專(zhuān)利名稱：體外檢測(cè)早期腎病的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病的體外檢測(cè)試劑盒，尤其涉及一種體外檢測(cè)腎病的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
正常人尿中白蛋白的含量小于20毫克/升。但人患糖尿病時(shí)，尿中總蛋白在正常范圍內(nèi)，而尿白蛋白排泄增加，微量白蛋白尿是腎病的早期癥兆，其特征是尿白蛋白濃度為0～300毫克/24小時(shí)，或白蛋白/肌酐比率為0～300毫克/每克肌酐，此時(shí)尿液分析尿蛋白為陰性。早期檢測(cè)尿微量白蛋白是防止腎臟病變的有效手段之一，特別對(duì)于糖尿病患者和高血壓患者尤為重要，測(cè)定尿微量白蛋白可以預(yù)測(cè)糖尿病腎病和高血壓病的進(jìn)展。
糖尿病腎病是糖尿病的重要并發(fā)癥，一旦臨床確診為糖尿病腎病，發(fā)展成腎衰是不可避免的，是糖尿病早期死亡的最重要原因。是不可逆病變。糖尿病腎臟病變主要是由于腎小球?yàn)V過(guò)增加、代謝改變導(dǎo)致高濾過(guò)率、基底膜改變、負(fù)電荷降低、腎小球內(nèi)壓力增高而造成。30％的I型糖尿病人病程15-20年會(huì)出現(xiàn)腎病，20％的II型糖尿病人在明確診斷時(shí)已有腎病，II型糖尿病人病程5年后腎臟并發(fā)癥顯著增高。
高血壓患者的尿白蛋白排泄率明顯高于正常人，而且與收縮壓及舒張壓均正相關(guān)，對(duì)有高血壓的心血管患者是很靈敏的預(yù)報(bào)指標(biāo)。高血壓患者的尿白蛋白排泄率高，其原因是腎小球內(nèi)壓力上升、白蛋白的濾過(guò)失調(diào)、腎小球結(jié)構(gòu)改變。無(wú)論糖尿病人和原發(fā)性高血壓病人，抗高血壓治療后尿微量白蛋白均下降。
當(dāng)前國(guó)內(nèi)外主要采用夾心法酶聯(lián)吸附試劑盒來(lái)檢測(cè)尿中微量白蛋白的含量從而進(jìn)行早期腎病的診斷。采用夾心法酶聯(lián)吸附試劑盒進(jìn)行早期腎病的診斷存在三個(gè)主要缺陷，即一是該試劑盒的穩(wěn)定期有限，通常只能保存6個(gè)月左右；二是檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，一般為4個(gè)小時(shí)；三是檢測(cè)成本高，每一次檢測(cè)的成本需耗費(fèi)100元左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種穩(wěn)定性高、方便快捷和成本較低的體外檢測(cè)早期腎病的試劑盒。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的體外檢測(cè)早期腎病的試劑盒，主要由以下兩種組分組成包被在酶標(biāo)板上的ALB抗原、抗ALB抗原的酶標(biāo)單克隆抗體。
所述的標(biāo)記單克隆抗體的酶為辣根過(guò)氧化物酶。
本發(fā)明的體外檢測(cè)早期腎病的試劑盒還可包括下述組分標(biāo)準(zhǔn)品、洗滌液、稀釋液、終止液、酶底物液。
本發(fā)明試劑盒各組分的制備方法為1)抗ALB抗原的單克隆抗體的制備及酶標(biāo)標(biāo)記首先用ALB抗原免疫動(dòng)物，末次免疫后取免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞利用細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體，將所制備的單克隆抗體經(jīng)鑒定后進(jìn)行酶標(biāo)記后備用，2)包被有ALB抗原的酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將ALB抗原稀釋后加入到酶標(biāo)板的孔中，依次經(jīng)第一次洗滌、封閉、第二次洗滌、保護(hù)、第三次洗滌、干燥等步驟后，將ALB抗原包被于酶標(biāo)板上備用。
3)準(zhǔn)備下述試劑盒組分標(biāo)準(zhǔn)品、洗滌液、稀釋液、終止液、酶底物液。
4)將上述步驟中制備的包被有ALB抗原的酶標(biāo)板、抗ALB抗原的酶標(biāo)單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、洗滌液、稀釋液、終止液、酶底物液組裝到一個(gè)試劑盒中并附上使用說(shuō)明書(shū)即得本發(fā)明試劑盒。
上述制備方法中，其中步驟1)中所用的免疫動(dòng)物為小鼠；標(biāo)記抗ALB抗原的單克隆抗體所用的酶是辣根過(guò)氧化物酶，用辣根過(guò)氧化物酶按常規(guī)改良過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記抗ALB單克隆抗體，標(biāo)記完后加入多種二價(jià)金屬離子，可顯著提高酶標(biāo)抗體的活性。所用到的ALB抗原購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。
