一種基于光二極管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光測(cè)定Ago2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)發(fā)光技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于光二極管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光測(cè)定Ag〇2 蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在哺乳動(dòng)物中Ago蛋白家族包含8個(gè)成員，其中的4個(gè)（Agol~Ag〇4)在很多細(xì) 胞中是緊密相關(guān)的。然而，只有Ag〇2蛋白被賦予了核酸內(nèi)切酶的活性，這就使得它在引導(dǎo) 目標(biāo)mRNA切割反應(yīng)中扮演著一個(gè)特殊的角色。到目前為止，已經(jīng)研制出來(lái)幾種方法用于 分析檢測(cè)Ag〇2蛋白的核酸內(nèi)切酶活性，例如熒光法（F. Li，M. Chen，X. Sun，X. Wang，P. Li，A novel graphene oxide-based fluorescence assay for RNA endonuclease activity of mammalian Argonaute2 protein.Sensors and Actuators B 182(2013) 156-160 ；F. Li, P. Li,L. M. Yang, B. Tang, Simple and sensitive fluorescence detection of the RNA endonuclease activity of mammalian argonaute2protein based on an RNA molecular beacon，Chemical Communications 48(2012) 12192-12194);電化學(xué)法（N. Yang，Y Cao，P. Han, X Zhu, L Sun，G Li，Tools for investigation of the RNA endonuclease activity of mammalian Argonaute2 protein, Analytical Chemistry (2012) 84 (5) : 2492-2497)等。 這些方法各有其缺點(diǎn)。
[0003] 本發(fā)明建立了一種基于光二極管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶 活性的新方法。光二極管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光具有高靈敏度和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合Ag〇2蛋白切 割核酸循環(huán)利用的特點(diǎn)，建立了一種新穎、簡(jiǎn)單、靈敏的方法來(lái)檢測(cè)Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi) 切酶活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的測(cè)定方法，利用光二極 管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光方法，以標(biāo)記異硫氰酸熒光素的核酸P-FITC為探針，實(shí)現(xiàn)了 Ag〇2蛋白的 RNA核酸內(nèi)切酶活性的測(cè)定。
[0005] 技術(shù)方案
[0006] -種基于光二極管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光測(cè)定Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法，其 特征是利用光二極管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光方法，以標(biāo)記異硫氰酸熒光素的核酸P-FITC為探針，建 立了一種Ago2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性測(cè)定的方法，其特征為：
[0007] (a)首先，制備M〇S2單層膜，將MoS 2粉體分散到得到DMF中，得到MoS 2的DMF溶 液，將該溶液在室溫下超聲，然后離心，得到黑色沉淀，最后，收集沉淀物，經(jīng)過(guò)水洗滌，然后 再分散于水中，形成溶液；
[0008] (b) P-FITC修飾MoS2的制備，將（a)步驟中制得的MoS 2與P-FITC混合均勻，然后 加入一定量的Tris-HCl緩沖液，反應(yīng)一段時(shí)間，然后離心，收集沉淀物，經(jīng)過(guò)水洗滌，然后 再分散于水中，得P-FITC修飾此&的溶液；
[0009] (c) Ago2-RNA復(fù)合物制備，將Ago2樣品溶液與RNA的Tris-HCl-RNasin緩沖液混 合，孵化，使得RNA與Ag 〇2蛋白充分結(jié)合，得Ag〇2-RNA復(fù)合物；
[0010] (d)隨后，再將（C)步驟所得的Ago2-RNA復(fù)合物加入到（b)步驟的P-FITC修飾 MoSj^溶液中，反應(yīng)；
[0011] (e)將（d)步驟所得的溶液經(jīng)過(guò)離心之后，取部分上層清夜置于小燒杯中，再加入 魯米諾溶液，打開(kāi)光二極管電源，照射后關(guān)閉電源，然后測(cè)定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)化學(xué)發(fā)光 強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)Ag 〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性測(cè)定。
[0012] 測(cè)定具體步驟如下：
[0013] (l)M〇S2單層膜制備。將MoS 2粉體分散到得到DMF中，得到MoS 2的DMF溶液。將 該溶液在室溫下超聲4~24小時(shí)。然后在3000~16000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，離心10min 得到黑色沉淀。最后，收集沉淀物，經(jīng)過(guò)水洗滌后，再分散于水中，形成0. 5mg/mL的溶液。
