A型流感病毒檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種A型流感病毒檢測方法及其試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括第一包被膜和第二包被膜，所述第一包被膜的一端與所述第二包被膜的一端相連，所述第一包被膜中的至少一塊區(qū)域包被有帶熒光標記的第一抗體，所述第二包被膜包含分離的第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域比所述第二區(qū)域靠近所述第一包被膜，所述第一區(qū)域包被有第二抗體，所述第二抗體和所述第一抗體能夠特異性結合同一種抗原，所述第二區(qū)域包被有抗抗體，所述抗抗體能夠特異性結合所述第一抗體。利用本發(fā)明的試劑盒和/或方法檢測A型流感病毒，具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現客觀化測定等優(yōu)點。
【專利說明】A型流感病毒檢測方法及其試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒檢測領域，特別地，本發(fā)明涉及A型流感病毒檢測方法及其試劑 盒，特別地，本發(fā)明涉及一種試劑盒、試劑盒在檢測A型流感病毒中的用途以及一種檢測A 型流感病毒的方法。
【背景技術】
[0002] A型流感病毒即甲型流感病毒為常見流感病毒，甲型流感病毒容易發(fā)生變異，其亞 型常被人們稱為"禽流感"。禽流感是嚴重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的毀滅性疫病，其病原容易突變， 具有多個血清型，給該病的防控帶來困難，病毒基因變異后能夠感染人類，感染后的癥狀主 要表現為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數伴有嚴重的肺炎，嚴重者心、腎等多種臟器衰竭導 致死亡，據WHO統(tǒng)計，人感染H5亞型的死亡率高達60 %。甲型流感對人類致病性高，曾多 次引起世界性大流行。甲型流感病毒中至今發(fā)現能直接感染人的禽流感病毒亞型有：甲型 H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2 和 H10N8,其中 H1、H5、H7、H9 亞型為高致病 性。
[0003] 目前常見的A型流感病毒的檢測方法主要有：核酸檢測和病毒分離鑒定。核酸檢 測有RT-PCR檢測和real-time RT-PCR檢測方法，核酸檢測依賴于樣本模板RNA的質與量， 操作要求嚴格，需要大量儀器與設備及專業(yè)人員操作，檢測時間較長，檢測靈敏度高。病毒 分離鑒定常用于對陽性樣品病毒的亞型鑒定，需要專門實驗室才能進行。
【發(fā)明內容】
[0004] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商 業(yè)選擇。
[0005] 為此，依據本發(fā)明的一方面，提供一種試劑盒，其包括第一包被膜和第二包被膜， 所述第一包被膜的一端與所述第二包被膜的一端相連，所述第一包被膜中的至少一塊區(qū)域 包被有帶熒光標記的第一抗體，所述第二包被膜包含分離的第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第 一區(qū)域比所述第二區(qū)域靠近所述第一包被膜，所述第一區(qū)域包被有第二抗體，所述第二抗 體和所述第一抗體能夠特異性結合同一種抗原，所述第二區(qū)域包被有抗抗體，所述抗抗體 能夠特異性結合所述第一抗體。