專利名稱：一種皇佳吉雞品種的分子生物學(xué)鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種皇佳吉雞品種的分子生物學(xué)鑒 定方法。
背景技術(shù)：
皇佳吉雞是現(xiàn)代新農(nóng)業(yè)股份有限公司最新培育的優(yōu)質(zhì)新型肉雞品種，因其肉質(zhì)鮮 香、味醇、汁多，受到了消費(fèi)者的廣泛親睞。但市場上一些不法企業(yè)、養(yǎng)殖戶非法生產(chǎn)和銷售 假冒、仿冒皇佳吉雞的現(xiàn)象屢見不鮮，嚴(yán)重?fù)p害了皇佳吉雞品牌的聲譽(yù)，影響了現(xiàn)代新農(nóng)業(yè) 股份有限公司的發(fā)展。目前對(duì)家禽品種的鑒定主要是以形態(tài)學(xué)標(biāo)記為依據(jù)來審查育種檔案 和生產(chǎn)性能測定。但隨著育種技術(shù)的不斷成熟，親本與雜交后代的外貌特征有較大的相似 性，很難從外貌特征進(jìn)行區(qū)分。所以利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記來進(jìn)行家禽品種(品系)鑒定就不夠 科學(xué)、準(zhǔn)確。如果進(jìn)行生產(chǎn)性能測定，不僅耗費(fèi)大量的人力、時(shí)間和高昂的性能測定費(fèi)用，而 且性能測定的結(jié)果還受飼養(yǎng)各個(gè)環(huán)節(jié)因素的影響，因此生產(chǎn)性能測定也難以準(zhǔn)確反映各品 種(品系)的真實(shí)的生產(chǎn)性能和種質(zhì)特性?；诨蚩寺『虳NA測序技術(shù)發(fā)展的DNA分子 標(biāo)記能夠準(zhǔn)確的揭示品種之間最根本的遺傳差異(堿基差異)。線粒體DNA分子標(biāo)記就屬 于這類標(biāo)記特別是COI (細(xì)胞色素C氧化酶亞基I)基因，它具有遺傳自主性、嚴(yán)格的母系遺 傳、拷貝數(shù)高、無組織特異性、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鯨、人類、鳥類等群體鑒 定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種準(zhǔn)確性高， 鑒定時(shí)間短，成本低的皇佳吉雞品種的分子生物學(xué)鑒定方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種皇佳吉雞品種的分子生物 學(xué)鑒定方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)通過苯酚-氯仿法分別提取皇佳吉雞和受測雞包括線粒體DNA的總DNA ；(2)按照GeneBank上發(fā)表的紅色原雞線粒體DNA的COI基因序列(AP003322)和 絲羽烏骨雞線粒體DNA的COI基因序列(AB086102)設(shè)計(jì)三對(duì)引物PFl (SEQ ID NO. 3)和 PRl (SEQ ID NO. 4)，PF2 (SEQ IDN0. 5)和 PR2 (SEQ ID NO. 6)，PF3 (SEQ ID NO. 7)和 PR3 (SEQ
ID NO.8)；所述引物的序列分別為
上游引物PFl:5，-TACAGCCTAACGCTTCAACA-3‘；
下游引物I3Rl:5，-GGTTGCGGTCGGTAAGTAGT-3’。
上游引物PF2:5，-GCCCATGCTTTCGTCATAA-3‘；
下游引物PR2:5，-TGGGATGGCGATGATTATTG-3’。
上游引物PF3:5，-CGCCATCCCAACTGGTAT-3，；
下游引物PR3:5，-GATGAGGCGTCTTGAAAG-3’。
(3)利用步驟⑵中所述引物對(duì)皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將
3擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆并在DNA測序儀上進(jìn)行測序獲得皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因的全序列 (SEQ ID NO. 1)；(4)根據(jù)步驟(3)中測得的皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因的全序列設(shè)計(jì)引物 PF(SEQ ID NO. 9)和 PR(SEQ ID NO. 10)；所述引物的序列為上游引物PF 5，-GCACAGGATGGACAGTTTAC-3，；下游引物PR 5，-ATAGCATAGGGGGGTCTCAT-3，。