專利名稱：關(guān)于鑒定和使用靶向癌癥干細胞的試劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定靶向癌癥干細胞的化合物和組合物的方法。在某些方面，本 發(fā)明涉及使用特異性靶向癌癥干細胞的化合物和組合物的治療方法，用于抑制有此需要的 受試者中的癌癥干細胞生長和/或存活。本發(fā)明的其他方面涉及癌癥干細胞生物標記在用 于抑制有此需要的受試者中的癌癥干細胞生長和/或存活的治療選擇中的用途。
背景技術(shù)：
癌癥可以起于許多遺傳和后生改變，其引起控制細胞遷移、增殖、分化和生長的機 制中的缺陷。近期發(fā)現(xiàn)已證實腫瘤形成和生長通過在腫瘤內(nèi)稱為癌癥干細胞的較小癌細胞 亞群驅(qū)動。癌癥干細胞(CSCs)是在腫瘤團塊內(nèi)的細胞，其具有種植且產(chǎn)生次級腫瘤的能 力，且負責轉(zhuǎn)移散布的癌癥死亡率的主因。這個概念對于潛在癌癥治療的開發(fā)和臨床前評 估具有重大牽涉。發(fā)明概述癌癥干細胞(CSCs)驅(qū)動腫瘤的長期生存。常規(guī)癌癥治療雖然在根除大塊腫瘤方 面是成功的，但對隱伏的CSCs —般是較不有效的。由這些惡性細胞顯示出的選擇性藥物抗 性促成癌癥中的顯著發(fā)病率和死亡率。此外，CSCs在動物模型中具有以有限稀釋種植腫瘤 的能力。因此，需要特異性且選擇性靶向CSCs的藥物的需要。然而，幾個因素限制了有效 鑒定此類藥物的能力。關(guān)鍵限制是獲得和維持CSCs培養(yǎng)物中的困難，所述CSCs培養(yǎng)物在 分離時分化且停止繁殖。因此，開發(fā)靶向這個惡性亞類的藥物候選物仍是癌癥生物學(xué)家正 在進行的挑戰(zhàn)。本發(fā)明的一些方面基于用于鑒定新型治療劑的方法的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，所述新型治療 劑靶向癌癥干細胞。在本發(fā)明的特定方面，靶向癌癥干細胞的療法的發(fā)現(xiàn)通過高流通量篩 選方法來達到。在本發(fā)明的其他方面，公開了特異性靶向癌癥干細胞的化合物。因此，本發(fā) 明公開了通過高流通量篩選方法鑒定的癌癥干細胞靶向療法及其用途。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了用于測試化合物抑制癌癥干細胞生長和/或存活 的能力的方法。該方法包括(a)使一種或多種測試細胞與化合物的樣品接觸，其中一種或 多種測試細胞已經(jīng)歷上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變，和(b)檢測通過化合物的一種或多種測試細胞的生長和/或存活的抑制水平。在某些實施方案中，上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變起因于抑制一種或多種測試細胞中的E-鈣 粘蛋白活性。在某些實施方案中，抑制一種或多種測試細胞中的E-鈣粘蛋白活性包括使一 種或多種測試細胞與針對E-鈣粘蛋白的封閉抗體接觸，誘導(dǎo)一種或多種測試細胞中的抗 粘附蛋白表達，或干擾一種或多種測試細胞中的細胞極性基因。在某些實施方案中，抑制一 種或多種測試細胞中的E-鈣粘蛋白活性包括使一種或多種測試細胞與和E-鈣粘蛋白mRNA 互補的小干擾核酸接觸。在某些實施方案中，上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變起因于誘導(dǎo)一種或多種測試細胞中的轉(zhuǎn)錄因 子活性，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自:SnailU Snail2、Goosecoid、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-I/ Zeb-2, dEFl/ZEbl、LEFl、Myc、HMGA2、TAZ、Klf8、HIF-1、H0XB7、SIM2s 和 Fos。在某些實施方案中，上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變起因于誘導(dǎo)TWIST的活性。在某些實施方案 中，誘導(dǎo)一種或多種測試細胞中的TWIST活性包括使一種或多種測試細胞與編碼TWIST的 表達載體接觸。在某些實施方案中，上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變起因于使一種或多種測試細胞與選自下述的 生長因子接觸TGF- β /BMP超家族成員、Wnt家族成員、FGF家族成員、Notch配體、EGF家 族成員、IGF家族成員、PDGF和HGF。在某些實施方案中，上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變起因于調(diào)節(jié)一種或多種測試細胞中的信號途 徑活性，其中所述信號途徑選自 TGF-β、Wnt、BMP、Notch、HGF-Met, EGF, IGF、PDGF, FGF, P38-mapk、Ras> PI3Kinase_Akt、Src 禾口 NF_kB。在某些實施方案中，上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變起因于對一種或多種測試細胞實施選自 下述的應(yīng)激缺氧、照射和長期化學(xué)療法治療。在某些實施方案中，上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變起 因于對一種或多種測試細胞實施用煙堿或活性氧生產(chǎn)者例如過氧化氫(H2O2)的處理。 (參見例如，Dasgupta 等人 Nicotine induces cell proliferation, invasion and epithelial-mesenchymal transition in a variety of human cancer cell lines. Int J Cancer. 2009 年 1 月 1 日；124(1) :36-45 和 Lim 等人 Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma :methylation of the E-cadherin promoter.Gastroenterology. 2008 年 12 月；135(6) :2128-40,2140. el-8. Epub 2008年7月31日.)。在某些實施方案中，上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變起因于對一種或多種測試 細胞實施用nAChR激動劑、C3a或MFG-E8的處理。(參見例如，Tang Z，等人，C3a mediates epithelial-to-mesenchymal transition in proteinuric nephropathy, J Am Soc N 印 hrol. 2009年 3 月；20(3) :459-60 Jinushi M，等人，Milk fat globule EGF-8 promotes melanoma progression through coordinated Akt and twist signaling in the tumor microenvironment, Cancer Res. 2008 ^ 11 ^ 1 H ；68 (21) :8889-98.)在某些實施方案中，一種或多種測試細胞包括非致瘤性細胞。在某些實施方案中，一種或多種測試細胞在經(jīng)歷EMT后已變?yōu)橹铝鲂缘?。在其?實施方案中，一種或多種測試細胞在經(jīng)歷EMT前已變?yōu)橹铝鲂缘?。