專利名稱：修飾的因子Ⅶ多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了修飾的治療性蛋白質。本發(fā)明特別提供了修飾的因子VII多肽及其 應用，所述多肽包括因子VIIa及其它形式的因子VII。
背景技術：
止血是使出血停止的復雜生理過程。血小板、血漿蛋白、和血管及內皮細胞是這個 過程的三個成分，每個成分在緊隨組織損傷后的事件中均起重要作用，并且在正常情況下 使血凝塊快速形成。關鍵的是凝血級聯(lián)反應，這是一系列蛋白酶解事件，其中某些血漿蛋白 (或者凝血因子)在“級聯(lián)”中相繼被另一先被活化的凝血因子激活，導致凝血酶的迅速形 成。隨后在這個級聯(lián)中產(chǎn)生的大量凝血酶使纖維蛋白原裂解為血凝塊形成所需的纖維蛋白 肽。凝血因子作為無活性的單鏈酶原循環(huán)，在一或多個部位通過裂解被活化而產(chǎn)生雙 鏈活性形式的蛋白質。因子VII(FVII)是維生素K依賴性血漿蛋白，最初在血液中以酶原 循環(huán)。FVII酶原在單一位置Arg152-Ileira被蛋白酶解活化，產(chǎn)生由單一二硫鍵連接的雙鏈 蛋白酶(FVIIa)。FVIIa結合其輔因子組織因子(TF)形成復合物，其中FVIIa可有效地使 因子X(FX)活化為FXa，從而起始導致纖維蛋白形成和止血的一系列事件。雖然在大多數(shù)情況中實現(xiàn)正常止血，但是該過程中的缺陷可以導致出血性疾病，其中血凝塊形成的時間延長。這種疾病可以是先天或者后天的。例如，血友病A和B是遺傳 性疾病，特征分別在于因子VIII (FVIII)和因子IX(FIX)的缺陷。替代治療是血友病A和 B的傳統(tǒng)治療方法，包括靜脈內施用從人血漿制備或者作為重組蛋白質的FVIII或者FIX。 然而在許多情況中，患者產(chǎn)生針對輸注蛋白質的抗體(也稱作抑制劑)，其降低治療效力或 者使治療無效。已經(jīng)許可重組FVIIa(N0V0Seven (凝血因子VIIa(重組))用于治療具有 FVIII或FIX抑制劑的血友病A或者B患者，且還用于終止與創(chuàng)傷和/或手術相關的出血事 件或者防止出血。重組FVIIa也被許可用于治療先天性FVII缺陷的患者，并越來越多地用 于標示外使用(off-label use)，如治療與非血友病患者中先天性或者獲得性出血疾病、創(chuàng) 傷和手術相關的出血。重組FVIIa促進血凝塊形成的應用突出了其作為治療劑的越來越重要的特點。 FVIIa治療明顯未滿足臨床需要。例如，基于臨床試驗數(shù)據(jù)，需要在6小時或更多的時間平 均3劑FVIIa以處理血友病患者的急性出血事件。需要更有效的FVIIa變體以減少這些需 求。因此，本發(fā)明的一個目的是提供修飾的FVII多肽，其被設計為具有改良的治療性質。概述本發(fā)明提供了修飾的因子VII (FVII)多肽。本發(fā)明特別提供了呈現(xiàn)促凝血劑活性 的修飾的FVII多肽。該FVII多肽與未修飾的FVII多肽相比在一級序列中被修飾，且可包 括氨基酸插入、缺失和置換。本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽包括這樣的FVII多肽，其呈現(xiàn) 出對于抑制劑如抗凝血酶-III (AT-III)和組織因子途徑抑制劑(TFPI)的抗性增加、對于 Si2+抑制作用的抗性增加、在有和/或無TF的條件下催化活性增加，具有改良的藥動學性質 如增加的半衰期、與血小板表面的結合和/或親和性增加、與血清白蛋白的結合和/或親和 性增加，以及與血小板整聯(lián)蛋白α IIb β 3的結合和/或親和性增加。所述修飾的FVII多肽 可含有本文提供的修飾的任何組合，由此與未修飾的FVII多肽相比上述多肽的一或多種 活性或者性質被改變。典型地，修飾的FVII多肽保留促凝血劑活性。本發(fā)明還提供了編碼 /表達修飾的FVII多肽的核酸分子、載體和細胞。本發(fā)明還提供了藥物組合物、制品、試劑 盒和治療方法。FVII多肽包括等位基因變體和物種變體以及具有影響其它活性和/或性質 的修飾的多肽和其它變體。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽的活性片段。 舉例FVII多肽是包含SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的那些多肽以及與其具有60%、65%、 70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 更高序列相同性的變體。本發(fā)明提供的修飾的因子VII (FVII)多肽，其在FVII多肽中在具有SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的FVII多肽的Q286位置或者在FVII多肽的對應殘基上具有修飾。所 述修飾可以是氨基酸置換、氨基酸插入或者缺失或其組合。在修飾是氨基酸置換的情況中， 所述置換可以是由堿性氨基酸(例如Arg(R)、Lys(K)和His(H))或者選自如下的氨基酸 置換=Arg (R)、Lys (K) His (H)、Tyr (Y)、Gly (G)、Phe (F)、Met (M)、IIe (I)、Leu (L)、Val (V)、 Pro (P)、Glu (E)、Trp (W)、Asp (D)和 Cys (C)。舉例的這種氨基酸置換包括 Q286R, Q286K, Q286H、Q286Y、Q286G、Q286F、Q286M、Q286I、Q286L、Q286V、Q286P、Q286E、Q286W、Q286D 以及 Q286C。這種修飾可以在含有SEQ ID NO :1_3任一所示序列的未修飾的FVII多肽、或者其 等位基因變體或者物種變體、或者與SEQ ID NO 1-3任一所示FVII具有至少60%序列相 同性的變體、或者包含SEQ ID NO :1-3任一所示氨基酸序列的FVII多肽的活性片段或者其等位基因變體或者物種變體、或者與SEQ ID NO 1-3任一所示FVII具有至少60%序列相 同性的變體中產(chǎn)生。例如，修飾的FVII多肽可以是在對應FVII多肽中Q286位置的位置含 有置換的活性片段。在一些實例中，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽在對應具有SEQ ID NO :3所示氨 基酸序列的FVII多肽的位置286或者FVII多肽中對應殘基的位置含有氨基酸置換，其中 所述修飾是在位置286的由堿性氨基酸置換，導致修飾的FVII多肽與在位置286不具有修 飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)出增加的凝血劑活性。所述堿性氨基酸可選自Arg(R)、Lys(K)和 His(H)。例如，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽在位置286可含有Gln(Q)由Arg(R)的置換。在一些實例中，所述修飾的FVII多肽僅具有在位置觀6的單一修飾。在其它實 例中，所述修飾的FVII多肽在FVII多肽的另一位置還含有一或多個其他修飾。所述其 他修飾可以是氨基酸置換、插入或者缺失。例如，所述其他修飾可以是在對應選自如下 位置的位置的氨基酸置換A51、S52、P54、S60、Q66、Y68、K109、S119、A122、G124、T130、 E132、V158、K161、A175、D196、K197、K199、R202、H216、S222、G237、T239、H257、Q286、 L287、R290A292、A294、E296、M298、L305、S314、G318、P321、K337、K341、Q366、H373、F374、 E394、P395 和 R396。舉例的這種修飾包括 D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、 D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、 K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、 R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、K341N、K341M、K341D、G237T238insA、 G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insff, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA、K197I198insS、T239S、T239N、T239Q、T239V、 T239L、T239H、T239I、L287T、M298Q、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、 Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373L、H373I、H373F、 H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、 S222E、S222D、H257A、H257S、Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、{Gla Swap FIX/ K43I}、 {Gla Swap FIX/Q44S}、 {Gla Swap FIX/M19K}、 {Gla SwapFIX/Ml9K/E40L/K43I/ Q44S}、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、Gla Swap Thrombin、S52A、 S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、 A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103Sllldeli ηsQRLMEDICLPRffGCLffEDDF, H115S 126de 1 iηsQRLMEDICLPRffGCLffEDDF, T128P134delinsQRL MEDICLPRffGCLffEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T 128P134delins IED I CLPRffGCLffE, S 103S111de1iηsD I CLPRffGCLffED , H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、 P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED, S103S1 IldelinsSFGRGDIRNV, Hl 15S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、 P406insCSFGRGDIRNVC、P406iηsGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T、V158D、L287T、E296V、M298K 和 M298Q0舉例的本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽是含有如下修飾的那些Q286R/M298Q、 Q286R/Gla Swap FIX、Q286R/H257A、Q286R/S222A、Q286R/S222A/H257A、Q286R/S222A/Gla Swap FIX、Q286R/H257A/GlaSwap FIX、Q286R/S222A/H257A/Gla Swap FIX、Q286R/ M298Q/K341Q、Q286R/M298Q/K199E、Q286R/M298Q/Gla Swap FIX、Q286R/Q366V、Q286R/ A292N/A294S/Q366V、A175S/Q286R/Q366V、S222A/Q286R/Q366V、H257S/Q286R、H257S/ Q286R/Q366V、S222A/H257A/Q286R/Q366V、Q286R/H373A、S222A/H257A/Q286R/M158Q、 Q286R/K341D、Q286R/Q366D、Q286R/Q366N、Q286R/M298Q/Q366D、Q286R/M298Q/Q366N、 Q286R/H373F、Q286R/M298Q/H373F、{Gla Swap FIX/E40L}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q、 {Gla Swap FIX/M19K}/ Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R, T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q、Gla SwapFIX/T128N/P129A/S222A/Q286R, Gla Swap FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/ P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F, S52A/S60A/Q286R、 Gla Swap FIX/S52A/S60A/S222A/Q286R、S52A/S60A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/S52A/ S60A/Q286R/M298Q、S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q、S52A/S60A/Q286R/H373F/, S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F、T239V/Q286R、Gla Swap FIX/S222A/T239V/Q286R、T239V/ Q286R/M298Q、S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/T239V/Q286R/M298Q、 T239V/Q286R/H373F、T239V/Q286R/M298Q/H373F、T239I/Q286R、Gla Swap FIX/S222A/ T239I/Q286R、T239I/Q286R/M298Q、S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/ T239I/Q286R/M298Q、T239I/Q286R/H373F、T239I/Q286R/M298Q/H373F、Gla Swap FIX/ S222A/Q286R/H373F、 Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q、 Gla Swap FIX/S222A/Q286R/ M298Q/H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F、H257A/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/ M298Q、Gla Swap FIX/S222A/H257S/Q286R/、S222A/H257S/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/ M298Q/H373F、 S222A/Q286R/M298Q/H373F、 S222A/Q286R/M298Q、 T128N/P129A/A175S/ Q286R、A122N/G124S/A175S/Q286R、Gla Swap FIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R、Gla Swap FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q、A122N/ G124S/A175S/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、A122N/ G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F、 A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F、{Gla Swap FIX /K43I }/TU8N/PU9A/Q286R/ M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N、{Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N、{Gla Swap FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, V158D/Q286R/E296V/M298Q、T128N/ P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F、 T239V/Q286R/M298Q/Q366N、 T239I/Q286R/M298Q/ Q366N、 T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q、 T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/ M298Q, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q 或者 T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F。 本發(fā)明提供了在FVII多肽中含有兩或更多個修飾的修飾的FVII多肽、其等 位基因變體或者種變體或者其活性片段。這種多肽的至少一個修飾是在對應具有SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的FVII多肽中Q286位置或者FVII多肽中對應殘基的位置， 條件是單獨的在Q286位置的修飾或者組合任何其它修飾與未修飾的FVII多肽相比不 導致導入新的糖基化位點。這種修飾可以是氨基酸置換、插入或者缺失。例如，在Q286 位置的修飾可以是由選自如下的氨基酸置換Arg (R)、Lys (K) Hi s (H)、Tyr (Y)、Gly (G)、Phe (F)、Met (M)、lie (I)、Leu (L)、Val (V)、Pro (P)、Glu (E)、Trp (W)、Asp (D)禾口 Cys (C)。 在一些實例中，所述修飾是Q286R。一或多個其它修飾可以選自D196K、D196R、D196A、 D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、 K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、 R290E、R290D、R290N、R290Q, R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q, K341N、K341M、 K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、 D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY,D196K197insff,D196K197insA, D196K197insM、K1971198insE、K1971198insY、K1971198insA、K1971198insS、T239S、 T239N、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、L287T、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、 Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373F、 H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、 S222E、S222D、H257A、H257S、Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、{Gla Swap FIX/ K43I}、 {Gla Swap FIX/Q44S}、 {Gla Swap FIX/M19K}、 {Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/ Q44S}、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、Gla Swap Thrombin、S52A、 S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、 A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103Sllldeli ηsQRLMEDICLPRffGCLffEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLM EDICLPRffGCLffEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T 128P134delins IED I CLPRffGCLffE, S 103S111de1iηsD I CLPRffGCLffED , H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、 P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED, S103S1 IldelinsSFGRGDIRNV, Hl 15S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、 P406insCSFGRGDIRNVC、P406iηsGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T、V158D、L287T、E296V、M298K 以 及似98Q。