利用所述引物獲取可用于品種鑒定的皇佳吉雞COI基因中的一段基因序列(SEQ ID NO. 2)，進(jìn)行測序，并通過Chromasl. 49軟件準(zhǔn)確讀取測序結(jié)果；(5)利用步驟⑷中所述引物獲取受測雞與步驟⑷中測得的皇佳吉雞COI基因 中的一段基因序列(SEQ ID NO. 2)相應(yīng)的基因序列，進(jìn)行測序，并通過Chromasl.49軟件準(zhǔn) 確讀取測序結(jié)果；(6)將步驟(4)獲得的測序結(jié)果和步驟(5)獲得的測序結(jié)果進(jìn)行人工逐堿基讀取 和核對(duì)；(7)通過DnaSP4. 10. 7軟件統(tǒng)計(jì)皇佳吉雞和受測雞的變異位點(diǎn)、單倍型、平均核苷 酸差異、核苷酸分歧度和凈遺傳距離，并根據(jù)皇佳吉雞和受測雞的變異位點(diǎn)、單倍型、平均 核苷酸差異、核苷酸分歧度和凈遺傳距離，確定皇佳吉雞和受測雞基因序列的平均變異程 度，平均變異程度不大于2%則為同一品種，平均變異程度大于2%則為不同品種；(8)運(yùn)用生物學(xué)軟件構(gòu)建皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹， 根據(jù)構(gòu)建的群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果確定皇佳吉雞與受測雞是否為同一品 種，若皇佳吉雞與受測雞的單倍型聚為一類則為同一品種，否則為不同品種。上述步驟(8)中所述構(gòu)建皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹 的方法為運(yùn)用MEGA4. 0軟件估計(jì)皇佳吉雞和受測雞之間Kimura雙參數(shù)遺傳距離，并基 于Kimura雙參數(shù)模型應(yīng)用UPGMA/NJ法構(gòu)建群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹，同時(shí)運(yùn)用 NETW0RK4. 5. 0. 1軟件構(gòu)建群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明利用品種間的遺傳信息差異經(jīng)軟件 精密計(jì)算和分析的結(jié)果鑒定真?zhèn)位始鸭u品種，具有準(zhǔn)確性高、鑒定時(shí)間短和成本低等優(yōu)
點(diǎn)ο下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例2皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2皇佳吉雞和受測雞的單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例3皇佳吉雞和受測雞的單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1受測雞為皇佳吉雞(1)通過苯酚-氯仿法分別提取皇佳吉雞(1只，品種代號(hào)為HJJ1)和受測雞(皇佳吉雞2只，品種代號(hào)為SHJJl和SHJJ2)包括線粒體DNA的總DNA ；
(2)按照GeneBank上發(fā)表的紅色原雞線粒體DNA的COI基因序列AP003322和絲 羽烏骨雞線粒體DNA的COI基因序列AB086102設(shè)計(jì)三對(duì)引物PFl (SEQ ID NO. 3)、PR1 (SEQ ID NO. 4)，PF2 (SEQ ID NO. 5)、PR2 (SEQ ID NO. 6)和 PF3 (SEQ ID NO. 7)、PR3 (SEQ ID NO. 8)；
所述引物的序列分別為
上游引物PFl:5，-TACAGCCTAACGCTTCAACA-3‘；
下游引物PRl:5，-GGTTGCGGTCGGTAAGTAGT-3’。
上游引物PF2:5，-GCCCATGCTTTCGTCATAA-3‘；
下游引物PR2:5，-TGGGATGGCGATGATTATTG-3’。
上游引物PF3:5，-CGCCATCCCAACTGGTAT-3，；
下游引物PR3:5，-GATGAGGCGTCTTGAAAG-3’。
(3)利用步驟⑵中所述引物對(duì)皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將
擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆并在DNA測序儀上進(jìn)行測序獲得皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因的全序列 (SEQ ID NO. 1)；利用引物 PFl，PR2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增DNA 模板 lOOng，10 X buffer2. 5 μ L, 25mM 鎂 離子2yL，10mM dNTP 0. 5yL，混合引物(上游引物PFl和下游引物PRl各為IOpmol/ μ L) 0. 5 μ L，TaqDNA聚合酶1U，加水至25 μ L。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min ；94°C變性 45s ；58°C退火45s ；72°C延伸Imin ；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin ；
利用引物 PF2, PR2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增=DNA 模板 IOOng, 10 X buffer2. 5 μ L, 25mM 鎂 離子2yL，10mM dNTP 0. 5yL，混合引物(上游引物PF2和下游引物PR2各為IOpmol/ μ L) 0. 5 μ L，TaqDNA聚合酶1U，加水至25 μ L。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min ；94°C變性 45s ；56°C退火45s ；72°C延伸Imin ；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin ；利用引物PF3, PR3 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增=DNA 模板 IOOng, 10 X buffer2. 5 μ L, 25mM 鎂 離子2yL，10mM dNTP 0. 5yL，混合引物(上游引物PF3和下游引物PR3各為IOpmol/ μ L) 0. 5 μ L，TaqDNA聚合酶1U，加水至25 μ L。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min ；94°C變性 45s ；59°C退火45s ；72°C延伸Imin ；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin ；(4)根據(jù)步驟(3)中測得的皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因的全序列設(shè)計(jì)引物 PF (SEQ ID N0. 9)和 PR (SEQ ID NO. 10)上游引物PF 5，-GCACAGGATGGACAGTTTAC-3，；下游引物PR 5，-ATAGCATAGGGGGGTCTCAT-3，。利用所述引物獲取可用于品種鑒定的皇佳吉雞COI基因中的一段基因序列(SEQ ID N0. 2)，進(jìn)行測序，并通過Chromasl. 49軟件準(zhǔn)確讀取測序結(jié)果；利用引物PF，PR 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增DNA 模板 lOOng，10Xbuffer2. 5 μ L，25mM 鎂離 子2yL，10mM dNTP 0. 5 μ L，混合引物(上游引物和下游引物各為IOpmol/μ L) 0. 5 μ L， TaqDNA聚合酶1U，加水至25 μ L。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min ；94°C變性45s ；55°C退 火45s ；72°C延伸Imin ；進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin ；(5)利用步驟⑷中所述引物獲取受測雞與步驟⑷中測得的皇佳吉雞COI基因 中的一段基因序列(SEQ ID N0. 2)相應(yīng)的基因序列，進(jìn)行測序，并通過Chromasl.49軟件準(zhǔn) 確讀取測序結(jié)果；PCR擴(kuò)增條件及反應(yīng)程序同步驟⑷；
5