在某些實施方案中，該方法包?a)使一種或多種測試細胞和一種或多種對照細 胞與化合物的樣品接觸，其中一種或多種測試細胞已經(jīng)歷上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變，并且一種或多 種對照細胞未經(jīng)歷EMT，(b)檢測通過化合物的一種或多種測試細胞和對照細胞的生長和/或存活抑制水平；和(C)如果化合物對測試細胞的生長和/或存活具有比對照細胞更大的 抑制作用，那么鑒定化合物為候選CSC選擇性化學(xué)治療劑。在特定實施方案中，測試細胞和 對照細胞是遺傳上匹配的。在某些實施方案中，測試細胞表達或包含抑制E-鈣粘蛋白表達 的小干擾RNA，并且對照細胞不表達此類RNA。在某些實施方案中，該方法進一步包括使一種或多種對照細胞與化合物的樣品接 觸，并且檢測通過化合物的一種或多種對照細胞的生長和/或存活抑制水平。在某些實施 方案中，一種或多種對照細胞是未經(jīng)歷上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變的上皮細胞。在特定實施方案中，使 一種或多種對照細胞與對照表達構(gòu)建體或?qū)φ招「蓴_核酸接觸。在某些實施方案中，對照 小干擾核酸不靶向一種或多種對照細胞的內(nèi)源基因，任選地其中所述小干擾核酸靶向GFP mRNA。在某些實施方案中，對照表達構(gòu)建體編碼GFP蛋白質(zhì)或報道蛋白質(zhì)。在某些實施方 案中，一種或多種對照細胞包括非致瘤性細胞。在其他實施方案中，一種或多種對照細胞包 括致瘤性細胞。在該方法的某些實施方案中，與至少一種其他測試細胞比較，一種或多種測試細 胞各自與不同劑量的化合物接觸，和/或與化合物接觸不同持續(xù)時間；和/或其中與至少一 種其他對照細胞比較，一種或多種對照細胞各自與不同劑量的化合物接觸，和/或與化合 物接觸不同持續(xù)時間。在特定實施方案中，該方法進一步包括分析測試和/或?qū)φ談┝繎?yīng) 答曲線，其中測試劑量應(yīng)答曲線指示通過在多個劑量下的化合物的一種或多種測試細胞抑 制水平；并且其中對照劑量應(yīng)答曲線指示通過在多個劑量下的化合物的一種或多種對照細 胞抑制水平。在某些實施方案中，分析包括測定化合物對于一種或多種測試細胞和/或一 種或多種對照細胞的EC50值。在特定實施方案中，化合物對于一種或多種對照細胞的EC50 值在統(tǒng)計上明顯小于化合物對于一種或多種測試細胞的EC50值。在其他實施方案中，化合 物對于一種或多種對照細胞的EC50值在統(tǒng)計上明顯大于化合物對于一種或多種測試細胞 的EC50值。在某些實施方案中，化合物是對照化合物，任選地選自多柔比星、紫杉醇、放線菌 素D、喜樹堿和星形孢菌素。在某些實施方案中，一種或多種對照細胞和一種或多種測試細胞在共培養(yǎng)中。在 特定實施方案中，一種或多種測試細胞具有鑒定特征，其是可檢測的并且不同于一種或多 種對照細胞的鑒定特征，任選地其中所述鑒定特征包括GFP蛋白質(zhì)和/或癌癥干細胞生物 標記的表達水平。在某些實施方案中，使一種或多種測試細胞中的GFP蛋白質(zhì)表達水平與 一種或多種對照細胞中的GFP蛋白質(zhì)表達水平比較。在某些實施方案中，該方法進一步包 括監(jiān)控一種或多種測試細胞與一種或多種對照細胞的比，通過檢測共培養(yǎng)物樣品中每種細 胞的鑒定特征，任選地其中所述檢測包括熒光激活細胞分選。在某些實施方案中，該方法進一步包括測試多個測試樣品，其中所述測試樣品各 自包括一種或多種測試細胞中的至少一種；和/或進一步包括測試多個對照樣品，其中所 述對照樣品各自包括一種或多種對照細胞中的至少一種。在某些實施方案中，每種測試樣 品和/或每種對照樣品在分開的培養(yǎng)小室中，任選地其中每個培養(yǎng)小室是多孔平板的孔。 在某些實施方案中，多孔平板具有選自6、12、24、96、384或1536的孔數(shù)目。在某些實施方案中，化合物得自由多種化合物組成的文庫，任選地其中所述文庫 選自天然產(chǎn)物文庫、多樣性文庫、激酶抑制劑文庫、HDAC抑制劑文庫、已知生物活性化合物文庫、肽文庫、抗體文庫或RNAi文庫。在特定實施方案中，接觸一種或多種測試細胞包括將 化合物的樣品從文庫轉(zhuǎn)移到包含測試樣品的培養(yǎng)小室；和/或其中接觸一種或多種對照細 胞包括將化合物的樣品從文庫轉(zhuǎn)移到包含對照樣品的培養(yǎng)小室。在某些實施方案中，該方 法進一步包括鑒定對于一種或多種測試細胞比一種或多種對照細胞基本上更有細胞毒性 的前導(dǎo)化合物，通過比較通過化合物的一種或多種測試細胞的生長和/或存活抑制水平與 通過化合物的一種或多種對照細胞的生長和/或存活抑制水平。在特定實施方案中，該方 法進一步包括使一種或多種癌細胞與前導(dǎo)化合物的樣品接觸；并且檢測通過前導(dǎo)化合物的 一種或多種癌細胞的生長和/或存活抑制水平。在某些實施方案中，一種或多種癌細胞得 自結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、宮頸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱 癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣 癌、支氣管原癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞癌、胚胎性癌、腎母細胞 瘤或睪丸瘤。在特定實施方案中，一種或多種癌細胞中的至少一種是癌癥干細胞，其具有癌 癥干細胞生物標記。在某些實施方案中，癌癥干細胞生物標記是⑶44+和⑶的細胞表面標記譜。在 某些實施方案中，癌癥干細胞是MDA-MB-231、SUM159或"T47D乳腺癌細胞。在某些實施方案中，檢測一種或多種癌細胞的生長和/或存活抑制水平包括測定 其為至少一種癌癥干細胞的一種或多種癌細胞的部分。在某些實施方案中，檢測一種或多種癌細胞的生長和/或存活抑制水平包括測定 一種或多種癌細胞在懸浮培養(yǎng)中形成集落的能力。在某些實施方案中，檢測一種或多種癌細胞的生長和/或存活抑制水平包括測定 一種或多種癌細胞在體內(nèi)形成腫瘤的能力。在某些實施方案中，該方法進一步包括通過修飾前導(dǎo)化合物產(chǎn)生精制前導(dǎo)化合 物，以達到(i)改善的效力、(ii)降低的毒性(改善的治療指數(shù))；(iii)降低的副作用； (iv)修飾的治療作用發(fā)作和/或效應(yīng)持續(xù)時間；和/或(ν)修飾的藥代動力學(xué)參數(shù)(吸收、 分布、代謝和/或排泄)。在特定實施方案中，該方法進一步包括測定前導(dǎo)或精制前導(dǎo)化合 物的體內(nèi)毒理學(xué)譜，其通過執(zhí)行前導(dǎo)或精制前導(dǎo)化合物的定量結(jié)構(gòu)活性關(guān)系分析。在某些 實施方案中，該方法進一步包括通過用藥學(xué)上可接受的載體配制前導(dǎo)或精制前導(dǎo)化合物產(chǎn) 生藥物組合物。在某些實施方案中，該方法進一步包括在體內(nèi)測試前導(dǎo)或精制前導(dǎo)化合物， 其通過給具有癌細胞的受試者施用藥物組合物，并且評估化合物對受試者的毒性和/或化 合物對受試者中的癌細胞生長和/或存活的作用。在特定實施方案中，受試者選自小鼠、大 鼠、兔、犬、貓、綿羊、豬、非人靈長類和人。在某些實施方案中，該方法進一步包括測定一種或多種癌癥干細胞標記在測試細 胞和/或?qū)φ占毎械谋磉_。在特定實施方案中，一種或多種癌癥干細胞標記選自CD20、 CD24、CD34、CD38、CD44、CD45、CD105、CD133、CD166、EpCAM、ESA, SCAl、Pecam 和 Strol。在 某些實施方案中，一種或多種癌癥干細胞標記是⑶對和⑶44。在某些實施方案中，檢測通過化合物的測試細胞和/或?qū)φ占毎纳L和/或存 活抑制水平包括執(zhí)行選自下述的測定法細胞計數(shù)測定法、復(fù)制標記測定法、細胞膜完整性 測定法、基于細胞ATP的生存測定法、線粒體還原酶活性測定法、胱天蛋白酶活性測定法、 膜聯(lián)蛋白V染色測定法、DNA含量測定法、DNA降解測定法和核碎裂測定法。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于表征一種或多種細胞的方法。