在一些實例中，所述修飾的FVII多肽在對應具有SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的 FVII多肽中P54、Q66、L121、A122、PU9或者E132位置或者在FVII多肽的對應殘基位置含 有修飾。舉例的修飾包括P54S、Q66N、L121S、A122N、PU9A和E132S。在一些實例中，在對應 P54、Q66、L121、A122、P129或者E132位置含有修飾的修飾的FVII多肽還含有一或多個進 一步修飾，包括在FVII多肽中另一位置的氨基酸置換、插入或者缺失。這種修飾包括P54S、 S52N、Y58S、S119N、G124S、T128N、T130N、V158D、A175S、S222A、G241S、E296V、M298Q、E394N、 P395A、R396S、G318N和Q366V。因此，本發(fā)明提供的FVII多肽中舉例的組合修飾是S119N/ L121S、T128N/P129A、A122N/G124S, A122N/G124S/A175S、A122N/G124S/E394N/P395A/ R396S、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S/G318N、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、S52N/ P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、S52N/P54S、Sl 19N/L121S/A175S、T128N/P129A/ A175S、T130N/E132S、Q66N/Y68S、T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q、T128N/P129A/S222A、 T128N/P129A/A175S/Q366V, A122N/G124S/A175S/Q366V, T128N/P129A/A175S/S222A, A122N/G124S/A175S/S222A、T128N/P129A/M298Q 和 T128N/P129A/M298Q/H373F。本發(fā)明還提供了修飾的FVII多肽，其含有對應具有SEQ ID NO 3所示氨基酸序 列的 FVII 多肽中 T239S、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366N、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373F、H373A、K161S、 K161V、H216S、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222D、S222N、S222E 或者 H257S 的修 飾或者在FVII多肽中對應殘基含有修飾。進一步地，這種修飾的FVII多肽在另一位置 還含有一或多個進一步修飾，如在氨基酸位置A51、S52、P54、S60、Q66、Y68、K109、S119、 A122、G124、T130、E132、V158、K161、A175、D196、K197、K199、R202、H216、S222、G237、T239、 H257、Q286、L287、R290 A292、A294、E296、M298、L305、S314、G318、P321、K337、K341、Q366、 H373、F374、E394、P395和R396。在這些位置的舉例的修飾包括Q286N、Q286E、Q286D、 Q286S、Q286T、Q286R、Q286K、Q286A、Q286V、Q286M、Q286L、Q286Y、D196K、D196R、D196A、 D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、 K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、 R290E、R290D、R290N、R290Q, R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q, K341N、K341M、 K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、 D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY,D196K197insff,D196K197insA, D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA、K197I198insS、T239S、T239N、 T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、L287T、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、 Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373F、H373A、 K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、S222E、 S222D、H257A、H257S、Gla Swap FIX、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、 Gla Swap Thrombin、Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、{Gla Swap FIX/K43I}、{Gla Swap FIX/Q44S}、{Gla Swap FIX/M19K}、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}、S52A、 S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、 A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103Sllldeli ηsQRLMEDICLPRffGCLffEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLM EDICLPRffGCLffEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T 128P134delins IED I CLPRffGCLffE, S 103S111de1iηsD I CLPRffGCLffED , H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、 P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED, S103S1 IldelinsSFGRGDIRNV, Hl 15S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、 P406insCSFGRGDIRNVC、P406iηsGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T、V158D、L287T、M298K 和 M298Q。 所得組合修飾可包括 Q366D/H373E、Q366V/H373V、Q366V/H373L、Q366V/H373I、S222K/ H257A、H216A/S222A、S222S/Gla Swap FIX、S222A/H257A/Gla Swap FIX、S222A/M298Q、 S222A/H257A/M298Q、S222A/A292N/A294S/Q366V、A175S/S222A/Q366V、S222A/Q366V、 H257S/Q366V、S222A/H373A、M298Q/H373F、S52A/S60A/S222A、S222A/T239V、V158D/T239V/ E296V/M298Q, S222A/T239I、V158D/E296V/M298Q/H373F, Gla Swap FIX/Q366V, M298Q/ Q366N/H373F、T239V/M298Q/H373F 以及 T239I/M298Q/H373F。 本發(fā)明提供了在FVII多肽中含有兩或更多個修飾的修飾的FVII多肽、其等位 基因變體和種變體或者其活性片段，其中所述兩或更多個修飾選自對應于H216A、H257A、 E394N、P395A、R396S、K109N、A292N、A175S、H257A 和 Gla Swap FIX 的氨基酸修飾。例如， 本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽包括具有選自H216A/H257A、E394N/P395A/R396S和K109N/
22A175S的修飾的那些FVII多肽。此外，也可包括對應于M298Q或者A294S的修飾。因此，本 發(fā)明還提供了含有選自H216A/H257A、E394N/P395A/R396S和K109N/A175S的修飾的修飾的 FVII多肽。在一些實例中，所述修飾的FVII多肽還含有對應于IC98Q或者的修飾。 這樣可產(chǎn)生例如含有H257A/M298Q或者K109N/A^2N/A^4S修飾的修飾的FVII多肽。本 發(fā)明還提供 了含有對應于 S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q 或者 V158D/T239I/E^6V/M298 的修飾的修飾的FVII多肽。在一些實例中，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽含有血清白蛋白結合序列，如 SEQ ID N0:103-109所示任一氨基酸序列，或者其實現(xiàn)血清白蛋白結合的足夠部分。這 種修飾的FVII多肽與未修飾的FVII多肽相比可以呈現(xiàn)出對血清白蛋白結合的親和性 或者結合增加。例如，含有血清白蛋白結合序列的修飾的FVII多肽可以呈現(xiàn)出與血清 白蛋白結合的親和性增加或者與其結合的增加至少大約為或者至少為l^d^d^i、 4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或者更 多。所述血清白蛋白結合序列可以置換未修飾的FVII多肽的連續(xù)氨基酸殘基序列。含 有血清白蛋白結合序列的修飾的FVII多肽可以含有選自如下的修飾S103SllldelinsQ RLMEDICLPRffGCLffEDDF, Hl 15S126deIinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLME DICLPRffGCLffEDDF, S103S11 ldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T 128P134delins IED I CLPRffGCLffE, S 103S111de1iηsD I CLPRffGCLffED , H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、 P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED 以及 P406insGGGSDICLPRWGCLWED。本發(fā)明提供了含有血小板整聯(lián)蛋白α IIbi3 3結合序列的修飾的FVII多肽。這種 修飾的FVII多肽與未修飾的FVII多肽相比可以呈現(xiàn)出與血小板整聯(lián)蛋白α IIbi3 3的親和 性增加或者與其結合增加。例如，含有血小板整聯(lián)蛋白α IIb β 3結合序列的修飾的FVII多 肽與未修飾的FVII多肽相比可以呈現(xiàn)出與血小板整聯(lián)蛋白aIIbi33結合序列的親和性增 加或者與其結合的增加至少大約為或者至少為l^d^d^d^j^j^j^^S^j^、 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或者更多。舉例的血清白蛋白結合 序列包括SEQ ID NO :110-112所示任一氨基酸序列或者其實現(xiàn)血小板整聯(lián)蛋白a IIb β 3 結合的足夠部分，其可以置換未修飾的FVII多肽的連續(xù)氨基酸殘基序列。修飾的FVII 多肽含有選自如下的修飾S103SllldelinsSFGRGDIRNV、H115S126delinsSFGRGDIRNV、 T127P134delinsSFGRGDIRNV、P406insCSFGRGDIRNVC 以及 P406insGGGSCSFGRGDIRNVC。含有血清白蛋白或者血小板整聯(lián)蛋白αΙΛβ3結合序列的修飾的FVII多肽 在FVII多肽的另一位置也可以含有一或多個進一步的修飾，如在對應的位置G237V的 位置的氨基酸置換。因此，本發(fā)明還提供了含有選自如下的修飾的修飾的FVII多肽: S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED/G237V, Hll 5S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V, Hl 15S126delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, H115S126delinsDICLPRWGCLWED/G237V, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V, T128P134delinsIEDICLPRWGCLffE/G237V,S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLffEDDF/G237V 以 及 T128P134de1insDICLPRWGCLWED/G237V。
在一些實例中，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽含有2、3、4、5、6、7或者更多個修 飾。在進一步的實例中，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽含有異源Gla結構域或者其實現(xiàn) 磷脂結合的足夠部分。這種多肽與未修飾的FVII多肽相比可以呈現(xiàn)出與磷脂的親和性增 加或者與其結合增加，如與磷脂的親和性增加或者與其結合的增加至少大約為或者至少為 1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%, 90 %,91 %,92 %,93 %,94%,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,100 %,200 %,300 %,400 500 %或者更多。所述異源Gla結構域可以選自因子IX (FIX)、因子X (FX)、凝血酶原、蛋白 C、蛋白S、骨鈣蛋白、基質Gla蛋白、生長抑制特異性蛋白6 (Gas6)以及蛋白Z中的Gla結 構域，以及在一些實例中，其可具有SEQ ID N0:83-91、93和94所示任一氨基酸序列或者其 實現(xiàn)磷脂結合的足夠部分。天然FVII Gla結構域的全部或者一連續(xù)部分(其可包含具有 SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的FVII多肽中的氨基酸1-45或者FVII多肽中的對應殘基) 可以除去以及用所述異源Gla結構域或者其實現(xiàn)磷脂結合的足夠部分置換。本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽與未修飾的FVII多肽比可以呈現(xiàn)出對抗凝血酶 III的抗性增加。這種修飾的FVH多肽與未修飾的FVII多肽相比可以呈現(xiàn)出至少或者 大約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,100 %,200 %,300 400^^500%或者更多對抗凝血酶III的抗性。本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽與未修飾 的FVII多肽相比也可以呈現(xiàn)出催化活性或者凝血劑活性增加，如與未修飾的FVII多肽相 比增加至少大約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、 60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%, 300%、400%、500%或者更多。進一步地，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽與未修飾的FVII 多肽相比呈現(xiàn)出對TFPI抗性增加。這種修飾的FVII多肽與未修飾的FVII多肽相比對TFPI 抗性可以增加至少或者至少大約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、 30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99%、100%、200%、300%、400%、500%或者更多。本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽與未修 飾的FVII多肽相比也呈現(xiàn)出對Si2+抑制作用的抗性增加。例如，修飾的FVII多肽與未修 飾的FVII多肽相比對加2+抑制作用的抗性為至少或者大約1 %、2 %、3 %、4 %、5 %、6 %、 7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或者更多。在一些實例中，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽與未修飾的FVII多肽相比含有導 入和/或消除一或多個糖基化位點的一或多個修飾。例如，可以導入或者消除1、2、3、4、5、 6或者更多個糖基化位點?？梢詫牖蛘呦奶腔稽c包括N-糖基化位點和0-糖基 化位點。本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽可含有一或多個進一步的氨基酸修飾，所述修飾可 增加對抗凝血酶-III的抗性，增加與磷脂的結合和/或親和性，增加對于組織因子的親和 性，增加內在活性，增加TF-依賴性活性，增加促凝活性，改變多肽的構象以改變酶原性，通 過將高活性與低活性FVIIa構象之間的平衡移向高活性構象而增加催化或者促凝活性，增 加蛋白酶抗性，降低糖基化，增加糖基化，降低免疫原性，提高穩(wěn)定性，和/或促進化學基團 連接。在一些實例中，改變的酶原性賦予更多或者更少酶原樣形狀。在一些實例中，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽含有選自如下的一或多個進一步的氨基酸修飾S279C/V302C、L280C/N301C、M81C/V302C、S282C/V299C、在第 4 位插入酪氨 酸、F4S、F4T、P10Q、P10E、P10D、P10N、Q21N、R28F、R28E、I30C、I30D、I30E、K32D、K32Q、K32E、 K32G、K32H、K32T、K32C、K32A、K32S、D33C、D33F、D33E、D33K、A34C、A34E、A34D、A34I、A34L、 A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、T37C、T37D、T37E、K38C、K38E、K38T、K38D、K38L、 K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、L39E、L39Q、L39H、W41N、W41C、W41E、W41D、I42R、I42N、I42S、 I42A、I42Q、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42K、S43Q、S43N、Y44K、Y44C、Y44D、Y44E、S45C、S45D、 S45E、D46C、A51N、S53N、G58N、G59S、G59T、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、 L65N、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、E82S、E82T
