專利名稱：基于核酸外切酶Ⅲ/Ⅰ保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性的熒光生物傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種檢測單核苷酸多態(tài)性的生物傳感方法，包括小分子修飾的單個脫氧核苷酸等位特異性延伸技術(shù)，延伸后帶有小分子的寡核苷酸DNA鏈引物與結(jié)合蛋白的相互作用以及核酸外切酶III/I的保護(hù)分析和基于雙鏈指示染料進(jìn)行末端保護(hù)的雙鏈結(jié)構(gòu)寡核苷酸DNA鏈的熒光定量檢測。
背景技術(shù)：
人類的許多遺傳疾病如a和|3地中海貧血癥等都是由于單基因突變產(chǎn)生的。這些遺傳疾病是我國最主要的出生缺陷之一，嚴(yán)重影響我國的人口質(zhì)量，給社會與家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，需要建立一種快速、靈敏、特異性的檢測技術(shù)。傳統(tǒng)基因突變檢測主要借助于電泳、質(zhì)譜或基因芯片方法，這些方法需昂貴精密儀器，操作程序復(fù)雜，技術(shù)外延性差，分析周期長，故不適于進(jìn)行大規(guī)模人群篩查與產(chǎn)前診斷。目前國際上的主要趨勢都集中于以DNA修飾酶為基礎(chǔ)，利用酶催化反應(yīng)提高基因突變鑒定方法的忠實(shí)性、可靠性與靈敏度，發(fā)展操作簡便、快速可靠、低成本、高通量的基因突變分析手段。例如，基于DNA聚合酶的等位特異性延伸或外切建立的T叫Man探針分析、單核苷酸延伸分析等，基于DNA連接酶的等位特異性連接建立的寡核苷酸連接分析、連接酶鏈分析等，基于DNA內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)識別的Invader分析等。但是，這些技術(shù)通常需采用特殊的熒光標(biāo)記探針(如雙標(biāo)記)，分析成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出了一種基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性的熒光生物傳感方法，這種方法不需要特殊的熒光標(biāo)記，可用于單核苷酸多態(tài)性的準(zhǔn)確、快速檢測。 本發(fā)明的技術(shù)方案是，基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性的熒光生物傳感方法包括 (1)小分子修飾的單個脫氧核苷酸等位特異性延伸和延伸后帶有小分子的寡核苷
酸DNA鏈引物與結(jié)合蛋白的相互作用以及核酸外切酶III/I的保護(hù)分析 (2)基于雙鏈指示染料進(jìn)行末端保護(hù)的雙鏈結(jié)構(gòu)寡核苷酸DNA鏈的熒光定量檢 以下對本發(fā)明做出進(jìn)一步說明。 本發(fā)明中，延伸了小分子標(biāo)記的單個脫氧核苷酸的發(fā)夾型探針引物與結(jié)合蛋白相互作用使其不被核酸外切酶III/I降解以及被保護(hù)的引物的檢測采用生物素標(biāo)記的單個脫氧核苷酸的等位特異性延伸以及核酸外切酶III/I保護(hù)。 進(jìn)一步地，所述基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性的熒光生物傳感方法采用以下步驟實(shí)現(xiàn)
取發(fā)夾型探針引物和小分子標(biāo)記的四種脫氧核苷酸于PCR管中，在待測目標(biāo)物和DNA聚合酶存在的情況下進(jìn)行單個堿基等位特異性聚合延伸反應(yīng)，再加入小分子結(jié)合蛋白與PCR管中，然后加入核酸外切酶I11/1反應(yīng)。 所述末端保護(hù)的發(fā)夾型探針引物DNA鏈的定量檢測可采用標(biāo)準(zhǔn)的雙鏈熒光嵌入染料指示劑法進(jìn)行檢測。 本發(fā)明中，所述基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性由以下幾個步驟實(shí)現(xiàn) 小分子標(biāo)記的單個脫氧核苷酸的等位特異性延伸堿基延伸反應(yīng)的總體積為25iiL，在四個不同的PCR管中進(jìn)行，其中每管包括待檢測的目標(biāo)鏈，5pmo1的檢測探針50pmol的Biotin-ddNTP四種單脫氧核苷酸的一種，2unit Taq DNA聚合酶，1 XDNA聚合酶緩沖溶液，反應(yīng)在在200 ii L的PCR管中進(jìn)行，94t:變性3min，94t:變性30s，62t:退火30s，68t:延伸10s，共20循環(huán)，最后停留在4t:。延伸之后的產(chǎn)物在8(TC熱失活30min，終止延伸反應(yīng)。 核酸外切酶III/I保護(hù)取1. 5 ii L濃度為lmg/mL的鏈酶親和素于上述單堿基延伸反應(yīng)后的溶液中，37t:恒溫反應(yīng)0. 5小時；再加入80U的核酸外切酶I和40U的核酸外切酶III，置于37"恒溫反應(yīng)0， 5小時后，升溫到8(TC反應(yīng)10min，進(jìn)行滅火以終止酶切反應(yīng)。
注意，以上反應(yīng)條件為最優(yōu)條件，所述溶液體積均可成倍變化不改變最優(yōu)結(jié)果。