[0014] (2) P-FITC 修飾 MoS2的制備。將 300 y L 濃度為 200 y g/mL MoS 2的溶液與 6. 0 y L 4. 0 yM P-FITC的溶液混合均勻，然后加入一定量的Tris-HCl緩沖液，使得P-FITC的最終 濃度為80nM，在37°C下反應(yīng)30min，得P-FITC修飾MoS2。
[0015] (3)Ago2-RNA復(fù)合物制備。將300 y L的Ago2樣品溶液與300 y L RNA的 Tris-HCl-RNasin緩沖液混合，在37 °C下孵化30min，使得RNA與Ago2蛋白充分結(jié)合，得 Ago2-RNA復(fù)合物。
[0016] (4)隨后，再將上述所得的Ag〇2-RNA復(fù)合物加入到P-FITC修飾M 〇S2的溶液中， 37°C條件下反應(yīng)30min。
[0017] (5)經(jīng)過(guò)離心之后，取部分上層清夜于2mL玻璃燒杯中，并加入20 yL pH 11. 30的 4mM的魯米諾溶液。打開(kāi)光二極管電源，照射一段時(shí)間后關(guān)閉電源，然后測(cè)定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度， 根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)Ag 〇2的RNA核酸內(nèi)切酶活性的測(cè)定。
[0018] 本發(fā)明的化學(xué)試劑優(yōu)選分析純?cè)噭?，所有溶液均用二次蒸餾水配置。
[0019] 本發(fā)明的 Tris-HCl 緩沖液由 pH 7. 4 的 20mM Tris-HCl，50mM KC1，1. 5mM MgCl2， 1%。DEPC 組成。
[0020] 本發(fā)明的 Tris-HCl-RNasin 緩沖液由 pH 7. 4 的 20mM Tris-HCl，1 y nit/ y L RNasin，50mM KC1，1. 5mM MgCl2,1%。DEPC 組成。
[0021] 本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光測(cè)定選用MPI-E型化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（西安瑞邁分析儀器有限 責(zé)任公司）。
[0022] 本發(fā)明的振蕩孵育選用THZ-82A氣浴恒溫振蕩器（全壇市醫(yī)療儀器廠）。
[0023] 本發(fā)明的離心機(jī)選用Anke-TGL_16C飛翁牌高速離心機(jī)（上海市安亭科學(xué)儀器 廠）。
[0024] 本發(fā)明的pH測(cè)量選用PHS-3D型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）。
[0025] 本發(fā)明的顯著效果
[0026] 本發(fā)明研究了不同濃度Ago2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性與發(fā)光強(qiáng)度之間的關(guān)系， 得到了檢測(cè)Ag 〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍及線性方程。
[0027] 當(dāng)Ag〇2的濃度在0. 5nM-90nM之間時(shí)，隨著Ag〇2濃度的變化，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度 有明顯變化。經(jīng)計(jì)算得到檢測(cè)Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性線性回歸方程是I a = 5. 4207x+4. 6628 (Ia是體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；x是Ag〇2的濃度，nM ;n = 12, n表示同一濃 度測(cè)定次數(shù)），線性相關(guān)系數(shù)R = 0. 9991，檢測(cè)限是0. 3nM。
[0028] 該測(cè)定方法的精密度通過(guò)對(duì)濃度為3. OnM的Ago2進(jìn)行11次平行測(cè)定而計(jì)算得 出，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3. 8%，表明本發(fā)明的測(cè)定方法有較好的重現(xiàn)性。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1.測(cè)定Ago2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性方法原理圖。
[0030] 圖2. Ago2標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)是Ago2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性，單位是nM，縱坐 標(biāo)la是體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。
[0031] 圖3?方法檢測(cè)Ago2，Thrombin，BSA，Hemoglobin和IgG的化學(xué)發(fā)光信號(hào)比較。其 中 Thrombin，BSA，Hemoglobin 和 IgG 濃度為 5 yM，Ago2 濃度為 50nM。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 按照技術(shù)方案的步驟（1)至（5)得到Ag〇2標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2,其中Ag 〇2蛋白是從北 京義翹神州有限公司（北京）購(gòu)買。核酸酶抑制劑RNasin從Promega(美國(guó)）購(gòu)買。焦炭 酸二乙酯DEPC從Amrcsco(美國(guó)）購(gòu)買。人血色素，牛血清蛋白，實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分 析純，并且不用對(duì)其進(jìn)一步純化可以直接使用。
[0033] 所用人工合成RNA序列（購(gòu)自北京賽百盛生物工程有限公司）如下。
[0034] RNA :5' -UUG UCU CUG ⑶C CUU AC-3,。
[0035] P-FITC ^'-CCC ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG TAG TAG TAG TAA AAA CAGAGA CCA GGA AUG-FITC-5'
