術(shù)平臺(tái)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :基于核酸外切酶末端保護(hù)分析所介導(dǎo)的納米金變色檢測(cè)赭曲霉素A
1) 3'端NH2標(biāo)記的寡核苷酸DNA鏈和赭曲霉素A的交聯(lián) 稱取9. 3mg的赭曲霉素A溶于2. 5mL磷酸鹽緩沖溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)，再加入lmg的1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)_碳二亞胺(EDC)，在室溫下攪拌15min，再加入2. 8mg琥珀酰亞胺(NHS)，在室溫反應(yīng)30分鐘；取260 y 1活化后的赭曲霉素A溶液加入到260 ii 1濃度為10 ii M的3'端NH2標(biāo)記5'端SH或Dual SH標(biāo)記的單鏈寡核苷酸DNA (序列
列是任意的))的溶液中，用1M的NaOH調(diào)其pH為7. 4，在輕微攪拌下室溫反應(yīng)2小時(shí)。
把交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物移到lmL的透析管中，透析管的截留分子量為6000D。把透析管放入500ml磷酸鹽緩沖溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)中在4t:透析12小時(shí)，每隔3小時(shí)更換一次透析液，最后一次用超純水透析。透析之后的寡核苷酸DNA鏈分管保存于-20°C的冰箱中備用。 2)赭曲霉素A修飾的單鏈寡核苷酸DNA標(biāo)記金納米顆粒 取上述赭曲霉素A標(biāo)記的寡核苷酸DNA單鏈儲(chǔ)備液(1 P M) lmL加入到離心后納米金中，室溫老化24h ;隨后加入0. 1M磷酸緩沖溶液(KH2P04， Na2HP04 pH 7. 0)和10mM磷酸鹽緩沖溶液(10mM KH2P04， Na2HP04 pH 7. 0和2M NaCL)，使最終的磷酸緩沖溶液的濃度為lOmM， NaCl的濃度為0. 1M，室溫老化48h ;最后再加lOmM磷酸鹽緩沖溶液(10mMKH2P04， Na2HP04 pH 7. 0和2M NaCL)，使最終NaCL的濃度為0. 3M ;通過在15000轉(zhuǎn)速離心去除沒有標(biāo)記上的DNA，離心之后的金納米顆粒復(fù)溶于200 ii 1 Exol緩沖溶液中(67mMGlycine-KOH(pH 9. 5) 5mM MgCL2) 4。C保存?zhèn)溆谩?br> 3)赭曲霉素A的檢測(cè) 取5yL所述的修飾有機(jī)小分子的單鏈寡核苷酸DNA標(biāo)記的金納米顆粒的儲(chǔ)備液于微量管中，加入10iiL 5XExo1標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液，該溶液為67mM Glycine-KOH(pH9. 5)5mMMgCL2，再加入5 y 1待檢測(cè)的赭曲霉素A樣品溶液，混合均勻后加入3 y 1濃度為1 P L的赭曲霉素A鼠源單克隆抗體，再加入27 L滅菌水，室溫反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)后加入0. 5 ill核酸外切酶I (NEB公司)在37t:酶切30分鐘；反應(yīng)后的終產(chǎn)物直接加入到50 y 1的紫外比色杯中進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)在其最大吸收值的吸光度變化。
按上述1) 、2)和3)步驟對(duì)7個(gè)配制的赭曲霉素A標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度從lnM到200nM，共做7個(gè)不同的濃度)進(jìn)行檢測(cè)，記錄各標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品最大吸收值的吸光度變化。用紫外吸光度變化值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中赭曲霉素A濃度作圖獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。 實(shí)施例2 :基于核酸外切酶末端保護(hù)分析所介導(dǎo)的納米金變色檢測(cè)葉酸結(jié)合蛋白
1) 3'端NH2標(biāo)記的寡核苷酸DNA鏈和葉酸的交聯(lián) 稱取10mg的葉酸溶于2. 5mL磷酸鹽緩沖溶液(0. 1M KH2P04和Na2HP04， pH 7. 4)，再加入lmg的1-乙基_3-(3- 二甲基氨丙基)-碳二亞胺(EDC)，在室溫下攪拌15分鐘，再加入2. 8mg琥珀酰亞胺(NHS)，在室溫反應(yīng)30分鐘；取260 y 1活化后的葉酸溶液加入到 260 ii 1濃度為1 ii M的3'端NH2標(biāo)記5'端SH或Dual SH標(biāo)記的單鏈寡核苷酸DNA (序列
是任意的))的溶液中，用1M的NaOH調(diào)其pH為7. 4，在輕微攪拌下室溫反應(yīng)2小時(shí)。
把交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物移到lmL的透析管中，透析管的截留分子量為6000D。把透析管放 入500ml磷酸鹽緩沖溶液(00. 1M KH2P04和Na2HP04，pH 7. 4)中在4"透析12小時(shí)，每隔3 小時(shí)更換一次透析液，最后一次用超純水透析。透析之后的寡核苷酸DNA鏈分保存于-2(TC 的冰箱中備用。 2)葉酸修飾的單鏈寡核苷酸DNA標(biāo)記納米金顆粒 取上述葉酸標(biāo)記的寡核苷酸DNA單鏈儲(chǔ)備液(1 y M) lmL加入到離心后納米金中， 室溫老化24h ;隨后加入0. IM磷酸緩沖溶液(KH2P04，Na2HP04 pH 7. 0)和lOmM磷酸鹽緩沖 溶液(10mM KH2P04， Na2HP04 pH 7. 0和2M NaCL)，使最終的磷酸緩沖溶液的濃度為lOmM， NaCl的濃度為0. 1M，室溫老化48h ;最后再加lOmM磷酸鹽緩沖溶液(10mMKH2P04， Na2HP04 pH 7. 0和2M NaCL)，使最終NaCL的濃度為0. 3M ;通過在15000轉(zhuǎn)速離心去除沒有標(biāo)記上 的DNA，離心之后的納米金復(fù)溶于200ii1 Exol緩沖溶液中(67mMGlycine-K0H(pH 9. 5) 5mM MgCL》4t:保存?zhèn)溆谩?