該方法包括 (a)使一種或多種細胞與選自多柔比星、紫杉醇、放線菌素D、喜樹堿和星形孢菌素的化合 物接觸，(b)檢測通過化合物的一種或多種細胞的生長和/或存活抑制水平，和(c)使(b) 的結(jié)果和對照水平比較，其中如果通過化合物的一種或多種細胞的生長和/或存活抑制水 平在統(tǒng)計上明顯小于對照水平，那么一種或多種細胞具有癌癥干細胞特征。在某些實施方案中，該方法進一步包括評估一種或多種細胞中的癌癥干細胞生物 標記。在特定實施方案中，癌癥干細胞生物標記選自E-鈣粘蛋白表達、TWIST表達和⑶44/ CD24 cell細胞表面標記譜。在某些實施方案中，功能測定法是集落形成測定法或體內(nèi)腫瘤 種植測定法。在某些實施方案中，對照水平是通過化合物的一種或多種癌細胞的生長和/或存 活抑制水平，所述一種或多種癌細胞不是癌癥干細胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于治療具有癌癥或懷疑具有癌癥的受試者的 方法。該方法包括給受試者施用與有效量的藥物組合物組合的有效量的紫杉醇，所述藥物 組合物包括依托泊苷、沙利霉素、阿巴克丁或尼日利亞菌素。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于治療具有癌癥或懷疑具有癌癥的受試者的 方法。該方法包括給受試者施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括依托泊苷、沙利 霉素、阿巴克丁、尼日利亞菌素、或前述任何的衍生物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于選擇關(guān)于具有癌癥的受試者治療的方法。 該方法包括評估癌癥中的癌癥干細胞生物標記，并且如果檢測出癌癥干細胞生物標記，那 么通過給受試者施用有效量的藥物組合物來治療受試者，所述藥物組合物包括沙利霉素、 阿巴克丁、依托泊苷或尼日利亞菌素或其衍生物，任選地與紫杉醇或其衍生物組合。在某些實施方案中，評估癌癥干細胞生物標記包括獲得來自受試者的癌癥樣品。在某些實施方案中，癌癥干細胞生物標記選自E-鈣粘蛋白表達；TWIST表達和 ⑶44/tDM cell細胞表面標記譜。在特定實施方案中，癌癥中的E-鈣粘蛋白和/或TWIST 表達這樣進行測定通過測量癌癥中的E-鈣粘蛋白和/或TWIST蛋白質(zhì)和/或RNA表達 水平，和任選地使該水平與參考標準比較。在某些實施方案中，參考標準是癌癥干細胞中的 E-鈣粘蛋白和/或TWIST蛋白質(zhì)和/或RNA表達水平。在其他實施方案中，參考標準是癌 細胞中的E-鈣粘蛋白和/或TWIST蛋白質(zhì)和/或RNA表達水平，所述癌細胞不是癌癥干細 胞。在某些實施方案中，癌癥是結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞 癌、宮頸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、 乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管原癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膽管癌、絨毛膜 癌、精原細胞癌、胚胎性癌、腎母細胞瘤或睪丸瘤。在特定實施方案中，癌癥是乳腺癌或肺癌。在某些實施方案中，受試者是哺乳動物，其任選地是人。在某些實施方案中，藥物組合物靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、經(jīng)口或作為氣溶膠施用。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于治療具有癌癥或懷疑具有癌癥的受試者的 方法。該方法包括給受試者施用有效量的包括化合物的藥物組合物，相對于未經(jīng)歷EMT的對照細胞的生長和/或增殖抑制，所述化合物選擇性抑制已經(jīng)歷EMT的測試細胞生長和/
或增殖。在某些實施方案中，測試和對照細胞是遺傳上匹配的。在某些實施方案中，測試細胞是非致瘤性的。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于治療具有癌癥或懷疑具有癌癥的受試者的 方法。該方法包括給受試者施用有效量的化合物，相對于其對非CSC癌細胞的作用，所述化 合物選擇性抑制癌癥干細胞增殖或殺死癌癥干細胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于治療具有癌癥或懷疑具有癌癥的受試者的 方法。該方法包括給受試者施用有效量的化合物，相對于其對非癌性細胞的作用，所述化合 物選擇性抑制癌癥干細胞增殖或殺死癌癥干細胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了鑒定用于藥物開發(fā)的靶的方法。該方法包括步 驟提供選擇性抑制測試細胞生長和/或增殖的化合物，其中所述測試細胞是已經(jīng)歷EMT的 細胞；并且鑒定化合物的生物靶。在某些實施方案中，生物靶是由測試細胞表達的蛋白質(zhì)或RNA。在某些實施方案中，化合物是表1中列出的化合物或其衍生物。在某些實施方案中，該方法進一步包括執(zhí)行篩選，以鑒定與生物靶相互作用或作 用于生物靶的第二種化合物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了鑒定用于藥物開發(fā)的靶的方法。該方法包括步 驟使測試細胞或測試細胞裂解物與選擇性抑制測試細胞生長和/或增殖的化合物接觸， 其中所述接觸在其中化合物可以與細胞生物分子在物理上相互作用的條件下執(zhí)行，并且其 中測試細胞是已經(jīng)歷EMT的細胞；分離與化合物在物理上相互作用的細胞生物分子；和鑒 定生物分子。在某些實施方案中，該方法進一步包括執(zhí)行篩選，以鑒定與生物分子相互作用或 作用于生物分子的第二種化合物。在某些實施方案中，化合物是表1中列出的化合物或其衍生物。在某些實施方案中，使化合物與載體附著，由此形成親和基質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了產(chǎn)生癌癥干細胞的方法。該方法包括誘導(dǎo)癌細 胞經(jīng)歷EMT。在某些實施方案中，癌細胞是實驗上產(chǎn)生的癌細胞。在某些實施方案中，實驗上產(chǎn) 生的癌細胞包括編碼癌基因的表達載體。在特定實施方案中，癌基因是V12H-RAS。在某些實施方案中，癌細胞衍生自天然存在的癌癥。在某些實施方案中，上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變起因于抑制癌細胞中的E-鈣粘蛋白活性。在 特定實施方案中，抑制癌細胞中的E-鈣粘蛋白活性包括使癌細胞與針對E-鈣粘蛋白的封 閉抗體接觸，誘導(dǎo)癌細胞中的抗粘附蛋白表達，或干擾癌細胞中的細胞極性基因。在特定其 他實施方案中，抑制癌細胞中的E-鈣粘蛋白活性包括使癌細胞與和E-鈣粘蛋白mRNA互補 的小干擾核酸接觸。在某些實施方案中，通過在一種或多種測試細胞中表達轉(zhuǎn)錄因子來誘導(dǎo)癌細胞經(jīng) 歷 EMT，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自Snaill、Snail2、Goosecoid、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-I/ Zeb-2, dEFl/ZEbl、LEFl、Myc、HMGA2、TAZ, Klf8、HIF-1、H0XB7、SIM2s 和 Fos。在特定實施方案中，通過組成性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子活性來誘導(dǎo)癌細胞經(jīng)歷EMT。在某些實施方案中，相對于未誘導(dǎo)經(jīng)歷EMT的癌細胞具有的可能性，癌癥干細胞 具有增加的下述可能性⑴起始腫瘤；(ii)在軟瓊脂懸浮培養(yǎng)中形成集落；和/或(iii) 形成腫瘤球。