對第一包被膜中的包被有熒光標記第一抗體的區(qū)域的大 小不作限制，可以是整個第一包被膜，也可以是第一包被膜的一部分，在本發(fā)明的一個實施 例中第一包被膜被稱為樣品墊。同樣的，對第二包被膜中的分離的第一區(qū)域和第二區(qū)域各 自的大小也不作特別限制，在本發(fā)明的一個實施例中，如圖1所示，試劑盒的第一包被膜和 第二包被膜都是長方形的，第一包被膜的一條寬邊和第二包被膜的一條寬邊相粘，第一包 被膜中的包被有熒光標記第一抗體的區(qū)域為長約2cm、寬約3mm的長方形，第二包被膜中的 第一區(qū)域和第二區(qū)域都為線狀，第一區(qū)域被稱為檢測線（T線），第二區(qū)域被稱為質控線（C 線），兩個區(qū)域所在的線狀平面都平行于兩包被膜的粘結邊，所說的線狀第一或第二區(qū)域的 寬度大約為〇. 5-lmm、長為膜的寬。
[0006] 本發(fā)明的這一試劑盒利用第一膜和第二膜分別包被有能特異性結合同一種抗原 的熒光標記的第一抗體和第二抗體，加入待測樣品后利用膜層析，在第二膜上形成雙抗體 夾心復合物，基于檢測復合物中的第一抗體上帶的熒光標記的熒光強度來判斷樣品中是否 存在所說的抗原。本發(fā)明的這一試劑盒能夠明顯的提高檢測的特異性，縮短檢測所需時間。 通過熒光標記第一抗體，能夠明顯的提高檢測靈敏度。
[0007] 根據本發(fā)明的一個實施例，本發(fā)明的這一方面的試劑盒中的第二包被膜的另一端 連接有吸水墊。吸水墊可為強吸水物質，這樣在檢測液態(tài)樣品時能夠給予定向作用力使液 態(tài)樣品從第一包被膜定向層析至第二包被膜。
[0008] 根據本發(fā)明的一個實施例，所述第一包被膜、所述第二包被膜和所述吸水墊固定 在同一固相基質上。固相基質主要為在使用本發(fā)明的這一試劑盒時有個承載，方便操作，固 相基質的類型不作特別限定，可以為不會與待測樣品發(fā)生反應或者不影響抗原抗體結合的 惰性材料，比如紙板、塑料板等。
[0009] 根據本發(fā)明的一個實施例，所述第一包被膜為玻璃纖維素膜，所述第二包被膜為 硝酸纖維素膜（NC膜）。玻璃纖維膜呈化學惰性，不含粘合劑，采用100%硼硅酸玻璃纖維制 造而成，其上包被有熒光標記的第一抗體，利于第一抗體與待測樣品中的目標抗原發(fā)生特 異性結合。而NC膜本身是已經添加了表面活性劑來改善親水能力，而且已經存在有一定的 緩沖系統(tǒng)，具有毛細纖維結構，能吸附比同等纖維素濾紙更多的水分，流速快，耐高溫，利于 其上包被的第二抗體與前述的熒光標記第一抗體-抗原發(fā)生特異性結合反應，激發(fā)熒光。
[0010] 根據本發(fā)明的一個實施例，所述突光標記為突光微球標記，所述第一抗體與所述 熒光微球標記通過肽鍵共價結合。這樣，提高標記物的穩(wěn)定性，避免了抗體空間位阻的影 響，有利于提高靈敏度和特異性。在本發(fā)明的一個實施例中，所述熒光微球直徑在納米級范 圍內，其直徑范圍為10-500nm，較佳地為20-300nm，其上負載有熒光物質，是受外界能量刺 激能激發(fā)出熒光的固體微粒。所述熒光微球負載的熒光物質為摻雜熒光染料、稀土絡合物、 量子點等的轉換熒光納米材料。所述熒光微球負載的熒光物質通過高分子聚合物修飾有活 性官能基團，所述活性官能基團為羧基，氨基，羥基，巰基。在本發(fā)明的一個實施例中，所述 活性官能基團具體為羧基，所述熒光微球標記第一抗體為為將待標記的第一抗體和羧基修 飾的熒光微球以肽鍵共價結合形成的聚合體。