步驟3)中所述的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，洗滌液、稀釋液、終止液、底物A液和B液的制備可參考實(shí)施例所述的制備方法。
本發(fā)明采用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)抑制原理檢測(cè)尿液里面的微量白蛋白。包被在酶標(biāo)板上的白蛋白和人尿液中的白蛋白與酶標(biāo)抗人白蛋白抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，洗滌后，加入底物顯色。顯色的強(qiáng)度與樣品中的白蛋白濃度成反比。然后加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)酶標(biāo)板各孔的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定尿樣中白蛋白的濃度。
本發(fā)明試劑盒的制備過(guò)程中，其中在包被有ALB抗原的酶標(biāo)板的制備時(shí)，在封閉后加入一道保護(hù)工序，延長(zhǎng)了試劑盒的保護(hù)期，從而提高了本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性；本發(fā)明試劑盒在檢測(cè)腎病時(shí)，采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法，該方法可顯著縮短檢測(cè)時(shí)間，使檢測(cè)更為方便、快捷；此外，本發(fā)明試劑盒只使用一個(gè)抗體進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需制備二抗，檢測(cè)成本因而降低。


圖1擬合曲線圖Alb標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ug/ml)的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Alb標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值為縱坐標(biāo)具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明的有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明試劑盒的制備一、試劑盒各組分的制備一)ALB抗原的單克隆抗體制備和標(biāo)記1、試驗(yàn)材料1)、ALB抗原購(gòu)自美國(guó)Sigma公司2)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物六周齡BALB/c小鼠購(gòu)自黑龍江省獸醫(yī)研究所，體重30-40g。
3)、其它試劑福氏完全佐劑羊毛脂1份、石蠟油5份，每毫升加10mg卡介苗。
2、制備方法1)免疫動(dòng)物用50-100ugALB加福氏完全佐劑對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射，間隔2-3周后，用同樣劑量ALB加強(qiáng)免疫2-3次，末次免疫后第3-4天取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
2)細(xì)胞融合免疫小鼠脾細(xì)胞和Sp2/0細(xì)胞(購(gòu)自上海生物制品研究所)按8∶1的比例混合，在50％PEG的作用下，進(jìn)行融合，用Elisa間接法初步篩選出陽(yáng)性克隆，再用中和抑制試驗(yàn)證實(shí)為陽(yáng)性克隆后，經(jīng)有限稀釋法克隆2-3次，篩選出分泌抗體陽(yáng)性的單個(gè)克隆，穩(wěn)定傳代3個(gè)月，制備腹水和液氮保存。
3)所篩選出的陽(yáng)性單克隆抗體的鑒定A雜交瘤細(xì)胞的染色體分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用秋水仙素處理，經(jīng)Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)。
BIg類(lèi)及IgG亞類(lèi)測(cè)定用美國(guó)Sigma公司的抗鼠亞類(lèi)抗血清與濃縮至原體積1/20的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清做瓊脂雙向擴(kuò)散C單克隆抗體特異性的測(cè)定將ALB進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，而后用各株單抗分別進(jìn)行Elisa染色D單克隆抗體比活性測(cè)定將各株單抗的蛋白進(jìn)行定量，然后按不同稀釋度測(cè)定各株的滴度。