在某些實施方案中，該方法進一步包括評估測試試劑抑制癌癥干細胞增殖、在軟 瓊脂懸浮培養(yǎng)中的集落形成、腫瘤球形成、和/或腫瘤起始能力的能力。在特定實施方案 中，如果抑制癌癥干細胞的增殖、在軟瓊脂懸浮培養(yǎng)中的集落形成、腫瘤球形成、和/或腫 瘤起始能力，那么測試試劑被鑒定為用于癌癥治療的候選試劑。在某些實施方案中，該方法進一步包括將具有癌癥干細胞性質(zhì)的癌細胞引入動物 宿主內(nèi)。在特定實施方案中，該方法進一步包括評估測試試劑抑制動物宿主中的癌癥干細 胞增殖或腫瘤起始能力的能力。在特定實施方案，如果抑制癌癥干細胞的增殖或腫瘤起始 能力，那么測試試劑被鑒定為用于癌癥治療的候選試劑。根據(jù)本發(fā)明的某些方面，提供了通過前述方法中的任何產(chǎn)生的癌癥干細胞。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了包括前述癌癥干細胞的動物宿主。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了包括具有癌細胞的容器的試劑盒，所述癌細胞已 使用本文公開的方法中的任何一種誘導(dǎo)經(jīng)歷EMT，以產(chǎn)生癌癥干細胞。在某些實施方案中， 試劑盒進一步包括具有癌細胞的第二個容器，所述癌細胞未誘導(dǎo)經(jīng)歷EMT，并且與已誘導(dǎo)經(jīng) 歷EMT以產(chǎn)生癌癥干細胞的癌細胞在遺傳上匹配。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了包括具有非癌細胞的容器的試劑盒，所述癌細胞 已使用本文公開的方法中的任何一種誘導(dǎo)經(jīng)歷EMT，以產(chǎn)生非癌癥干細胞。在某些實施方案 中，試劑盒進一步包括具有非癌細胞的第二個容器，所述非癌細胞未誘導(dǎo)經(jīng)歷EMT，并且與 已誘導(dǎo)經(jīng)歷EMT以產(chǎn)生非癌癥干細胞的非癌細胞在遺傳上匹配。在特定實施方案中，與試劑盒一起提供的一個或多個容器進一步包括冷凍保護 劑。應(yīng)當理解試劑盒并不限于任何一種具體冷凍保護劑，并且技術(shù)人員將能夠選擇合適 的冷凍保護劑(例如，DMS0)。用于細胞的低溫保存的示例性方法和試劑公開于Freshney R. I. , Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique,第 4 版，第 19 章， ffiley-Liss, Inc. (2000)中。附圖簡述

圖1描述了 E-鈣粘蛋白抑制和EMT誘導(dǎo)對轉(zhuǎn)移、原發(fā)性腫瘤發(fā)生率、乳腺球形成 能力和抗原標記表達的作用。圖IA描述了在永生化的HMLE和經(jīng)轉(zhuǎn)化的HMLER細胞中的 E-鈣粘蛋白和間質(zhì)蛋白質(zhì)N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達水平。β-肌動蛋白用作裝載對照。 底圖顯示細胞角蛋白8在shCntrl和shEcad HMLER細胞中的表達。圖IB描述了(左側(cè)) 荷有HMLER-shCntrl禾口 shEcad細胞的正位原發(fā)性月中瘤(orthotopic primary tumor)或這 些系的尾靜脈注射后8周的小鼠中的肺轉(zhuǎn)移總負荷的定量。每個條代表分析的5只小鼠/ 組的平均值士 s. d. (*p < 0. 001)。右側(cè)荷有HMLER-shCntrl和shEcad細胞的正位原發(fā)性 腫瘤的小鼠肺葉的代表性熒光圖像。GFP信號指示腫瘤細胞的存在。還顯示的是來自相同 肺組的切片用抗大T抗體的代表性免疫組織化學(xué)染色。褐色核染色指示腫瘤細胞。N，肺組 織；M，轉(zhuǎn)移小結(jié)(右圖)。圖IC描述了通過HMLER-shCntrl和HMLER-shEcad細胞形成的 原發(fā)性皮下腫瘤的生長模式。每個數(shù)據(jù)點代表8個原發(fā)性腫瘤的平均值(標準差士 s. d.)。圖ID描述了在溫育10周后用HMLER-shCtnrl或HMLER-shEcad細胞以所示數(shù)目的注射細 胞接種的NOD/Scid小鼠中的皮下腫瘤發(fā)生率。應(yīng)當指出盡管HMLER-shCntrl細胞在較低 稀釋度下無法起始腫瘤，但HMLER-shEcad保留這樣的能力。(E) HMLE和HMLER衍生細胞系 就⑶M和⑶44表達而言的流式細胞術(shù)分析。紅圈指示⑶24TD44+CSC樣部分。應(yīng)當指出 表達shE-Cad的永生化(HMLE)和經(jīng)轉(zhuǎn)化的(HMLER)細胞包含明顯更大數(shù)目顯示CSC抗原 譜的細胞圖2描述了通過EMT的傳代導(dǎo)致對常規(guī)化學(xué)治療藥物的抗性。圖2A描述了用紫 杉醇和多柔比星處理的經(jīng)轉(zhuǎn)化的HMLERshCntrl (淺灰色線)和HMLERshEcad(深灰色線) 細胞的劑量應(yīng)答曲線。虛線指示50%部分存活。應(yīng)當指出對于2種藥物和任何給定濃度， 與HMLERshCntrl細胞比較，HMLERshEcad細胞更有抗性。圖2B描述了永生化細胞對化學(xué) 治療藥物的應(yīng)答。HMLEshCntrl和HMLEshEcad細胞用所示藥物在3個濃度下處理3天，并 且使用MTS測定法就生存進行測定。盡管多柔比星、放射菌素D、紫杉醇和喜樹堿是化學(xué)治 療藥物，但星形孢菌素是有效誘導(dǎo)凋亡的一般激酶抑制劑。圖2C描述了紫杉醇處理導(dǎo)致已 經(jīng)歷EMT的較小細胞群體的選擇性擴展。對照HMLE細胞和表達GFP的HMLEshEcad細胞以 20 1的比混合，并且一式三份地種植到6孔平板上。在種植后1天，將在2. 5nm或IOnm 濃度下的DMSO或紫杉醇加入混合細胞群體上，隨后為3天溫育。在處理結(jié)束時通過流式細 胞術(shù)分析GFP陽性細胞的數(shù)目。在右側(cè)上的曲線圖顯示GFP陽性的定量。應(yīng)當指出在IOmM 紫杉醇處理后，GFP陽性從5%增加到14%。圖3描述了高流通量篩選，以鑒定具有癌癥干細胞特異性毒性的化合物，并且提 供(A)描述篩選設(shè)計的示意圖；(B)命中位置未顯示任何顯著位置偏差的證據(jù)，和(C)來自 起始篩選的ζ得分分布。圖4A描述了用在起始篩選過程中鑒定的8種化合物處理的HMLEshCntrl (A，淺 灰色曲線)和HMLEshEcacKA，深灰色曲線)細胞的劑量應(yīng)答曲線。將每種系的1000個 細胞種植到384孔平板上，并且用在2. 5對數(shù)范圍內(nèi)的8個不同化合物濃度處理。通過 Cell-Titer-Glo測量在3天處理后的細胞生存。應(yīng)當指出盡管頂端4種化合物(從左到右 沙利霉素、阿巴克丁、依托泊苷和尼日利亞菌素)顯示針對HMLEshEcad細胞的選擇毒性，但 底部4種化合物(從左到右克霉唑、吖啶、間苯二酚和西吡氯銨，CPC)未顯示此類行為。 圖4B描述了用與(A)中相同的化合物處理的HMLEshCntrl (具有正方形數(shù)據(jù)點的曲線)和 HMLE-Twist (具有三角形數(shù)據(jù)點的曲線)細胞的劑量應(yīng)答曲線。應(yīng)當指出即使使用不同EMT 誘導(dǎo)方法，沙利霉素、阿巴克丁、依托泊苷和尼日利亞菌素(頂部，從左到右)的選擇性也被 保留。(底圖從左到右克霉唑、吖啶、間苯二酚和西吡氯銨，CPC)圖4C描述了使表達GFP 的對照HMLE細胞和未經(jīng)標記的HMLE-twist細胞混合且鋪平板到ΙΟ-cm皿上。在種植后1 天，加入以所示濃度的DMS0、沙利霉素(1.25或5μΜ)或阿巴克丁(0. 25或1. 25 μ Μ)。因 為GFP載體包含殺稻瘟菌素抗性基因，所以使用殺稻瘟菌素處理作為用于表達GFP的對照 HMLE細胞擴展的陽性對照。在3天溫育后，通過流式細胞術(shù)分析細胞的混合群體，并且測定 GFP陽性細胞百分率。