(6)將步驟(4)獲得的測序結(jié)果和步驟(5)獲得的測序結(jié)果進(jìn)行人工逐堿基讀取 和核對(duì)；(7)通過DnaSP4. 10. 7軟件統(tǒng)計(jì)皇佳吉雞和受測雞的變異位點(diǎn)、單倍型、平均核苷 酸差異、核苷酸分歧度和凈遺傳距離，并根據(jù)皇佳吉雞和受測雞的變異位點(diǎn)、單倍型、平均 核苷酸差異、核苷酸分歧度和凈遺傳距離，確定皇佳吉雞和受測雞基因序列的平均變異程 度；(8)運(yùn)用MEGA4. 0軟件估計(jì)皇佳吉雞和受測雞之間Kimura雙參數(shù)遺傳距離，并基 于Kimura雙參數(shù)模型應(yīng)用UPGMA/NJ法構(gòu)建皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖和單倍型系統(tǒng) 發(fā)生樹，同時(shí)運(yùn)用NETW0RK4. 5. 0. 1軟件構(gòu)建皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖和單倍型系 統(tǒng)發(fā)生樹。鑒定結(jié)果采用設(shè)計(jì)的上、下游引物，通過測序技術(shù)獲得了皇佳吉雞和受測雞共計(jì) 3個(gè)個(gè)體的COI基因一段長65 Ibp序列，運(yùn)用Chromasl. 49軟件比對(duì)未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)，運(yùn)用 DnaSP4. 10. 7軟件發(fā)現(xiàn)所有序列共有1種單倍型(Hapl :CAG)，皇佳吉雞與受測雞序列之間 單倍型多樣度為0. 000，核苷酸多樣度為0. 000，平均核苷酸差異為0. 000，基因序列的平均 變異程度為0%。通過所得結(jié)果，得出待測品種是皇佳吉雞。實(shí)施例2受測雞為土雞(1)通過苯酚-氯仿法提取皇佳吉雞(1只，品種代號(hào)為HJJ1)和受測雞(土雞3 只，品種代號(hào)為TJl，TJ2和TJ3)包括線粒體DNA的總DNA ；(2)按照GeneBank上發(fā)表的紅色原雞線粒體DNA的COI基因序列AP003322和絲 羽烏骨雞線粒體DNA的COI基因序列AB086102設(shè)計(jì)三對(duì)引物PFl (SEQ ID NO. 3)、PR1 (SEQ ID NO. 4)，PF2 (SEQ ID NO. 5)、PR2 (SEQ ID NO. 6)和 PF3 (SEQ ID NO. 7)、PR3 (SEQ ID NO. 8)；
所述引物的序列分別為
上游引物PFl:5，-TACAGCCTAACGCTTCAACA-3‘；
下游引物PRl:5，-GGTTGCGGTCGGTAAGTAGT-3’。
上游引物PF2:5，-GCCCATGCTTTCGTCATAA-3‘；
下游引物PR2:5，-TGGGATGGCGATGATTATTG-3’。
上游引物PF3:5，-CGCCATCCCAACTGGTAT-3，；
下游引物PR3:5，-GATGAGGCGTCTTGAAAG-3’。
(3)利用步驟⑵中所述引物對(duì)皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將
擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆并在DNA測序儀上進(jìn)行測序獲得皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因的全序列 (SEQ ID NO. 1)；(4)根據(jù)步驟(3)中測得的皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因的全序列設(shè)計(jì)引物 PF (SEQ ID N0. 9)和 PR (SEQ ID NO. 10)上游引物PF 5，-GCACAGGATGGACAGTTTAC-3，；下游引物PR 5，-ATAGCATAGGGGGGTCTCAT-3，。利用所述引物獲取可用于品種鑒定的皇佳吉雞COI基因中的一段基因序列(SEQ ID N0. 2)，進(jìn)行測序，并通過Chromasl. 49軟件準(zhǔn)確讀取測序結(jié)果；
(5)利用步驟⑷中所述引物獲取受測雞(土雞)與步驟⑷中測得的皇佳 吉雞COI基因中的一段基因序列(SEQ ID N0.2)相應(yīng)的基因序列，進(jìn)行測序，并通過 Chromasl. 49軟件準(zhǔn)確讀取測序結(jié)果；(6)將步驟(4)獲得的測序結(jié)果和步驟(5)獲得的測序結(jié)果進(jìn)行人工逐堿基讀取 和核對(duì)；(7)通過DnaSP4. 10. 7軟件統(tǒng)計(jì)皇佳吉雞和受測雞(土雞)的變異位點(diǎn)、單倍型、 平均核苷酸差異、核苷酸分歧度和凈遺傳距離，并根據(jù)皇佳吉雞和受測雞(土雞)的變異位 點(diǎn)、單倍型、平均核苷酸差異、核苷酸分歧度和凈遺傳距離，確定皇佳吉雞和受測雞(土雞) 基因序列的平均變異程度；(8)運(yùn)用MEGA4. 