專利名稱：生產(chǎn)方法
生產(chǎn)方法本發(fā)明涉及用于在宿主細(xì)胞中由甘油產(chǎn)生1，2_丙二醇的方法。更具體地，本發(fā) 明描述了使得能夠從甘油的純制劑和粗制劑專門合成丙二醇的1，2_異構(gòu)體的重組酶促活 性。本發(fā)明還提供了用于1，2-丙二醇的產(chǎn)生的關(guān)鍵活性的過表達(dá)和失活的適當(dāng)?shù)慕M合。1,2-丙二醇(丙二醇；1，2-PD)是廣泛用作不飽和聚醚樹脂、藥物制劑和化妝品、 液體洗滌劑、冷凍劑和防凍液或除冰液的組分的主要散裝化學(xué)藥品(bulk chemical)。因?yàn)?1,2-PD具有光學(xué)活性，因此1，2-PD的對(duì)映體純的制劑可能在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)或生理學(xué)應(yīng)用方面 特別引人注意。目前通過包括處理大量有毒化合物如表氯醇或氫過氧化物的化學(xué)合成從石油化 學(xué)品產(chǎn)生1，2_丙二醇。在常規(guī)化學(xué)合成中，通過水化從丙烯產(chǎn)生的環(huán)氧丙烷獲得1，2-PD。 化學(xué)合成產(chǎn)生消旋1，2-PD并且需要大量的水以防止聚乙二醇形成。常規(guī)的化學(xué)合成依賴 于化石資源并且導(dǎo)致大量副產(chǎn)品的產(chǎn)生；從而其在環(huán)境和經(jīng)濟(jì)方面看來是問題的。已知可利用微生物由作為底物的糖產(chǎn)生1，2丙二醇(Kluyver和Schellen， 1937)(Heath, Ε. C.，1962)(Altaras, N. Ε,2001)(TranDin, K,198)(Cameron, D. C.，1986) (Cameron, D. C, 1998) (Park, Y. H.，2006 ；US 7，049，109 B2)。US 6087140和US 6303352描述了利用重組生物由糖(除了 6-脫氧己糖外)產(chǎn)生 1,2-PDο在WO 2005/073364, US 2007/072279中，描述了籍以產(chǎn)生和選擇顯示增強(qiáng)的從非 特定的碳源產(chǎn)生1，2-PD的能力的微生物的方法。更具體地，已教導(dǎo)一組基因的失活產(chǎn)生具 有單個(gè)或多個(gè)突變的菌株(其為通過恒化器-發(fā)酵(chemostat-fermentation)進(jìn)行的隨 后選擇步驟的基礎(chǔ))。應(yīng)用的焦點(diǎn)集中在編碼aldA和gloA活性的基因的失活。所有公開 的實(shí)施例針對(duì)大腸桿菌(E. coli)MG1655，所述大腸桿菌在至少下列兩個(gè)基因中具有突變 磷酸三糖異構(gòu)酶(tpiA)和丙酮酸甲酸裂解酶(pflAB)的兩個(gè)亞基。此外，實(shí)施例明確地提 及葡萄糖作為用于發(fā)酵的碳源。因此在本領(lǐng)域內(nèi)存在對(duì)改進(jìn)用于1，2_丙二醇(1，2-PD)的產(chǎn)生的生物技術(shù)方法的 未滿足的需要。還存在對(duì)可用于這樣的方法的改良微生物菌株的未滿足的需要。本發(fā)明通過為到目前為止仍然阻礙該領(lǐng)域中的重大進(jìn)步的問題提供解決辦法來 滿足該未滿足的需要。為了解決這些問題，本發(fā)明提供了用于從非發(fā)酵性廉價(jià)碳底物產(chǎn)生1，2丙二醇 (1,2-PD)的改進(jìn)的生物技術(shù)方法，其中碳底物維持生物質(zhì)的產(chǎn)生并且同時(shí)用作為產(chǎn)生1，2 丙二醇(1，2-PD)的底物。本發(fā)明還提供了特別適合于本方法的特殊要求，從而特別適合用 于根據(jù)本發(fā)明的方法的改良微生物菌株。特別地，本發(fā)明提供了當(dāng)在非發(fā)酵性碳底物上生長(zhǎng)時(shí)，特別是當(dāng)在作為唯一碳源 的甘油上生長(zhǎng)時(shí)，產(chǎn)生高水平1，2丙二醇(1，2-PD)的經(jīng)工程改造的宿主細(xì)胞，特別是微生 物或菌株，其中碳底物維持生物質(zhì)的產(chǎn)生并且同時(shí)用作產(chǎn)生1，2丙二醇(1，2-PD)的底物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生高水 平的1，2丙二醇(1，2-PD)的經(jīng)工程改造的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中所述甘油具有至少70 %，特別地至少75 %，特別地至少80 %，特別地至少85 %，特別地至少90 %，特 別地至少95%，特別地至少99%和達(dá)到100%的純度，落在上面確定的范圍內(nèi)的所有整數(shù) 也一起包括在其中。在特定的實(shí)施方案中，所述甘油具有80%至90%，特別地大約85%的純度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了當(dāng)在作為唯一的碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn) 生高水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中特別是通過引入 編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因?qū)λ鏊拗骷?xì)胞，特別是所述微生物或菌株，進(jìn) 行工程改造用以過表達(dá)丙二醇氧化還原酶(fucO)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中特別是通過將至少一 個(gè)編碼選自甘油脫氫酶(gldA)、二羥基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)的酶 活性的另外的基因與編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因一起共引入所述宿主細(xì)胞 (就此表達(dá)所述活性和丙二醇氧化還原酶(fucO)活性)來對(duì)所述宿主細(xì)胞，特別是所述微 生物或菌株進(jìn)行工程改造以共表達(dá)選自甘油脫氫酶(gldA)，二羥基丙酮激酶(dhaK)和甲 基乙二醛合酶(mgsA)的至少一個(gè)酶蛋白以及丙二醇氧化還原酶(fucO)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中特別是通過將編碼甘 油脫氫酶(gldA)活性的基因與編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因共引入所述宿主 細(xì)胞(就此表達(dá)所述甘油脫氫酶(gldA)活性和丙二醇氧化還原酶(fucO)活性)來對(duì)所述 宿主細(xì)胞，特別地所述微生物或菌株進(jìn)行工程改造以共表達(dá)甘油脫氫酶(gldA)活性和丙 二醇氧化還原酶(fucO)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中特別是通過將編碼二 羥基丙酮激酶(dhaK)活性的基因與編碼編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因一起 共引入所述宿主細(xì)胞(就此表達(dá)所述二羥基丙酮激酶(dhaK)活性和丙二醇氧化還原酶 (fucO)活性)來對(duì)所述宿主細(xì)胞，特別是所述微生物或菌株進(jìn)行工程改造以共表達(dá)二羥基 丙酮激酶(dhaK)活性和丙二醇氧化還原酶(fucO)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中特別是通過將編碼甲 基乙二醛合酶(mgsA)活性的基因與編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因一起共引入 所述宿主細(xì)胞(就此表達(dá)所述甲基乙二醛合酶(mgsA)活性和丙二醇氧化還原酶(fucO)活 性)來對(duì)所述宿主細(xì)胞，特別是所述微生物或菌株進(jìn)行工程改造以共表達(dá)甲基乙二醛合酶 (mgsA)活性和丙二醇氧化還原酶(fucO)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中特別地通過將編碼甘 油脫氫酶(gldA)和二羥基丙酮激酶(dhaK)活性的基因與編碼丙二醇氧化還原酶(fucO) 活性的基因一起共引入所述宿主細(xì)胞(就此表達(dá)所述甘油脫氫酶(gldA)和二羥基丙酮激 酶(dhaK)活性以及丙二醇氧化還原酶(fucO)活性)來對(duì)所述宿主細(xì)胞，特別是所述微生 物或菌株進(jìn)行工程改造以共表達(dá)甘油脫氫酶(gldA)和二羥基丙酮激酶(dhaK)活性以及丙二醇氧化還原酶(fucO)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中特別是通過將編碼甘 油脫氫酶(gldA)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性的基因與編碼丙二醇氧化還原酶(fucO) 活性的基因一起共引入所述宿主細(xì)胞(就此表達(dá)所述甘油脫氫酶(gldA)和甲基乙二醛合 酶(mgsA)活性以及丙二醇氧化還原酶(fucO)活性)來對(duì)所述宿主細(xì)胞，特別地所述微生 物或菌株進(jìn)行工程改造以共表達(dá)甘油脫氫酶(gldA)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性以及丙 二醇氧化還原酶(fucO)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中特別是通過將編碼 二羥基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性的基因與編碼丙二醇氧化還原酶 (fucO)活性的基因一起共引入所述宿主細(xì)胞(就此表達(dá)二羥基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙 二醛合酶(mgsA)活性以及丙二醇氧化還原酶(fucO)活性)來對(duì)所述宿主細(xì)胞，特別是所 述微生物或菌株進(jìn)行工程改造以共表達(dá)二羥基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA) 活性以及丙二醇氧化還原酶(fucO)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中特別是通過將編碼 