E將所篩選到的合格單克隆抗體保存?zhèn)溆谩?br> 4)抗ALB抗原的單克隆抗體的酶標(biāo)記選用辣根過(guò)氧化物酶按常規(guī)改良過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記抗ALB單克隆抗體，標(biāo)記完后加入多種二價(jià)金屬離子，以提高酶標(biāo)抗體的活性。
二)、包被有ALB抗原的酶標(biāo)板制備1、試驗(yàn)材料1)ALB抗原購(gòu)自美國(guó)Sigma公司2)所用的試劑包被緩沖液碳酸鈉1.5g，碳酸氫鈉2.9g，硫柳汞0.2g，加雙蒸水至1000ml調(diào)PH9.6，滅菌備用。
保護(hù)液氯化鈉8.0g，磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鉀0.2g，硫柳汞0.1g，蔗糖40g，慶大霉素1g，氯化鎂5mM，加雙蒸水至1000ml，調(diào)PH7.4，滅菌備用。
2、操作方法包被用包被緩沖液將ALB抗原稀釋成2μg-10μg/ml工作濃度，每孔加入工作濃度抗原100μL，蓋好酶標(biāo)板，置于4℃冰箱中過(guò)夜；洗滌棄去包被液，用PBS-T洗滌液滿孔洗滌5次，每次3分鐘，最后一次在紙抹布上拍干；封閉用封閉液加滿各反應(yīng)孔，去除加樣時(shí)產(chǎn)生的貼壁氣泡，蓋好酶標(biāo)板，于37℃水浴箱中孵育60分鐘。
洗滌棄去包被液，用PBS-T洗滌液滿孔洗滌5次，每次3分鐘，最后一次在紙抹布上拍干。
保護(hù)用保護(hù)液加滿各反應(yīng)孔，蓋好酶標(biāo)板，于4℃水浴箱中孵育過(guò)夜后棄去保護(hù)液，于37℃干燥20分鐘，然后真空包裝于鋁箔袋中保存?zhèn)溆谩?br> 三)、封閉液氯化鈉8.0g，磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鉀0.2g，硫柳汞0.1g，牛血清白蛋白 20g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)PH7.4，高壓滅菌即可四)、終止液20ml硫酸加雙蒸水至184ml
五)、標(biāo)準(zhǔn)品及酶標(biāo)記物稀釋液的配制氯化鈉 8.0g，磷酸二氫鉀 0.2g，磷酸氫二鈉 2.9g，氯化鉀 0.2g，硫柳汞 0.1g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)PH7.4，高壓滅菌即可。
六)、酶底物液的制備A液磷酸氫二鈉 14.60g檸檬酸 9.33g0.75％過(guò)氧化氫尿素 10ml加雙蒸水至1000，調(diào)PH值5.5B液TMB 30mgDMSO28ml雙蒸水 60ml七)、洗滌液(PBS-T)的配制氯化鈉 8.0g，磷酸二氫鉀 0.2g磷酸氫二鈉 2.9g氯化鉀 0.2g硫柳汞 0.1g吐溫20 0.5ml加雙蒸水至 1000ml，調(diào)PH值7.4。
八)、標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。
二、本發(fā)明試劑盒的組成抗ALB抗原的酶標(biāo)單克隆抗體5ml；包被有ALB抗原的96孔酶標(biāo)板；底物A液5ml、底物B液5ml；標(biāo)準(zhǔn)品5ug；10×樣品稀釋液10ml；20×洗滌液25ml；終止液5ml；試劑盒使用說(shuō)明書(shū)一份。
三、本發(fā)明試劑盒保存及有效期2-8℃、密閉、避光保存，有效期6～8個(gè)月。
使用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行早期腎病的檢測(cè)一、試驗(yàn)材料1、檢測(cè)試劑盒本發(fā)明實(shí)施例所制備2待檢樣品的采集取早晨第一次尿液的中段置于潔凈的容器中，2-8℃，可保存48小時(shí)；若標(biāo)本需更長(zhǎng)時(shí)間保存，置于-20℃冰箱中，并放入防腐劑(萬(wàn)分之一的氯仿)，可保存一個(gè)月。測(cè)定前取尿液100μl用試劑盒稀釋液稀釋到500μl。
3、試劑準(zhǔn)備1)將10×稀釋液用前置于37℃水浴15分鐘，然后用蒸餾水做10倍稀釋?zhuān)?)將20×洗滌液用前置于37℃水浴15分鐘，然后用蒸餾水做20倍稀釋?zhuān)?)將5ug標(biāo)準(zhǔn)品用500ul稀釋液準(zhǔn)確復(fù)溶(10ug/ml)。取出200ul用稀釋液作五次倍比稀釋?zhuān)脻舛?ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml、0.3125ug/ml六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。