[0036] 同時(shí)，考察了該檢測(cè)方法的選擇性。圖3為本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)凝血酶 (Thrombin)，牛血清白蛋白（BSA)，血紅蛋白（Hemoglobin)，免疫球蛋白G (IgG)和Ago2的 化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從圖3可以看出，檢測(cè)Thrombin，BSA，Hemoglobin和IgG的化學(xué)發(fā)光信號(hào)遠(yuǎn) 遠(yuǎn)低于檢測(cè)Ag 〇2的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，說(shuō)明該方法檢測(cè)Ag〇2具有很高的選擇性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于光二極管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光測(cè)定Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法，具體 特征包括以下步驟： (a) 首先，制備MoS2單層膜，將MoS 2粉體分散到得到DMF中，得到MoS 2的DMF溶液，將 該溶液在室溫下超聲，然后離心，得到黑色沉淀，最后，收集沉淀物，經(jīng)過(guò)水洗滌，然后再分 散于水中，形成溶液； (b) P-FITC修飾MoS2的制備，將（a)步驟中制得的MoS^ P-FITC混合均勾，然后加入 一定量的Tris-HCl緩沖液，反應(yīng)一段時(shí)間，然后離心，收集沉淀物，經(jīng)過(guò)水洗滌，然后再分 散于水中，得P-FITC修飾此&的溶液； (c) Ag〇2-RNA復(fù)合物制備，將Ag〇2樣品溶液與含有RNA的Tris-HCl-RNasin緩沖液混 合，孵化，使得RNA與Ag 〇2蛋白充分結(jié)合，得Ag〇2-RNA復(fù)合物； (d) 隨后，再將（c)步驟所得的Ago2-RNA復(fù)合物加入到（b)步驟的P-FITC修飾MoS2 的溶液中，反應(yīng)； (e) 將（d)步驟所得的溶液經(jīng)過(guò)離心之后，取部分上層清夜置于小燒杯中，再加入魯米 諾溶液，打開(kāi)光二極管電源，照射后關(guān)閉電源，然后測(cè)定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度 實(shí)現(xiàn)Ag 〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性測(cè)定。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法，其特征在于所述化 學(xué)試劑為分析純?cè)噭腥芤壕枚握麴s水配置。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法，其特征在于所述 Tris-HCl 緩沖液由 pH 7. 4 的 20mM Tris-HCl，50mM KC1，I. 5mM MgCl2,1%。DEPC 組成。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法，其特征在于所述 Tris-HCl-RNasin緩沖液由 pH 7.4 的 20mM Tris-HCl，lynit/y L RNasin，50mM KCl，1.5mM MgCl2,1 %。DEPC 組成。5. 根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法，其特征在于所述化 學(xué)發(fā)光測(cè)定選用MPI-E型化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法，其特征在于所述振 蕩孵育選用THZ-82A氣浴恒溫振蕩器。7. 根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法，其特征在于所述離 心機(jī)選用Anke-TGL-16C飛翁牌高速離心機(jī)。8. 根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法，其特征在于所述 pH測(cè)量選用PHS-3D型酸度計(jì)。9. 根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定Ag〇2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法，其特征在于所述的 RNA和P-FITC的核苷酸部分序列如下： RNA :5,-UUG UCU CUG ⑶C CUU AC-3' ； P-FITC :5'-GUA AGG ACC AGA GAC AAA AAT GAT GAT GAT GTA GTA GTA GTA GTA GTA GTA GTA GTA CCC-FITC-3'。
【專利摘要】一種基于光二極管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光測(cè)定Ago2蛋白的RNA核酸內(nèi)切酶活性的方法，屬于化學(xué)發(fā)光技術(shù)領(lǐng)域。首先，制備Ago2-RNA復(fù)合物和P-FITC修飾MoS2復(fù)合物。然后，將Ago2-RNA復(fù)合物加入到P-FITC修飾MoS2的溶液中，反應(yīng)一段時(shí)間后，離心，取部分上層清夜于2mL玻璃燒杯中，并加入20μLpH11.30的4mM的魯米諾溶液。然后，打開(kāi)光二極管電源，照射一段時(shí)間后關(guān)閉電源，然后測(cè)定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)Ago2的RNA核酸內(nèi)切酶活性的測(cè)定。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高。
【IPC分類】C12Q1/44
【公開(kāi)號(hào)】CN105039498
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510325008
【發(fā)明人】混旭, 張躍, 王慧敏
【申請(qǐng)人】青島科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年6月12日