甘油脫氫酶(gldA)、二羥基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性的基因與編 碼丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因一起共引入所述宿主細(xì)胞(就此表達(dá)甘油脫氫 酶(gldA)、二羥基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性以及丙二醇氧化還原酶 (fucO)活性)來對(duì)所述宿主細(xì)胞，特別是所述微生物或菌株進(jìn)行工程改造以共表達(dá)甘油脫 氫酶(gldA)、二羥基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性以及丙二醇氧化還原 酶(fucO)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中特別是通過將編碼甘 油脫水酶活性的基因與編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因一起共引入所述宿主 細(xì)胞(就此表達(dá)甘油脫水酶活性以及丙二醇氧化還原酶(fucO)活性)來對(duì)所述宿主細(xì) 胞，特別是所述微生物或菌株進(jìn)行工程改造以共表達(dá)甘油脫水酶活性和丙二醇氧化還原酶 (fucO)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中特別是通過將選自 dkgA、dkgB、yeaE和yghZ的編碼醛酮還原酶活性的基因(特別是微生物基因)與編碼丙二 醇氧化還原酶(fucO)活性的基因一起共引入所述宿主細(xì)胞(就此表達(dá)所述醛酮還原酶活 性和丙二醇氧化還原酶(fucO)活性)來對(duì)所述宿主細(xì)胞，特別是所述微生物或菌株進(jìn)行工 程改造以共表達(dá)醛酮還原酶活性(特別是由選自dkgA、dkgB、yeaE和yghZ的基因，特別是 微生物基因貢獻(xiàn)的醛酮還原酶活性)和丙二醇氧化還原酶(fucO)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中已通過重組DNA技術(shù) 對(duì)所述宿主細(xì)胞，特別是所述微生物或菌株進(jìn)行了工程改造。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中所述宿主細(xì)胞，特別是 微生物或菌株在阿拉伯糖代謝中具有缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞，特別是所述 微生物或菌株由于降低的核酮糖激酶活性或丟失核酮糖激酶活性而在阿拉伯糖代謝中具 有缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中所述宿主細(xì)胞，特別是 微生物或菌株在甲基乙二醛代謝中具有缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞，特別是所 述微生物或菌株由于降低的或丟失選自乙二醛酶系統(tǒng)I、乙二醛酶系統(tǒng)II、乳酸脫氫酶A、 乙二醛酶系統(tǒng)III、醛脫氫酶A活性的酶活性，尤其是由于降低的乙二醛酶系統(tǒng)I活性或丟 失乙二醛酶系統(tǒng)I活性而在甲基乙二醛的代謝中具有缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，其中所述宿主細(xì)胞，特別是 微生物或菌株在磷酸二羥丙酮代謝中具有缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞，特別是 所述微生物或菌株由于降低的磷酸三糖異構(gòu)酶活性或丟失磷酸三糖異構(gòu)酶活性而在磷酸 二羥丙酮的代謝中具有缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的和如本文中之前描述的宿主細(xì) 胞，特別是微生物或菌株，其中所述微生物是大腸桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備1，2_丙二醇的方法，其中將根據(jù)本發(fā) 明的宿主細(xì)胞，特別是微生物菌株培養(yǎng)在含有簡(jiǎn)單碳源，特別是粗制甘油制劑的適當(dāng)培養(yǎng) 基中，之后回收以及必要時(shí)純化產(chǎn)生的1，2_丙二醇。特別，本發(fā)明提供了通過將根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞特別是微生物或菌株培養(yǎng)在非 發(fā)酵性碳底物上來產(chǎn)生1，2_丙二醇的方法，其包括i)培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的和如本文中之前描述的所述宿主細(xì)胞，特別是所述微生物或 菌株，該宿主細(xì)胞在含有非發(fā)酵性碳底物的培養(yǎng)基中過表達(dá)丙二醇氧化還原酶(fucO)活 性，其中碳底物維持生物質(zhì)的產(chǎn)生并且同時(shí)用作為產(chǎn)生1，2丙二醇(1，2-PD)的底物，并且 非發(fā)酵性碳源被根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株代謝成1，2_丙二醇ii)回收根據(jù)步驟i)產(chǎn)生的1，2_丙二醇；和，任選地，iii)純化回收的1，2-丙二醇。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述非發(fā)酵性碳底物是粗制甘油制劑，特別是含有 具有至少70 %，特別地至少75 %，特別地至少80 %，特別地至少85 %，特別地至少90 %，特 別地至少95%，特別地至少99%和達(dá)到100%的純度的甘油的制劑。在特定的實(shí)施方案中，甘油具有80 %至90 %，特別地大約85 %的純度。在一個(gè)實(shí)施方案中，非發(fā)酵性碳源，特別是如本文中之前描述的粗制甘油制劑被 選擇性代謝成1，2-丙二醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如本文中之前描述的產(chǎn)生1，2_丙二醇的方法， 其中將根據(jù)本發(fā)明的和如本文中之前描述的經(jīng)工程改造過表達(dá)丙二醇氧化還酶(fucO)的 宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株用于所述方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如本文中之前描述的產(chǎn)生1，2_丙二醇的方法，其中將根據(jù)本發(fā)明的和如本文中之前描述的宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株用于所述方 法，所述宿主細(xì)胞經(jīng)工程改造共表達(dá)至少一種選自甘油脫氫酶(gldA)、二羥基丙酮激酶 (dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)的另外的酶蛋白以及丙二醇氧化還原酶(fucO)活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用根據(jù)本發(fā)明的和如本文中之前描述的宿主細(xì) 胞，特別是微生物或菌株，其中已使至少一個(gè)參與與1，2-PD的產(chǎn)生相競(jìng)爭(zhēng)的非產(chǎn)生性路徑 的酶活性失活。特別地，使用微生物突變體，特別是大腸桿菌的突變體，在所述突變體中已使編碼 乙二醛酶系統(tǒng)I和II (gloA和gloB)、乳酸脫氫酶A(IdhA)、乙二醛酶系統(tǒng)111(通過使主調(diào) 節(jié)劑rpoS失活間接地)和醛脫氫酶的基因中的一個(gè)或多個(gè)基因失活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用其中已使編碼gloA活性的基因部分或完全失活的微 生物突變體或菌株，特別是大腸桿菌突變體在另一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用阿拉伯糖代謝失活的微生物突 變體或菌株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將大腸桿菌菌株，特別是大腸桿菌菌株MG1655和 DH5ci，分別用作宿主生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼選自甘油脫氫酶(gldA)、二羥基丙酮激酶 (dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)以及丙二醇氧化還原酶(fucO)的酶活性的基因中的至少 一個(gè)基因處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，特別是阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，尤其是ParaBAD啟動(dòng)子的控 制之下。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了合成操縱子并且將所述操縱子用于根據(jù)本 發(fā)明的提供宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株的方法，所述宿主細(xì)胞共表達(dá)選自甘油脫氫酶 (gldA)、二羥基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性的至少一個(gè)酶活性以及丙 二醇氧化還原酶(fucO)活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼上述活性的基因處于誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子，特別是阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，尤其是ParaBAD啟動(dòng)子的控制之下。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)的基因和至少一 個(gè)編碼選自甘油脫氫酶、二羥基丙酮激酶和甲基乙二醛合酶(mgsA)的酶蛋白的另外的基 因的合成操縱子，特別是包含編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)、甘油脫氫酶、二羥基丙酮激酶 和甲基乙二醛合酶(mgsA)的基因的合成操縱子。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的合成操縱子處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子特別是阿拉伯糖 誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制之下。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)從所述操縱子轉(zhuǎn)錄的基因的連續(xù)物 (succession of gene)的基因如下mgsA、gldA、dhaK、fucO。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的和如本文中之前描述的操縱子的多核苷酸分子 或構(gòu)建體，特別是質(zhì)粒和載體分子以及涉及包含所述多核苷酸分子的宿主細(xì)胞，特別是微 生物宿主細(xì)胞。附圖和序列表的概述