T83K、N95S、N95T、G97S、G97T、YlOlN、D104N、T106N.、K109N、.E116D、G117N、G124N、S126N、T128N、L141C、L141D、L141E、E142D、E142C、K143C、K143D、K143E、R144E、R144C、R144D、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N145I、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q,N145E、N145R、N145W、N145D、N145C、K157V、K157L、K157I、K157M、K157F、K157W、K157P、K157G、K157S、K157T、K157C、K157Y、K157N、K157E、K157R、K157H、K157D、K157Q、V158L、V158I、V158M、V158F、V158W、V158P、V158G、V158S、V158T、V158C、V158Y、V158N、V158E、V158R、V158K、V158H、V158D、V158Q、A175S、A175T、G179N、I186S、I186T、V188N、R202S、R202T、I205S、I205T、D212N、E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、Q250C、V253N,E265N,T267N,E270N、A274M、A274L、A274K、A274R、A274D、A274V、A274I、A274F、A274W、A274P、A274G、A274T、A274C、A274Y、A274N、A274E、A274H、A274S、A274Q、F275H、R277N、F278S、F278A.F278N、F278Q、F278G、L280N,L288K,L288C,L288D、D289C,D289K,L288E,R290C、R290G、R290A、R290S、R290T、R290K、R290D、R290E、G291E,G291D,G291C,G291N,G291K,A292C,A292K,A292D,A292E,T293K,E296V,E296L,E296I,E296M,E296F,E296W,E296P,E296G,E296S,E296T,E296C,E296Y,E296N,E296K,E296R,E296H,E296D,E296Q,M298Q,M298V,M298L,M298I,M298F,M298W,M298P,M298G,M298S,M298T,M298C,M298Y,M298N,M298K,M298R,M298H,M298E,M298D,P303S、P303T、R304Y、R304F、R304L、R304M、R304G、R304T、R304A、R304S、R304N、L305V、L305Y、L305I、L305F、L305A、L305M、L305W、L305P、L305G、L305S、L305T、L305C、L305N、L305E、L305K,L305R、L305H、L305D、L305Q,M306D、M306N、D309S、D309T、Q312N、Q313K,Q313D、Q313E、S314A、S314V、S314I、S314M、S314F、S314W、S314P、S314G、S314L、S314T、S314C、S314Y、S314N、S314E、S314K、S314R、S314H、S314D、S314Q、R315K、R315G、R315A、R315S、R315T、R315Q,R315C、R315D、R315E、K316D、K316C、K316E、V317C、V317K、V317D、V317E、G318N、N322Y、N322G、N322F、N322M、N322S、N322I、N322L、N322T、N322V、N322P、N322K,N322H、N322Q,N322E、N322R,N322W、N322C、G331N、Y332S,Y332A,Y332N,Y332Q,Y332G,D334G、D334E、D334A,D334V、D334I、D334M,D334F、D334W,D334P、D334L、D334T、D334C、D334Y、D334N、D334K、D334R、D334H、D334S、D334Q、S336G、S336E、S336A、S336V、S336I、S336M、S336F、S336W、S336P、S336L、S336T、S336C、S336Y、S336N、S336K、S336R、S336H、S336D、S336Q、K337L、K337V、K337I、K337M、K337F、K337W、K337P、K337G、K337S、K337T、K337C、K337Y、K337N、K337E、K337R、K337H、K337D、K337Q、K341E,K341Q,K341G,K341T,K341A,K341S,G342N,H348N,R353N、Y357N,I361N、F374P、F374A、F374V、F374I、F374L、F374M、F374W、F374G、F374S、F374T、F374C、F374Y、F374N、F374E、F374K、F374R、F374H、F374D、F374Q、V376N、R379N、L390C、L390K、L390D、L390E、M391D、M391C、M391K、M391N、M391E、R392C、R392D、R392E、S393D、 S393C、S393K、S393E、E394K、P395K、E394C、P395D、P395C、P395E、R396K、R396C、R396D、 R396E、P397D、P397K、P397C、P397E、G398K、G398C、G398D、G398E、V399C、V399D、V399K、 V399E、L400K、L401K、L401C、L401D、L401E、R402D、R402C、R402K、R402E、A403K、A403C、 A403D、A403E、P404E、P404D、P404C、P404K、F405K、P406C、K32N/A34S、K32N/A34T、F31N/ D33S、F31N/D33T、I30N/K32S、I30N/K32T、A34N/R36S、A34N/R36T、K38N/F40S、K38N/F40T、 T37N/L39S、T37N/L39T、R36N/K38S、R36N/K38T、L39N/W41S、L39N/W41T、F40N/I42S、F40N/ I42T、I42N/Y44S、I42N/Y44T、Y44N/D46S、Y44N/D46T、D46N/D48S、D46N/D48T、G47N/Q49S、 G47N/Q49T、K143N/N145S、K143N/N145T、E142N/R144S、E142N/R144T、L141N/K143S、L141N/
K143T、I140N/,E142S、I140N/ 142Τ、R144N/'A146S、R144N/1146T、A146N/,K148S、A146N,K148T、S147N/'P149S/、S147N/P149T-.R290N/A292S、,R290N,/A292T、D289N,/G291S,D289N,G291T,L288N//R290S,L288N/'R290T,L287N/'D289S、L287N/'D289T、A292N/,A294S、A292N,A294T、T293N//L295S,T293N/'L295T,R315N/'V317S、R315N/'V317T、S314N/,K316S、S314N,K316T、Q313N/,R315S、Q313N/'R315T,K316N/'G318S、K316N/'G318T、V317N/,D319S、V317N,D319T、K341N/,D343S、K341N/'D343T、S339N/'K341S、S339N/1341T、D343N/ZGiMSS、D343N,G345T,R392N/,E394S、R392N/'E394T、L390N/'R392S、L390N/'R392T、K389N/,M391S、K389N,M391T、S393N/,P395S、S393N/'P395T、E394N/'R396S、E394N/'R396T、P395N/,P397S、P395N,P397T、R396N/,G398S、R396N/'G398T,P397N/'V399S、P397N/ 399 ,G398N/,L400S、G398N,L400T、V399N/,L401S、V399N/'L401T,L400N/'R402S,L400N/T402T、L401N/,A403S、L401N,
A403T、R402N/P404S、R402N/P404T、A403N/F405S、A403N/F405T、P404N/P406S 和 P404N/ P406T。在一些實例中，所述修飾的FVII多肽還含有將第300-322、305-322、300-312或者 305-312位用來自胰蛋白酶、凝血酶或者FX的對應氨基酸取代，或者將第310-329、311-322 或者233-3 位用來自胰蛋白酶的對應氨基酸取代。舉例的本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽是具有SEQ ID NO :113-273所示任一氨基 酸序列的那些多肽。在一些實例中，所述修飾是在未修飾的FVII多肽中產(chǎn)生，其是SEQ ID NO 3所示多肽的等位基因變體或者種變體。所述等位基因變體或者種變體或者其它變體 與SEQ ID而3所示多肽除了氨基酸修飾之外可具有40%、50%、60%、70%、80%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%序列相同性。本發(fā)明提供的修飾的 FVII多肽可以是人多肽，非人多肽和/或成熟多肽。在一些實例中，只有一級序列被修飾。 在其它實例中，也包括化學修飾或者翻譯后修飾。例如，修飾的FVII多肽可以是糖基化、羧 化、羥化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化，或者與聚乙二醇(PEG)組分綴合。本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽可以是單鏈多肽、雙鏈多肽和/或活性或者活化 的。可以例如通過蛋白酶解、通過自身激活、通過因子IX(FIXa)裂解、通過因子X(FXa)裂 解、通過因子XII (FXIIa)裂解、或者通過凝血酶裂解而實現(xiàn)活化。本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽可保留未修飾的FVII多肽的一或多種活性。例如， 修飾的FVII多肽可含有在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或者60個氨基酸位置的 修飾，只要所述多肽保留未修飾的FVII多肽至少一種FVII活性即可。這種修飾的FVII多 肽可以保留未修飾的FVII多肽的至少大約1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、 50 %,60 %,70 %,80 %,90 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,100 %,200 %,300 %,400500%或者更多的活性。在一些實例中，一或多種活性選自組織因子(TF)結合、因子X(FX) 活化、因子IX(FIX)活化、磷脂結合以及凝血活性。進一步地，所述保留的活性與未修飾的 FVII多肽對比可以增加或者降低。在一些實例中，所述凝血活性與未修飾的FVII多肽相比 增加，如未修飾的FVII多肽的凝血活性的至少大約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9 %,10%,20 %,30 %,40 %,50 %,60 %,70%,80 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94%,95 96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或者更多?；钚钥梢栽隗w外、離體 (ex vivo)或者在體內測量。本發(fā)明還提供了核酸分子，其含有編碼本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽的核苷酸 序列。本發(fā)明也提供了含有這種核酸分子的載體，包括原核載體、病毒載體或者真核載體， 如哺乳動物載體。病毒載體可選自腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒、慢病毒、痘 病毒和巨細胞病毒。本發(fā)明還提供了含有這些載體的細胞，包括真核細胞，如哺乳動物細 胞。舉例的哺乳動物細胞是幼倉鼠腎細胞(BHK-21)或者293細胞或者CHO細胞。在一些 實例中，所述細胞表達修飾的FVII多肽。因此，本發(fā)明還提供了由這些細胞產(chǎn)生的修飾的 FVII多肽。本發(fā)明提供了在藥物可接受的載體中的含有治療有效濃度或者量的本發(fā)明提供 的任何修飾的FVII多肽、核酸分子、載體或者細胞的藥物組合物。在一些實例中，所述藥物 組合物配制為用于局部(local)、全身或者表面(topical)施用，如口服、經(jīng)鼻、肺、口腔、經(jīng) 皮、皮下、十二指腸內、腸道、胃腸外、靜脈內或者肌內施用。所述藥物組合物可以配制為控 制釋放和/或單一劑量施用。本發(fā)明還提供了通過施用本發(fā)明提供的藥物組合物治療對象的方法，其中所述對 象患有通過施用FVII或者促凝血劑進行治療的疾病或病癥，如通過施用活性FVII (FVIIa) 進行治療的疾病或病癥。在一些實例中，用所述藥物組合物治療改善或者減輕了與所述疾 病或病癥相關的癥狀。在進一步的實例中，本發(fā)明提供的方法還包括監(jiān)測對象在施用FVII 或者促凝血劑治療的疾病或者病癥相關的癥狀的變化。使用本發(fā)明提供的方法治療的疾病 或病癥可選自凝血障礙、血液病、出血性疾病(hemorrhagic disorder)、血友病(如血友病 A或者血友病B或者血友病C，先天性血友病或者獲得性血友病)、因子VII缺陷和出血障礙 (bleeding disorder)，包括由于手術(如心臟手術、血管成形術、肺手術、腹部手術、脊髓手 術、腦手術、血管手術、牙科手術或者器官移植術)或者外傷所致出血性并發(fā)癥。在一些實 例中，出血可以是急性關節(jié)積血，慢性血友病關節(jié)病、血腫、血尿、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、胃腸 出血，或者腦出血。在進一步的實例中，所述出血是由于拔牙所致。所述移植手術可選自骨 髓移植、心臟移植、肺移植、胰腺移植和肝臟移植。在一些實例中，本發(fā)明提供的方法可用于治療具有因子VIII或者因子IX的自身 抗體的對象。本發(fā)明提供的方法也可以包括施用一或多種額外的凝血因子，例如血漿純化 的或者重組的凝血因子、促凝血劑如維生素K、維生素K衍生物和蛋白C抑制劑，血漿、血小 板、紅細胞和皮質類固醇或者治療。本發(fā)明提供了 一種產(chǎn)品，其含有包裝材料和包含在所述包裝材料中的本發(fā)明提供 的藥物組合物。在一些實例中，所述藥物組合物中修飾的FVII多肽有效地治療FVII-介導 的疾病或病癥，且所述包裝材料包含標示修飾的FVII多肽用于治療FVII-介導的疾病或病 癥的標簽。本發(fā)明還提供了試劑盒，其包含本發(fā)明提供的藥物組合物、施用該組合物的裝置
27以及任選包含施用說明書。附圖簡述

圖1描述了凝血級聯(lián)反應。圖中示出不依賴于Ffe產(chǎn)生的凝血內源性途徑和外源 性途徑以及所述途徑趨同為共有途徑以產(chǎn)生形成血凝塊的凝血酶和纖維蛋白。這些途徑是 互相聯(lián)系的。該圖描述了參與活化級聯(lián)的分子的順序，其中酶原通過一或多個肽鍵的裂解 而被轉變?yōu)榛罨牡鞍酌?。然后該活化的蛋白酶作為級?lián)中下一酶原分子的激活蛋白酶， 最后導致血凝塊形成。圖2描述了基于細胞的凝血模型(見例如Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85:958-965)。該圖描述了分為三個階段的凝血事件，其中凝血的開始是通過TF-攜帶 細胞上TF/FVIIa復合物使FX活化為FXa而引起的，導致FXa/FVa活化后少量凝血酶產(chǎn) 生。當凝血酶結合并激活血小板時發(fā)生放大，并啟始足夠數(shù)量的適當凝血因子活化以形 成FVIIIa/FIfe和FVa/FXa復合物。在損傷部位大量活化的血小板表面上發(fā)生凝血擴散 (propagation)，導致大量凝血酶產(chǎn)生，足以從纖維蛋白原中產(chǎn)生足夠的纖維蛋白以在損傷 部位形成血凝塊。圖3描述了 FVIIa可啟始凝血酶形成的機制。該圖例證了 FVIIa凝血酶產(chǎn)生的 TF-依賴性途徑，其在TF-攜帶細胞的表面起作用并參與FVIIa與TF的復合，隨后使FX活 化為FXa。該圖還描述了 FVIIa凝血酶產(chǎn)生的TF-非依賴性途徑，在此期間FVIIa結合活化 的血小板上的磷脂并使FX活化為FXa，F(xiàn)Xa隨后與FVa復合使得凝血酶原裂解為凝血酶。發(fā)明詳述結構概述A.定義B.止血綜述1.血小板粘附與聚集2.凝血級聯(lián)a.啟動b.放大c.傳播3.凝血的調節(jié) C.因子VII (FVII)1.FVII結構與組構2.翻譯后修飾3. FVII 加工4. FVII 活化5. FVII 功能a.組織因子-依賴性FVIIa活性b.組織因子-非依賴性FVIIa活性6. FVII作為生物制藥 D.修飾的FVII多肽1.催化活性增加a.舉例的增加催化活性的修飾i.在位置觀6的堿性氨基酸取代
ii.在位置觀6的其它突變2. AT-III 抗性增加舉例的實現(xiàn)AT-111抗性增加的修飾3. Zn2+抑制作用的抗性增加舉例的S12+抑制作用抗性增加的修飾4.改變的糖基化舉例的改變糖基化的修飾5.與血清白蛋白和/或血小板整聯(lián)蛋白α 3的結合增強a.舉例的具有血清白蛋白結合序列的FVII多肽b.舉例的具有血小板整聯(lián)蛋白α IIb β 3結合序列的FVII多肽6.通過導入異源Gla結構域的修飾7.組合及另外的修飾a.增加TFPI抗性的修飾b.增加固有活性的修飾c.增加蛋白酶抗性的修飾d.增加磷脂親和性的修飾e.改變糖基化的修飾f.促進化學基團連接的修飾g.舉例的組合突變E. FVII多肽的產(chǎn)生1.載體和細胞2.表達系統(tǒng)a.原核表達b.酵母c.昆蟲和昆蟲細胞d.哺乳動物細胞e.植物2.純化3.融合蛋白4.多肽修飾5.核苷酸序列F.評估修飾的FVII多肽的活性1.體外測定a.翻譯后修飾b.蛋白酶解活性c.凝血活性d.與其它蛋白質結合和/或被其它蛋白質抑制e.磷脂結合2.非人動物模型
3.臨床測定G.配制與給藥1.配制a.劑量b.劑型2.施用修飾的FVII多肽3.施用編碼修飾的FVII多肽的核酸(基因治療)H.治療應用1.先天性出血性疾病a.血友病b. FVII 缺陷c.其它疾病2.獲得性出血性疾病a.化療獲得性血小板減少癥b.其它凝血疾病c.移植獲得性出血d.抗凝血治療誘導的出血e.獲得性血友病3.外傷與手術出血I.組合治療J.產(chǎn)品和試劑盒K.實施例A.定義除非另有說明，本文所用所有技術和科學術語都具有本領域技術人員通常理解的 含義。本文引用的所有專利，專利申請，公開申請和公開出版物，GenBank序列，數(shù)據(jù)庫，網(wǎng) 站以及其它公開材料除非另有說明均以其全部內容援引加入。如果本發(fā)明的術語有多種定 義，以本部分中為準。描述URL或其它標識符或地址時，應理解所述標識符可改變并且因特 網(wǎng)上的具體信息隨時更新，相關信息可通過搜索因特網(wǎng)找到。其引用證明了這種信息的可 獲得性和公開傳播。如本文所用，凝血途徑或者凝血級聯(lián)是指一系列的活化事件，導致不可溶纖維蛋 白血凝塊形成。在凝血級聯(lián)或途徑中，絲氨酸蛋白酶的無活性蛋白質(也稱作酶原)通過 一或多個肽鍵的裂解而被轉變?yōu)榛钚缘鞍酌福淙缓笞鳛樵摷壜?lián)中下一酶原分子的激活蛋 白酶。在該級聯(lián)的最后蛋白酶解步驟中，纖維蛋白原通過凝血酶被蛋白酶解為纖維蛋白，隨 后其在損傷部位交聯(lián)形成血凝塊。如本文所用，“止血”是指使器官或者機體一部分的出血或者血流停止。術語止血 可包含血液凝固以防止在血管損傷后血液流失以及隨后組織修復后血凝塊的溶解的全過程。如本文所用，“血液凝塊”或者“血液凝固”是指不溶的纖維蛋白血凝塊的形成，或 者凝血級聯(lián)中血液凝血因子互相影響的過程，最后導致不溶的纖維蛋白血凝塊形成。
如本文所用，“蛋白酶”是催化共價肽鍵水解的酶。這些名稱包括酶原形式及其活 化的單鏈、雙鏈和多鏈形式。為清晰起見，提及蛋白酶時是指所有形式。根據(jù)活性位點的催 化活性以及裂解靶底物肽鍵的機制，蛋白酶包括例如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬 氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。如本文所用，絲氨酸蛋白酶或者絲氨酸內肽酶是指這樣的一類肽酶，其特征在于 通過所述酶的活性位點中存在絲氨酸殘基。絲氨酸蛋白酶參與機體的許多功能，包括血液 凝固和炎癥，以及在原核生物和真核生物中發(fā)揮消化酶的功能。由絲氨酸蛋白酶裂解的機 制基于絲氨酸對于靶向的肽鍵的親核攻擊。與天冬氨酸或者金屬相關的半胱氨酸、蘇氨酸 或者水分子也可以發(fā)揮該作用。絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸的排列的側鏈形成大多數(shù)絲氨 酸蛋白酶共有的催化三聯(lián)體。絲氨酸蛋白酶的活性位點是裂口形狀，在此結合多肽底物。