0軟件估計(jì)皇佳吉雞和受測雞(土雞)之間Kimura雙參數(shù)遺傳距 離，并基于Kimura雙參數(shù)模型應(yīng)用UPGMA/NJ法構(gòu)建皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖和單 倍型系統(tǒng)發(fā)生樹，同時(shí)運(yùn)用NETW0RK4. 5. 0. 1軟件構(gòu)建皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖，以 及單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹。本實(shí)施例中的PCR擴(kuò)增條件及反應(yīng)程序同實(shí)施例1。鑒定結(jié)果采用設(shè)計(jì)的上、下游引物，通過測序技術(shù)獲得了皇佳吉雞和受測雞(土 雞)共計(jì)4個(gè)個(gè)體的COI基因一段長651bp序列，運(yùn)用Chromasl. 49軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)3個(gè)變 異位點(diǎn)(C-G/53bp處，A-I7282bp處，C_G/606bp處)，運(yùn)用DnaSP4. 10. 7軟件發(fā)現(xiàn)共有4種 單倍型，1個(gè)皇佳吉雞個(gè)體享有1種單倍型(Hapl =CAG)，3個(gè)受測雞(土雞)共享3種單倍 型(Hap2，Hap3, Hap4 :GAC，CTC, CAC)，皇佳吉雞與受測雞(土雞)序列之間單倍型多樣度 為0. 800，核苷酸多樣度為0. 00195，平均核苷酸差異為1. 26667，2個(gè)品種間基因序列的平 均變異程度大于2%。運(yùn)用MEGA4. 0軟件計(jì)算出皇佳吉雞和受測雞(土雞)之間Kimura 雙參數(shù)遺傳距離為0. 00257，基于Kimura雙參數(shù)模型應(yīng)用UPGMA法構(gòu)建群體聚類圖(如圖 1)，皇佳吉雞和受測雞(土雞)聚于不同分支。運(yùn)用NETW0RK4. 5. 0. 1軟件構(gòu)建單倍型系統(tǒng) 發(fā)生樹(如圖2)，皇佳吉雞個(gè)體享有的單倍型1 (Hapl)與3個(gè)受測雞(土雞)共享的3種 單倍型(Hap2，Hap3，Hap4)聚于不同分支。通過所得結(jié)果，得出待測品種不是皇佳吉雞。實(shí)施例3受測雞為烏雞(1)通過苯酚-氯仿法提取皇佳吉雞(1只，品種代號(hào)為HJJ1)和受測雞(烏雞3 只，品種代號(hào)為WJl，WJ2和WJ3)包括線粒體DNA的總DNA ；(2)按照GeneBank上發(fā)表的紅色原雞線粒體DNA的COI基因序列AP003322和絲 羽烏骨雞線粒體DNA的COI基因序列AB086102設(shè)計(jì)三對(duì)引物PFl (SEQ ID NO. 3)、PR1 (SEQ ID NO. 4)，PF2 (SEQ ID NO. 5)、PR2 (SEQ ID NO. 6)和 PF3 (SEQ ID NO. 7)、PR3 (SEQ ID NO. 8)；
所述引物的序列分別為
上游引物PFl:5，-TACAGCCTAACGCTTCAACA-3‘；
下游引物PRl:5，-GGTTGCGGTCGGTAAGTAGT-3，。
上游引物PF2:5，-GCCCATGCTTTCGTCATAA-3‘；
下游引物PR2:5，-TGGGATGGCGATGATTATTG-3’。
上游引物PF3:5，-CGCCATCCCAACTGGTAT-3，；
下游引物PR3 5，-GATGAGGCGTCTTGAAAG-3，。(3)利用步驟(2)中所述引物對(duì)皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將 擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆并在DNA測序儀上進(jìn)行測序獲得皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因的全序列 (SEQ ID NO. 1)；(4)根據(jù)步驟(3)中測得的皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因的全序列設(shè)計(jì)引物 PF (SEQ ID NO. 9)和 PR (SEQ ID NO. 10)上游引物PF 5，-GCACAGGATGGACAGTTTAC-3，；下游引物PR 5，-ATAGCATAGGGGGGTCTCAT-3，。利用所述引物獲取可用于品種鑒定的皇佳吉雞COI基因中的一段基因序列(SEQ ID NO. 2)，進(jìn)行測序，并通過Chromasl. 