圖1舉例說明大腸桿菌的野生型(黑色條)和突變型菌株(gloA突變體，灰色條； gloB突變體，陰影線條)的生長(zhǎng)被不同量的加入至肉湯培養(yǎng)基的甲基乙二醛抑制。圖2是當(dāng)糖或甘油是碳底物時(shí)產(chǎn)生1，2_PD的路徑的示意圖。
圖3和4舉例說明本發(fā)明中描述的質(zhì)粒的圖譜。術(shù)語“多核苷酸”在本文中理解為是指高分子量的聚合物分子，其可以是單鏈或 雙鏈的，可由含有糖、磷酸和作為嘌呤或嘧啶的堿基的單體(核苷酸)組成。因此術(shù)語“多 核苷酸”主要是指DNA或RNA的聚合物，其可以是單鏈的或雙鏈的，任選地包含能夠整合入 DNA或RNA聚合物的合成的、非天然或改變的核苷酸堿基。除非另外指出，否則本發(fā)明的特 定核酸序列還明確地包括其保守修飾的變體(例如簡(jiǎn)并密碼子置換)和互補(bǔ)序列以及明確 指定的序列。特別地，簡(jiǎn)并密碼子置換可通過產(chǎn)生其中用混合堿基和/或脫氧肌苷殘基置 換一個(gè)或多個(gè)選擇的(或所有)密碼子的第3位置的序列來獲得(Batzer，等人(1991)； Ohtsuka，等人，(1985)；和Rossolini，等人(1994))。術(shù)語多核苷酸與核酸、核酸分子可互 換使用并且可包括基因、cDNA和由基因編碼的mRNA等。術(shù)語“構(gòu)建體”是指來源于任何來源的質(zhì)粒、病毒、自主復(fù)制序列、噬菌體或單鏈或 雙鏈DNA或RNA的線性或環(huán)狀核苷酸序列，其中許多核苷酸序列已被連接或重組入獨(dú)特結(jié) 構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)能夠?qū)?dòng)子片段和編碼根據(jù)本發(fā)明的酶活性的選擇的基因產(chǎn)物的DNA序列 以及適當(dāng)?shù)?'非翻譯序列引入細(xì)胞。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”涉及在核酸整合后細(xì)胞中獲得新基因。術(shù)語“表達(dá)”是指將編碼基因產(chǎn)物的序列的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成基因產(chǎn)物。在表達(dá) 中，編碼基因產(chǎn)物的序列的DNA鏈?zhǔn)紫缺晦D(zhuǎn)錄成通常為信使RNA的互補(bǔ)RNA，然后，如果基因 產(chǎn)物是蛋白質(zhì)的話，所轉(zhuǎn)錄的信使RNA被翻譯成上述基因產(chǎn)物。本文中使用的術(shù)語“質(zhì)粒”或“載體”或“粘?！笔侵竿ǔy帶不是細(xì)胞的中心代謝 的部分的基因并且通常以環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式存在的染色體外元件。用于本說明書中的術(shù)語“調(diào)控子(regulator) ”是指具有功能性啟動(dòng)子的和任何相 關(guān)轉(zhuǎn)錄元件(例如，增強(qiáng)子、CCAAT盒、TATA盒、SPI部分等)的堿基序列。用于本說明書的術(shù)語“有效地連接”意指在宿主細(xì)胞中以可操作的狀態(tài)將控制基 因表達(dá)的各種調(diào)控元件例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等與目的基因連接，就此使所述目的基因能夠 表達(dá)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說眾所周知的是調(diào)控子的類型和種類可視宿主而變化。術(shù)語“缺失”是抑制基因活性，其通常由抑制可以是失活、抑制的活性組成，或其 可以是所述基因的至少部分的缺失(例如其表達(dá)所必需的啟動(dòng)子區(qū)域的全部或部分的缺 失)，以使其不表達(dá)或無功能或以使表達(dá)產(chǎn)物喪失其功能(例如所述基因的編碼部分的缺 失)。優(yōu)選，基因的缺失基本上是對(duì)該基因的抑制，所述基因可被幫助鑒定、分離和純化根據(jù) 本發(fā)明的菌株的篩選標(biāo)記基因替代。例如，可通過例如大腸桿菌的recA-蛋白介導(dǎo)的同源 重組使基因失活(Cunningham，等人(1980))。簡(jiǎn)而言之，失活方案可以如下將DNA的線性片段引入細(xì)胞。體外獲得該片段并 且其包含側(cè)翼連接基因的兩個(gè)區(qū)域和位于兩個(gè)側(cè)翼區(qū)域之間的編碼篩選基因產(chǎn)物的基因 (通?？股乜剐曰?。該片段從而提供了滅活的基因。通過在選擇培養(yǎng)基上涂板來選 擇已經(jīng)歷重組事件并且整合了合成片段的細(xì)胞。選擇已經(jīng)歷雙重組事件，其中天然基因已 被失活的基因替換的細(xì)胞。術(shù)語“碳底物”意指能夠被微生物代謝的任何碳源，其中底物包含至少一個(gè)碳原子。
術(shù)語“非發(fā)酵性碳底物”，如本發(fā)明中所使用的，是指不支持給定的生物在外源電 子受體不存在的情況下產(chǎn)生生物質(zhì)的氧化還原過程的碳底物。1，2_丙二醇(丙二醇；1，2_PD)是廣泛用作不飽和聚酯樹脂、藥物制劑和化妝品、 液體洗滌劑、冷卻劑(coolant)和防凍液或除冰液的成分的主要散裝化學(xué)品。因?yàn)?，2丙 二醇(1，2-PD)具有光學(xué)活性，因此對(duì)映體純的1，2丙二醇(1，2-PD)的制劑在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)或 生理學(xué)應(yīng)用方面可能特別引人注意?？衫梦⑸飶淖鳛榈孜锖臀ㄒ惶荚吹奶钱a(chǎn)生1，2丙二醇(1，2-PD)。近年來，就 用作發(fā)酵底物而言，可選擇的底物例如甘油(而非例如糖碳源)已吸引了人們相當(dāng)多的注 意。對(duì)甘油的興趣主要?dú)w因于顯著增加的生物柴油或生物乙醇的生產(chǎn)。這兩種方法都產(chǎn)生 甘油作為主要副產(chǎn)品，其構(gòu)成例如產(chǎn)生的生物柴油的10% (w/w) 0本發(fā)明現(xiàn)提供了用于從非發(fā)酵性廉價(jià)的碳底物特別是粗制甘油制劑產(chǎn)生1，2丙 二醇(1，2-PD)的改進(jìn)的生物技術(shù)方法，其中碳底物維持生物質(zhì)的產(chǎn)生并且同時(shí)用作產(chǎn)生 1，2丙二醇(1，2-PD)的底物。本發(fā)明還提供了改良微生物菌株，其特別適合該方法的特殊 要求，從而特別適合用于根據(jù)本發(fā)明的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用宿主細(xì)胞特別是微生物或菌株(所述宿主 細(xì)胞經(jīng)工程改造包含一個(gè)或多個(gè)參與由甘油產(chǎn)生1，2丙二醇(1，2-PD)的產(chǎn)生路徑的基因) 將甘油或粗制甘油制劑作為非發(fā)酵性碳源直接生物轉(zhuǎn)化成1，2-丙二醇。特別地，已通過重 組DNA技術(shù)對(duì)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞特別是微生物或菌株進(jìn)行了工程改造，從而產(chǎn)生重組 宿主細(xì)胞，特別是重組微生物或菌株，所述重組宿主細(xì)胞包含參與磷酸二羥丙酮和甲基乙 二醛(1，2丙二醇(1，2-PD)的產(chǎn)生路徑中的兩個(gè)至關(guān)重要的前體化合物)的代謝的基因。 特別地，提供了宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，所述宿主細(xì)胞具有選自編碼展示甘油脫氫 酶活性、二羥基丙酮激酶活性、甲基乙二醛合酶活性和丙二醇氧化還原酶活性的酶的基因， 所述酶能夠以高選擇性將甘油轉(zhuǎn)化成1，2丙二醇(1，2-PD)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用經(jīng)工程改造的大腸桿菌菌株，特別是 重組大腸桿菌菌株。在本發(fā)明內(nèi)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)來自生物柴油生產(chǎn)的普通粗制甘油(85%的純度)可 用作許多種不同來源的生物在好氧和缺氧條件下生長(zhǎng)的底物。可證明大多數(shù)受試生物就生 物質(zhì)產(chǎn)生而言與純甘油相比較，不受粗制甘油損害，從而表明可利用粗制甘油并且其對(duì)于 微生物通常是無毒的。生物質(zhì)產(chǎn)生不受粗制甘油制劑中發(fā)現(xiàn)的雜質(zhì)影響。因此，來自生物 柴油生產(chǎn)或可選擇的來源的粗制甘油可被微生物同樣良好地用作碳源，從而所述粗制甘油 可在無需進(jìn)一步加工的情況下在用于生物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)酵過程中用作一般可再生碳源。因而粗制甘油制劑，特別是來自生物柴油或生物乙醇生產(chǎn)的粗制甘油制劑可用于 根據(jù)本發(fā)明的用于產(chǎn)生1，2丙二醇(1，2-PD)的方法。1，2丙二醇(1，2-PD)的產(chǎn)生路徑中的第一關(guān)鍵前體化合物是磷酸二羥丙酮 (DHAP)。通過甲基乙二醛合酶(mg sA)的活性將DHAP轉(zhuǎn)化成甲基乙二醛(第二必需前體 化合物)。甲基乙二醛最終轉(zhuǎn)化成S-乳酸醛(S-Iactaldehyde)。迄今為止未鑒定的甘油 脫水酶活性可將甘油轉(zhuǎn)化成R或S-乳酸醛，其分別被進(jìn)一步代謝為R-或S-I，2-PD。然而 有人提出宿主細(xì)胞的內(nèi)源性還原活性從R-乳酸醛產(chǎn)生R-l，2-PD，S-乳酸醛似乎是丙二醇 氧化還原酶(fucO)的底物，所述酶可將S-乳酸醛轉(zhuǎn)化成S-l，2-PD(AltaraS，N. Ε.