二、操作步驟1、加樣每孔加酶標(biāo)抗體50ul，同時(shí)分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品或陰性對(duì)照各50ul，標(biāo)準(zhǔn)品做6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。(陰性對(duì)照采用本試劑盒的稀釋液)。標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本以及陰性對(duì)照品均加復(fù)孔，每孔再加酶標(biāo)抗體50ul，輕輕振蕩混勻，37℃水浴40分鐘；2、洗板棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置3分鐘，甩干，反復(fù)3次后拍干；3、顯色臨用前把底物A、B溶液按體積比1∶1混合均勻。每孔加底物液100ul，37℃水浴15分鐘；4、終止比色每孔加入50ul終止液，輕輕混勻30秒，在酶標(biāo)儀450nm處，以底物空白孔調(diào)零，測(cè)各孔的吸光值。
三、數(shù)據(jù)處理以Alb標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ug/ml)的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作圖，并用4P方式擬合曲線(見(jiàn)圖1)。待測(cè)標(biāo)本Alb含量(ug/ml)可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上算出，然后乘以稀釋倍數(shù)即可。
四、評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)1)陰性＜20μg/ml。
2)陽(yáng)性＞25μg/ml。
3)臨界值 20-25μg/ml，若檢測(cè)結(jié)果為臨界值，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若仍為臨界值判為陰性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)以后者結(jié)果為準(zhǔn)。
五、檢測(cè)結(jié)果使用本發(fā)明試劑盒對(duì)400例無(wú)腎疾患的人群進(jìn)行測(cè)試，檢測(cè)結(jié)果平均值為7.84±4.32ug/L，特異性為95％；對(duì)200例早期腎病檢測(cè)，均值為45.36±20.48ug/L，靈敏性達(dá)到96％，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒對(duì)早期腎病的檢測(cè)有良好的特異性和敏感性。
權(quán)利要求
1.一種體外檢測(cè)早期腎病的試劑盒，其特征是主要由包被在酶標(biāo)板上的ALB抗原和抗ALB抗原的酶標(biāo)單克隆抗體組成。
2.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是所述的包被有ALB抗原的酶標(biāo)板在其制備過(guò)程中加入了一道保護(hù)工序。
3.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是所述的抗ALB抗原的酶標(biāo)單克隆抗體在其制備步驟中，用酶標(biāo)記單克隆抗體完成后再加入多種二價(jià)金屬離子。
4.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是所述的酶標(biāo)板為96孔單條或雙條可拆酶標(biāo)板。
5.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是所述的試劑盒還包括有標(biāo)準(zhǔn)品、洗滌液、稀釋液、終止液和酶底物液。
6.權(quán)利要求1～5任意一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)早期腎病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的用于檢測(cè)早期腎病的試劑盒，該試劑盒主要由下述組分組成抗ALB抗原的酶標(biāo)單克隆抗體、包被有ALB抗原的酶標(biāo)板、酶底物液、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、洗滌液、終止液及試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明試劑盒具有穩(wěn)定性高、檢測(cè)快捷、成本低、特異性和敏感性高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1588074SQ200410056969
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者劉艷青 申請(qǐng)人:哈爾濱市天地仁醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)股份有限公司