[0011] 根據本發(fā)明的一個實施例，所述第一抗體為A型流感病毒通用型抗體，所述第二 抗體為不同于所述第一抗體的A型流感病毒通用型抗體，所述A型流感病毒通用型抗體能 夠特異性結合A型流感病毒的不同亞型的共有表位，這兩種抗體都能夠與A型流感病毒的 各種亞型的共有表位特異性結合，而且較佳地，兩種抗體能與A型流感病毒的不同共有表 面決定簇特異性結合，這樣利于準確檢測抗原。在本發(fā)明的一個實施例中，所述第一抗體和 /或第二抗體為A型流感病毒通用型單克隆抗體和A型流感病毒通用型多克隆抗體中的任 一種。本發(fā)明的這一試劑盒是基于對熒光標記、抗原和抗體特性的研究，通過選擇適合的熒 光標記與特異性的抗體進行定向共價化學偶聯，獲得熒光標記抗體分析，并通過優(yōu)化雙抗 體夾心免疫反應的各種條件，制備得到上述檢測A型流感病毒的試劑盒。
[0012]根據本發(fā)明的一個實施例，所述抗抗體為羊抗鼠 IgG抗體，其能夠與第一抗體特 異性結合，即與多余的帶熒光標記第一抗體結合形成免疫復合物，激發(fā)熒光，得以能夠定性 和/或定量檢測該免疫復合物。
[0013] 依據本發(fā)明的另一方面，提供上述本發(fā)明一方面的和各種實施例中的任一試劑盒 在檢測A型流感病毒中的用途。前面針對試劑盒所描述的優(yōu)點和技術特征，仍適用于該試 劑盒的用途，在此不再贅述。
[0014] 依據本發(fā)明的又一方面，提供一種檢測A型流感病毒的方法，所述方法包括步驟：將待測樣本加到上述任一試劑盒中的第一包被膜中的包被有帶熒光標記的第一抗體的區(qū) 域；檢測所述試劑盒中的第一區(qū)域和第二區(qū)域的熒光強度，獲得第一區(qū)域熒光強度和第二 區(qū)域熒光強度；基于比值大于預定閾值，判定所述待測樣本中存在A型流感病毒，其中，t匕 值=第一區(qū)域熒光強度/第二區(qū)域熒光強度。第一包被膜中的包被有帶熒光標記的第一 抗體的區(qū)域為與待測樣本中的目標抗原（若有的話）結合的區(qū)域，在本發(fā)明的一個實施例 中，將該區(qū)域稱為加樣端。在本發(fā)明的一個實施例中，所述預定閾值為0.020,該值是通過 參考利用已知的雙抗體夾心免疫反應的條件或市售試劑盒產品，大量測定正常樣本和添 加陽性樣本的正常樣本來確定的，是個二者測定值的比值的均值，利用該均值作為臨界值 (cutoff)，可以準確判斷檢測樣本是陽性或陰性的。在本發(fā)明的一個實施例中，通過手持儀 器檢測熒光強度，獲得第一區(qū)域熒光強度和第二區(qū)域熒光強度的比值，將比值與所述的臨 界值相比較，能夠客觀得到檢測結果，而且該檢測結果與市售檢測A型流感病毒通用型的 熒光PCR試劑盒的檢測結果一致。利用本發(fā)明的這一檢測方法，利用本發(fā)明的上述試劑盒， 能夠實現對A型流感病毒的快速和高靈敏測定，本發(fā)明的方法具有靈敏度高、特異性強、快 速、簡便，可實現客觀化測定的優(yōu)點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結合下面附圖對實施方式的描述中將 變得明顯和容易理解，其中：
[0016] 圖1是本發(fā)明的一個實施例中的試劑盒結構示意圖；
[0017] 圖2是本發(fā)明的一個實施例中的檢測A型流感病毒的試劑盒的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0018] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。另外，本發(fā)明中的術語"包被"為免疫學術語，包含固 定和/或吸附之意。
[0019] 以下將第一抗體稱為A型流感病毒標記抗體，將熒光標記的第一抗體稱為A型流 感病毒型抗體混合物，將第二抗體稱為A型流感病毒包被抗體，將第一區(qū)域稱為測試區(qū)或T 線，將第二區(qū)域稱為質控區(qū)或C線，將第一包被膜稱為樣品墊，將第二包被膜稱為包被膜。