，1999 ；Applield andEnvironmental Microbiology(65)，1180—1185)。因此假設(shè)通過將丙二醇氧化還原酶(fucO)引入宿主生物，產(chǎn)生1，2丙二醇(1， 2-PD)的網(wǎng)絡(luò)的靈活性(flexibility)可通過接受乳酸醛的S-對(duì)映體以轉(zhuǎn)化成1，2丙二 醇(1，2-PD)而得到擴(kuò)大。此外，可得出丙二醇氧化還原酶(fucO)活性可能是不依賴于甲 基乙二醛路徑由甘油產(chǎn)生1，2丙二醇(1，2-PD)所必需的。因此，將包含編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的核苷酸序列的多核苷酸補(bǔ)充 給無論培養(yǎng)條件如何，不從甘油產(chǎn)生可檢測(cè)量的1，2丙二醇(1，2-PD)的野生型菌株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因克隆 入宿主生物(所述宿主生物不從甘油產(chǎn)生可檢測(cè)量的1，2丙二醇(1，2-PD))并且所述基因 在好氧和半缺氧條件下，在于含有甘油的基本培養(yǎng)基中的所述宿主中過表達(dá)。丙二醇氧化 還原酶(fucO)活性的過表達(dá)導(dǎo)致1，2丙二醇(1，2-PD)的產(chǎn)生。1，2丙二醇(1，2-PD)的產(chǎn)生路徑中的另外的關(guān)鍵前體化合物是磷酸二羥丙酮 (DHAP) 0在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過工程改造將產(chǎn)生作為1，2丙二醇(1，2-PD)_合 成的前體的磷酸二羥丙酮的可選擇路徑引入微生物菌株，特別是大腸桿菌菌株，所述路徑 不依賴于作用于甘油磷酸激酶(glpK)的內(nèi)源調(diào)控網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生必需前體DHAP。特別地，將包含編碼甘油脫氫酶(gldA)和二羥基丙酮激酶(dhaK)活性的核苷酸 序列的DNA分子引入宿主生物，特別是大腸桿菌宿主?？蓮拇竽c桿菌菌株，特別是大腸桿菌 K12分離編碼甘油脫氫酶(gldA)的基因并且將其克隆入適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將編碼甘油脫氫酶(gldA)的基因與編碼二羥基丙酮激酶 (dhaK)活性的基因一起克隆入適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒?？蓮臋幟仕釛U菌(Citrobacter)菌株，特別是 弗氏檸檬酸桿菌(CitrcAacterfreimdii)菌株分離編碼二羥基丙酮激酶(dhaK)活性的基 因。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將甘油脫氫酶(gldA)基因克隆入獨(dú)立于和與甘 油脫氫酶(gldA)分開的適當(dāng)質(zhì)粒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，引入的編碼甘油脫氫酶(gldA)和/或二羥基丙酮激 酶(dhaK)活性的編碼序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，特別是阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(paraBAD)的 控制之下?？蓪a(chǎn)生磷酸二羥丙酮的該可選擇路徑的分別編碼甘油脫氫酶(gldA)和二羥基 丙酮激酶(dhaK)活性的基因與包含編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的核苷酸序列的多 核苷酸一起(分別作為單個(gè)表達(dá)盒(其中編碼序列處于其自已的啟動(dòng)子和終止信號(hào)的控制 之下，所述表達(dá)盒可位于不同質(zhì)粒上或位于單個(gè)質(zhì)粒上)或以包含處于共同啟動(dòng)子和終止 序列的控制之下的兩個(gè)或更多個(gè)所述基因的合成操縱子的形式)引入野生型宿主生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼甘油脫氫酶(gldA)和二羥基丙酮激酶 (dhaK)活性的基因克隆入已包含編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因的單個(gè)質(zhì)粒， 從而產(chǎn)生包含編碼甘油脫氫酶(gldA)和丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因的質(zhì)粒，或 包含編碼二羥基丙酮激酶(dhaK)和丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因的質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生包含編碼甘油脫氫酶(gldA)和二羥基丙酮激酶(dhaK) 以及丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的基因的質(zhì)粒?？蓪⒕幋a不同酶活性的不同基因序列排列在質(zhì)粒上例如用以產(chǎn)生合成操縱子，其中兩個(gè)或更多個(gè)基因排列在共同調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和多腺苷酸化序列的控制之下。在一 個(gè)實(shí)施方案中，合成操縱子處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子特別是阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制之下。DHAP是產(chǎn)生1，2丙二醇(1，2_PD)的路徑的初始中間產(chǎn)物。糖酵解路徑的磷酸三 糖異構(gòu)酶(tpi)與甲基乙二醛合酶競(jìng)爭(zhēng)DHAP。為了驅(qū)動(dòng)1，2丙二醇(1，2-PD)產(chǎn)生，可將編 碼甲基乙二醛合酶的mgsA整合入合成操縱子以使平衡移向1，2丙二醇(1，2-PD)的產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，從而提供了除了參與磷酸二羥丙酮路徑的基因外還 包含參與甲基乙二醛的產(chǎn)生的另外的基因(特別是甲基乙二醛合酶基因，特別是大腸桿菌 的甲基乙二醛合酶基因)的延長(zhǎng)的合成操縱子。然后將所得的質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞，特別是微生物宿主細(xì)胞或菌株，特別是大腸桿 菌菌株，無論培養(yǎng)條件如何，所述宿主細(xì)胞不能夠由甘油產(chǎn)生可檢測(cè)量的1，2丙二醇(1， 2-PD)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，宿主生物不具有活性阿拉伯糖代謝或之前已通過缺 失或使至少一個(gè)參與阿拉伯糖代謝的必需基因例如編碼核酮糖激酶活性(araB)的基因失 活來使其失去阿拉伯糖代謝活性。在好氧和半缺氧條件下在含有甘油的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng) 相應(yīng)的菌株，然后從上清液中分離1，2丙二醇(1，2-PD)并且對(duì)其進(jìn)行分析。丙二醇氧化還原酶基因(fucO)的過表達(dá)導(dǎo)致從粗制甘油制劑產(chǎn)生1，2丙二醇(1， 2-PD)?？赏ㄟ^共表達(dá)二羥基丙酮激酶(dhaK)和/或甘油脫氫酶基因(gldA)以及丙二醇 氧化還原酶基因(fucO)來增加1，2丙二醇(1，2-PD)的量?？赏ㄟ^共表達(dá)二羥基丙酮激酶 (dhaK)和/或甘油脫氫酶基因(gldA)和/或甲基乙二醛合酶基因(mgsA)以及丙二醇氧化 還原酶基因(fucO)和/或使用宿主細(xì)胞，特別是微生物宿主細(xì)胞或菌株(所述宿主細(xì)胞在 至少一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)1. 2-丙二醇產(chǎn)生性路徑中的關(guān)鍵前體化合物的非產(chǎn)生性路徑中具有缺陷) 來實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步提高。以所述方式如5' -mgSA、gldA、dahK、fuC0-3'排列參與催化的基因是優(yōu)選的，然 而本發(fā)明不限于該特定的排列。所述基因的任何順序可能適合于1，2丙二醇(1，2-PD)的產(chǎn)生。已顯示路徑對(duì)于丙二醇的1，2丙二醇(1，2-PD)異構(gòu)體的產(chǎn)生是特異性的，因?yàn)槲?檢測(cè)到1，3-丙二醇。從細(xì)菌基因組獲得期望的基因的方法在分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)是普通的并且熟知的。 例如，如果已知基因的序列，可通過限制性內(nèi)切核酸酶降解產(chǎn)生適當(dāng)?shù)幕蚪M文庫(kù)，然后可 利用與期望的基因序列互補(bǔ)的探針篩選所述文庫(kù)。在分離該序列后，可使用標(biāo)準(zhǔn)引物指導(dǎo) 的擴(kuò)增方法例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(美國(guó)專利4，683，202)擴(kuò)增DNA以獲得適合用于使 用適當(dāng)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的DNA量?？蛇x擇地，可產(chǎn)生其中可將基因組DNA的大片段(35-451Λ) 包裝入載體并且用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗鞯恼沉Ｎ膸?kù)。粘粒載體的獨(dú)特性在于能夠容納大量 DNA0通常，粘粒載體具有至少一個(gè)拷貝的cos DNA序列，該序列是包裝和隨后環(huán)化外源DNA 所必需的。除了 cos序列外，此類載體還將包含復(fù)制起始點(diǎn)例如ColEl和藥物抗性標(biāo)記例 如抗氨芐西林或新霉素的基因。使用粘粒載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)菌宿主的方法已在Sambrook 等人，(1989)中獲得詳盡描述。