本發(fā)明中，所述基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性的熒光生物傳感方法的定量檢測可采用標(biāo)準(zhǔn)的雙鏈熒光指示劑法進(jìn)行，以下是用雙鏈熒光嵌入染料SYBR-GREEN 1指示劑法對基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性的的定量檢測步驟 所述核酸外切酶III/I作用后的反應(yīng)溶液中，加入5ii1 SYBR-GREEN 1 (—種雙鏈熒光嵌入染料，l : 30000稀釋)，用核酸外切酶反應(yīng)緩沖液稀釋到100 iU，放入熒光光譜儀，以480nm為激發(fā)波長、520nm為發(fā)射波長測其熒光信強(qiáng)度。 本發(fā)明提出了一種基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性的分析檢測方法，該方法無需熒光標(biāo)記，僅需設(shè)計(jì)一條發(fā)夾型的寡核苷酸探針引物，在目標(biāo)鏈存在的情況下延伸一個小分子標(biāo)記的脫氧核苷酸，即可利用小分子與其結(jié)合蛋白相互作用保護(hù)該引物不被外切酶III/I降解對單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行基因分型；其操作快速簡便、靈敏特異，樣品用量少、操作簡便、成本較低、能快速自動化實(shí)現(xiàn)，可望為人群篩查、產(chǎn)前診斷提供一個通用的技術(shù)平臺。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析用于13地貧654位點(diǎn)的突變檢測
1)生物素標(biāo)記的單個脫氧核苷酸的等位特異性延伸堿基延伸反應(yīng)的總體積為25L，在四個不同的PCR管中進(jìn)行，其中每個管中包括待檢測的目標(biāo)鏈，5pmo1的發(fā)夾型寡核苷酸探針引物，引物序列為GAA TTC CAA GCG CGA AG TTTT CTT CGC GCT TGG AATTC TTTTTTCAC CAT TCT AAA GAA TAA CAG TGA TAA TTT CTG GGT TAA GG，50pmo1的四禾中Biotin-dNTP(Invitrogen)的一種堿基，2unit Taq DNA聚合酶(NEB)，1XT即DNA聚合酶標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液(10mM Tris-HCL(pH 8. 6) ， 50mM KCL， 1. 5mM MgCL2)，反應(yīng)在200 ii L的PCR管中進(jìn)行，94。C變性3min，94。C變性30s，62。C退火30s，68。C延伸10s，共進(jìn)行20循環(huán)，最后停留在4°C 。延伸之后的產(chǎn)物在8(TC熱失活10min，終止延伸反應(yīng)。 2)核酸外切酶III/I保護(hù)取3 ii L濃度為lmg/mL的鏈酶親和素于上述單堿基延伸反應(yīng)后的溶液中，37t:恒溫反應(yīng)0. 5小時；再加入80U的核酸外切酶I (NEB)和40U的核酸外切酶III (NEB)，置于37"恒溫反應(yīng)0， 5小時后，升溫到8(TC反應(yīng)10min，進(jìn)行滅火以終止酶切反應(yīng)。 單核苷酸多態(tài)性的檢測；加入5iU SYBR-GREEN 1 (—種雙鏈熒光嵌入染料，1 : 30000稀釋)，用核酸外切酶III反應(yīng)緩沖液(10mM Bis Tris Propane-HCL， 10mMMgCL2， lmMDTT(pH 7. O))稀釋酶切終產(chǎn)物到100 y 1，放入熒光光譜儀，以480nm為激發(fā)波長、520nm為發(fā)射波長測其熒光強(qiáng)度。 按照上述步驟1)、2)對8個四種不同基因型的目標(biāo)鏈(人工合成)的標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度從100pM到100nM)進(jìn)行檢測，記錄各標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，未知樣品的熒光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)的液的熒光強(qiáng)度對照，從而確定未知樣品的基因型。 實(shí)施例2 :基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析用于K-ras基因第12密碼子的突變檢 1)生物素標(biāo)記的單個脫氧核苷酸的等位特異性延伸堿基延伸反應(yīng)的總體積為25L，在四個不同的PCR管中進(jìn)行，其中每個管中包括待檢測的目標(biāo)鏈，5pmo1的發(fā)夾型寡核苷酸探針引物，引物序列為(GAA TTC CAA GCG CGA AG TTTT CTT CGC GCT TGG AAT TCTTTTTTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTG) ，50pmol的四種Biotin-dNTP(Invitrogen)的一種堿基，2unit Taq DNA聚合酶(NEB)，1XT即DNA聚合酶標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液(10mMTris-HCL(pH8. 