[0020] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0021] 下述實施例中所用的突光微球是購自Bangs Laboratories, Inc.公司，產品目 錄號為FC02F/10930固含量為10mg/ml，為羧基修飾的熒光微球，該熒光微球平均直徑為 IlOnm0
[0022] 下述實施例中所用的待標記A型流感病毒抗體是購自EastCoast Bio公司的編號 為J320抗A型流感病毒的單克隆抗體。
[0023] 下述實施例中的A型流感病毒包被抗體是購自EastCoast Bio公司的編號為J333 抗A型流感病毒的單克隆抗體。
[0024] 下述實施例中用于制作樣品墊的玻璃纖維膜購自Millipore公司、商品目錄號為 GF-CP20300。
[0025] 下述實施例中用于制作吸水墊的吸水紙購自Millipore公司、商品目錄號為 CF-SP22300。
[0026] 下述實施例中用于制作包被膜的硝酸纖維素膜購自Millipore公司、商品目錄號 為 Hi-Flow Plus HF135。
[0027] 下述實施例中的pH為7. 4的0. 02M PBS緩沖液按照如下方法配制：稱取2. 3g Na2HP04、0. 524gNaH2P04. H20、8. 77g NaCl 溶于純水，用純水定容至 1L，調 pH 至 7. 4,得到 pH 為7. 4的0. 02M PBS緩沖液。
[0028] 下述實施例中的膜處理緩沖液按照如下方法配制：將Tween-20、BSA、蔗糖溶于上 述pH為7. 4的0. 02M PBS緩沖液使Tween-20的質量百分含量為0. 2 %、BSA的質量百分含 量為1 %、蔗糖的質量百分含量為2%，調pH至7. 4,得到膜處理緩沖液。
[0029] 下述實施例中的50mM pH為8. 5的硼砂緩沖液按照如下方法配制：稱取I. 9g Na2B4O7. IOH2O溶于IOOml純水，調pH至8. 5得到50mM pH為8. 5的硼砂緩沖液。
[0030] 下述實施例中的樣品處理液按照如下方法配制：將Tween-20溶于上述pH為7. 4 的0. 02M PBS緩沖液使Tween-20的質量百分含量為0. 2%，調pH至7. 4,得到樣品處理液。
[0031] 檢測A型流感病毒試劑盒的一般制備方法包括以下步驟：
[0032] ( -）羧基修飾的熒光微球標記探針的制備
[0033] 采用適合的羧基修飾的熒光微球，活化其表面的羧基后，采用共價偶聯的方式分 別將A型流感病毒標記抗體定向連接到該羧基修飾的熒光微球表面。
[0034] (二）測試區(qū)T線和C線處抗體的包被
[0035] 采用噴膜儀器，于包被膜測試區(qū)的T線處噴涂通用型A型流感病毒包被抗體于C 線處噴涂羊抗鼠 IgG抗體。
[0036] (三）樣品墊處標記探針的包被
[0037] 采用噴涂儀器，于樣品墊特定位置處噴涂熒光微球標記的通用型抗A型流感病毒 抗體混合物。
[0038](四）試劑盒的組裝成型
[0039] 按照試劑盒的結構示意圖圖2,于塑料支撐背板中間粘貼作為測試區(qū)的包被膜，于 包被膜的T線端粘貼樣品墊，C線端粘貼吸水墊。采用試紙分切機，將其分切為一定寬帶的 紙條，并裝入夾片，用裝有干燥劑的鋁箔袋進行包裝。
[0040] (五）抗原-抗體熒光免疫復合物的形成
[0041] 于上述組裝成型的反應板的加樣端處加入待測樣品，樣品中的A型流感病毒與熒 光微球標記的通用型A型流感病毒標記抗體結合后層析到T線處噴涂的通用型A型流感病 毒包被抗體，在T線處形成包被抗體-抗原-熒光微球標記抗體免疫復合物，多余的熒光微 球標記通用型A型流感病毒抗體則在C線處與羊抗鼠 IgG形成的熒光標記免疫復合物。 [0042](六）熒光標記免疫復合物熒光強度檢測