一般地，為了克隆粘粒，使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶分離 外源DNA，并且將其與粘粒載體的cos區(qū)鄰接。然后將含有線性化的外源DNA的粘粒載體與 包裝DNA的載體例如噬菌體1反應(yīng)。在包裝過程中，cos位點(diǎn)初切割，然后外源DNA被包裝入細(xì)菌病毒顆粒的頭部。然后可將這些顆粒用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞例如大腸桿菌。當(dāng)注 射入細(xì)胞后，外源DNA在cos粘性末端的影響下環(huán)化。這樣，外源DNA的大片段可被引入重 組宿主細(xì)胞并且在其中表達(dá)。在已分離基因并且將其序列輸入public domain后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用例如 GenBank中給出的此類已知基因的參照序列來確定其他生物、細(xì)菌菌株、酵母、真菌、哺乳動(dòng) 物和植物等中的等價(jià)基因。有利地使用可使用序列比對(duì)確定的與來自其他微生物的基因的 共有序列和通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并探針(通過所述探針可將相應(yīng)的基因克隆入另一種生物)來進(jìn)行 該常規(guī)工作。此類常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的并且描述于例如 Sambrook 等人(1989)中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了適合用于根據(jù)本發(fā)明的酶促活性的克隆、轉(zhuǎn) 化和表達(dá)的許多種載體以及轉(zhuǎn)化和表達(dá)盒。所述載體可以是例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以 是復(fù)制型或復(fù)制缺陷型。在后一種情況下，病毒擴(kuò)增通常將只在互補(bǔ)宿主/細(xì)胞中才發(fā)生?？蓪⒈景l(fā)明的多核苷酸或基因連接至含有篩選標(biāo)記的載體以在宿主中進(jìn)行擴(kuò)增。 通常，以沉淀例如磷酸鈣沉淀或氯化銣沉淀的形式或以與帶電荷的脂質(zhì)的復(fù)合物的形式或 以基于碳的簇例如富勒烯(fulleren)的形式引入質(zhì)粒載體。當(dāng)載體是病毒時(shí)，在用于宿主 細(xì)胞之前可使用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系體外包裝其。在本發(fā)明的的載體的更優(yōu)選實(shí)施方案中，將多核苷酸有效地連接至表達(dá)控制序 列，從而允許在原核或真核細(xì)胞或其分離級(jí)分中表達(dá)。所述多核苷酸的表達(dá)包括將多核苷酸優(yōu)選轉(zhuǎn)錄成可翻譯的mRNA。確保在真核細(xì)胞 例如細(xì)菌或直菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或人細(xì)胞，特別是細(xì)菌或真菌細(xì) 胞中表達(dá)的調(diào)控元件對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。它們通常包含確保轉(zhuǎn)錄起始的調(diào) 控序列和任選地確保轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定的多腺苷酸化信號(hào)。另外的調(diào)控元件可包括轉(zhuǎn) 錄以及翻譯增強(qiáng)子。允許在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)的可能的調(diào)控元件包括例如大腸桿菌中的 lac.trp或tac啟動(dòng)子，允許在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件的實(shí)例是酵母中的AOXl或 GALl啟動(dòng)子。除了負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的元件外，此類調(diào)控元件還可在多核苷酸的下游包括轉(zhuǎn)錄 終止信號(hào)。在本說明書中，合適的表達(dá)載體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如Okayama-Berg cDNA ^ ii ic # pcDVl (Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNAU pcDNA3 (In-vitrogene)、 pSPORTl (GIBCO BRL) ,pSE380 (In-vitrogene)或任何 pBR322 或 pUC18_ 來源的質(zhì)粒。優(yōu)選， 所述載體是表達(dá)載體和/或基因轉(zhuǎn)移或靶向載體。來源于病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、 腺伴隨病毒、皰疹病毒或牛乳頭瘤病毒的表達(dá)載體可用于將本發(fā)明的多核苷酸或載體遞送 入靶細(xì)胞群體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建重組病毒載體；參見，例如，描述于 Sambrook, (1989)和Ausubel (1994)中的技術(shù)。可選擇地，可將本發(fā)明的多核苷酸和載體 重建入脂質(zhì)體以遞送至靶細(xì)胞。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的基因或本發(fā)明的載體進(jìn)行了基因 工程改造的宿主細(xì)胞。用于1，2-丙二醇的重組產(chǎn)生的合適的宿主細(xì)胞可以是原核或真核 細(xì)胞并且將只受宿主細(xì)胞表達(dá)活性酶的能力限制。所述宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞?？蓪⒋嬖谟谒拗骷?xì)胞中的本發(fā)明的多核苷酸或載體整合入宿主細(xì)胞的基因組或其可以以染色體外形式保持。在這方面，還應(yīng)理 解本發(fā)明還涉及可用于“基因打靶”和/或“基因替代”以通過同源重組恢復(fù)突變基因或 產(chǎn)生突變基因的重組DNA分子；參見例如Mouellic，(1990) Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press。宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞例如細(xì)菌或真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng) 物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或人細(xì)胞，特別是細(xì)菌或真菌細(xì)胞。優(yōu)選宿主將是通常用于 產(chǎn)生甘油或1，2_丙二醇的宿主。優(yōu)選真菌細(xì)胞是例如曲霉菌屬(Aspergillus)、 酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、接合酵母屬 (Zygosaccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母 屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、毛霉屬(Mucor) 和球擬酵母屬(Torulopsis)的真菌細(xì)胞，特別是釀酒酵母(S. cerevisiae)種的真菌 細(xì)胞。術(shù)語“原核”是指包括可用多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的酶活性的 所有細(xì)菌和古細(xì)菌(archaea)。原核宿主可包括革蘭陰性以及革蘭陽性細(xì)菌例如檸檬 SIff^M (Citrobacter) > Jgff^M (Enterobacter) > It ^M (Clostridium) >K 菌屬(Klebsiella)、氣桿菌屬(Aerobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、甲基細(xì)菌屬 (Methylobacter) K^M (Escherichia)、Π K^M (Salmonella) > Wl^PfMM (Bacillus)、鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)和假單胞菌屬(I^seudomonas)。本發(fā)明中最優(yōu)選的 是大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌(S. typhimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、克雷伯氏菌屬種和酵母菌屬種，特別是大腸桿菌屬種。其特殊實(shí)例包括大腸桿菌MG1655(ATCC 700926 ；Bachmann, B.，pp. 2460-2488 in Neidhardt 等人 1996)、大腸桿菌XLl-Blue MRF'[由 Mratagene，Strategies, 5,81 (1992) 制造的]、大腸桿菌 C600 [Genetics, 39,440 (1954)],大腸桿菌 Y1088 [Science, 222, 778 (1983)]、大腸桿菌 Y1090 [Science, 222, 778 (1983)]、大腸桿菌 NM522 [J. Mol. Biol.， 166，1 (1983)]、大腸桿菌 K802 [J. Mol. Biol. ,16,118 (1966)]、大腸桿菌 JM109 [Gene, 38 275 (1985)]、大腸桿菌 DH5 α [J. Mol. Biol. , 166,557(1983)1 等?？赏ㄟ^使用其中已降低或消除了參與非產(chǎn)生性路徑的一些或所有酶活性的適當(dāng) 的微生物突變體來實(shí)現(xiàn)1，2-PD產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。例如，由mgsA和tpi編碼的酶促活性競(jìng) 爭(zhēng)DHAP。已顯示甲基乙二醛合酶活性(mgsA)被二磷酸鹽滅活(Hopper，D.J. 1972)。為了 促進(jìn)DHAP至甲基乙二醛的轉(zhuǎn)化，可通過篩選利用產(chǎn)生mgsA的編碼序列內(nèi)的變異的任何方 法例如易錯(cuò)PCR(error-prone PCR)獲得的變異文庫(kù)來鑒定MgsA的磷酸非敏感型突變體。 用mgsA變體的質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化之前已使磷酸三糖異構(gòu)酶(tpiA)和內(nèi)源mgsA失活的微生物 菌株特別是大腸桿菌克隆，然后將其培養(yǎng)在非選擇固體培養(yǎng)基上。通過在含有高濃度的甘 油或DHAP (板B)或高濃度的二磷酸鹽和甘油或DHAP (板C)的瓊脂板上影印培養(yǎng)初始轉(zhuǎn)化 體(板A)，將可選擇可在板A和B上生長(zhǎng)但不能在板C上生長(zhǎng)的克隆。此類克隆編碼具有 在高濃度磷酸鹽存在的情況下產(chǎn)生毒性水平的甲基乙二醛的顯著活性的mgsA變體?？扇鐚?duì)于甲基乙二醛合酶突變體所描述的一樣產(chǎn)生磷酸三糖異構(gòu)酶突變體。通過 比較復(fù)雜培養(yǎng)基(例如Luria Broth, LB)、葡萄糖和甘油上的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)鑒定在生長(zhǎng)動(dòng)力 學(xué)上顯著受損的Tpi-突變體。以甘油作為唯一的碳源和能源，目的突變體與未修飾菌株相 比較顯示更慢的生長(zhǎng)或不生長(zhǎng)，然而利用LB或葡萄糖作為碳源的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)不受影響。