如本文所用，因子VII (FVII，F(xiàn)7 ；也稱作因子7，凝血因子VII，血清因子VII，血清 凝血酶原轉變加速因子，SPCA，前轉變素和^tacog alpha)是指是凝血級聯(lián)一部分的絲氨 酸蛋白酶。FVII包含一個Gla結構域，兩個EGF結構域(EGF-1和EGF-2)以及一個絲氨酸 蛋白酶結構域(或者肽酶Sl結構域)，其在絲氨酸蛋白酶的肽酶Sl家族的所有成員中是 高度保守的，例如糜蛋白酶。舉例的具有信號肽和前肽的前體FVII的序列如SEQ ID NO 1 示出。舉例的成熟FVII多肽如SEQ ID NO 3示出。FVII作為單鏈酶原、酶原樣雙鏈多肽 和完全活化的雙鏈形式出現(xiàn)。在構象改變時發(fā)生的從酶原樣形式的完全活化在結合其輔因 子組織因子時發(fā)生。另外，也可以導入突變以使得在沒有組織因子時發(fā)生構象改變。因此， 提及FVII時包含其單鏈和雙鏈形式，包括酶原樣和完全活化的雙鏈形式。提及FVII多肽時也包括前體多肽和具有活性的單鏈或者雙鏈形式的、截短形 式的其成熟FVII多肽，以及包括等位基因變體和種變體、由剪接變體編碼的變體及其它 變體，包括與SEQ ID NO :1所示前體多肽或其成熟形式具有至少40 ^^45%,50^^55%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或者更高序列相同性的多 肽。本發(fā)明包括修飾的FVII多肽，例如SEQ ID NO :113和273所示那些多肽及其變體。本 發(fā)明還包括保留FVII的至少一種活性如TF結合、因子X結合、磷脂結合和/或凝血活性的 那些多肽。通過保留活性，所述活性與野生型FVII相比可以被改變，例如降低或者增加，只 要保留的活性水平足以產(chǎn)生可檢測的作用即可。FVII多肽包括但不限于其組織特異性同種 型和等位基因變體，通過核酸翻譯制備的合成分子，通過化學合成產(chǎn)生的蛋白質，例如通過 重組方法包括連接較短多肽的合成體，分離自人和非人組織和細胞的蛋白質，嵌合的FVII 多肽及其修飾的形式。FVII多肽還包括足夠長的或者包含適當區(qū)域以保留全長成熟多肽的 至少一種活性(如果需要基于活化)的FVII的片段或者一部分。FVII多肽還包括含有化 學或者翻譯后修飾的那些多肽，以及不含有化學或者翻譯后修飾的那些多肽。這種修飾包 括但不限于PEG化、白蛋白化、糖基化、法尼基化(farnysylation)、羧化、羥化、磷酸化及本 領域已知的其它多肽修飾。舉例的FVII多肽是來源于哺乳動物包括人的那些多肽。舉例的人源FVII的氨基 酸序列如SEQ ID NO :1、2和3所示。舉例的這種人FVII多肽的變體包括SEQ ID NO 18-74 所示任何前體多肽。FVII多肽還包括任何非人源包括但不限于鼠、犬、貓、兔、鳥類、牛、羊、 豬、馬、魚類、蛙科動物(ranine)及其它靈長類動物因子VII多肽。舉例的非人源FVII多 肽包括例如牛(Bos taurus，SEQ ID N0:4)、小鼠(Mus musculus，SEQ ID NO :5)、小黑猩猩(Pan paniscus，SEQ ID NO :6)、黑猩猩(Pan troglodytes, SEQ ID NO :7)、兔(Oryctolagus cuniculus, SEQ ID NO 8) > i； (Rattus norvegicus, SEQ ID NO :9)(Macaca
mulatta，SEQ ID NO: 10)、豬(Sus scrofa,SEQ ID NO: 11)、狗(Canis familiaris,SEQ ID NO :12)、斑馬魚(Brachydanio rerio, SEQ ID NO :13)、日本河豚(Fugu rubripes, SEQ ID NO :14)、雞(GalIus gallus, SEQ ID NO :15)、猩猩(Pongo pygmaeus,SEQ ID NO :16)和大 猩猩(Gorilla gorilla, SEQ ID NO :17)。本領域技術人員意識到提及的成熟因子VII多肽(SEQ ID NO 3)的位置與SEQ ID NO :1所示同種型a前體FVII多肽(其是含有信號肽和前肽序列的同種型a因子VII多肽) 對比時有60個氨基酸殘基不同。因此，SEQ ID NO :3的第1個氨基酸殘基“對應于”SEQ ID NO 1的第61個(61st)氨基酸殘基。本領域技術人員還意識到提及的成熟因子VII多肽 (SEQ ID NO 3)的位置與SEQ ID NO :2所示前體FVII多肽(其是含有信號肽和前肽序列 的同種型b因子VII多肽)對比時有38個氨基酸殘基不同。因此，SEQ ID NO :3的第1個 氨基酸殘基“對應于” SEQ ID NO 2的第39個(39th)氨基酸殘基。如本文所用，對應殘基是指位于對比的基因座的殘基。通過本領域技術人員熟知 的任何方法排列對比相關的或者變體多肽。這種方法典型最大化匹配，且包括如使用人工 排列對比及通過使用眾多可利用的排列對比程序(例如BLASTP)以及本領域技術人員已知 的其它方法。通過對比多肽序列，本領域技術人員使用保守和相同的氨基酸殘基作為指導 可以鑒別對應的殘基。例如，通過對比因子VII多肽的序列，本領域技術人員使用保守和 相同的氨基酸殘基作為指導可以鑒別對應的殘基。例如，SEQ ID NO :3(成熟因子VII)的 第1個氨基酸位置中的丙氨酸(Al)對應于SEQ ID NO :1的第61個氨基酸位置中的丙氨酸 (A61)，以及對應于SEQ ID NO 2的第39個氨基酸位置中的丙氨酸(A39)。在其它情況中， 可以鑒別對應區(qū)域。例如，Gla結構域對應于SEQ ID NO :3的A1-F45氨基酸位置，對應于 SEQ ID NO :1的A61-S105氨基酸位置以及對應于SEQ ID NO :2的A39-S83位置。本領域 技術人員還可應用保守的氨基酸殘基作為指導以發(fā)現(xiàn)人與非人序列之間和之中的對應氨 基酸殘基。例如，SEQ ID N0:3(人)的氨基酸殘基S43和E163對應于SEQ ID N0:4(牛) 的S83和E203。對應位置也可以基于結構對比，例如通過使用計算機模擬蛋白質結構排列 進行。在其它情況中，可以鑒別對應區(qū)域。如本文所用，“前區(qū)”、“前肽”或者“前序列”是指被裂解產(chǎn)生成熟蛋白質的區(qū)域或 節(jié)段。這可以包括發(fā)揮抑制蛋白酶解活性功能的節(jié)段，其通過掩蔽催化機制并因此阻止催 化中間物形成而起作用(即通過位阻底物結合位點)。前區(qū)是位于成熟生物活性多肽氨基 末端的氨基酸序列且可以小如幾個氨基酸或者可以是多結構域結構。如本文所用，“成熟因子VII”是指缺少信號序列和前肽序列的FVII多肽。典型地， 信號序列靶向蛋白質通過內質網(wǎng)(ER)-高爾基體途徑分泌，并且在翻譯期間插入ER之后被 裂解。前肽序列典型在蛋白質的翻譯后修飾中起作用并且在蛋白質從細胞中分泌之前被裂 解。因此，成熟FVII多肽典型是分泌蛋白。在一個實例中，成熟人FVII多肽如SEQ ID N0: 3所示。SEQ ID NO :3所示氨基酸序列與SEQ ID NO 1和2所示前體多肽的氨基酸序列不 同在于SEQ ID NO 3沒有對應于SEQ ID NO :1和2的第1_20位氨基酸殘基的信號序列且 也沒有對應于SEQ ID NO :1的第21-60位氨基酸殘基和SEQ ID NO :2的第21-38位氨基酸 殘基的前肽序列。提及成熟FVII多肽包含單鏈酶原形式和雙鏈形式。
如本文所用，提及“野生型”或者“天然”FVII是指由天然或者天然發(fā)生的FVII基 因編碼的FVII多肽，包括等位基因變體，其天然存在于生物體包括人和其它動物中。提及 野生型因子VII而不提及物種是指包含任何物種的野生型因子VII。包括的野生型FVII 多肽是編碼的前體多肽、其片段以及其加工形式，如沒有信號肽的成熟形式以及任何翻譯 前或者翻譯后加工或修飾的形式。還包括的天然FVII多肽是翻譯后修飾的那些多肽，包括 但不限于通過糖基化、羧化和羥化進行的修飾。天然FVII多肽還包括單鏈和雙鏈形式。例 如，人表達天然FVII。舉例的野生型人FVII的氨基酸序列如SEQ ID NO :1，2，3所示及SEQ ID NO :44-100所示等位基因變體及其成熟形式。其它動物產(chǎn)生天然FVII，包括但不限于牛 (Bos Taurus,SEQ ID NO :4)、小鼠(Mus musculus，SEQ ID NO :5)、小黑猩猩(Panpaniscus， SEQ ID N0:6)、黑猩猩(Pan troglodytes, SEQ ID NO :7)、兔(Oryctolagus cuniculus, SEQ ID NO :8)、大鼠(Rattus norvegicus, SEQ ID NO :9)、恒河猴(Macaca mulatta, SEQ ID NO :10)、豬(Sus scrofa, SEQ ID NO :11)、狗(Canis familiaris, SEQ ID NO :12)、斑 S^M (Brachydanio rerio, SEQ ID NO 13) > H^nJK (Fugu rubripes, SEQ ID NO 14) > 雞(GalIus gallus, SEQ ID NO :15)、猩猩(Pongo pygmaeus, SEQ ID NO :16)以及大猩猩 (Gorilla gorilla, SEQ ID NO :17)。如本文所用，種變體是指不同物種的多肽變體，包括不同哺乳動物種，如小鼠和 人。如本文所用，等位基因變體是指相同物種成員中蛋白質變異。如本文所用，剪接變體是指通過對基因組DNA的原始轉錄物進行差異加工產(chǎn)生的 變體，導致一種類型以上的mRNA。如本文所用，酶原是指通過蛋白酶解包括成熟裂解如活化裂解和/或與其它蛋白 質和/或輔因子形成復合物激活的蛋白酶。酶原是蛋白酶的無活性前體。這種前體通常比 活性形式大，盡管非必須較大。對于絲氨酸蛋白酶，酶原通過特異性裂解被轉變?yōu)榛钚悦福?包括催化和自催化裂解，或者通過結合活化輔因子產(chǎn)生活性酶。例如，酶原通常以單鏈形式 存在。酶原通常是無活性的且可以通過在一或多個蛋白酶解位點催化或者自催化裂解產(chǎn)生 多鏈如雙鏈多肽而被轉變?yōu)槌墒旎钚远嚯?。因此，酶原是無酶活性蛋白質，通過激活物的 作用而被轉變?yōu)榈鞍酌浮？梢酝ㄟ^自身激活實現(xiàn)裂解。許多凝血蛋白是酶原它們是無活 性的，但是在血管損傷后凝血系統(tǒng)啟動時被裂解和活化。對于FVII，F(xiàn)VII多肽以酶原形式 存在于血漿中，直至被蛋白酶例如活化的因子IX(FIXa)、活化的因子X(FXa)、活化的因子 XII (FXIIa)、凝血酶裂解或者自身激活產(chǎn)生酶原樣雙鏈形式，其完全活性需要進一步的構 象變化。如本文所用，“酶原樣”蛋白質或多肽是指已經(jīng)通過蛋白酶解激活、但是仍呈現(xiàn)出 酶原相關性質的蛋白質，例如呈現(xiàn)較低活性或者無活性，或者其構象類似蛋白質的酶原形 式的構象。例如，當其不結合組織因子時，F(xiàn)VII的雙鏈活性形式是酶原樣蛋白質，其保留與 未裂解的FVII酶原相似的構象，并因此呈現(xiàn)出極低活性。在與組織因子結合時，F(xiàn)VII的雙 鏈活性形式經(jīng)歷構象變化，并獲得其完全活性作為凝血因子。如本文所用，活化序列是指酶原中的氨基酸序列，其是活化裂解或者成熟裂解以 形成活性蛋白酶所需的位點?；罨蛄械牧呀饪梢员蛔源呋蛘咄ㄟ^活化配偶體催化。如本文所用，活化裂解是一種成熟裂解，其誘導為完全酶活性所需的構象改變。這是經(jīng)典的活化途徑，例如對于絲氨酸蛋白酶，其中裂解產(chǎn)生與蛋白酶的保守區(qū)域如糜蛋白 酶中Aspl94相互作用的新的N-末端，誘導活性所需的構象改變。活化可以導致多鏈形式 的蛋白酶產(chǎn)生。在一些情況中，單鏈形式的蛋白酶可呈現(xiàn)出蛋白酶解活性。如本文所用，“活化的因子VII”或者“FVIIa”是指任何雙鏈形式的FVII多肽。雙 鏈形式典型得自蛋白酶解，但是也可以是合成產(chǎn)生的。因此，活化的因子VII包括低凝血活 性的酶原樣雙鏈形式，在與組織因子結合發(fā)生的完全活化形式(大約1000倍活性)，以及 存在于完全活化的雙鏈形式中或者經(jīng)歷構象改變成為完全活化形式的突變形式。例如，單 鏈形式的FVII多肽(見例如SEQ ID NO 3)在成熟FVII多肽的R152與1153氨基酸殘基 之間被蛋白酶解。裂解產(chǎn)物FVII重鏈和FVII輕鏈通過二硫鍵連接在一起(在SEQID NO 3所示FVII的C135與C262氨基酸殘基之間)，形成雙鏈活化FVII酶。蛋白酶解可以例如 通過活化的因子IX(FIXa)、活化的因子X(FXa)、活化的因子XII (FXIIa)、凝血酶或者通過 自身激活進行。如本文所用，F(xiàn)VII多肽的“性質”是指物理或者結構性質，這種三維結構、pi、半衰 期、構象及其它這種物理特性。如本文所用，F(xiàn)VII多肽的“活性”是指因子VII多肽呈現(xiàn)的任何活性。這種活性 可以在體外和/或在體內檢測，包括但不限于凝血和凝血劑活性，促凝血劑活性，蛋白酶解 或者催化活性，如使得因子X(FX)活化或者因子IX(FIX)活化；抗原性(結合或者競爭多 肽結合抗FVII-抗體的能力)；結合組織因子、因子X或因子IX的能力；和/或結合磷脂的 能力?；钚钥梢酝ㄟ^使用認可的測定法在體外或者在體內評估，例如通過在體外或體內測 量凝血情況進行評估。這種測定的結果表明多肽呈現(xiàn)出與所述多肽在體內的活性相關的活 性，其中體內活性可以被稱作生物活性。確定修飾形式的FVII的功能性或者活性的測定為 本領域技術人員所已知。舉例的評估FVII多肽活性的測定法包括凝血酶激酶原時間(PT) 測定或者激活部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)測定，用以評估凝血活性，或者使用合成底 物進行的生色測定，如下文實施例所述，用以評估催化或者蛋白酶解活性。如本文所用，“呈現(xiàn)至少一種活性”或者“保留至少一種活性”是指與相同形式的 未修飾的FVII多肽在相同條件下對比由修飾的FVII多肽呈現(xiàn)的活性。例如，雙鏈形式 的修飾的FVII多肽與雙鏈形式的未修飾的FVII多肽在相同實驗條件下對比，其中這兩個 多肽的唯一差別是所研究的修飾。在另一實例中，單鏈形式的修飾的FVII多肽與單鏈形 式的未修飾的FVII多肽在相同實驗條件下對比，其中這兩個多肽之間唯一差別是所研究 的修飾。典型地，保留或者呈現(xiàn)相同形式的未修飾的FVII多肽的至少一種活性的修飾的 FVII多肽保留足量的活性，由此當在體內施用時，該修飾的FVII多肽是治療有效的促凝 血劑。通常，對于保持作為促凝血劑的治療效力的修飾的FVII多肽而言，被保留的活性的 量是或大約是呈現(xiàn)促凝血劑治療效力的相同形式的未修飾FVII多肽活性的0. 5 %、1 %、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18%, 19%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500% 或 者更高。如果需要，保持促凝血劑治療效力所需的活性的量可以根據(jù)經(jīng)驗確定。典型地，保 持0. 5% -20%,0. 5% -10%,0. 5% 的活性足以保留在體內作為促凝血劑的治療效力。應理解由修飾的FVII多肽呈現(xiàn)或者保留的活性可以是任何活性，包括但不限于 凝血或者凝血劑活性，促凝血劑活性，蛋白酶解或者催化活性，如使得因子X(FX)活化或者因子IX(FIX)活化；抗原性(結合或者競爭多肽結合抗FVII-抗體的能力)；結合組織因子、 因子X或因子IX的能力；和/或結合磷脂的能力。在一些情況中，修飾的FVII多肽可以保 留與未修飾的FVII多肽相比增加的活性。在一些情況中，修飾的FVII多肽可保留與未修 飾的FVII多肽相比降低的活性。修飾的FVII多肽的活性可以是未修飾多肽的任何百分比 水平的活性，其中這兩個多肽均是相同形式，包括但不限于與不含有修飾的多肽相比的 活性，2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更多的活性。例如，修飾的 FVII 多肽 可以呈現(xiàn)出與相同形式的未修飾的FVII多肽相比增加或者降低的活性。例如，其可以保留 未修飾的FVII多肽的至少大約或者1%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,20%, 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或者至少 99% 的活性。在其 它實施方案中，活性的改變是未修飾FVII的至少大約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、 9 倍、10 倍、20 倍、30 倍、40 倍、50 倍、60 倍、70 倍、80 倍、90 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或者更多倍。保留的特定水平與所述多肽 的指定用途的函數(shù)，可以根據(jù)經(jīng)驗確定?？梢岳缡褂皿w外或者體內測定法測量活性，例如 在此描述或者下文實施例中描述的那些方法。如本文所用，“凝血活性”或者“凝血劑活性”或者“促凝血劑活性”是指多肽導致 凝血的能力。評估凝血劑活性的測定為本領域技術人員已知，包括凝血酶激酶原時間(PT) 測定或者激活部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)測定。如本文所用，F(xiàn)VII的“催化活性”或者“蛋白酶解活性”是指FVII蛋白催化底物蛋 白酶解的能力，這些術語可互換使用。評估這種活性的測定法為本領域已知。例如，F(xiàn)VII的 蛋白酶解活性可以通過使用生色底物如Spectrozyme FVIIa (CH3S02-D-CHA_But-Arg-pNA) 測量，其中底物的裂解通過吸光度監(jiān)測，底物水解的速度通過線性回歸確定。如本文所用，F(xiàn)VII多肽的“內在活性”是指在不存在組織因子的條件下FVII蛋白 的催化、蛋白酶解和/或凝血劑活性。如本文所用，結構域(典型為3或更多個、通常為5或7個或更多個氨基酸的序列) 是指分子如蛋白質或者編碼核酸的一部分，其與該分子的其它部分在結構和/或功能上不 同且可以被鑒別。例如，結構域包括多肽鏈的那些部分，其可以形成在蛋白質內由一或多個 結構基序組成的獨立折疊的結構和/或通過功能活性如蛋白酶解活性而被識別。蛋白質可 具有一或一個以上的獨特結構域。例如，結構域可以通過與相關家族成員的序列同源例如 與定義蛋白酶結構域或者gla結構域的基序同源而被鑒別、定義或者區(qū)別。在另一實例中， 結構域可以通過其功能區(qū)別，如通過蛋白酶解活性或者與生物分子相互作用的能力如DNA 結合、配體結合和二聚體化。結構域獨立地可以呈現(xiàn)生物功能或活性，由此所述結構域獨立 地或者與另一分子融合可以執(zhí)行活性，例如蛋白酶解活性或者配體結合。結構域可以是線 性氨基酸序列或者非線性氨基酸序列。許多多肽含有多個結構域。本領域技術人員已知這 種結構域并可以鑒別。為舉例說明，本發(fā)明提供了定義，但是應理解本領域技術人員可以通 過名稱識別特定結構域。如果需要，可以應用適當?shù)能浖b別結構域。如本文所用，蛋白酶結構域是蛋白酶的催化活性部分。提及的蛋白酶的蛋白酶結 構域包括單鏈、雙鏈和多鏈形式的任何這些蛋白質。蛋白質的蛋白酶結構域含有為其蛋白 酶解活性所需的所有必備性質，例如催化中心。對于FVII，蛋白酶結構域與糜蛋白酶/胰蛋白酶家族蛋白酶結構域呈現(xiàn)同源和結構特征，包括催化三聯(lián)體。例如，在SEQ ID N0:3所示 成熟FVII多肽中，蛋白酶結構域對應于第153-392位氨基酸。如本文所用，Y-羧基谷氨酸(Gla)結構域是指蛋白質例如維生素K依賴性蛋白 質的一部分，其含有谷氨酸殘基的翻譯后修飾，通常但不是所有谷氨酸殘基通過被維生素 K依賴性羧化形成Gla。Gla結構域負責與鈣離子的高親和性結合以及與帶負電磷脂的結 合。典型地，Gla結構域在成熟形式維生素K依賴性蛋白質的N末端開始，以保守芳族殘基 終止。在成熟FVII多肽中，Gla結構域對應舉例的SEQ ID NO 3所示多肽的第1_45位氨 基酸。Gla結構域為本領域熟知，其位置可以在特定多肽中鑒別。不同的維生素K依賴性蛋 白質的Gla結構域呈現(xiàn)序列、結構和功能同源性，包括N-末端疏水性殘基聚集為疏水性板 塊(patch)，介導與細胞表面膜上帶負電磷脂的相互作用。舉例的其它含有Gla的多肽包括 但不限于FIX、FX、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、骨鈣蛋白、基質Gla蛋白、生長抑制特異性蛋白 6 (Gas6)和蛋白Ζ。這些及其它舉例蛋白質Gla結構域在SEQ ID NO :83-94中示出。如本文所用，“天然”或者“內源”Gla結構域是指與具有Gla結構域的多肽的所有 或者部分相關的天然發(fā)生的Gla結構域。對于本發(fā)明，天然Gla結構域是相對于FVII多肽。 例如，SEQ ID N0:92所示FVII的天然Gla結構域對應SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的第 1-45位氨基酸。如本文所用，異源Gla結構域是指來自相同或者不同物種的多肽的Gla結構域，其 不是FVII Gla結構域。舉例的異源Gla結構域是來自含有Gla多肽的Gla結構域，所述多 肽包括但不限于FIX、FX、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、骨鈣蛋白、基質Gla蛋白、生長抑制特異 性蛋白6(Gas6)和蛋白Ζ。這些及其它舉例蛋白質的Gla結構域在SEQ ID Ν0:83_91、93和 94任一中示出。如本文所用，Gla結構域的連續(xù)部分是指至少兩或更多個相鄰氨基酸，典型為2、 3、4、5、6、8、10、15、20、30、40或者更多直至組成Gla結構域的所有氨基酸。如本文所用，“導致磷脂結合的Gla結構域的足夠部分”包括該結構域的至少一個 氨基酸，典型包括2、3、4、5、6、8、10、15或者更多個氨基酸，但是少于組成該結構域的所有 氨基酸，只要含有這部分的所述多肽呈現(xiàn)磷脂結合即可。如本文所用，Gla結構域“置換”或者“Gla結構域Swap”是指使用重組、合成或者 其它方法用另一蛋白質的Gla結構域置換蛋白質的內源Gla結構域的過程。在“Gla結構 域Swap”中，“Gla結構域”是足以保留磷脂結合活性的選自Gla結構域和相鄰區(qū)域的任何 氨基酸。