應(yīng)當指出沙利霉素和阿巴克丁處理都導(dǎo)致針對GFP陰性HMLE-twist 細胞的選擇和GFP陽性對照細胞的相對擴展。圖4D描述了用沙利霉素和阿巴克丁處理的經(jīng) 轉(zhuǎn)化的HMLERshCntrl (淺灰色線)和HMLERshEcad (深灰色線)細胞的劑量應(yīng)答曲線。虛 線指示50%部分存活。應(yīng)當指出即使當細胞進行轉(zhuǎn)化時，沙利霉素針對經(jīng)歷EMT的細胞的選擇毒性也保留。圖5A描述了就CD44和CD24的細胞表面表達而言，Suml59, MDA-MB-231和T47D 細胞系的流式細胞術(shù)分析。應(yīng)當指出盡管Suml59和MDA-MB-231系中的大多數(shù)細胞包含 大量CSCs，但T47D細胞具有非常少的此類細胞。圖5B描述了用沙利霉素處理的Suml59、 MDA-MB-231和T47D細胞的劑量應(yīng)答曲線。圖5C描述了響應(yīng)用沙利霉素處理在Suml59細 胞系內(nèi)CSC群體(淺灰色條)中的減少，和在非CSC群體(深灰色條)中的伴隨增加。圖6描述了沙利霉素對HMLER細胞系中的CSC群體的作用。㈧HMLER細胞用媒介 物對照(dmso)、沙利霉素或紫杉醇以所示濃度處理15天。在處理結(jié)束時執(zhí)行FACS分析，以 測量⑶44+/⑶M-CSC群體(右圖)。應(yīng)當指出沙利霉素使⑶44+/⑶群體從基礎(chǔ)的4. 9% 降低到0.2%。還對經(jīng)處理的培養(yǎng)物實施乳腺球形成測定法(左圖)。乳腺球數(shù)目/由每 種培養(yǎng)物形成的1000個細胞在測定孔的代表性照片下指出。(B)在用媒介物對照(dmso)、 沙利霉素或紫杉醇以(A)中所示濃度處理15天后，HMLER培養(yǎng)物的生長速率。圖7描述了原發(fā)性小鼠乳房干細胞、正常人乳腺干細胞樣細胞和贅生性人乳腺干 細胞樣細胞表達與EMT相關(guān)的標記。(A)使用FACS從人乳房縮小成形術(shù)組織中分離⑶44高 /CD24低細胞(R4)和CD44低/CD24高細胞(R3)。(B)相對于CD44低/CD24高細胞(R3)， 在⑶44高/⑶對低細胞(R4)中編碼E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、SIP-I和F0XC2的mRNAs 表達水平，如通過實時RT-PCR測定的。GAPDH mRNA用于標準化模板裝載中的變異性。數(shù)據(jù) 報告為平均值+/-SEM。(C)熱度圖(本文也稱“熱圖”)描述了與CD44低/CDM高細胞比 較，在CD44高/CDM低細胞中編碼EMT標記的mRNAs表達水平，如通過SAGE分析測定的。 深灰色和淺灰色正方形分別與高和低mRNA水平相應(yīng)。圖8描述了 EMT誘導(dǎo)與癌癥干細胞相關(guān)的表型。㈧用它莫西芬處理10天時間段 的NeuNT-Snail-ER、NeuNT-Twist-ER和NeuNT對照載體細胞的相位差圖像以及未經(jīng)處理的 細胞的圖像。(B)在小圖A中所示的細胞中HER2/neU、E-鈣粘蛋白、纖連蛋白和波形蛋白蛋 白質(zhì)表達的蛋白質(zhì)印跡分析。肌動蛋白用作上樣或加載對照。(C)通過用它莫西芬處 理或未處理10天的NeuNT-Snai 1-ER、NeuNT-Twist-ER或NeuNT對照載體細胞種植的乳腺 球的定量。數(shù)據(jù)報告為平均值+/-SD。(D)在用它莫西芬處理10天后，在NeuNT-Snail-ER、 NeuNT-Twist-ER和NeuNT載體細胞的軟瓊脂培養(yǎng)過程中形成的集落圖像。軟瓊脂測定法在 不存在它莫西芬的情況下執(zhí)行。(E)小圖D中所示的軟瓊脂集落(或稱“克隆”)的定量。 數(shù)據(jù)報告為平均值+/-SD(**-P < 0. 01 ；_-P < 0. 001，與對照比較)。圖9描述了通過Snail-ER或Twist-ER它莫西芬誘導(dǎo)性載體誘導(dǎo)EMT產(chǎn)生具有干 細胞性質(zhì)的細胞(A)用它莫西芬處理12天的Snail-ER、Twist-ER或?qū)φ蛰d體細胞的相位 差圖像。(B)編碼與EMT相關(guān)蛋白質(zhì)的mRNAs的表達水平，如在通過Snail-ER的異位表達 誘導(dǎo)經(jīng)歷EMT的HMLE細胞中觀察到的(它莫西芬誘導(dǎo)的)。表達水平相對于12天它莫西 芬處理的第0天報告。GAPDH mRNA用于標準化模板裝載中的變異性。數(shù)據(jù)報告為平均值 +/-SEM。圖10描述了在它莫西芬G-OHT)處理(中間箭頭)10天后經(jīng)歷EMT或未經(jīng)處理 (頂端箭頭)的HMLEN-Snail-ER或HMLEN-Twist-ER細胞的相位差圖像。在這種4-0HT處 理后，撤出4-0HT，并且在15天后觀察細胞。未受感染的細胞或用所示病毒載體感染的細胞 顯示于柱中。
圖11描述了使用SnailJwist或?qū)φ蛰d體在HMLER細胞中的EMT誘導(dǎo)(A)。使用 針對E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、纖連蛋白和波形蛋白的抗體，通過Snail或Twist的異位表 達誘導(dǎo)經(jīng)歷EMT的HMLER細胞的免疫染色。顯示對照細胞的免疫染色用于比較(B)。相對 于對照載體感染的細胞，通過Snail或Twist的異位表達誘導(dǎo)經(jīng)歷EMT的HMLERs中與EMT 相關(guān)的mRNAs表達，如通過實時RT-PCR測定的。GAPDHmRNA用于標準化模板裝載中的變異 性。數(shù)據(jù)報告為平均值+/-SEM。(C)通過Snail、Twist或?qū)φ蛰d體的異位表達誘導(dǎo)經(jīng)歷 EMT的HMLER細胞中的⑶44高/⑶對低細胞百分率。(D)乳腺球數(shù)目/1000個表達Snail、 Twist或?qū)φ蛰d體的HMLER細胞。數(shù)據(jù)報告為平均值+/-SEM。圖12描述了衍生自表達Snail、Twist或?qū)φ蛰d體的HMLER細胞的腫瘤的H&E染 色。衍生自表達㈧載體、(B)Snail、(C)Twist的HMLER細胞的腫瘤的光學(xué)顯微鏡圖像 (IOX)。圖13A描述了用DMS0、紫杉醇或沙利霉素以指定劑量處理4天的HMLER細胞。顯 示了在化合物處理后的⑶細胞百分比，并且通過熒光激活細胞分選進行定量。 條形圖描述了用2種不同HMLER細胞群體(HMLER_1、HMLER_2)的2次獨立實驗的結(jié)果。圖 13B描述了用所示化學(xué)化合物處理的HMLER_2癌細胞群體的熒光激活細胞分選譜(CD44與 ⑶對比較)。左上方的橢圓形(----)指示富含CSC部分，并且左下方橢圓形(----)指示 CSC耗盡部分。圖14A描述了用DMS0、紫杉醇(泰素)或沙利霉素以指定劑量處理的親本HMLER 細胞的乳腺球形成潛力。圖14B描述了用DMS0、紫杉醇或沙利霉素處理的MCF7Ras或4T1 細胞。下文顯示了乳腺球形成潛力。圖15A描述了在用沙利霉素、紫杉醇或媒介物處理的小鼠中，通過SUM159乳腺癌 細胞的體內(nèi)腫瘤形成。沙利霉素處理導(dǎo)致腫瘤生長的抑制。圖15B描述了從來自沙利霉素、 紫杉醇或DMSO處理小鼠的SUM159腫瘤獲得的癌細胞的乳腺球形成潛力。圖16描述了沙利霉素處理減少臨床相關(guān)乳腺CSC和祖先基因的表達?；蚣?集分析用于測定與紫杉醇處理比較，先前報告的與干細胞樣細胞相關(guān)的3個基因集是否響 應(yīng)于沙利霉素而被阻遏。曲線圖是Kolmogorov-Smirnov富集得分與基于差異表達的基因 排序比較。顯示了反映關(guān)于每個分析的統(tǒng)計顯著性的P值。詳述腫瘤發(fā)生或致瘤性涉及許多遺傳和后生改變，其引起細胞增殖、分化、生長和存活 中的缺陷。這些細胞缺陷產(chǎn)生可以是良性或惡性的腫瘤。