存在用于MG脫毒的兩個(gè)其他主要路徑，所述路徑就1，2 PD生物合成而言是產(chǎn)生 性的。利用所謂的MG還原酶作為初始步驟催化它們。有人提出幾個(gè)酶編碼應(yīng)當(dāng)通過使競(jìng) 爭(zhēng)性非產(chǎn)生性路徑失活來增強(qiáng)的該活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建微生物突變體，特別是大腸桿菌的突變體，其中 已通過例如單基因敲除使編碼乙二醛酶系統(tǒng)I和II(gloA和gloB)、乳酸脫氫酶A(IdhA)、 乙二醛酶系統(tǒng)III (通過使主調(diào)控子rpoS失活間接地)和醛脫氫酶A(aldA)的基因中的一 個(gè)或多個(gè)失活例如來顯著降低或完全抑制功能性酶活性。這樣，可獲得具有一個(gè)或多個(gè)所 述失活的基因的微生物突變體，特別是其中使2、特別地3、特別地4、特別地5個(gè)選自編碼乙 二醛酶系統(tǒng)I (gloA)、乙二醛酶系統(tǒng)II (gloB)、乳酸脫氫酶A(IdhA)、乙二醛酶系統(tǒng)III (通 過使主調(diào)控子rpoS失活間接地)和醛脫氫酶A(aldA)的基因失活的突變體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了其中已使編碼gloA活性的基因部分或完全 失活的微生物突變體，特別是大腸桿菌突變體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使宿主細(xì)胞，特別是微生物或菌株，尤其是原核微生 物例如大腸桿菌喪失其將甲基乙二醛(MG)代謝成D-和/或L-乳酸(MG-至-乳酸的代 謝)的能力。這可通過例如使乙二醛酶A失活(優(yōu)選與使編碼乙二醛酶B、可選擇的σ因 子rpoS和醛還原酶A的基因中的一個(gè)或多個(gè)失活組合)來實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，菌株 缺乏所有上文所列的活性和/或基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用包含編碼選自甲基乙二醛合酶(mgsA)、甘油脫氫酶 (gldA)、二羥基丙酮激酶(dhaK)和丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的酶活性的基因的多核 苷酸，特別是用質(zhì)粒pDP_mgdf轉(zhuǎn)化例如通過使乙二醛酶A失活而產(chǎn)生的阿拉伯糖代謝和MG 至乳酸的代謝失活的菌株，然而，合成操縱子中基因的排列不限于質(zhì)粒pDP_mgdf中顯示的 排列，其可以是任何順序。本發(fā)明還涉及未喪失阿拉伯糖代謝功能的菌株例如野生型大腸 桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用賦予醛酮還原酶活性的質(zhì)粒編碼的基因轉(zhuǎn)化優(yōu)選喪失但 不必喪失MG至乳酸的代謝的活性的菌株。編碼活性的基因獲自一組大腸桿菌基因，包括 dkgA、dkgB、yeaE 禾口 yghZ。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用編碼醛酮還原酶活性(例如大腸桿菌的DkgA)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 表達(dá)甘油脫氫酶(gldA)、二羥基丙酮激酶、丙二醇氧化還原酶(fucO)和甲基乙二醛合酶 (例如通過質(zhì)粒pDP_mgdf)的菌株，然后將其培養(yǎng)在包含粗制甘油作為碳源的培養(yǎng)基中。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，MG至乳酸的代謝失活并且表達(dá)甘油脫氫酶(gldA)、二羥 基丙酮激酶、丙二醇氧化還原酶(fucO)和甲基乙二醛合酶(例如質(zhì)粒pDP_mgdf上編碼的) 的菌株表達(dá)醛酮還原酶活性(例如，在質(zhì)粒PCR2. 1上編碼的大腸桿菌的dkgA)并且培養(yǎng)在 含有粗制甘油作為碳源的培養(yǎng)基中。本發(fā)明還提及未喪失阿拉伯糖代謝能力的菌株和/或從微生物的染色體表達(dá)本 發(fā)明中引述的相關(guān)酶活性的菌株。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的任何技術(shù)將編碼根據(jù)本發(fā)明的酶活性的多核 苷酸用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。優(yōu)先用于將此類基因引入菌株的技術(shù)是電穿孔，其對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟 知的。簡(jiǎn)而言之，電穿孔方案可以如下將目的異源基因于啟動(dòng)子與終止子之間克隆入表達(dá)載體。該載體還具有抗生素抗性基因(用以選擇含有其的細(xì)胞)和宿主菌株的功能性復(fù)制 起始點(diǎn)(這樣其可得到保持)。方案需要制備電感受態(tài)細(xì)胞，然后用載體通過電穿孔轉(zhuǎn)化 其。根據(jù)本發(fā)明，通過電穿孔引入的基因優(yōu)選是根據(jù)本發(fā)明的編碼選自甘油脫氫酶(gldA)、 二羥基丙酮激酶(dhaK)、甲基乙二醛合酶(mgsA)和丙二醇氧化還原酶(fucO)活性的酶活 性的基因。用于制備融合的有效連接的基因和在細(xì)菌或動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)它們的方法在本領(lǐng) 域內(nèi)是熟知的(Sambrook，同上)。本文中描述的基因構(gòu)建體和方法可用于在例如原核宿主 中表達(dá)本發(fā)明的多肽。一般地，與宿主相關(guān)，使用含有促進(jìn)插入的多核苷酸高效轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng) 子序列的表達(dá)載體。表達(dá)載體通常包含復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子和終止子以及能夠提供轉(zhuǎn)化細(xì) 胞的表型選擇的特定基因?？砂凑毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的獲得最佳細(xì)胞生長(zhǎng)的技術(shù)在發(fā)酵罐中生 長(zhǎng)和培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的原核宿主。通常，將細(xì)胞于30°C下培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中。本發(fā)明中的優(yōu)選培養(yǎng)基是已知成 份培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基，例如含有甘油作為碳源的基本培養(yǎng)基M9。還可使用常用的商業(yè)上 制備的培養(yǎng)基例如Luria Bertani (LB)肉湯、Sabouraud Dextrose(SD)肉湯或酵母麥芽提 取物(YeastMalt Extract) (YM)肉湯并且微生物學(xué)或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員知道用于 培養(yǎng)特定微生物的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。還可將已知直接或間接調(diào)節(jié)分解代謝物抑制的試劑例如 環(huán)腺苷2' 3'-單磷酸或環(huán)腺苷2' 5'-單磷酸的用途整合入反應(yīng)介質(zhì)。類似地，還可 將已知調(diào)節(jié)酶促活性的導(dǎo)致1，2-PD的產(chǎn)量增加的試劑(例如，亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽和堿 (alkalis))的用途與基因操作結(jié)合使用或作為對(duì)基因操作的另一選擇使用。用于發(fā)酵的合適的pH范圍是pH 5.0至？!1 9.0，其中？!1 6. O至pH 8. O優(yōu)選作為 初始條件的范圍。可在好氧條件、微氧條件或缺氧條件下進(jìn)行反應(yīng)，其中好氧條件或微氧條 件是優(yōu)選的。分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵本發(fā)明使用分批發(fā)酵法。經(jīng)典的分批發(fā)酵是封閉的系統(tǒng)，其 中在發(fā)酵開始時(shí)設(shè)定培養(yǎng)基的組成并且該組成在發(fā)酵過程中不經(jīng)歷人工改變。因此，在發(fā) 酵開始時(shí)，用期望的生物接種培養(yǎng)基，并且在不向系統(tǒng)加入任何東西的情況下允許發(fā)酵進(jìn) 行。然而，通常就碳源的加入而言分批發(fā)酵是“分批的”并且經(jīng)常在控制因子例如PH和氧氣 濃度下進(jìn)行嘗試。