典型地，Gla結構域Swap包含用另一蛋白質的40-50個氨基酸置換內源蛋白質的 40-50個氨基酸，但是可以包含較少或者更多的氨基酸。如本文所用，表皮生長因子(EGF)結構域(EGF-1或EGF-2)是指與表皮生長因子 (EGF)序列的特異的30-40個氨基酸部分呈現(xiàn)序列同源性的蛋白質的一部分。EGF結構域 包括六個半胱氨酸殘基，已經(jīng)示出其參與二硫鍵(在EGF中)。EGF結構域的主要結構是雙 鏈β -折疊，隨后是環(huán)以及C末端短雙鏈折疊。FVII含有兩個EGF結構域EGF-1和EGF-2。 這些結構域分別對應SEQ ID NO 3所示成熟FVII多肽的第46-82位和第87-1 位氨基 酸。如本文所用，“未修飾的多肽”或者“未修飾的FVII”及其語法變化是指針對本發(fā) 明提供的修飾選擇的起始多肽。所述起始多肽可以是天然發(fā)生的野生型多肽。另外，所述起始多肽可以被改變或者突變，由此其與天然野生型同種型不同，但是在此相對于隨后本 發(fā)明產(chǎn)生的修飾的多肽稱作起始未修飾的多肽。因此，可以選擇已經(jīng)被修飾的、其特定活 性或者性質與未修飾的參考蛋白質相比具有所需增加或降低的本領域已知現(xiàn)有蛋白質并 用作起始未修飾的多肽。例如，已經(jīng)通過一或多個單一氨基酸改變而從其天然形式被修 飾且其希望的性質增加或降低(例如氨基酸殘基的變化以改變糖基化)的蛋白質可以是 靶蛋白，在此稱作未修飾的，以進一步修飾相同或者不同性質。舉例的本領域已知的修飾 的FVII多肽包括例如如下專利中描述的任何FVII多肽美國專利No. 5580560,6017882, 6693075,6762286 和 6806063，美國專利出版物 No. 20030100506 和 20040220106 以及國 際專利出版物 W01988010295、W0200183725、W02003093465、W0200338162、W02004083361、 W02004108763,ff02004029090,ff0200402909Uff02004111242 和 W02005123916。如本文所用，“修飾的因子VII多肽”和“修飾的因子VII”是指與未修飾的因子VII 多肽相比具有一或多個氨基酸差異的FVII多肽。所述一或多個氨基酸差異可以是氨基酸 突變如一或多個氨基酸置換(取代)、插入或缺失，或者可以是插入或缺失全部結構域，以 及其任何組合。典型地，修飾的FVII多肽與未修飾的FVII多肽相比在一級序列中具有一 或多個修飾。例如，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽與未修飾的FVII多肽相比可具有1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50 或者更多個氨基酸不同。 只要所得多肽呈現(xiàn)與天然FVII多肽相關的至少一種FVII活性，就包含這樣的任何修飾，所 述活性例如是催化活性、蛋白酶解活性、結合TF的能力或者結合活化的血小板的能力。如本文所用，“凝血抑制劑”是指抑制或者阻止凝血或者血凝塊形成的蛋白質或分 子。凝血的抑制或者阻止可以在體內或者體外觀測，且可以通過使用本領域已知的任何方 法測定，所述方法包括但不限于凝血酶激酶原時間(PT)測定或者激活部分促凝血酶原激 酶時間(aPTT)測定。如本文所用，組織因子途徑抑制劑(TFPI，也稱作TFPI-1)是Kunitz-型抑制劑，其 參與四元TF/FVIIa/TFPI/Fxa抑制復合物的形成，其中FVIIa的活性被抑制。TFPI在可變 剪接之后被表達為兩種不同的前體形式=TFPI α (SEQ ID NO :75)和TFPI β (SEQ ID NO :77) 前體，其在分泌期間被裂解分別產(chǎn)生276個氨基酸(SEQ ID NO :76)和223個氨基酸(SEQ ID NO 78)的成熟蛋白。TFPI含有3個Kunitz結構域，其中Kunitz-I結構域負責與FVIIa 的結合和抑制。如本文所用，TFPI_2(也稱作胎盤蛋白和基質相關絲氨酸蛋白酶抑制劑 (MSPI))是指TFPI的同系物。所述213個氨基酸的成熟TFPI-2蛋白(SEQ ID NO 79)含有 3個Kunitz-型結構域，與TFPI-I Kunitz-型結構域1、2和3分別呈現(xiàn)43%、35%和53% 的一級序列相同性。TFPI-2在調節(jié)胞外基質消化和重塑中起作用，不認為其是凝血途徑中 的重要因子。如本文所用，抗凝血酶III(AT-III)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑(絲氨酸蛋白酶 抑制蛋白)。AT-III作為含有464個氨基酸殘基(SEQ ID NO 95)的前體蛋白合成，在分泌 期間被裂解釋放432個氨基酸的成熟抗凝血酶(SEQ ID NO :96)。如本文所用，輔因子是指結合其它特異蛋白質或分子以形成活性復合物的蛋白質 或分子。在一些實例中，與輔因子結合是最佳蛋白酶解活性必需的。例如，組織因子(TF) 是FVIIa的輔因子。FVIIa與TF的結合誘導構象改變，導致FVIIa對于其底物FX和FIX的蛋白酶解活性增加。如本文所用，組織因子(TF)是指沈3個氨基酸的跨膜糖蛋白(SEQ IDNO :97)，其 發(fā)揮FVIIa的輔因子功能。其由平滑肌細胞和成纖維細胞組成性表達，且在當組織損傷后 這些細胞與血流接觸時通過結合FVII和FVIIa幫助起始凝血。如本文所用，活化的血小板是指已經(jīng)通過結合如膠原、血栓烷A2、ADP和凝血酶等 分子經(jīng)歷最終促進凝血的形態(tài)學、表型和功能的各種改變而觸發(fā)的血小板。例如，活化的 血小板在形態(tài)上改變?yōu)榫哂型怀鲋傅母鼰o定形形狀?；罨难“逡步?jīng)歷細胞膜的“翻轉 (flip)”，由此在細胞膜內層(leaflet)正常存在的磷脂酰絲氨酸及其它帶負電的磷脂被 轉位至外層朝向血漿表面?；罨“宓倪@些膜提供了在其上實現(xiàn)許多凝血級聯(lián)反應的表 面?；罨难“逡卜置诤羞@種促凝因子如vWF、FV、凝血酶、ADP和血栓烷A2的小泡，并 且彼此粘附形成血小板栓子，其由纖維蛋白穩(wěn)定成為血凝塊。如本文所用，活化的血小板的增加的結合和/或親和性及其語法變化是指多肽或 者蛋白質例如FVII多肽結合活化的血小板表面的能力與參考多肽或者蛋白質相比增強。 例如，修飾的FVII多肽結合活化的血小板的能力可以高于未修飾的FVII多肽結合活化的 血小板的能力。多肽與活化的血小板的結合和/或親和性與未修飾的多肽的結合和/或 親和性相比可增加至少大約 1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%, 40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更高。確定多肽與 活化的血小板的結合和/或親和性的測定法為本領域已知。FVII多肽與活化的血小板的結 合通過FVII多肽的Gla結構域中氨基酸與活化的血小板上帶負電磷脂如磷脂酰絲氨酸的 相互作用而介導。如此，測定多肽如FVII多肽與活化的血小板的結合的測定法使用含有磷 脂如磷脂酰絲氨酸的膜和小泡。例如，多肽結合活化的血小板的能力受該多肽結合磷脂小 泡的能力的影響，這可以通過光散射技術測量。如本文所用，與磷脂的結合和/或親和性增加及其語法變化是指多肽或蛋白質結 合磷脂的能力與參考多肽或蛋白質相比增加。磷脂可包括任何磷脂，但是特別包括磷脂酰 絲氨酸。多肽與磷脂的結合和/或親和性與未修飾的多肽的結合和/或親和性相比可增 加至少大約 1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%, 70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。確定多肽與磷脂的親和性和/ 或結合的測定法為本領域已知。例如，F(xiàn)VII多肽與磷脂小泡的結合可以通過在入射光90° 的相對光散射而確定。測量單獨磷脂小泡以及磷脂小泡與FVII的光散射強度以確定解離 常數(shù)。也可以使用如在BIAcore生物傳感器設備上進行的表面等離子共振測量FVII多肽 與磷脂膜的親和性。如本文所用，增加的對抑制劑的抗性或者“增加的對AT-III的抗性”或者“增加 的對TFPI的抗性”是指多肽與參考多肽如未修飾的FVII多肽相比對于抑制劑如AT-III 或TFPI的抑制作用的任何量的敏感性降低。對于抑制劑如AT-III的抗性增加可以通過 評估修飾的FVII多肽與抑制劑的結合而測定。對于抑制劑如AT-III的抗性增加也可以 通過測量在存在AT-III條件下FVII多肽的內在活性或者凝血劑活性而測定。確定多肽 與抑制劑結合的測定法為本領域已知。對于共價抑制劑如AT-III，可以測量抑制作用的二 級速率常數(shù)。對于非共價抑制劑如TFPI，可以測量kp另外，例如在BIAcore生物傳感器 設備上進行的表面等離子共振也可用于測量FVII多肽與AT-III或者其它抑制劑的結合。然而，對于共價抑制劑如AT-III，使用BIAcore僅可測量on-rate。確定例如AT-III對于 FVII凝血劑活性或者內在活性的抑制作用的測定法也為本領域已知。例如，可以測量修 飾的FVII多肽在存在或不存在AT-III的條件下裂解其底物FX的能力，確定AT-III抑制 該反應的程度?？蓪⑵渑c未修飾的FVII多肽在存在或不存在AT-III的條件下裂解其底 物FX的能力對比。呈現(xiàn)抑制劑抗性增加的修飾的多肽與未修飾的多肽相比對于抑制劑作 用的抗性例如增加 1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%, 60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%, 300 %、400 %、500 % 或更多。如本文所用，“Zn2+抑制抗性增加”、“Zn2+抑制作用抗性增加”或者“Zn2+抗性增 加”是指多肽與參考多肽如未修飾的FVII多肽相比對于Si2+抑制作用的敏感性降低的任 何量。Si2+抗性增加可以通過例如在存在Si2+條件下測量FVII多肽的內在活性或者凝血 劑活性而評定，如在實施例11中描述。Si2+抑制作用抗性增加可以是與Si2+結合降低的結 果。與Si2+的結合降低可以通過測量每個FVIIa分子結合的Si2+的量或者通過測量Zn2+結 合FVIIa的親和性或者通過測量鋅對于FVIIa活性的抑制作用的IC5tl而評定。呈現(xiàn)出Si2+ 抑制作用抗性增加的修飾的多肽與未修飾的多肽相比對于Si2+作用的抗性例如增加1%、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%,300%,400%,500%^； 者更多。如本文所用，血清白蛋白結合序列是指可以實現(xiàn)與血清白蛋白結合的氨基酸殘基 序列。因此，當插入FVII多肽中時，所述血清白蛋白結合序列可以增強FVII多肽與血清 白蛋白的親和性或者與其的結合。含有血清白蛋白結合序列的修飾的FVII多肽的能力因 此可呈現(xiàn)出與血清白蛋白的結合和/或親和性增加。呈現(xiàn)出與血清白蛋白的結合和/或親 和性增加的修飾的多肽與未修飾的多肽的結合和/或親和性相比例如增加l^d^d^i、 4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更多。 典型地，血清白蛋白結合序列含有至少10個或者更多個氨基酸，典型為10、11、12、13、14、 15、20、30、40或更多個氨基酸。舉例的血清白蛋白結合序列是如SEQ ID NO :103-109所示 那些序列。如本文所用，血小板整聯(lián)蛋白α IIb β 3結合序列是指可以實現(xiàn)與血小板整聯(lián)蛋白 α IIb β 3結合的氨基酸殘基序列。因此，當插入FVII多肽中時，血小板整聯(lián)蛋白α IIb β 3結合 序列可以增強FVII多肽結合血小板整聯(lián)蛋白α IIbi3 3及因此結合血小板包括激活的血小板 的能力。含有血小板整聯(lián)蛋白αΙΛβ3結合序列的修飾的FVII多肽的能力因此可呈現(xiàn)出與 血小板整聯(lián)蛋白和/或血小板的結合和/或親和性增加。呈現(xiàn)出與血小板整聯(lián)蛋 白α IIb β 3的結合和/或親和性增加的修飾的多肽與未修飾的多肽的結合和/或親和性相 比呈現(xiàn)出增加例如 1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%, 60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%, 300%、400%、500%或者更多。典型地，血小板整聯(lián)蛋白α IIb β 3結合序列含有至少5個或 者更多個氨基酸，典型為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40或者更多個氨基酸。舉 例的血小板整聯(lián)蛋白απ 3β3結合序列如SEQ ID NO :110-112所示。
如本文所用，糖基化位點是指多肽中碳水化合物部分可以附著的氨基位置。典型 地，糖基化蛋白質含有一或多個氨基酸殘基如天冬酰胺或者絲氨酸用以附著碳水化合物部 分。如本文所用，天然糖基化位點是指野生型多肽中碳水化合物部分附著的氨基位 置。在FVII中有四個天然糖基化位點，兩個N-糖基化位點在W45和N322和兩個0-糖基 化位點在S52和S60，相應于SEQ ID NO 3所示成熟FVII多肽中氨基酸位置。如本文所用，非天然糖基化位點是指在野生型多肽中不存在的修飾的多肽中附 著碳水化合物部分的氨基位置。非天然糖基化位點可以通過氨基酸置換導入FVII多肽 中。0-糖基化位點可以例如通過用絲氨酸或者蘇氨酸置換天然殘基的氨基酸置換而產(chǎn)生。 N-糖基化位點可以例如通過建立基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys而產(chǎn)生，其中fcia不是脯氨酸。 這種通過氨基酸修飾進行的共有序列的產(chǎn)生可以包含例如用天冬酰胺置換天然氨基酸殘 基的單一氨基酸置換、用絲氨酸、蘇氨酸或者半胱氨酸置換天然氨基酸殘基的單一氨基酸 置換，或者包含用天冬酰胺置換天然殘基的第一氨基酸置換以及用絲氨酸、蘇氨酸或者半 胱氨酸置換天然殘基的第二氨基酸置換的雙重氨基酸置換。如本文所用，“生物學活性”是指化合物的體內活性或者在體內施用化合物、組合 物或者其它混合物時產(chǎn)生的生理反應。因此，生物學活性包含這種化合物、組合物和混合物 的治療作用和藥物學活性。生物學活性可以在設計為檢測或者使用這種活性的體外系統(tǒng)中 觀測到。因此，對于本發(fā)明，F(xiàn)VII多肽的生物學活性包含凝血劑活性。如本文所用，術語“評估”及其語法變化就獲得多肽活性的絕對值以及獲得表示活 性水平的指數(shù)、比率、百分比、目測值或者其它值而言包括定量和定性確定。評估可以是直 接或者間接的。例如，檢測多肽對底物的裂解可以通過直接測量產(chǎn)物進行，或者可以通過確 定裂解的底物的所得活性而間接測量。如本文所用，“糜蛋白酶編號”是指SEQ ID NO :80所示成熟糜蛋白酶多肽的氨基 酸編號。可以將另一蛋白酶的蛋白酶結構域例如因子VII的蛋白酶結構域與糜蛋白酶進行 序列對比。在這種情況中，對應糜蛋白酶的氨基酸的因子VII的氨基酸以糜蛋白酶氨基酸 的編號給出。本領域技術人員使用人工序列對比或者通過使用可獲得的許多序列對比程序 (例如BLASTP)通過這種序列對比確定對應位置。對應位置也可以基于結構對比，例如通 過使用計算機模擬的蛋白質結構對比進行。對應于揭示序列中氨基酸的多肽的氨基酸是指 在所述多肽與揭示序列的對比時使用標準序列對比算法如GAP算法最大化相同性或者同 源性(其中對比保守的氨基酸)而鑒別的氨基酸。表1提供了 SEQ ID NO 3所示FVII多 肽的第1-406位氨基酸的對應糜蛋白酶編號。SEQ ID NO :3所示序列的氨基酸位置是正常 字體，在那些位置的氨基酸殘基以黑體字示出，對應糜蛋白酶編號以斜體字示出。例如，成 熟因子VII(SEQ ID NO 3)與成熟糜蛋白酶(SEQ ID NO 80)進行序列對比時，在因子VII 中第153氨基酸位置的異亮氨酸(I)的糜蛋白酶編號是116。據(jù)此對隨后的氨基酸編號。 在一個實例中，成熟因子VII(SEQ ID NO :3)的第210氨基酸位置的谷氨酸(E)基于糜蛋 白酶編號對應E70氨基酸位置。在殘基在蛋白酶中存在而在糜蛋白酶中不存在的情況中， 氨基酸殘基以字母符號示出。例如，糜蛋白酶中是具有基于糜蛋白酶編號氨基酸60的環(huán)的 一部分但是與糜蛋白酶對比插入在因子VII序列中的殘基被稱作例如K60a、I60b、K60c或 者N60d。這些殘基分別對應成熟因子VII序列(SEQ ID NO 3)編號的K197、I198、K199和N200。表1 因子VII的糜蛋白酶編號
權利要求
1.修飾的因子VII(FVII)多肽，其在FVII多肽中包含修飾，其中所述修飾是在對應于具有SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的FVII多肽的第286位的位 置或者FVII多肽中對應殘基上的氨基酸置換；以及所述修飾是在第286位的由堿性氨基酸的置換，導致修飾的FVII多肽與在286位不具 有該修飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)增加的凝血劑活性。
2.權利要求1的修飾的FVII多肽，其中所述堿性氨基酸選自Arg(R)、Lys(K)和 His(H)。
3.權利要求1或者2的修飾的FVII多肽，其中所述修飾是用Arg(R)置換Gln(Q)。
4.權利要求1-3任一項的修飾的FVII多肽，其中未修飾的FVII多肽包含SEQID NO 1-3、18-74、98、158或者343-353任一所示氨基酸序列，或者是其等位基因變體或者種變體 或者與SEQ ID NO :1-3、18-74、98、158或者；343-353任一所示FVII具有至少60%序列相 同性的變體，或者是包含SEQ ID NO 1-3、18-74、98、158或者343-353任一所示氨基酸序列 的FVII多肽的活性片段。
5.權利要求3的修飾的FVII多肽，其中所述修飾的FVII多肽是在對應FVII多肽中 286位的位置上含有置換的活性片段。
6.權利要求1-5任一項的修飾的FVII多肽，其僅具有在286位的一個修飾。
7.權利要求1-5任一項的修飾的FVII多肽，其包含在FVII多肽中其它位置的一或多 個進一步修飾。
8.權利要求1-7任一項的修飾的FVII多肽，其具有除了286位修飾之外的一或兩個修飾。
9.權利要求7的修飾的FVII多肽，其中進一步修飾是氨基酸置換、插入或者缺失。
10.權利要求7或者9的修飾的FVII多肽，其中進一步修飾是在對應選自如下位置 的位置的氨基酸置換51、52、M、60、66、68、109、119、122、124、130、132、158、161、175、196、 197、199、202、216、222、237、239、257、286、287、290292、294、296、298、305、314、318、321、 337、341、366、373、374、394、395 和 396。
11.權利要求7-10任一項的修飾的FVII多肽，其中進一步氨基酸修飾選自 D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、 K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、 G237V、 T239A、 R290A、 R290E、 R290D、 R290N、 R290Q、 R290K、 R290M、 R290V、 K341E、 K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insff, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA, K1971198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T、M298Q、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、 Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373L、H373I、H373F、H373A、K161S、K161A、 K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、S222E、S222D、H257A、 H257S、Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、{Gla Swap FIX/K43I}、{Gla Swap FIX/ Q44S}、{Gla Swap FIX/M19K}、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、Gla Swap Thrombin、S52A、S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、A51N、T130N、 E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103SllldelinsQRLMED ICLPRWGCLWEDDF, Hl 15S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDIC LPRffGCLffEDDF, S103S11IdelinsIEDICLPRWGCLWE, Hl 15S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T 128P134delins IED I CLPRffGCLffE, S 103S111de1iηsD I CLPRffGCLffED , H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、 P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED, S103S1 IldelinsSFGRGDIRNV, Hl 15S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、 P406insCSFGRGDIRNVC、P406iηsGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T、V158D、L287T、E296V、M298K 和 M298Q0