49軟件準(zhǔn)確讀取測序結(jié)果；(5)利用步驟⑷中所述引物獲取受測雞(烏雞)與步驟⑷中測得的皇佳 吉雞COI基因中的一段基因序列(SEQ ID N0.2)相應(yīng)的基因序列，進(jìn)行測序，并通過 Chromasl. 49軟件準(zhǔn)確讀取測序結(jié)果；(6)將步驟(4)獲得的測序結(jié)果和步驟(5)獲得的測序結(jié)果進(jìn)行人工逐堿基讀取 和核對(duì)；(7)通過DnaSP4· 10. 7軟件統(tǒng)計(jì)皇佳吉雞和受測雞(烏雞)的變異位點(diǎn)、單倍型、 平均核苷酸差異、核苷酸分歧度和凈遺傳距離，并根據(jù)皇佳吉雞和受測雞(烏雞)的變異位 點(diǎn)、單倍型、平均核苷酸差異、核苷酸分歧度和凈遺傳距離，確定皇佳吉雞和受測雞(烏雞) 基因序列的平均變異程度；(8)運(yùn)用MEGA4. 0軟件估計(jì)皇佳吉雞和受測雞(烏雞)之間Kimura雙參數(shù)遺傳距 離，并基于Kimura雙參數(shù)模型應(yīng)用UPGMA/NJ法構(gòu)建皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖和單 倍型系統(tǒng)發(fā)生樹，同時(shí)運(yùn)用NETW0RK4. 5. 0. 1軟件構(gòu)建皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖和 單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹，根據(jù)兩種軟件的群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果。本實(shí)施例中的PCR擴(kuò)增條件及反應(yīng)程序同實(shí)施例1。鑒定結(jié)果采用設(shè)計(jì)的上、下游引物，通過測序技術(shù)獲得了皇佳吉雞和受測雞(烏 雞)共計(jì)4個(gè)個(gè)體的COI基因一段長651bp序列，運(yùn)用Chromasl. 49軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)3個(gè)變 異位點(diǎn)(T-A/9bp處，A-C/46bp處，C_G/386bp處)，運(yùn)用DnaSP4. 10. 7軟件發(fā)現(xiàn)共有3種單 倍型，1個(gè)皇佳吉雞個(gè)體享有1種單倍型(Hapl =TAC)，3個(gè)受測雞(烏雞)共享2種單倍型 (Hap2, Hap3 :TCG，ACG)，皇佳吉雞與受測雞(烏雞)序列之間單倍型多樣度為0. 733，核苷 酸多樣度為0. 00236，平均核苷酸差異為1. 53333，2個(gè)品種間基因序列的平均變異程度大 于2%。運(yùn)用MEGA4. 0軟件計(jì)算出皇佳吉雞和受測雞(烏雞)之間Kimura雙參數(shù)遺傳距離 為0. 0036，基于Kimura雙參數(shù)模型應(yīng)用UPGMA/NJ法構(gòu)建群體聚類圖(如圖3)，皇佳吉雞 和受測烏雞聚于不同分支。運(yùn)用NETW0RK4. 5. 0. 1軟件構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹(如圖4)，1 個(gè)皇佳吉雞個(gè)體享有的單倍型I(Hapl)，3個(gè)受測烏雞共享的2種單倍型(Hap2，Hap3)聚于 不同分支。通過所得結(jié)果，得出待測品種不是皇佳吉雞。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明 技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、變更以及等效結(jié)構(gòu)變換，均仍屬于本發(fā)明技 術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。
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權(quán)利要求