分批系統(tǒng)的代謝產(chǎn)物和生物質(zhì)組成持續(xù)變化直至發(fā)酵停止的時(shí)候。在分 批培養(yǎng)中，細(xì)胞緩慢通過靜止延滯期(static lag phase)至高對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以及最后至靜止 期(此時(shí)生長(zhǎng)率降低或停止)。如果不進(jìn)行處理，靜止生長(zhǎng)期中的細(xì)胞將最終死亡。對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期中的細(xì)胞負(fù)責(zé)終產(chǎn)物或中間產(chǎn)物的大量產(chǎn)生。標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的變型是也適合于本發(fā)明 的分批補(bǔ)料發(fā)酵系統(tǒng)O^ed-Batchfermentation system)。在分批系統(tǒng)的該典型的變型中， 隨著發(fā)酵進(jìn)行以遞增的方式加入底物。當(dāng)分解代謝物抑制傾向于抑制細(xì)胞的代謝時(shí)和在 期望在培養(yǎng)基中具有有限量的底物時(shí)，分批補(bǔ)料系統(tǒng)非常有用。分批補(bǔ)料系統(tǒng)中實(shí)際底物 濃度的測(cè)量是非常困難的，因此基于可測(cè)量因子例如PH、溶解氧和廢氣例如二氧化碳(CO. sub. 2)的分壓的變化來估計(jì)其。分批和分批補(bǔ)料發(fā)酵在本領(lǐng)域內(nèi)是常見的并且熟知的，實(shí) 例可見于Brock，同上。還預(yù)期方法可適用于連續(xù)發(fā)酵法。連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，其中向生物 反應(yīng)器中連續(xù)加入已知成份的發(fā)酵培養(yǎng)基并且同時(shí)取出等量的條件化培養(yǎng)基以進(jìn)行加工。 連續(xù)發(fā)酵通常以恒定的高密度維持培養(yǎng)物，其中細(xì)胞主要處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。連續(xù)發(fā)酵允許 調(diào)節(jié)影響細(xì)胞生長(zhǎng)或終產(chǎn)物濃度的一個(gè)因子或許多因子。例如，一個(gè)方法可將限制性營(yíng)養(yǎng)物例如碳源或氮?dú)馑骄S持在固定比率并且允許調(diào)節(jié)所有其他參數(shù)。在其他系統(tǒng)中，可連 續(xù)改變?cè)S多影響生長(zhǎng)的因子同時(shí)使通過培養(yǎng)基濁度測(cè)量的細(xì)胞濃度保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)努 力保持穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)條件(steady state growth condition)，從而由于培養(yǎng)基被取走而引起 的細(xì)胞損失必須通過發(fā)酵中細(xì)胞的生長(zhǎng)率來平衡。調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子以進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵 過程的方法以及用于使產(chǎn)物形成的比率最大化的技術(shù)在工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域中是熟知的，許 多方法由Brock(同上)詳細(xì)描述。可使用分批、分批補(bǔ)料或連續(xù)方法進(jìn)行本發(fā)明，并且任 何已知的發(fā)酵模式可以是合適的。此外，預(yù)期可將細(xì)胞作為完整的細(xì)胞催化劑固定在基質(zhì) 上并且使其經(jīng)歷發(fā)酵條件以進(jìn)行1，2-丙二醇的產(chǎn)生。然后可從已成熟生長(zhǎng)的培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物分離1，2丙二醇產(chǎn)物?？赏ㄟ^任何 常規(guī)方法分離和純化微生物或其它方式產(chǎn)生的丙二醇。用于從發(fā)酵或培養(yǎng)培養(yǎng)基純化丙 二醇的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。例如，可通過使用有機(jī)溶劑、蒸餾和柱層析(美國(guó)專利 5，356，812)使反應(yīng)混合物經(jīng)歷提取來從細(xì)胞培養(yǎng)基獲得丙二醇。用于該方法的特別好的有 機(jī)溶劑是環(huán)己烷(美國(guó)專利5，008, 473)。為了進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用，從大體積的發(fā)酵液純化1，2_丙二醇需要非實(shí)驗(yàn)室規(guī)模方法。 待克服的困難包括從液體培養(yǎng)基中除去細(xì)胞物質(zhì)(澄清)、通過提取或除去水分濃縮1， 2-丙二醇以及將殘留的雜質(zhì)與部分純化的單體分離。通常通過過濾、離心或錯(cuò)流微孔過濾 (crossf lowmicrofiltration)進(jìn)行肉湯澄清。適當(dāng)?shù)倪^濾器例如由 Mi 11 ipore (Mi 11 ipore Corporation, 80 Ashby Road, Bedford, Mass.)或 Filmtec (Dow Chemical Co.)制造。離 心有效地除去了大量細(xì)胞，但取決于肉湯的性質(zhì)，并非總是完全去除細(xì)胞。錯(cuò)流微孔過濾產(chǎn) 生極其澄清的濾液。濃縮物是漿體(slurry)而非高固體塊(high-solidcake)。本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠改進(jìn)澄清方法以使其最適合于將使用的發(fā)酵裝置和條件。減少澄清的肉湯中的 水因1，2_丙二醇在水中的高溶解度而變得復(fù)雜。從澄清的肉湯提取1，2_丙二醇可通過許 多方法來完成，包括蒸發(fā)/蒸餾、膜技術(shù)、利用有機(jī)溶劑和吸附進(jìn)行的提取?？蓪⑿D(zhuǎn)蒸發(fā) 器用于初步減少澄清內(nèi)湯的水體積。該方法在申請(qǐng)者的手中已享有良好的成功。外源蛋白 質(zhì)和鹽的沉淀未顯示影響1，2_丙二醇的回收?？煞珠_地或與蒸發(fā)結(jié)合使用膜技術(shù)。合適 的膜可(i)允許1，2-丙醇通過，阻擋水和其他進(jìn)料分子，(ii)允許水和其他分子通過，阻 擋1，2_丙二醇或(iii)允許水和1，2_丙二醇通過同時(shí)阻擋其他分子。在本發(fā)明中方法 (iii)是優(yōu)選的。特別有用的是反滲透膜例如SW-302540(FilmteC，DOW Chemical Co.)和 由 Millipore (MilliporeCorporation，Bedford, Mass.)制造的 DL 和 SH 系列的反滲透膜。 在蒸發(fā)和膜濃縮后，可在有機(jī)溶劑中提取部分純化的1，2_丙二醇。合適的溶劑可包括醇例 如叔戊醇、環(huán)戊醇、辛醇、丙醇、甲醇和乙醇。還可使用非醇例如辛酮、環(huán)己烷和戊醛。在本 發(fā)明的說明書中，醇是優(yōu)選的并且乙醇是最優(yōu)選的?？蛇x擇地，可通過咐附至不同的工業(yè)吸 附劑來進(jìn)一步濃縮1，2-丙二醇?；钚蕴己铜h(huán)糊精聚合物例如由AmericanMaize Products Company生產(chǎn)的是特別合適的。在提取或吸附后，必須提純部分純化的1，2-丙二醇?？赏?過電滲析(對(duì)于脫鹽特別有用)實(shí)現(xiàn)提純，所述電滲析利用陰離子和陽離子交換膜或雙極 (陰極和陽極)膜(參見例如，Grandison, Alistair S.，(1996))的組合。本發(fā)明中的優(yōu) 選提純方法是蒸餾?？煞峙M(jìn)行蒸餾，其中操作壓力是環(huán)境壓力或低于例如大約25in.Hg 的真空。蒸餾的監(jiān)控顯示按第一至最后的順序蒸發(fā)的材料始于輕有機(jī)物、水、二元醇(包括 1，2_丙二醇)和最終重材料例如甘油和沉淀的固體。實(shí)施例下列實(shí)施例提供了舉例說明的實(shí)施方案。根據(jù)本公開內(nèi)容和本領(lǐng)域技術(shù)人員的一 般水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解下列實(shí)施例旨在僅為舉例說明性的并且可使用許多變化、 改進(jìn)和改變而不背離在此所述主題的范圍。構(gòu)建和擴(kuò)增本發(fā)明中描述的菌株所必需的所有操作和技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員 來說是已知的。技術(shù)細(xì)節(jié)描述于例如Ausubel等人1995 ;Sambrook，J，2001和Miller, J. H. 1992中以及本發(fā)明中引用的相關(guān)公開案中。實(shí)施例1 一般方法1. 1菌株的培養(yǎng)在經(jīng)設(shè)計(jì)包含低水平磷酸鹽的已知成份基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌，因?yàn)榱姿猁} 是已知的甲基乙二醛合酶抑制劑。每升培養(yǎng)基含有(NH4) 2S04-3g酵母抽提物_0，2gCoCl2-I，9e_6g雙-(2-羥乙基)-亞胺基-三-(羥甲基)-甲烷-IOgKH2PO4-0,002gK2HPO4-0,0085gMgSO4-O, 225g微量元素溶液[Pfennig，1966]-Iml適當(dāng)時(shí)，向培養(yǎng)基中加入抗生素。使用的濃度是慶大霉素，5yg/l，氨芐西林， 10μ g/1。從生物柴油生產(chǎn)獲得粗制甘油，其具有85%的純度。在培養(yǎng)試管(總體積30ml，接種物5ml)或用橡皮塞密封的玻璃瓶(總體積12ml， 接種物IOml)(以產(chǎn)生半缺氧條件)中常規(guī)地增殖大腸桿菌菌株。術(shù)語“在好氧條件下培 養(yǎng)”意指在攪拌的情況下在非密封容器中進(jìn)行的培養(yǎng)。在該背景中半缺氧意指在不攪拌的 情況下在于好氧條件下制備的培養(yǎng)基中且在密封的容器例如在接種后用橡皮塞密封的瓶 中(以避免外部氧擴(kuò)散進(jìn)來)進(jìn)行的菌株培養(yǎng)。