12.權利要求7-11任一項的修飾的FVII多肽，其包含選自如下的修飾Q286R/M298Q、 Q286R/Gla Swap FIX、Q286R/H257A、Q286R/S222A、Q286R/S222A/H257A、Q286R/S222A/ Gla Swap FIX、Q286R/H257A/Gla Swap FIX、Q286R/S222A/H257A/Gla Swap FIX、Q286R/ M298Q/K341Q、Q286R/M298Q/K199E、Q286R/M298Q/Gla Swap FIX、Q286R/Q366V、Q286R/ A292N/A294S/Q366V、A175S/Q286R/Q366V、S222A/Q286R/Q366V、H257S/Q286R、H257S/ Q286R/Q366V、S222A/H257A/Q286R/Q366V、Q286R/H373A、S222A/H257A/Q286R/M158Q、 Q286R/K341D、Q286R/Q366D、Q286R/Q366N、Q286R/M298Q/Q366D、Q286R/M298Q/Q366N、 Q286R/H373F、Q286R/M298Q/H373F、{Gla Swap FIX/E40L}/Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/ K43I}/Q286R/M298Q、 {Gla Swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q、 {Gla Swap FIX/M19K}/Q286R/ M298Q,{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q,T128N/P129A/Q286R,T128N/ P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q, Gla Swap FIX/T128N/P129A/S222A/Q286R、Gla Swap FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/ S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F、S52A/S60A/Q286R、Gla Swap FIX/S52A/S60A/S222A/Q286R、S52A/S60A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/S52A/S60A/ Q286R/M298Q、S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q、S52A/S60A/Q286R/H373F/、S52A/ S60A/Q286R/M298Q/H373F、T239V/Q286R、Gla Swap FIX/S222A/T239V/Q286R、T239V/ Q286R/M298Q、S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/T239V/Q286R/M298Q、 T239V/Q286R/H373F、T239V/Q286R/M298Q/H373F、T239I/Q286R、Gla Swap FIX/S222A/ T239I/Q286R、T239I/Q286R/M298Q、S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/ T239I/Q286R/M298Q、T239I/Q286R/H373F、T239I/Q286R/M298Q/H373F、Gla Swap FIX/ S222A/Q286R/H373F、 Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q、 Gla Swap FIX/S222A/Q286R/ M298Q/H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F、H257A/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/ M298Q、Gla Swap FIX/S222A/H257S/Q286R/、S222A/H257S/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/ M298Q/H373F、 S222A/Q286R/M298Q/H373F、 S222A/Q286R/M298Q、 T128N/P129A/A175S/ Q286R、A122N/G124S/A175S/Q286R、Gla Swap FIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R、Gla Swap FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q、A122N/ G124S/A175S/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、A122N/ G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F、 A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F、 {Gla Swap FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N、{Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N、{Gla Swap FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, V158D/Q286R/E296V/M298Q、T128N/ P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F、 T239V/Q286R/M298Q/Q366N、 T239I/Q286R/M298Q/ Q366N、 T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q、 T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/ M298Q、T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F、T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q 和 T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F。
13.權利要求12的修飾的FVII多肽，其中所述修飾是Q286R/iC98Q。
14.修飾的FVII多肽，其在FVII多肽、其等位基因變體或者種變體或者其活性片段中 包含兩或更多個修飾，其中一個修飾在對應具有SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的FVII多肽中Q286位的位置或者 FVII多肽中對應殘基；在Q286位的修飾單獨或者組合任何其它修飾不導致與未修飾的FVII多肽相比導入新 的糖基化位點；以及修飾的FVII多肽與在286位不具有該修飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)增加的凝血劑活性。
15.權利要求14的修飾的FVII多肽，其中所述修飾是氨基酸置換、插入或者缺失。
16.權利要求15的修飾的FVII多肽，其中所述修飾是在對應具有SEQIDNO 3所示 氨基酸序列的FVII多肽中Q286位的位置的置換或者在FVII多肽對應殘基中由選自如下 的氨基酸置換Arg (R)、Lys (K) His (H)、Tyr (Y)、Gly (G)、Phe (F)、Met (M)、IIe (I)、Leu (L)、 Val (V)、Pro (P)、Gle (E)、Trp (W)、Asp (D)以及 Cys (C)。
17.權利要求16的修飾的FVII多肽，其中所述修飾是Q286R。
18.權利要求14-17任一項的修飾的FVII多肽，其中所述修飾之一選自D196K、 D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、 K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、 T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、 K341N、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、 G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insff, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA, K197I198insS、T239S、T239N、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、L287T、P321K、P321E、 P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、 H373E、H373S、H373F、H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、 S222K、S222V、S222N、S222E、S222D、H257A、H257S、Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、 {Gla Swap FIX/K43I}、{Gla Swap FIX/Q44S}、{Gla Swap FIX/M19K}、{Gla Swap FIX/M19K/ E40L/K43I/Q44S}、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、Gla Swap Thrombin、 S52A、S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、 A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103Sllldeli ηsQRLMEDICLPRffGCLffEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLM EDICLPRffGCLffEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T 128P134delins IED I CLPRffGCLffE, S 103S111de1iηsD I CLPRffGCLffED , H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED, S103S1 IldelinsSFGRGDIRNV, Hl 15S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、 P406insCSFGRGDIRNVC、P406iηsGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T、V158D、L287T、E296V、M298K 和 M298Q0
19.修飾的FVII多肽，其在FVII多肽中包含選自如下的修飾Q286R/GlaSwap FIX、 Q286R/H257A、Q286R/S222A、Q286R/S222A/H257、Q286R/S222A/Gla Swap FIX、Q286R/ H257A/Gla Swap FIX、Q286R/S222A/H257A/Gla Swap FIX、Q286R/M298Q、Q286R/M298Q/ K341Q、Q286R/M298Q/K199E、Q286R/M298Q/Gla Swap FIX、Q286R/Q366V、Q286R/A292N/ A294S/Q366V、A175S/Q286R/Q366V、S222A/Q286R/Q366V、H257S/Q286R、H257S/Q286R/ Q366V、S222A/H257A/Q286R/Q366V、Q286R/H373A、S222A/H257A/Q286R/M298Q、V 158D/ E296V/M298Q、 {Gla Swap FIX/E40L}/Q286R/M298Q、 {Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q、 {Gla Swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q、 {Gla Swap FIX/M19K}/Q286R/M298Q、 {Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S} /Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R、T128N/P129A/Q286R/ M298Q, T128N/P129A/Q286R/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q, Gla Swap FIX/T128N/ P129A/S222A/Q286R, Gla Swap FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/ H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F、S52A/S60A/Q286R、Gla Swap FIX/ S52A/S60A/S222A/Q286R、S52A/S60A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/S52A/S60A/Q286R/ M298Q, S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q、 S52A/S60A/Q286R/H373F/, S52A/S60A/ Q286R/M298Q/H373F、T239V/Q286R、Gla Swap FIX/S222A/T239V/Q286R、T239V/Q286R/ M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/T239V/Q286R/M298Q、T239V/ Q286R/H373F、T239V/Q286R/M298Q/H373F、T239I/Q286R、Gla Swap FIX/S222A/T239I/ Q286R、T239I/Q286R/M298Q、S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/T239I/ Q286R/M298Q, T239I/Q286R/H373F, T239I/Q286R/M298Q/H373F, Gla Swap FIX/S222A/ Q286R/H373F、 Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q、 Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q/ H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F、H257A/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/M298Q、 Gla Swap FIX/S222A/H257S/Q286R/、S222A/H257S/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/M298Q/ H373F、 S222A/Q286R/M298Q/H373F、 S222A/Q286R/M298Q、 T128N/P129A/A175S/Q286R、 A122N/G124S/A175S/Q286R、 Gla Swap FIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R、 Gla Swap FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q, A122N/G124S/ A175S/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、A122N/G124S/ A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F、A122N/ G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F、 {Gla Swap FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N、{Gla Swap FIX/K43I} /T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, V158D/Q286R/E296V/M298Q, T128N/P129A/ Q286R/M298Q/Q366N/H373F、T239V/Q286R/M298Q/Q366N、T239I/Q286R/M298Q/Q366N、 T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q、T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q、 T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F、T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q 和 T128N/ P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F。
20.權利要求19的修飾的FVII多肽，其中未修飾的FVII多肽包含SEQID NO :1_3、18-74、98、158或者343-353所示任一氨基酸序列，或者是其等位基因變體或者種變體或者 與SEQ ID NO 1-3、18-74、98、158或343-353任一所示FVII具有至少60%序列相同性的變 體，或者是包含SEQ ID NO :1-3、18-74、98、158或者343-353任一所示氨基酸序列的FVII 多肽的活性片段。
21.修飾的FVII多肽，其包含F(xiàn)VII多肽中的修飾，其中所述修飾在對應具有SEQID NO 3所示氨基酸序列的FVII多肽中選自54、66、121、122、1 和132位的位置或者FVII多 肽中的對應殘基。
22.權利要求21的修飾的FVII多肽，其中所述修飾選自PMS、Q66N、L121S、A122N、 P129A 和 E132S。
23.權利要求21或22的修飾的FVII多肽，其包含在FVII多肽中另一位置的一或多個進一步修飾。
24.權利要求23的修飾的FVII多肽，其中所述進一步修飾是氨基酸置換、插入或者缺失。
25.權利要求23或M的修飾的FVII多肽，其中所述進一步修飾之一選自P54S、S52N、 Y58S、S119N、G124S、T128N、T130N、V158D、A175S、S222A、G241S、E296V、M298Q、E394N、P395A、 R396S、G318N 和 Q366V。
26.權利要求25的修飾的FVII多肽，其包含選自如下的修飾:S119N/L121S、T128N/ P129A、A122N/G124S、A122N/G124S/A175S、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、A122N/ G124S/E394N/P395A/R396S/G318N, A122N/G124S/E394N/P395A/R396S, S52N/P54S/A122N/ G124S/E394N/P395A/R396S、S52N/P54S、S119N/L121S/A175S、T128N/P129A/A175S、T130N/ E132S、Q66N/Y68S、T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q、T128N/P129A/S222A、T128N/P129A/ A175S/Q366V、A122N/G124S/A175S/Q366V、T128N/P129A/A175S/S222A、A122N/G124S/ A175S/S222A、T128N/P129A/M298Q 和 T128N/P129A/M298Q/H373F。