3)葉酸結(jié)合蛋白的檢測(cè) 取5yL所述的修飾有機(jī)小分子的單鏈寡核苷酸DNA標(biāo)記的金納米顆粒的儲(chǔ) 備液于微量管中，加入10iiL 5XExo1標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液，該溶液為67mM Glycine-KOH(pH 9. 5) 5mMMgCL2，再加入5 y 1待檢測(cè)的葉酸結(jié)合蛋白樣品溶液，再加入30 y L滅菌水，室溫反 應(yīng)15分鐘，反應(yīng)后加入0. 5 iil核酸外切酶I (NEB公司)在37t:酶切30分鐘；反應(yīng)后的終 產(chǎn)物直接加入到50 iU的紫外比色杯中進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)在其最大吸收值的吸光度 變化。 按上述1)、2)和3)步驟對(duì)7個(gè)配制的葉酸結(jié)合蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度從lnM到 200nM)進(jìn)行檢測(cè)，記錄各標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品的最大吸收值的吸光度變化值做葉酸結(jié)合蛋白的濃 度和熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知樣品中葉酸結(jié)合蛋白所產(chǎn)生的紫外吸光度的變化和標(biāo)準(zhǔn)的 曲線對(duì)照確定其濃度。
權(quán)利要求
一種基于核酸外切酶I保護(hù)分析檢測(cè)有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)相互作用的可視傳感方法，其特征是，該方法包括(1)Au納米顆粒上末端有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA單鏈與蛋白質(zhì)的相互作用以及核酸外切酶I的保護(hù)分析；(2)Au納米顆粒上修飾的標(biāo)記有機(jī)小分子的寡核苷酸DNA單鏈在保護(hù)分析過程中進(jìn)行定性分析和定量檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于核酸外切酶I保護(hù)分析檢測(cè)有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)相互作用的可視傳感方法，其特征是，Au納米顆粒上末端有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA單鏈與蛋白質(zhì)的相互作用以及核酸外切酶I的保護(hù)分析采用以下步驟實(shí)現(xiàn)對(duì)于有機(jī)小分子與結(jié)合蛋白的相互作用以及核酸外切酶I的保護(hù)分析，檢測(cè)步驟是取所述用有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA單鏈標(biāo)記的Au納米顆粒的儲(chǔ)備液置于微量管中；在微量管中加入包含有小分子結(jié)合蛋白的樣品溶液；然后加入核酸外切酶I反應(yīng)，得末端保護(hù)后的Au納米顆粒的溶液；對(duì)于有機(jī)小分子的檢測(cè)以及核酸外切酶I的保護(hù)分析，采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)檢測(cè)步驟是取所述用有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA單鏈標(biāo)記的Au納米顆粒的儲(chǔ)備液置于微量管中；再加包含有待測(cè)小分子的樣品溶液，均勻混合后加入小分子結(jié)合蛋白或單克隆抗體溶液；再加入核酸外切酶I，得末端保護(hù)后的Au納米顆粒的溶液；
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于核酸外切酶I保護(hù)分析檢測(cè)有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)相互作用的可視傳感方法，其特征是，所述定性分析采用直接目視觀察顏色的改變，定量檢測(cè)為采用標(biāo)準(zhǔn)的紫外分光光度計(jì)對(duì)保護(hù)前后納米金的紫外吸收進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種于核酸外切酶I保護(hù)分析所介導(dǎo)的納米金變色檢測(cè)小分子和結(jié)合蛋白相互作用的可視比色傳感方法，它包括納米金上標(biāo)記的修飾有機(jī)小分的單鏈寡核苷酸DNA鏈與蛋白質(zhì)相互作用及核酸外切酶I保護(hù)分析和基于末端保護(hù)的單鏈寡核苷酸DNA介導(dǎo)的納米金變色對(duì)DNA鏈進(jìn)行的比色檢測(cè)。本發(fā)明利用標(biāo)記在金納米顆粒上的寡核苷酸DNA鏈3’末端修飾的小分子和其結(jié)合蛋白或抗體的特異性結(jié)合，基于核酸外切酶I末端保護(hù)作用，通過被保護(hù)的寡核苷酸DNA鏈?zhǔn)菇鸺{米顆粒在鹽溶液中穩(wěn)定存在進(jìn)行小分子與蛋白相互作用以及小分子或其結(jié)合蛋白的檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)快速、靈敏、特異性強(qiáng)，可望成為食品與農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)、環(huán)境毒物檢測(cè)、藥物篩選等的通用技術(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101717823SQ20091022702
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者俞汝勤, 吳戰(zhàn), 楚霞, 沈國(guó)勵(lì), 蔣健暉 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)