雖然良性腫瘤通常在原發(fā)性腫瘤 中保留局限性，所述原發(fā)性腫瘤在原始部位處保留局限性，并且就腫瘤生長而言通常是自 限性的，但惡性腫瘤具有持續(xù)生長的趨勢和播散或轉(zhuǎn)移至遙遠位置的能力。惡性腫瘤通過 一系列逐步的進行性改變發(fā)展，所述改變導(dǎo)致不受控制的細胞增殖和侵入周圍組織且轉(zhuǎn)移 至不同器官部位的能力。近期發(fā)現(xiàn)已證實腫瘤形成和生長通過腫瘤內(nèi)的較小癌細胞亞群-癌癥干細胞驅(qū) 云力(Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF. , Proc Natl Acad Sci U S A 2003 ； 100 (7) :3983-8) (Li C, Heidt DG, Dalerba P，等人，Cancer Res 2007 ；67 (3) :1030-7) (0' Brien CA, Pollett A, Gallinger S, Dick JE.，Nature 2007 ； 445(7123) :106-10)(Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E,等人，Nature 2007 ；445(7123) :111-5) (Singh SK, Hawkins C, Clarke ID,等人，Nature 2004 ；432 (7015) 396-401)。癌癥干細胞(CSCs)在功能上定義為在腫瘤團塊內(nèi)具有種植且產(chǎn)生繼發(fā)性腫瘤 的能力的那些細胞。在某些方面，已在操作上通過其在動物模型中在有限稀釋下種植腫瘤 的能力定義CSCs。在這個功能范疇中牽涉的是癌癥干細胞是在腫瘤內(nèi)負責癌癥死亡率-轉(zhuǎn) 移播散主因的細胞的觀念。這個概念對于潛在癌癥治療的開發(fā)和臨床前評估具有重大牽 涉。本發(fā)明描述了使得能夠開發(fā)靶向癌癥干細胞的新型治療的新方法。在本文描述的本發(fā) 明方法之前，癌癥干細胞靶向療法的開發(fā)以高流通量篩選設(shè)置是不可能的。經(jīng)由使所述方 法付諸實踐，通過開發(fā)特異性靶向癌癥干細胞的新型化合物，我們建立了用于本發(fā)明的原 理驗證。因此，本發(fā)明首次使得能夠使用高流通量篩選方法鑒定靶向癌癥干細胞的治療。上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變正常和腫瘤細胞在體外和體內(nèi)以各種分化狀態(tài)存在。這些分化狀態(tài)通過至少部分 起于其中細胞駐留的組織微環(huán)境的復(fù)雜信號整合進行調(diào)節(jié)。通過許多遺傳干擾可以誘導(dǎo)細 胞(例如，癌細胞)經(jīng)歷上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)，例如經(jīng)由特定因子(例如，Twist、Snail、 TGF-β或MMPs)的過表達，或通過粘附連接蛋白質(zhì)例如E-鈣粘蛋白的抑制。不管使用的誘 導(dǎo)方法，已誘導(dǎo)成EMT的細胞表達相似表型性狀和蛋白質(zhì)標記(例如，生物標記)，指出EMT 是核心分化程序。本發(fā)明涉及已誘導(dǎo)成EMT的細胞共享癌癥干細胞的許多性質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，所 述性質(zhì)包括與癌癥干細胞相關(guān)的細胞表面標記的表達，在懸浮培養(yǎng)中生長，在體內(nèi)在低細 胞數(shù)目下的腫瘤形成，和對特定標準化學(xué)治療藥物的抗性。因此，由已經(jīng)歷上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變 (也稱為間質(zhì)轉(zhuǎn)分化或上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)分化)的細胞顯示的分化狀態(tài)可以用于鑒定特異性靶 向癌癥干細胞的治療。在某些實施方案中，提供了誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(例如，產(chǎn)生測試細 胞)的方法。如本文使用的，“上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變”(EMT)指上皮細胞至具有一種或多種間質(zhì)特征 的細胞的轉(zhuǎn)化或部分轉(zhuǎn)化，所述一種或多種間質(zhì)特征的細胞也具有癌癥或非癌癥干細胞的 一種或多種性質(zhì)。一種或多種癌癥或非癌癥干細胞性質(zhì)可以包括一種或多種蛋白質(zhì)(例 如，細胞表面標記)的存在或不存在(高表達水平或低表達水平)，和/或一種或多種(至少 2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種)功能性質(zhì)中的增加，所述功能性質(zhì)包括在懸 浮培養(yǎng)中生長(增殖)的能力，在體內(nèi)在低細胞種植數(shù)目下形成腫瘤的能力，對特定化學(xué)治 療的抗性(例如，對紫杉醇的抗性)，轉(zhuǎn)移能力，遷移能力，對凋亡或失巢凋亡(anoikis)的 抗性，擴散和細胞形狀的延長。應(yīng)當理解通過執(zhí)行與對照細胞的比較，可以評估已經(jīng)歷EMT 的細胞顯示一種或多種蛋白質(zhì)表達的增加或降低，或癌癥干細胞的一種或多種功能性質(zhì)中 的增加的程度，所述對照細胞例如是未經(jīng)歷EMT的細胞(陰性對照細胞)，或已經(jīng)歷EMT的 細胞(陽性對照細胞)，例如癌癥干細胞。與未經(jīng)歷EMT的細胞比較，已經(jīng)歷EMT的細胞中關(guān)于其的表達增加指示EMT的蛋 白質(zhì)例子包括N-鈣粘蛋白、波形蛋白、纖連蛋白、Snaill (Snail)、Snail2 (Slug)、Twist、 Goosecoid、FOXC2、SoxlO、MMP-2、MMP-3、MMP-9、整聯(lián)蛋白 νβ 6、CD44 和 ESA。與未經(jīng)歷 EMT 的細胞比較，已經(jīng)歷EMT的細胞中關(guān)于其的表達減少指示EMT的蛋白質(zhì)例子包括E-鈣粘蛋 白、橋粒斑蛋白、細胞角蛋白、閉鎖蛋白和CDM。上皮細胞已經(jīng)歷EMT的程度可以通過測定 至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9 種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種、至少20種或更多種蛋白質(zhì)的表達進行評估。此類蛋白質(zhì)的表 達可以使用各種測定方法進行測定，包括本文公開的那些和本領(lǐng)域已知的其他。應(yīng)當理解 其表達水平指示細胞中的EMT的某些蛋白質(zhì)也是可以引起EMT發(fā)生的蛋白質(zhì)。例如，在上 皮細胞中Twist的過表達引起細胞經(jīng)歷EMT。類似地，在上皮細胞中E-鈣粘蛋白表達中的 減少引起細胞經(jīng)歷EMT。因此，當通過增加(例如，通過cDNA介導(dǎo)的過表達)蛋白質(zhì)例如 Twist表達或降低(例如，通過RNAi介導(dǎo)的抑制)蛋白質(zhì)例如E-鈣粘蛋白表達來達到EMT 時，其他蛋白質(zhì)(例如，CD44、橋粒斑蛋白)表達中的改變可以充當EMT的合適指示劑。應(yīng)當理解癌癥或非癌癥干細胞的功能性質(zhì)可以使用本領(lǐng)域已知的各種方法進行 評估。懸浮培養(yǎng)中的生長例如可以這樣進行評估通過在旋轉(zhuǎn)燒瓶中培育已經(jīng)歷EMT的細 胞，并且測量旋轉(zhuǎn)燒瓶中隨著時間過去細胞數(shù)目中的改變。細胞數(shù)目中的這種改變可以與 對照細胞的細胞數(shù)目中的改變比較，所述對照細胞未經(jīng)歷EMT并且已在相同或相似條件下 生長。