一種皇佳吉雞品種的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)通過苯酚 氯仿法分別提取皇佳吉雞和受測雞包括線粒體DNA的總DNA；(2)按照紅色原雞線粒體DNA的COI基因序列AP003322和絲羽烏骨雞線粒體DNA的COI基因序列AB086102設(shè)計(jì)三對(duì)引物；所述引物的序列分別為上游引物PF15’ TACAGCCTAACGCTTCAACA 3’；下游引物PR15’ GGTTGCGGTCGGTAAGTAGT 3’。上游引物PF25’ GCCCATGCTTTCGTCATAA 3’；下游引物PR25’ TGGGATGGCGATGATTATTG 3’。上游引物PF35’ CGCCATCCCAACTGGTAT 3’；下游引物PR35’ GATGAGGCGTCTTGAAAG 3’。(3)利用步驟(2)中所述引物對(duì)皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆并在DNA測序儀上進(jìn)行測序獲得皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因的全序列；(4)根據(jù)步驟(3)中測得的皇佳吉雞線粒體DNA的COI基因的全序列設(shè)計(jì)引物；所述引物的序列為上游引物PF5’ GCACAGGATGGACAGTTTAC 3’；下游引物PR5’ ATAGCATAGGGGGGTCTCAT 3’。利用所述引物獲取可用于品種鑒定的皇佳吉雞COI基因中的一段基因序列，進(jìn)行測序，并通過Chromas1.49軟件準(zhǔn)確讀取測序結(jié)果；(5)利用步驟(4)中所述引物獲取受測雞與步驟(4)中測得的皇佳吉雞COI基因中的一段基因序列相應(yīng)的基因序列，進(jìn)行測序，并通過Chromas1.49軟件準(zhǔn)確讀取測序結(jié)果；(6)將步驟(4)獲得的測序結(jié)果和步驟(5)獲得的測序結(jié)果進(jìn)行人工逐堿基讀取和核對(duì)；(7)通過DnaSP4.10.7軟件統(tǒng)計(jì)皇佳吉雞和受測雞的變異位點(diǎn)、單倍型、平均核苷酸差異、核苷酸分歧度和凈遺傳距離，并根據(jù)皇佳吉雞和受測雞的變異位點(diǎn)、單倍型、平均核苷酸差異、核苷酸分歧度和凈遺傳距離確定皇佳吉雞和受測雞基因序列的平均變異程度，若平均變異程度不大于2％則為同一品種，平均變異程度大于2％則為不同品種；(8)運(yùn)用生物學(xué)軟件構(gòu)建皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹，根據(jù)構(gòu)建的群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果確定皇佳吉雞與受測雞是否為同一品種，若皇佳吉雞與受測雞的單倍型聚為一類則為同一品種，否則為不同品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種皇佳吉雞品種的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，步 驟(8)中所述構(gòu)建皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹的方法為運(yùn)用 MEGA4. O軟件估計(jì)皇佳吉雞和受測雞之間Kimura雙參數(shù)遺傳距離，并基于Kimura雙參數(shù)模 型應(yīng)用UPGMA/NJ法構(gòu)建群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹，同時(shí)運(yùn)用NETW0RK4. 5. 0. 1軟件 構(gòu)建群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種皇佳吉雞品種的分子生物學(xué)鑒定方法，其基于基因克隆和DNA測序技術(shù)準(zhǔn)確獲得皇佳吉雞和受測雞的線粒體DNA的COI基因序列，運(yùn)用DnaSP4.10.7軟件統(tǒng)計(jì)皇佳吉雞和受測雞的變異位點(diǎn)、單倍型、平均核苷酸差異、核苷酸分歧度和凈遺傳距離，運(yùn)用生物學(xué)軟件構(gòu)建皇佳吉雞和受測雞的群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹，根據(jù)構(gòu)建的群體聚類圖和單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果確定皇佳吉雞與受測雞是否為同一品種。本發(fā)明利用品種間的遺傳信息差異經(jīng)軟件精密計(jì)算和分析的結(jié)果鑒定真?zhèn)位始鸭u品種，具有準(zhǔn)確性高、鑒定時(shí)間短和成本低等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101974647SQ20101056197
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者宋金典 申請(qǐng)人:現(xiàn)代新農(nóng)業(yè)(集團(tuán))股份有限公司