[0043] 用熒光檢測儀測定T線處熒光強度，通過與設定的閾值比對而確定其陽性或陰性 結果，C線測定結果則作為該測定方法的質控內標。
[0044] 所述的熒光標記免疫復合物的熒光強度，是指在T線和C線處分別滯留下的結合 熒光微球的數量用熒光檢測儀測定后所得到的數值。通過雙抗體夾心免疫反應的條件，經 大量測定正常樣本和添加陽性樣本可確定出各不同正常樣本的測定均值，以此作為臨界值 (cutoff)來確定檢測樣本的陽性或陰性結果。C線測定結果則作為該測定方法的質控內 標。
[0045] 實施例1檢測通用型A型流感病毒試劑盒的制備
[0046] (一）熒光微球標記通用型A型流感病毒標記抗體的制備
[0047] 以平均直徑為llOnm、羧基修飾的突光微球（購自Bangs Laboratories, Inc?公 司，產品目錄號為FC02F/10930)，抗A型流感病毒的單克隆抗體（購自EastCoast Bio公 司，編號為J320)，按照下述方法制備熒光微球標記A型流感病毒標記抗體：
[0048] 取5mg的上述羧基修飾的熒光微球用MES緩沖液（0. lM、pH4. 7)洗滌并離心后，用 Iml MES緩沖液（0? 1M、pH4. 7)重懸，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC) 至終濃度為5mM、加入NHS (N-羥基丁二酰亞胺）至終濃度為10mM，室溫避光，反應半小時得 到活化后羧基修飾的熒光微球。
[0049] 用50mM pH8. 5的硼砂緩沖液洗滌該活化后羧基修飾的熒光微球，分別取0. 37mg 上述待標記通用型A型流感病毒抗體和5mg上述活化后羧基修飾的熒光微球混合到50mM PH8. 5的硼砂緩沖液中充分混勻。室溫避光下反應2小時，讓抗體和熒光微球形成穩(wěn)定的肽 鍵共價結合得到熒光微球與A型流感病毒抗體的偶聯物。反應結束后，加入終濃度為1 % (質量百分含量）的BSA溶液對熒光微球與A型流感病毒抗體的偶聯物上剩余活性羧基位 點進行封閉，室溫避光反應〇. 5小時。完成后，用pH7. 4的0. 02M PBS緩沖液洗滌、重懸得 到5mg/ml熒光微球標記A型流感病毒抗體液體，4°C保存待用。
[0050] (二）檢測A型流感病毒試劑盒的制備
[0051] 以A型流感病毒包被抗體，以羊抗鼠 IgG抗體制備包被膜，具體方法如下：
[0052] 采用pH7. 4的0. 02M PBS緩沖液，將羊抗鼠 IgG抗體（長沙博優(yōu)生物科技有限公 司，ABGAM-0500)配制為濃度lmg/ml溶液，將A型流感病毒包被抗體（EastCoast Bio公司， 編號為J333)配制為濃度2mg/ml溶液，選用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)將羊抗鼠 IgG抗 體噴至包被膜（硝酸纖維素膜）的質控線（C線）位置，將通用型A型流感病毒包被抗體噴 至檢測線（T線）位置，于相對濕度為10%以下的干燥車間進行抽濕4小時后干燥待用，得 到具有檢測線和質控線的包被膜。
[0053] 用上述膜處理緩沖液浸泡玻璃纖維紙半小時，浸泡的溫度為37°C，于同樣的抽濕 條件進行抽濕4小時后，用上述膜處理緩沖液稀釋步驟（一）所得熒光微球標記A型流感 病毒抗體液體至熒光微球標記A型流感病毒抗體含量為0. 05mg/ml混合液后，采用BioDot 的XYZ3050噴膜系統(tǒng)將其噴涂至上述處理過的玻璃纖維素膜上制備形成樣品墊，于同樣的 抽濕條件進行干燥。在10萬級潔凈和干燥的車間中把上述干燥好的具有檢測線和質控線 的包被膜、上述樣品墊、吸水墊、背板按圖2所示進行搭配組裝后，采用BioDot的CM4000裁 切系統(tǒng)將貼好的紙板裁切，裝入檢測用夾片待用。