27.修飾的FVII多肽，其包含F(xiàn)VII多肽中的修飾，其中所述修飾對應于具有SEQID NO :3所示氨基酸序列的FVII 多肽中選自 T239S、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、P321K、 P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366N、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、 H373F、H373A、K161S、K161V、H216S、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222D、S222N、S222E 和H247S的修飾或者FVII多肽中對應殘基的修飾。
28.權利要求27的修飾的FVII多肽，其在FVII多肽的另一位置包含一或多個進一步 修飾。
29.權利要求觀的修飾的FVII多肽，其中所述進一步修飾之一是在對應選自如下位置 的位置的氨基酸置換51、52、M、60、66、68、109、119、122、124、130、132、158、161、175、196、 197、199、202、216、222、237、239、257、286、287、290292、294、296、298、305、314、318、321、 337、341、366、373、374、394、395 和 396。
30.權利要求觀或四的修飾的FVII多肽，其中所述進一步氨基酸修飾之一選 自:Q286N, Q286E, Q286D, Q286S, Q286T, Q286R, Q286K, Q286A, Q286V, Q286M, Q286L, Q286Y、D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、 K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、 G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insff, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA, K1971198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、 Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373F、H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、 H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、S222E、S222D、H257A、H257S、Gla Swap FIX、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、Gla Swap Thrombin、 Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、{Gla Swap FIX/K43I}、{Gla Swap FIX/Q44S}、 {Gla Swap FIX/M19K}、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}、S52A、S60A、E394N、 P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、A51N、T130N、 E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103SllldelinsQRLMED ICLPRffGCLffEDDF, Hl 15S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDIC LPRffGCLffEDDF, S103S11IdelinsIEDICLPRWGCLWE, Hl 15S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T 128P134delins IED I CLPRffGCLffE, S 103S111de1iηsD I CLPRffGCLffED , H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、 P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED, S103S1 IldelinsSFGRGDIRNV, Hl 15S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、 P406insCSFGRGDIRNVC、P406iηsGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T、V158D、L287T、M298K 和 M298Q。
31.權利要求30的修飾的FVII多肽，其包含選自如下的修飾Q366D/H373E，Q366V/ H373V, Q366V/H373L, Q366V/H373I, S222K/H257A, H216A/S222A, S222S/Gla Swap FIX, S222A/H257A/Gla Swap FIX, S222A/M298Q, S222A/H257A/M298Q, S222A/A292N/A294S/ Q366V,A175S/S222A/Q366V,S222A/Q366V,H257S/Q366V,S222A/H373A,M298Q/H373F,S52A/ S60A/S222A, S222A/T239V,V158D/T239V/E296V/M298Q,S222A/T239I,V158D/E296V/M298Q/ H373F, Gla Swap FIX/Q366V, M298Q/Q366N/H373F, T239V/M298Q/H373F 和 T239I/M298Q/ H373F。
32.修飾的FVII多肽，其包含在FVII多肽、其等位基因變體或者種變體或者活性片段 中的兩或更多個修飾，其中所述兩或更多個氨基酸修飾選自對應H216A、H257A、E394N、P395A、R396S、K109N、 A292N、A175S、H257A 和 Gla Swap FIX 的氨基酸修飾。
33.權利要求32的修飾的FVII多肽，其包含選自H216A/H257A、E394N/P395A/R396S和 K109N/A175S 的修飾。
34.權利要求32或33的修飾的FVII多肽，其進一步包含對應iC98Q或者的修飾。
35.權利要求；34的修飾的FVII多肽，其包含選自H257A/M298Q和K109N/A^2N/A^4S 的修飾。
36.修飾的FVII多肽，其在FVII多肽、其等位基因變體或者種變體或者活性片段中包 含對應 S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q 或者 V158D/T239I/E296V/M298Q 的修飾。
37.修飾的FVII多肽，其在FVII多肽、其等位基因變體或者種變體或者活性片段中包含血清白蛋白結合序列。
38.權利要求37的修飾的FVII多肽，其中所述血清白蛋白結合序列具有SEQID NO 103-109任一所示氨基酸序列或者其實現(xiàn)血清白蛋白結合的足夠部分。
39.權利要求37或38的修飾的FVII多肽，其中血清白蛋白結合序列置換未修飾的 FVII多肽的連續(xù)氨基酸殘基序列。
40.權利要求37-39任一項的修飾的FVII多肽，其包含選自如下的修飾S103Slllde linsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、T128P134delinsQRL MEDICLPRffGCLffEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T 128P134delins IED I CLPRffGCLffE, S 103S111de1iηsD I CLPRffGCLffED , H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、 P406insGGGSIEDICLPRWGCLW,P406insDICLPRWGCLWED 和 P406insGGGSDICLPRWGCLWED。
41.權利要求37-40任一項的修飾的FVII多肽，其與未修飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)出與 血清白蛋白結合的親和性或者結合增加。
42.權利要求41的修飾的FVII多肽，其中修飾的FVII多肽呈現(xiàn)出與血清白蛋白結 合的親和性或者結合的增加至少大約為或者至少為l^d^d^d^j^j^j^^S^、 9 %,10%,20 %,30 %,40 %,50 %,60 %,70%,80 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94%,95 96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更多。
43.修飾的FVII多肽，其在FVII多肽、其等位基因變體或者種變體或者活性片段中包 含血小板整聯(lián)蛋白α IIb β 3結合序列。
44.權利要求43的修飾的FVII多肽，其中所述血小板整聯(lián)蛋白aIIbi33結合序列具有 SEQ ID NO :110-112任一所示氨基酸序列或者其實現(xiàn)血小板整聯(lián)蛋白aIIbi33結合的足夠 部分。
45.權利要求43或44修飾的FVII多肽，其中血小板整聯(lián)蛋白aIIbi33結合序列置換 未修飾的FVII多肽的連續(xù)氨基酸殘基序列。
46.權利要求43-45任一項的修飾的FVII多肽，其包含選自如下的修飾 S103S1 lldelinsSFGRGDIRNV, Hl 15S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、 P406insCSFGRGDIRNVC和 P406insGGGSCSFGRGDIRNVC。
47.權利要求43-46任一項的修飾的FVII多肽，其與未修飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)出與 血小板整聯(lián)蛋白a IIbβ 3的親和性或結合增加。
48.權利要求47的修飾的FVII多肽，其中修飾的FVII多肽與血小板整聯(lián)蛋白aIIb β 3 結合的親和性或結合的增加至少大約為或者至少為l^d^d^d^j^j^j^^S^、 9 %,10%,20 %,30 %,40 %,50 %,60 %,70%,80 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94%,95 96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或者更多。
49.權利要求37-48任一項的修飾的多肽，其在FVII多肽中另一位置包含一或多個進 一步修飾。
50.權利要求49的修飾的FVII多肽，其中所述進一步修飾是在對應位置G237V的位置的氨基酸置換。
51.權利要求50的修飾的FVII多肽，其包含選自如下的修飾 S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED/G237V, Hll5S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V, Hl 15S126delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, H115S126delinsDICLPRWGCLWED/G237V, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V, T128P134delinsIEDICLPRWGCLffE/G237V,S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLffEDDF/G237V 和 T128P134de1insDICLPRWGCLWED/G237V。
52.權利要求7、14、2U8、32或49任一項的修飾的FVII多肽，其包含2、3、4、5、6、7或 者更多個修飾。
53.權利要求7、14、21、觀、32或49任一項的修飾的FVII多肽，其包含異源Gla結構域 或者其實現(xiàn)磷脂結合的足夠部分。
54.權利要求53的修飾的FVII多肽，其中所述異源Gla結構域選自因子IX(FIX)、因子 X (FX)、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、骨鈣蛋白、基質Gla蛋白、生長抑制特異性蛋白質6(Gas6) 和蛋白Z中的Gla結構域。
55.權利要求53或M的修飾的FVII多肽，其中所述異源Gla結構域具有SEQID NO: 83-91,93和94任一所示氨基酸序列或者其實現(xiàn)磷脂結合的足夠部分。
56.權利要求53-55任一項的修飾的FVII多肽，其中天然FVIIGla結構域的全部或者 連續(xù)部分被除去并用所述異源Gla結構域或者其實現(xiàn)磷脂結合的足夠部分置換。
57.權利要求56的修飾的FVII多肽，其中天然FVIIGla結構域包括具有SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的FVII多肽中的氨基酸1-45或者FVII多肽中的對應殘基。
58.權利要求53-57任一項的修飾的FVII多肽，其中異源Gla結構域與野生型異源Gla 結構域相比含有修飾。
59.權利要求58的修飾的FVII多肽，其中 所述異源Gla結構域是FIX Gla結構域，以及所述修飾是在對應選自SEQ ID NO 83所示FIX Gla結構域的位置19、40、43和44的位置的氨基酸置換。
60.權利要求59的修飾的FVII多肽，其中所述修飾選自M19K、E40L、K43I和Q44S。
61.權利要求53-60任一項的修飾的FVII多肽，其中所述異源Gla結構域含有進一步 修飾。
62.權利要求61的修飾的FVII多肽，其中 所述異源Gla結構域是FIX Gla結構域，以及所述進一步修飾是在選自對應SEQ ID N0:83所示FIX Gla結構域的位置19、40、43和 44的位置的氨基酸置換。
63.權利要求61或62的修飾的FVII多肽，其中所述進一步修飾選自M19K、E40L、K43I 和 Q44S。
64.權利要求61-63任一項的修飾的FVII多肽，其中所述修飾是M19K/E40L/K43I/ Q44S。
65.修飾的FVII多肽，其包含異源Gla結構域或者其實現(xiàn)磷脂結合的足夠部分，其中所 述異源Gla結構域包含修飾，從而與具有未修飾的異源Gla結構域的FVII多肽相比與血小板的結合或者親和性增加，或者所述異源Gla結構域與對應的野生型異源Gla結構域相比含有一或多個修飾。
66.權利要求65的修飾的FVII多肽，其中所述異源Gla結構域選自因子IX(FIX)、因子 X (FX)、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、骨鈣蛋白、基質Gla蛋白、生長抑制特異性蛋白質6(Gas6) 和蛋白Z中的Gla結構域。
67.權利要求65或66的修飾的FVII多肽，其中未修飾的或者野生型異源Gla結構域 具有SEQ ID NO :83-91、93和94任一所示氨基酸序列或者其實現(xiàn)磷脂結合的足夠部分。
68.權利要求65-67任一項的修飾的FVII多肽，其中天然FVIIGla結構域的全部或者 連續(xù)部分被除去并由所述異源Gla結構域或者其實現(xiàn)磷脂結合的足夠部分置換。
69.權利要求68的修飾的FVII多肽，其中天然FVIIGla結構域包括具有SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的FVII多肽中氨基酸1-45或者FVII多肽中的對應殘基。
70.權利要求65-69任一項的修飾的FVII多肽，其中所述異源Gla結構域是FIX Gla結構域，以及所述修飾是在選自對應SEQ ID NO 83所示FIX Gla結構域的位置19、40、43和44的位置的氨基酸置換。
71.權利要求65-70任一項的修飾的FVII多肽，其中所述修飾選自M19K、E40L、K43I 和 Q44S。
72.權利要求65-71任一項的修飾的FVII多肽，其中所述異源Gla結構域含有進一步 修飾。
73.權利要求72的修飾的FVII多肽，其中所述異源Gla結構域是FIX Gla結構域，以及所述進一步修飾是在選自對應SEQ ID N0:83所示FIX Gla結構域的位置19、40、43和 44的位置的氨基酸置換。
74.權利要求73的修飾的FVII多肽，其中所述進一步修飾選自M19K、E40L、K43I和 Q44S。
75.權利要求73或74的修飾的FVII多肽，其中所述修飾是M19K/E40L/K43I/Q44S。
76.權利要求53-75任一項的修飾的FVII多肽，其與未修飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)出與 磷脂的親和性或結合增加。
77.權利要求76的修飾的FVII多肽，其中所述修飾的FVII多肽呈現(xiàn)出與磷脂的親 和性或結合的增加至少為或者至少大約為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%,99% ,100%,200%,300%,400%, 500 % 或更多。
78.權利要求1-77任一項的修飾的FVII多肽，其與未修飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)出增 加的抗凝血酶III抗性。
79.權利要求78的修飾的FVII多肽，其與未修飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)出抗凝血酶III 抗性的增加至少為或至少大約為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、 30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99% ,100%,200%,300%,400%, 500 % 或更多。
80.權利要求1-79任一項的修飾的FVII多肽，其與未修飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)出增 加的催化活性。
81.權利要求78的修飾的FVII多肽，其中修飾的FVII多肽的催化活性與未修飾的FVII多肽的催化活性相比高至少大約或1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%,99% ,100%,200%,300%,400%, 500 % 或更多。
82.權利要求1-82任一項的修飾的FVII多肽，其與未修飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)出增 加的TFPI抗性。
83.權利要求78的修飾的FVII多肽，其中修飾的FVII多肽與未修飾的FVII多肽相 比 TFPI 抗性呈現(xiàn)出高至少或大約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、 30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99% ,100%,200%,300%,400%, 500 % 或者更多。
84.權利要求1-83任一項的修飾的FVII多肽，其與未修飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)出增 加的Si2+抑制作用抗性。
85.權利要求84的修飾的FVII多肽，其中修飾的FVII多肽與未修飾的FVII多肽 的Si2+抑制作用抗性相比呈現(xiàn)出高至少或大約1%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%, 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更多。
86.權利要求7、14、21、28、32或者49的修飾的FVII多肽，其與未修飾的FVII多肽相 比包含導入和/或消除一或多個糖基化位點的一或多個修飾。
87.權利要求86的修飾的FVII多肽，其中導入1、2、3、4、5、6或更多個糖基化位點。
88.權利要求86的修飾的FVII多肽，其中消除1、2、3、4、5、6或更多個糖基化位點。
89.權利要求87或88的修飾的FVII多肽，其中所述糖基化位點是N-糖基化位點。
90.權利要求87或88的修飾的FVII多肽，其中所述糖基化位點是0-糖基化位點。
91.權利要求1-90任一項的修飾的FVII多肽，其包含一或多個進一步氨基酸修飾，所 述修飾增加抗凝血酶III抗性、增加與磷脂的結合和/或親和性、增加組織因子親和性、增 加內部活性、增加TF依賴性活性、增加凝血劑活性、改變多肽構象以改變酶原性、通過將高 活性與低活性FVIIa構象之間的平衡移向高活性構象而增加催化或凝血劑活性、增加蛋白 酶抗性、降低糖基化、增加糖基化、降低免疫原性、增加穩(wěn)定性和/或促進化學基團連接。
92.權利要求91的修飾的FVII多肽，其中改變的酶原性賦予更酶原樣形狀或者更不酶 原樣的形狀。