與在相同或相似條件下生長但未經(jīng)歷EMT的對照細胞比較，在懸浮培養(yǎng)中生長已經(jīng) 歷 EMT 的細胞倍增時間中高達 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%UOO% 或更多增加，可能指示在懸浮中生長的能力增加。已經(jīng)歷EMT的細胞在體內(nèi)在低細胞種植數(shù)目下形成腫瘤的能力可以通過與對照 細胞比較進行評估，所述對照細胞未經(jīng)歷EMT。在體內(nèi)在低細胞種植數(shù)目下形成腫瘤的能 力依賴于各種因素，所述因素對于技術(shù)人員將是顯而易見的，包括例如其中注射細胞的動 物類型(例如小鼠)、其中種植(例如，注射)細胞的位置、和動物發(fā)動針對細胞的免疫應(yīng) 答的能力。如本文使用的，“低細胞種植數(shù)目”意指高達10°、高達101、高達102、高達103、 高達104、高達105、高達IO6或更多細胞的種植。在細胞種植后(例如，一個或多個位置或 在一個或多個動物中)在體內(nèi)形成的腫瘤數(shù)目是通過其可以進行與對照的這種比較的示 例性參數(shù)。在細胞種植后在體內(nèi)形成的腫瘤大小(例如，體積)是通過其可以進行與對照 的這種比較的另一種示例性參數(shù)。例如，腫瘤發(fā)生率或大小中高達lO^dO^dO^dO^、 50%,60%,70%,80%,90%,100%或更多增加，可以指示在體內(nèi)在低細胞種植數(shù)目下形成 腫瘤的能力。用于評估癌癥或非癌癥干細胞的功能性質(zhì)的其他方法在本文中和其他地方公 開，并且對于技術(shù)人員將是顯而易見。(參見例如，SM Frisch和H Francis, Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis, J Cell Biol. 1994 年 2 月；124(4) :619-26 ；Mushinski JF,等人，Inhibition of tumor cell motility by the interferon-inducible GTPase MxA. J Biol Chem. 2009 年 3 月 18 日；Liu YN,等 人，Activated androgen receptor downregulates E-cadherin gene expression and promotes tumor metastasis. Mol Cell Biol. 2008年 12月；28^3) :7096-108 ；Carpenter PM,等人，Motility Induction in Breast Carcinoma by Mammary Epithelial Laminin 332(Laminin 5)，Mol Cancer Res. 2009 年 4 月 7 日；Nakamura Μ,等人，Polarized hydroxyapatitepromotes spread and motility of osteoblastic cells. J Biomed Mater Res A. 2009^3, 9 H ；Gu W, ^A,Measuring cell motility using quantum dot probes. Methods Mol Biol. 2007 ;374 :125-31 ；禾口 Sakai K，等人，Inducible expression of p57KIP2 inhibits glioma cell motility and invasion. J Neurooncol. 2004年7月； 68(3) :217-23.)
本發(fā)明公開了用于誘導(dǎo)細胞中的EMT的方法。在特定實施方案中，通過抑制細胞 中的E-鈣粘蛋白表達或活性來達到上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變。通過使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知 的方法可以抑制E-鈣粘蛋白的表達或活性。用于抑制E-鈣粘蛋白表達或活性的示例性 方法包括使細胞和與E-鈣粘蛋白mRNA互補的小干擾核酸接觸，使細胞和針對E-鈣粘蛋 白的封閉抗體接觸，通過基于cDNA的抗粘附蛋白過表達而誘導(dǎo)抗粘附蛋白表達；和干擾細 胞中的細胞極性基因。例如，krilAle的耗盡破壞E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的細胞間粘附且誘導(dǎo) EMT (Qin Y，等人，J Cell Biol 2005 ；171 :1061-71)。因此，在某些實施方案中，Scribble 例如通過RNA干擾的抑制可以誘導(dǎo)EMT。此外，果蠅屬(Drosophila)中的遺傳篩選鑒定 出影響細胞極性的許多基因，其失活導(dǎo)致E-鈣粘蛋白表達的喪失(Pagliarini RA，等人， Science 2003 ；302 :1227-31)。用于干擾細胞極性基因以誘導(dǎo)EMT的其他示例性方法是本 領(lǐng)域已知的。在特定實施方案中，通過RNA干擾抑制E-鈣粘蛋白活性。通過RNA干擾用于抑制 基因表達例如E-鈣粘蛋白表達的方法是在本文中公開和本領(lǐng)域已知的。在某些實施方案 中，用與細胞中的E-鈣粘蛋白mRNA互補的小干擾核酸轉(zhuǎn)染細胞，以抑制細胞中的E-鈣粘 蛋白活性。示例性小干擾核酸在本文中公開且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。用于轉(zhuǎn)染小干擾 核酸(例如，siRNA)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且例子在本文中公開。在某些實施方 案中，細胞具有穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因，其表達與E-鈣粘蛋白mRNA互補的小干擾核酸(例如， shRNA, miRNA)，并且通過RNA干擾途徑引起E-鈣粘蛋白mRNA的下調(diào)。本領(lǐng)域已知的用于基因擊倒的各種策略可以用于抑制基因的表達，所述基因例 如E-鈣粘蛋白和對于誘導(dǎo)EMT有用的本文公開的其他基因。例如，可以使用利用RNA干 擾(RNAi)和/或微小RNA(miRNA)途徑的基因擊倒策略，包括小干擾RNA (siRNA)、小發(fā)夾 RNA(shRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、miRNAs、和本領(lǐng)域已知的其他基于核苷酸的分子。在一個實 施方案中，基于載體的RNAi方式(例如，shRNA或shRNA-mir表達構(gòu)建體)用于減少細胞 中的基因(例如，E-鈣粘蛋白)表達。廣泛范圍的基于RNAi的方式也可以用于抑制細胞中的基因表達，例如基于 siRNA的寡核苷酸和/或經(jīng)改變的基于siRNA的寡核苷酸。經(jīng)改變的基于siRNA的寡核 苷酸是進行修飾以改變效力、靶親和力、安全譜和/或穩(wěn)定性的那些，例如，以使得它們對 細胞內(nèi)降解有抗性或部分抗性。例如可以對寡核苷酸進行修飾例如硫代磷酸酯，以增加 對核酸酶降解的抗性，結(jié)合親和力和/或攝取。此外，疏水化和生物綴合增強siRNA遞 送和靶向(De Paula等人，RNA. 13(4) :431_56，2007)，并且具有核-二氟甲苯酰核苷酸 的 siRNAs 維持基因沉默活性(Xia 等人，ASC Chem. Biol. 1(3) =176-83, (2006)) 已產(chǎn) 生具有酰胺連接的寡聚核糖核苷的siRNAs，其對Sl核酸酶降解比未經(jīng)修飾的siRNAs更 有抗性(Iwase R 等人 2006 Nucleic Acids Symp Ser 50:175-176)。此外，siRNAs 在 2’ -糖位置上的修飾和磷酸二酯鍵賦予改善的血清穩(wěn)定性而不喪失功效(Choimg等人， Biochem. Biophys. Res. Commun. 