[0054] 實施例2檢測通用型A型流感病毒試劑盒的評估測試
[0055] (一）檢測靈敏度
[0056] 以A型流感病毒H5N1亞型HI試驗抗原和H9N2亞型HI試驗抗原作為待測樣品來 測定實施例1的檢測A型流感病毒試劑盒的靈敏度。
[0057] 將A型流感病毒H5N1亞型HI試驗抗原和H9N2亞型HI試驗抗原分別用pH為7. 4 的0. 02M PBS緩沖液分別和混合配制成系列濃度（64、32、16、8、4、2、1、0. 5、0. 25、0. 125、 0. 063、0. 031、0. 016、0HA unit)，分別加入由實施例1得到的檢測A型流感病毒試劑盒的加 樣端中，并采用熒光檢測儀檢測。檢測步驟：檢測前先將待檢測樣品恢復室溫（25°C)，用精 確移液器取待檢測樣品60 iU垂直緩慢滴入實施例1得到的檢測A型流感病毒試劑盒的加 樣端，10分鐘后用熒光檢測儀進行測試。
[0058] 其檢測結果如下表1所示。從檢測結果中可以得出實施例1的檢測A型流感病 毒H5N1亞型的靈敏度為0. 063HA unit，檢測A型流感病毒H9N2亞型的靈敏度為0. 031HA unit。
[0059] 表IA型流感病毒H5N1亞型不同樣品濃度的試劑盒檢測結果
[0060]
【權利要求】
1. 一種試劑盒，其包括第一包被膜和第二包被膜，所述第一包被膜的一端與所述第二 包被膜的一端相連， 所述第一包被膜中的至少一塊區(qū)域包被有帶熒光標記的第一抗體， 所述第二包被膜包含分離的第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域比所述第二區(qū)域靠近 所述第一包被膜， 所述第一區(qū)域包被有第二抗體，所述第二抗體和所述第一抗體能夠特異性結合同一種 抗原， 所述第二區(qū)域包被有抗抗體，所述抗抗體能夠特異性結合所述第一抗體。
2. 權利要求1的試劑盒，其特征在于，所述第二包被膜的另一端連接有吸水墊。
3. 權利要求2的試劑盒，其特征在于，所述第一包被膜、所述第二包被膜和所述吸水墊 固定在同一固相基質上。
4. 權利要求1的試劑盒，其特征在于，所述第一包被膜為玻璃纖維素膜，所述第二包被 膜為硝酸纖維素膜。
5. 權利要求1的試劑盒，其特征在于，所述熒光標記為熒光微球標記。
6. 權利要求5的試劑盒，其特征在于，所述第一抗體與所述熒光微球標記通過肽鍵共 價結合。
7. 權利要求1的試劑盒，其特征在于，所述第一抗體為A型流感病毒通用型抗體，所述 第二抗體為不同于所述第一抗體的A型流感病毒通用型抗體，所述A型流感病毒通用型抗 體能夠特異性結合A型流感病毒的不同亞型的共有表位。
8. 權利要求1的試劑盒，其特征在于，所述抗抗體為羊抗鼠IgG抗體。
9. 權利要求1-8任一試劑盒在檢測A型流感病毒中的用途。
10. -種檢測A型流感病毒的方法，其特征在于，包括， 將待測樣本加到權利要求1-8任一試劑盒中的第一包被膜中的包被有帶熒光標記的 第一抗體的區(qū)域； 檢測所述試劑盒中的第一區(qū)域和第二區(qū)域的熒光強度，獲得第一區(qū)域熒光強度和第二 區(qū)域熒光強度； 基于比值大于預定閾值，判定所述待測樣本中存在所述A型流感病毒，其中，比值=第 一區(qū)域熒光強度/第二區(qū)域熒光強度； 任選地，所述預定閾值為0. 02。
【文檔編號】G01N33/543GK104407133SQ201410612004
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權日:2014年11月3日
【發(fā)明者】馬嵐, 吳峰, 秦智鋒, 盧體康 申請人:清華大學深圳研究生院