93.權利要求1-92任一項的修飾的FVII多肽，其包含選自如下的一或多個進一步氨基 酸修飾S279C/V302C、L280C/N301C、V281C/V302C、S282C/V299C、insertion of a tyrosine at position 4、F4S、F4T、P10Q、P10E、P10D、P10N、Q21N、R28F、R28E、I30C、I30D、I30E、 K32D、K32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32C、K32A、K32S、D33C、D33F、D33E、D33K、A34C、A34E、 A34D、A34I、A34L、A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、T37C、T37D、T37E、K38C、K38E、 K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、L39E、L39Q、L39H、W41N、W41C、W41E、W41D、 I42R、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42K、S43Q、S43N、Y44K、Y44C、Y44D、 Y44E、S45C、S45D、S45E、D46C、A51N、S53N、G58N、G59S、G59T、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、 K62T、L65Q、L65S、L65N、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、 E82N、E82S、E82T T83K、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、E116D、G117N、 G124N、S126N、T128N、L141C、L141D、L141E、E142D、E142C、K143C、K143D、K143E、R144E、R144C、R144D、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N145I、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q,N145E、N145R、N145W、N145D、N145C、K157V、K157L、K157I、K157M、K157F、K157W、K157P、K157G、K157S、K157T、K157C、K157Y、K157N、K157E、K157R、K157H、K157D、K157Q、V158L、V158I、V158M、V158F、V158W、V158P、V158G、V158S、V158T、V158C、V158Y、V158N、V158E、V158R、V158K、V158H、V158D、V158Q、A175S、A175T、G179N、I186S、I186T、V188N、R202S、R202T、I205S、I205T、D212N、E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、Q250C、V253N,E265N,T267N,E270N、A274M、A274L、A274K、A274R、A274D、A274V、A274I、A274F、A274W、A274P、A274G、A274T、A274C、A274Y、A274N、A274E、A274H、A274S、A274Q、F275H、R277N、F278S、F278A.F278N、F278Q、F278G、L280N,L288K,L288C,L288D,D289C,D289K,L288E,R290C、R290G、R290A、R290S、R290T、R290K、R290D、R290E、G291E,G291D,G291C,G291N,G291K,A292C,A292K,A292D,A292E,T293K,E296V,E296L,E296I,E296M,E296F,E296W,E296P,E296G,E296S,E296T,E296C,E296Y,E296N,E296K,E296R,E296H,E296D,E296Q,M298Q,M298V,M298L,M298I,M298F,M298W,M298P,M298G,M298S,M298T,M298C,M298Y,M298N,M298K,M298R,M298H,M298E,M298D,P303S、P303T、R304Y、R304F、R304L、R304M、R304G、R304T、R304A、R304S、R304N、L305V、L305Y、L305I、L305F、L305A、L305M、L305W、L305P、L305G、L305S、L305T、L305C、L305N、L305E、L305K,L305R、L305H、L305D、L305Q,M306D、M306N、D309S、D309T、Q312N、Q313K,Q313D、Q313E、S314A、S314V、S314I、S314M、S314F、S314W、S314P、S314G、S314L、S314T、S314C、S314Y、S314N、S314E、S314K、S314R、S314H、S314D、S314Q、R315K、R315G、R315A、R315S、R315T、R315Q,R315C、R315D、R315E、K316D、K316C、K316E、V317C、V317K、V317D、V317E、G318N、N322Y、N322G、N322F、N322M、N322S、N322I、N322L、N322T、N322V、N322P、N322K,N322H、N322Q,N322E、N322R,N322W、N322C、G331N、Y332S,Y332A,Y332N,Y332Q,Y332G,D334G、D334E、D334A,D334V、D334I、D334M,D334F、D334W,D334P、D334L、D334T、D334C、D334Y、D334N、D334K、D334R、D334H、D334S、D334Q、S336G、S336E、S336A、S336V、S336I、S336M、S336F、S336W、S336P、S336L、S336T、S336C、S336Y、S336N、S336K、S336R、S336H、S336D、S336Q、K337L、K337V、K337I、K337M、K337F、K337W、K337P、K337G、K337S、K337T、K337C、K337Y、K337N、K337E、K337R、K337H、K337D、K337Q、K341E,K341Q,K341G,K341T,K341A,K341S,G342N,H348N,R353N、Y357N,I361N、F374P、F374A、F374V、F374I、F374L、F374M、F374W、F374G、F374S、F374T、F374C、F374Y、F374N、F374E、F374K、F374R、F374H、F374D、F374Q、V376N、R379N、L390C、L390K、L390D、L390E、M391D、M391C、M391K、M391N、M391E、R392C、R392D、R392E、S393D、S393C、S393K,S393E、E394K、P395K,E394C、P395D、P395C、P395E、R396K、R396C、R396D、R396E、P397D、P397K、P397C、P397E、G398K、G398C、G398D、G398E、V399C、V399D、V399K、V399E、L400K、L401K、L401C、L401D、L401E、R402D,R402C、R402K,R402E、A403K、A403C、A403D、A403E、P404E、P404D、P404C、P404K、F405K、P406C、K32N/A34S、K32N/ A34T、F31N/D33S、F31N/D33T、I30N/K32S、I30N/K32T、A34N/R36S、A34N/R36T、K38N/F40S、 K38N/F40T、T37N/L39S、T37N/L39T、R36N/K38S、R36N/K38T、L39N/W41S、L39N/W41T、F40N/ I42S、F40N/I42T、I42N/Y44S、I42N/Y44T、Y44N/D46S、Y44N/D46T、D46N/D48S、D46N/D48T、 G47N/Q49S、G47N/Q49T、K143N/N145S、K143N/N145T、E142N/R144S、E142N/R144T、L141N/ K143S、L141N/K143T、I140N/E142S、I140N/E142T、R144N/A146S、R144N/A146T、A146N/K148S、A146N/K148T、S147N/P149S/、S147N/P149T、R290N/A292S、R290N/A292T、D289N/ G291S、D289N/G291T、L288N/R290S、L288N/R290T、L287N/D289S、L287N/D289T、A292N/ A294S、A292N/A294T、T293N/L295S、T293N/L295T、R315N/V317S、R315N/V317T、S314N/ K316S、S314N/K316T、Q313N/R315S、Q313N/R315T、K316N/G318S、K316N/G318T、V317N/ D319S、V317N/D319T、K341N/D343S、K341N/D343T、S339N/K341S、S339N/K341T、D343N/ G345S, D343N/G345T、R392N/E394S、R392N/E394T、L390N/R392S、L390N/R392T、K389N/ M391S、K389N/M391T、S393N/P395S、S393N/P395T、E394N/R396S、E394N/R396T、P395N/ P397S、P395N/P397T、R396N/G398S、R396N/G398T、P397N/V399S、P397N/V399T、G398N/ L400S、G398N/L400T、V399N/L401S、V399N/L401T、L400N/R402S、L400N/R402T、L401N/ A403S、L401N/A403T、R402N/P404S、R402N/P404T、A403N/F405S、A403N/F405T、P404N/P406S 和 P404N/P406T。
94.權利要求1-92任一項的修飾的FVII多肽，其包含將位置300_322、305_322、 300-312或者305-312用來自胰蛋白酶、凝血酶或者FX的對應氨基酸取代，或者將位置 310-329、311-322或者233-3 用來自胰蛋白酶的對應氨基酸取代。
95.權利要求1-94任一項的修飾的FVII多肽，其中未修飾的FVII多肽具有SEQID NO: 3所示氨基酸序列。
96.權利要求95的修飾的FVII多肽，其具有SEQID NO :113-157或者159-342任一 所示氨基酸序列。
97.權利要求1-96任一項的修飾的FVII多肽，其中未修飾的FVII多肽是SEQID NO 3所示多肽的等位基因變體或者種變體。
98.權利要求97的修飾的FVII多肽，其中所述等位基因變體或者種變體除了氨基酸修 飾之外與 SEQ ID NO :3 所示多肽具有 40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或者99%的序列相同性。
99.權利要求1-98任一項的修飾的FVII多肽，其是人多肽。
100.權利要求1-98任一項的修飾的FVII多肽，其是非人多肽。
101.權利要求1-100任一項的修飾的FVII多肽，其是成熟多肽。
102.權利要求1-101任一項的修飾的FVII多肽，其中僅一級序列被修飾。
103.權利要求1-101任一項的修飾的FVII多肽，其進一步包含化學修飾或者翻譯后修飾。
104.權利要求1-103任一項的修飾的FVII多肽，其中FVII多肽是糖基化的、羧化的、 羥化的、硫酸化的、磷酸化的、白蛋白化的或者綴合聚乙二醇(PEG)部分。
105.權利要求1-104任一項的修飾的FVII多肽，其是單鏈多肽。
106.權利要求1-104任一項的修飾的FVII多肽，其是雙鏈多肽。
107.權利要求1-104任一項的修飾的FVII多肽，其是活性的或者被活化的。
108.權利要求107的修飾的FVII多肽，其中活化是通過自身活化蛋白酶解、因子 IX(FIXa)裂解、因子X(FXa)裂解、因子XII (FXIIa)裂解或者凝血酶裂解實現(xiàn)的。
109.權利要求1-108任一項的修飾的FVII多肽，其保留未修飾的FVII多肽的一或多 種活性。
110.權利要求1-108任一項的修飾的FVII多肽，其包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、·20、30、40、50或者60個氨基酸位置的修飾，只要所述多肽保留未修飾的FVII多肽的至少一 種FVII活性。
111.權利要求109或110的修飾的FVII多肽，其中修飾的多肽保留未修飾的多肽的 至少大約或者 1% >2%,3%,4%,5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或者更多的活性。
112.權利要求109-111任一項的修飾的FVII多肽，其中所述一或多種活性選自組織因 子(TF)結合、因子X(FX)活化、因子IX(FIX)活化、磷脂結合以及凝血活性。
113.權利要求109-112任一項的修飾的FVII多肽，其中保留的活性與未修飾的FVII 多肽相比增加。
114.權利要求109-112任一項的修飾的FVII多肽，其中保留的活性與未修飾的FVII 多肽相比降低。
115.權利要求1-114任一項的修飾的FVII多肽，其中修飾的FVII多肽的凝血活性是 未修飾的FVII多肽的凝血活性的至少大約或者1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或者更多。
116.權利要求109-115任一項的修飾的多肽，其中所述活性在體外、離體或者在體內 測量。
117.核酸分子，其包含編碼權利要求1-116任一項的修飾的FVII多肽的核苷酸序列。
118.載體，其包含權利要求117的核酸分子。
119.權利要求118的載體，其中所述載體是原核載體、病毒載體或者真核載體。
120.權利要求118或119的載體，其中所述載體是哺乳動物載體。
121.權利要求119的載體，其中所述病毒載體選自腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒、 皰疹病毒、慢病毒、痘病毒以及巨細胞病毒。
122.細胞，其包含權利要求118-121任一項的載體。
123.權利要求122的細胞，其是真核細胞。
124.權利要求123的細胞，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞。
125.權利要求124的細胞，其中所述哺乳動物細胞選自幼倉鼠腎細胞(BHK-21)或者 293細胞或者CHO細胞。
126.權利要求122-125任一項的細胞，其中所述細胞表達修飾的FVII多肽。
127.修飾的FVII多肽，其由權利要求122-1 任一項的細胞產(chǎn)生。
128.藥物組合物，其在藥物可接受的運載體中包含治療有效濃度或量的權利要求 1-116或127任一項的修飾的FVII多肽，或者權利要求117的核酸分子或者權利要求 118-121任一項的載體或者權利要求122-1 任一項的細胞。
129.權利要求128的藥物組合物，其配制為局部、系統(tǒng)或者表面施用。
130.權利要求1 或129的藥物組合物，其配制為口服、經(jīng)鼻、肺、口腔、經(jīng)皮、皮下、 十二指腸內、腸道內、胃腸外、靜脈內或者肌內施用。
131.權利要求1觀-130任一項的藥物組合物，其配制為控制釋放形式。
132.權利要求1觀-131任一項的藥物組合物，其配制為單劑量施用形式。
133.—種方法，其包括通過施用權利要求1觀-132任一項的藥物組合物治療對象，其中所述對象患有通過施用FVII或者促凝血劑治療的疾病或者病癥。
134.權利要求133的方法，其中所述疾病或者病癥通過施用活性FVII(FVIIa)治療。
135.權利要求133或134的方法，其中用所述藥物組合物治療改善或者減輕了與所述 疾病或病癥相關的癥狀。
136.權利要求133-135任一項的方法，其進一步包括監(jiān)測對象與施用FVII或者促凝血 劑治療的疾病或者病癥相關的癥狀的改變。
137.權利要求133-136任一項的方法，其中被治療的疾病或者病癥選自凝血失調，血 液病，出血性疾病，血友病，因子VII缺陷以及出血障礙。
138.權利要求137的方法，其中所述疾病或者病癥是血友病，其中所述血友病是血友 病A或者血友病B或者血友病C。
139.權利要求138的方法，其中所述血友病是先天性血友病。
140.權利要求138的方法，其中所述血友病是獲得性血友病。
141.權利要求133-136任一項的方法，其中所述疾病或病癥是由于手術或創(chuàng)傷引起的 出血并發(fā)癥。
142.權利要求141的方法，其中所述出血表現(xiàn)為急性關節(jié)血腫、慢性血友病性關節(jié)病、 血腫、血尿、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、胃腸道出血或者腦出血。
143.權利要求141的方法，其中所述出血是由拔牙所致。
144.權利要求141的方法，其中所述手術是心臟手術、血管成形術、肺部手術、腹部手 術、脊柱手術、腦部手術、血管手術、腎臟手術或者器官移植術。
145.權利要求144的方法，其中所述移植手術選自骨髓移植、心臟移植、肺移植、胰腺 移植和肝臟移植。
146.權利要求133-145任一項的方法，其中所述對象具有因子VIII或者因子IX的自 身抗體。
147.權利要求133-146任一項的方法，其進一步包括施用一或多種其它凝血因子。
148.權利要求147的方法，其中所述一或多種其它凝血因子選自血漿純化或重組的凝 血因子，促凝血劑，如維生素K、維生素K衍生物以及蛋白C抑制劑，血菜，血小板，紅細胞以 及糖皮質激素。
149.權利要求1-116和127任一項的修飾的FVII多肽，用于治療通過施用FVII或者 促凝血劑治療的疾病或病癥。
150.權利要求U8-132任一項的藥物組合物在制備治療通過施用FVII或者促凝血劑 治療的疾病或病癥的藥物中的應用。
151.權利要求149的修飾的FVII多肽或者權利要求150的應用，其中所述疾病或病癥 通過施用酶原或者活性形式的FVII治療。
152.權利要求149或151的修飾的FVII多肽或者權利要求150或151的應用，其中用 所述藥物組合物治療改善或者減輕了與所述疾病或病癥相關的癥狀。
153.權利要求149或151或152的修飾的FVII多肽或者權利要求150-152任一項的 應用，進一步包括監(jiān)測對象與通過施用FVII或者其它促凝血治療的疾病或者病癥相關的 癥狀的改變。
154.權利要求149或151-153任一項的修飾的FVII多肽或者權利要求150-153任一項的應用，其中被治療的疾病或病癥選自凝血失調，血液病，出血性疾病，血友病，因子VII 缺陷，出血障礙，手術出血或者創(chuàng)傷出血。
155.權利要求154的修飾的FVII多肽或者應用，其中所述疾病或病癥是血友病，所述 血友病是血友病A或者血友病B或者血友病C。
156.權利要求155的修飾的FVII多肽或者應用，其中所述血友病是先天性血友病。
157.權利要求155的修飾的FVII多肽或者應用，其中所述血友病是獲得性血友病。
158.權利要求IM的修飾的FVII多肽或者應用，其中所述疾病或病癥是由于手術或者 創(chuàng)傷所致出血并發(fā)癥。
159.權利要求158的修飾的FVII多肽或者應用，其中所述出血表現(xiàn)為急性關節(jié)血腫、 慢性血友病關節(jié)病、血腫、血尿、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、胃腸道出血或者腦出血。
160.權利要求158的修飾的FVII多肽或者應用，其中所述出血是由于拔牙所致。
161.權利要求158的修飾的FVII多肽或者應用，其中所述手術是心臟手術、血管成形 術、肺部手術、腹部手術、脊柱手術、腦部手術、血管手術、腎臟手術或者器官移植術。
162.權利要求161的修飾的FVII多肽或者應用，其中所述移植手術選自骨髓移植，心 臟移植，肺移植，胰腺移植和肝臟移植。
163.權利要求149或151-162任一項的修飾的FVII多肽或者權利要求150-162任一 項的應用，其中所述對象具有因子VIII或者因子IX的自身抗體。
164.權利要求149或151-163任一項的修飾的FVII多肽或者權利要求150-163任一 項的應用，進一步包括施用一或多種其它凝血因子。
165.權利要求164的修飾的FVII多肽或應用，其中所述一或多種其它凝血因子選自血 漿純化或者重組的凝血因子，促凝血劑如維生素K、維生素K衍生物以及蛋白質C抑制劑，血 漿，血小板，紅細胞以及糖皮質激素。
166.—種產(chǎn)品，其包含包裝材料及包含于該包裝材料中的權利要求U8-132任一項的 藥物組合物。
167.權利要求165的產(chǎn)品，其中修飾的FVII多肽有效地治療FVII介導的疾病或病癥，所述包裝材料包括標明該修飾 的FVII多肽用于治療FVII介導的疾病或病癥的標簽。
168.試劑盒，其包含權利要求U8-132任一項的藥物組合物，施用該組合物的裝置，以 及任選包含施用說明書。
全文摘要
本發(fā)明提供的修飾的因子VII多肽及其應用。這種修飾的FVII多肽包括因子VIIa及其它形式的因子VII。本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽是具有改變的活性的那些多肽，典型具有改變的促凝血劑活性，包括促凝血劑活性增加。因此，這種修飾的多肽是治療劑。
文檔編號C12N9/64GK102083971SQ200980121895
公開日2011年6月1日 申請日期2009年4月10日 優(yōu)先權日2008年4月11日
發(fā)明者C·薩諾斯, E·L·麥迪遜 申請人:催化劑生物科學公司