6) ，50mM KCL， 1. 5mM MgCL2)，反應(yīng)在200 ii L的PCR管中進(jìn)行，94。C變性3min，94。C變性30s， 65。C退火30s， 72。C延伸10s，共進(jìn)行20循環(huán)，最后停留在4°C 。延伸之后的產(chǎn)物在80°C熱失活15min，終止延伸反應(yīng)。 核酸外切酶III/I保護(hù)取3 ii L濃度為lmg/mL的鏈酶親和素于上述單堿基延伸反應(yīng)后的溶液中，37t:恒溫反應(yīng)0. 5小時；再加入80U的核酸外切酶I (NEB)和40U的核酸外切酶III (NEB)，置于37"恒溫反應(yīng)0，5小時后，升溫到8(TC反應(yīng)10min，進(jìn)行滅火以終止酶切反應(yīng)。 2)單核苷酸多態(tài)性的檢測；加入5 ill SYBR-GREEN 1 ( —種雙鏈熒光嵌入染料，1 : 30000稀釋)，用核酸外切酶III反應(yīng)緩沖液(10mM Bis Tris Propane-HCL， 10mMMgCL2， lmMDTT(pH7. O))稀釋酶切終產(chǎn)物到100 y l，放入熒光光譜儀，以480nm為激發(fā)波長、520nm為發(fā)射波長測其熒光強(qiáng)度。 按照上述步驟1)、2)對8個四種不同基因型的目標(biāo)鏈(人工合成)的標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度從100pM到100nM)進(jìn)行檢測，記錄各標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，未知樣品的熒光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)的液的熒光強(qiáng)度對照，從而確定未知樣品的基因型。
權(quán)利要求
一種基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性的熒光生物傳感方法，其特征是，該方法包括(1)小分子修飾的單個脫氧核苷酸等位特異性延伸和延伸后帶有小分子的寡核苷酸DNA鏈引物與結(jié)合蛋白的相互作用以及核酸外切酶III/I的保護(hù)分析(2)基于雙鏈指示染料進(jìn)行末端保護(hù)的雙鏈結(jié)構(gòu)寡核苷酸DNA鏈的熒光定量檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性的熒光生 物傳感方法，其特征是，延伸了小分子標(biāo)記的單個脫氧核苷酸的發(fā)夾型探針引物與結(jié)合蛋 白相互作用使其不被核酸外切酶III/I降解以及被保護(hù)的引物的檢測采用生物素標(biāo)記的 單個脫氧核苷酸的等位特異性延伸以及核酸外切酶III/I保護(hù)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述基于核酸外切酶III/I保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性的熒 光生物傳感方法，其特征是，它采用以下步驟實(shí)現(xiàn)取發(fā)夾型探針引物和小分子標(biāo)記的四種脫氧核苷酸于PCR管中，在待測目標(biāo)物和DNA 聚合酶存在的情況下進(jìn)行單個堿基等位特異性聚合延伸反應(yīng)，再加入小分子結(jié)合蛋白與 PCR管中，然后加入核酸外切酶III/I反應(yīng)；所述末端保護(hù)的發(fā)夾型探針引物DNA鏈的定量檢測采用標(biāo)準(zhǔn)的雙鏈熒光嵌入染料指 示劑法進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于核酸外切酶保護(hù)分析檢測單核苷酸多態(tài)性的熒光生物傳感方法，它包括小分子修飾的單個脫氧核苷酸等位特異性延伸和延伸后帶有小分子的寡核苷酸DNA鏈引物與結(jié)合蛋白的相互作用以及核酸外切酶III/I的保護(hù)分析及基于雙鏈指示染料進(jìn)行末端保護(hù)的發(fā)夾型寡核苷酸DNA探針引物的熒光定量檢測。本發(fā)明利用引物等位特異性延伸在特定引物的3’末端結(jié)合單個小分子修飾的脫氧核苷酸，在和小分子結(jié)合蛋白特異性結(jié)合保護(hù)該引物不被核酸外切酶III/I降解，通過被保護(hù)的寡核苷酸DNA引物與雙鏈嵌合染料的復(fù)合物的熒光進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性基因分型的檢測。該方法操作簡便、經(jīng)濟(jì)快速、靈敏、特異性強(qiáng)，可望為基因突變相關(guān)的遺傳病的人群篩查、產(chǎn)前診斷提供一個通用的技術(shù)平臺。
文檔編號G01N21/64GK101705292SQ20091022702
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者俞汝勤, 吳戰(zhàn), 楚霞, 沈國勵, 蔣健暉 申請人:湖南大學(xué)