分別地對(duì)于好氧和半缺氧條件，培養(yǎng)時(shí)間 在2至5天之間變化。一般地，當(dāng)光密度不能再增加時(shí)終止實(shí)驗(yàn)。1.2 1，2_PD形成的分析利用3個(gè)不同的方法(包括比色測(cè)定、HPLC和GC-MS)測(cè)定培養(yǎng)肉湯的上清液中 的1，2-PD水平。然而使用陽離子交換柱的HPLC不能區(qū)分丙二醇的1，2_和1，3_異構(gòu)體， 比色測(cè)定對(duì)于1，2-PD是特異性的。GC-MS分析允許同時(shí)分別定量?jī)煞N異構(gòu)體。檢測(cè)水平是 0. 5g/l (對(duì)于HPLC分析)、50mg/l (對(duì)于比色測(cè)定)和10mg/l (對(duì)于GC-MS分析)。關(guān)于常規(guī)分析，利用由Jones和Riddick {Jones，1957}描述的比色法測(cè)定上清液 中的1，2-PD?；旧希瑢⒘蛩峒尤胫翢o細(xì)胞上清液樣品，混合，然后加熱。此后，加入茚三酮 溶液和亞硫酸氫鈉，混合并且溫育1小時(shí)。加入另一等份的硫酸，記錄相當(dāng)于1，2-PD的濃 度的595nm處的吸收。關(guān)于定量分析，通過GC-MS分析測(cè)量樣品中的1，2_PD。通過與真實(shí)材料相比相同的保留時(shí)間和利用質(zhì)量指紋圖譜(mass-fingerprinting)鑒定1，2_PD。實(shí)施例2 重組牛物的構(gòu)建2. 1用于本發(fā)明的菌株和質(zhì)粒將大腸桿菌MG1655(F-X-ilvG-rfb_50 rph_l)禾口 DH5 α (Γ，Φ 80dlacZ Δ Μ15、 Δ (lacZYA-argF)U169、deoR、recAl、endAl、hsdR17(rk、mk+)、phoA、supE44、λ \ thi_l、 gyrA96、relAl)及其衍生物用作產(chǎn)生1，2_PD的宿主。此外，MG1655的基因組DNA提供了用 于相關(guān)基因的擴(kuò)增的來源。來自弗氏檸檬酸桿菌(CitrcAacterfreundii) (DSM30040)的基 因組DNA用作擴(kuò)增dhaK基因的模板。2. 2基因的分離和克降作為第一步驟，將甘油脫氫酶gldA(SEQ ID NO :29)的大腸桿菌基因引入質(zhì)粒 pB2araJ(圖3a)或質(zhì)粒pCR2. 1 (圖北)。用于目的基因的擴(kuò)增的所有引物列于表1中。將 引物gldH_forl和gldH_revl用于從大腸桿菌擴(kuò)增1，104-bp gldA片段。將凝膠純化的 PCR-片段插入pB2araJ載體的AatII-SwaI位點(diǎn)以產(chǎn)生pDP_g。在該質(zhì)粒中，gldA-表達(dá) 處于啟動(dòng)子paraBAD的控制之下，從而允許受L-阿拉伯糖密切調(diào)控的可誘導(dǎo)的表達(dá)，如由 Guzman等人(Guzman, L. Μ.，1995)描述的。使用引物dhaK_forl和dhaK_revl從弗氏檸檬 酸桿菌擴(kuò)增dhaK-基因。獲得的1659-nt序列示于SEQ ID NO :27中，相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列示 于SEQ ID N0:30中。將凝膠純化的dhaK片段插入pDP_g的Swal-AscI位點(diǎn)，從而產(chǎn)生共 轉(zhuǎn)錄gldA和dhaK的pDP_gd。將引物fuc0_forl和fuC0_revl用于擴(kuò)增來自大腸桿菌的編 碼丙二醇氧化還原酶(fuc0)的1152-nt基因(SEQ ID NO :31)，將所述基因連接pDP_gd的 AvrII-SmaI位點(diǎn)以獲得共轉(zhuǎn)錄gldA、dhaK和fucO的質(zhì)粒pDP_gdf。使用引物mgsA_xhoI_ for和mgSA_XhoI_rev從大腸桿菌擴(kuò)增示于SEQID NO 32中的大腸桿菌甲基乙二醛合酶的 mgsA的468-bp片段，然后將其以有意方向引入BioI位點(diǎn)以獲得pDP_mgdf。因而在誘導(dǎo)時(shí) 從質(zhì)粒pDP_mgdf轉(zhuǎn)錄的基因的連續(xù)物如下mgsA、gldA、dhaK、fucO和lacZ-α，然而剩下的 LacZ α-肽只用于在適當(dāng)?shù)乃拗骶?例如DH5 a )中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究。完整質(zhì)粒pDP_mgdf 的nt序列示于SEQ ID NO 28中。使用Taq-聚合酶以及引物dkgB_up和dkg_dw或dkgA_up和dkgA_dw從大腸桿菌 擴(kuò)增分別編碼多功能MG-還原酶(SEQ ID NO :33)和4-硝基苯甲醛還原酶(SEQ ID NO 34) 的基因dkgA和dkgB。通過TA克隆(Invitrogen)將純化的PCR產(chǎn)物引入載體pCR2. 1 (圖 3b)。表1 用于將在pB2araJ或pCR2. 1中克隆的基因的PCR擴(kuò)增的引物
權(quán)利要求
1.當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生高水平的1，2-丙二醇的經(jīng)工程改造的宿主 細(xì)胞。
2.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中甘油具有80%至90%的純度。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞已通過引入編碼丙二醇 氧化還原酶活性的基因進(jìn)行了工程改造。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞已通過引入至少一個(gè)另外的基因進(jìn) 行了工程改造，所述另外的基因編碼選自甘油脫氫酶(gldA)、二羥基丙酮激酶(dhaK)和甲 基乙二醛合酶(mgsA)的酶活性，所述宿主細(xì)胞就此表達(dá)所述酶活性和丙二醇氧化還原酶 活性(fucO)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞已通過引入另外的基因進(jìn)行了工程 改造，所述另外的基因編碼甘油脫氫酶、二羥基丙酮激酶和甲基乙二醛合酶，所述宿主細(xì)胞 就此表達(dá)所述甘油脫氫酶、二羥基丙酮激酶和甲基乙二醛合酶活性以及丙二醇氧化還原酶 活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞已通過引入另外的基因進(jìn)行了工程 改造，所述另外的基因編碼甘油脫水酶，所述宿主細(xì)胞就此表達(dá)所述甘油脫水酶活性和丙 二醇氧化還原酶活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞已通過引入另外的基因進(jìn)行了工程 改造，所述另外的基因編碼醛酮還原酶，所述宿主細(xì)胞就此表達(dá)所述醛酮還原酶活性以及 丙二醇氧化還原酶活性。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞在至少選自下列的化合 物的代謝中具有缺陷i)阿拉伯糖ii)甲基乙二醛iii)磷酸二羥丙酮。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，當(dāng)在作為唯一碳源的甘油上生長(zhǎng)時(shí)其產(chǎn)生 高水平的1，2-丙二醇，但基本上不產(chǎn)生1，3-丙二醇。
10.根據(jù)所述權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其為大腸桿菌。
11.多核苷酸分子，其包含處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下的合成操縱子，所述操縱子包 含編碼甘油脫氫酶(gldA)和丙二醇氧化還原酶(fucO)的基因。
12.多核苷酸分子，其包含處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制之下的合成操縱子，所述操縱子包含 另外的基因進(jìn)行了工程改造，所述另外的基因編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)的基因和至 少一個(gè)編碼選自甘油脫氫酶(gldA)、二羥基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)的 酶蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的多核苷酸分子，其包含處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制之下的合成操縱 子，所述操縱子包含編碼丙二醇氧化還原酶(fucO)、甘油脫氫酶(gldA)、二羥基丙酮激酶 (dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)的基因。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的微生物，其包含根據(jù)權(quán)利要求11至13的任一項(xiàng)的多 核苷酸。
15.用于產(chǎn)生1，2_丙二醇的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求1至10和14的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞培養(yǎng)在含有簡(jiǎn)單碳源，特別是粗制甘油制劑的適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中，之后回收和任 選地純化所產(chǎn)生的1，2_丙二醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及由甘油產(chǎn)生1，2-丙二醇(1，2-PD)的微生物的開發(fā)，然而甘油同時(shí)是用于1，2-PD和生物質(zhì)產(chǎn)生的底物碳源。本發(fā)明顯示任何類型的甘油可用作為1，2-PD生物合成的碳底物。微生物是重組生物，優(yōu)選是大腸桿菌K12菌株或其衍生物，特別是降低1，2-PD產(chǎn)量的競(jìng)爭(zhēng)性路徑失活的菌株。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102089421SQ200980122082
公開日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日
發(fā)明者G·繆爾, J·埃克, J·馬姆派爾 申請(qǐng)人:科萊恩金融(Bvi)有限公司