342 (3) :919-26,2006) 可以用于抑制基因(例如，負面調(diào) 節(jié)EMT的基因，例如E-鈣粘蛋白)表達的其他分子包括有義和反義核酸(單或雙鏈)、核 酶、肽、DNA酶、肽核酸(PNAs)、三螺旋形成寡核苷酸、抗體和適體及其針對一種或多種基 因、RNA轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)中的序列的一種或多種修飾形式。通過減少基因產(chǎn)物的表達或通 過在突變位點處切割突變型轉(zhuǎn)錄物，反義和核酶抑制策略已導(dǎo)致腫瘤表型的逆轉(zhuǎn)(Carter禾口 Lemoine Br. J. Cancer. 67 (5) :869-76,1993 ；Lange 等人，Leukemia. 6 (11) :1786-94, 1993 ；Valera 等人，J. Biol. Chem. 269 (46) :28543-6,1994 ；Dosaka-Akita 等人，Am. J. Clin. Pathol. 102(5) :660-4,1994 ；Feng 等人，Cancer Res. 55(10) :2024-8,1995 ；Quattrone 等 人，Cancer Res. 55(1) :90-5,1995 ；Lewin 等人，Nat Med. 4(8) :967-71，1998)。核酶也已提 議作為抑制突變型基因的基因表達且通過靶向反式剪接校正突變型的手段(Sullenger和 Cech Nature 371(6498) :619_22，1994 ； Jones 等人，Nat. Med. 2 (6) :643-8,1996) 通過使 用例如非特異性核酸結(jié)合蛋白質(zhì)或促進寡核苷酸可以增強核酶活性(Herschlag等人，Embo J.13(12) :2913-24,1994 Jankowsky 禾口 Schwenzer Nucleic Acids Res. 24(3) :423-9, 1996)。多靶核酶(連接的或鳥槍)已提議作為改善核酶效率用于基因抑制的手段(Ohkawa 等人，Nucleic Acids Symp Ser. (29) 121-2，1993)。三螺旋方法也已研究用于序列特異性基因抑制。三螺旋形成寡核苷酸也已在某 些情況下發(fā)現(xiàn)以序列特異性方式結(jié)合(Postel等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 88(18) 8227-31，1991 ；Duval-Valentin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 (2) :504-8,1992 ； Hardenbol 和 Van Dyke Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93(7) :2811-6,1996 ；Porumb 等人， Cancer Res. 56(3) :515-22,1996)。類似地，肽核酸已顯示抑制基因表達(Hanvey等人， Antisense Res. Dev. 1(4) :307-17,1991 ；Knudsen ^P Nielson Nucleic Acids Res. 24(3) 494-500,1996 ；Taylor 等人，Arch. Surg. 132(11) :1177-83,1997) 小溝結(jié)合聚酰胺可以 以序列特異性方式與DNA靶結(jié)合，并且因此可以代表用于在DNA水平下抑制的有用小分 子(Trauger等人，Chem. Biol. 3 (5) =369-77,1996) 此外，抑制也已通過使用顯性失活 突變體肽和抗體在蛋白質(zhì)水平下干擾而獲得(Herskowitz Nature 329(6136) =219-22, 1987 ；Rimsky 等人，Nature 341 (6241) :453-6,1989 ；Wright 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86(9) :3199-203,1989)。在許多情況下，抑制策略已導(dǎo)致RNA水平中的減少而無蛋 白質(zhì)中的伴隨減少，而在其他中，RNA中的減少已通過蛋白質(zhì)中的減少反映。可以采用的抑制策略的不同排列包括DNA和/或RNA適體的使用，其可以選擇為 靶向目的蛋白質(zhì)(例如，E-鈣粘蛋白)。例如，在年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的情況下，抗 VEGF適體已產(chǎn)生且已顯示在某些AMD患者中提供臨床利益(Ulrich H，等人Comb. Chem. High Throughput Screen 9:619-632,2006)。在某些實施方案中，通過使細胞與一種或多種結(jié)合試劑(例如，針對E-鈣粘蛋白 的封閉抗體)接觸來抑制負面調(diào)節(jié)EMT的蛋白質(zhì)(例如，E-鈣粘蛋白)活性。因此，本發(fā)明 包含結(jié)合試劑，其例如可以是具有與蛋白質(zhì)例如E-鈣粘蛋白選擇性結(jié)合的能力的抗體或 抗體片段，且誘導(dǎo)EMT?？贵w包括多克隆和單克隆抗體，其可以根據(jù)常規(guī)方法進行制備。如 本文使用的，E-鈣粘蛋白封閉抗體是與E-鈣粘蛋白特異性結(jié)合且誘導(dǎo)EMT的抗體。明顯地，如本領(lǐng)域眾所周知的，僅抗體分子的小部分，互補位，涉及抗體與其表 ^ ya ( —Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern
Immunology Wiley & Sons,Inc., New York ；Roitt, I. (1991)Essential Immunology,第 7 版，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。pFc'和 Fc 區(qū)例如是補體級聯(lián)的效 應(yīng)物，但不涉及抗原結(jié)合。從其中酶促切割PFc'區(qū)，或不含pFc'區(qū)產(chǎn)生的抗體，命名為 F(ab' )2片段，保留完整抗體的2個抗原結(jié)合位點。類似地，從其中酶促切割!^c區(qū)，或不 含F(xiàn)c區(qū)產(chǎn)生的抗體，命名為Fab片段，保留完整抗體分子的抗原結(jié)合位點之一。進一步加工，F(xiàn)ab片段由共價結(jié)合的抗體輕鏈和命名為Fd的部分抗體重鏈組成。Fd片段是抗體特異 性的主要決定簇(單個Fd片段可以與高達10條不同輕鏈結(jié)合，而不改變抗體特異性)，并 且Fd片段在分離中保留表位結(jié)合能力。在抗體的抗原結(jié)合部分內(nèi)，如本領(lǐng)域眾所周知的，存在與抗原的表位直接相互 作用的互補決定區(qū)(⑶Rs)，和維持互補位的三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)架區(qū)(FRs)(—般參見，Clark, 1986 ；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重鏈Fd片段和輕鏈中，存在分別通過3個互補決 定區(qū)(⑶Rl到⑶R3)分開的4個構(gòu)架區(qū)(FRl到FR4)。⑶Rs且特別地⑶R3區(qū)且更特別地 重鏈CDR3，在很大程度上負責抗體特異性。本領(lǐng)域目前充分確定哺乳動物抗體的非CDR區(qū)可以由同種特異性或異種特異性 抗體的相似區(qū)域代替，同時保留原始抗體的表位特異性。這是在“人源化”抗體的開發(fā)和 使用最明確表明，在所述“人源化”抗體中使非人CDRs與人FR和/或Fc/pFc ‘區(qū)共價連 接，以產(chǎn)生功能抗體。參見例如，美國專利4，816，567,5, 225，539,5, 585，089,5, 693，762和 5，859，205。通過免疫接種對于人免疫球蛋白重和輕鏈基因座的大部分轉(zhuǎn)基因的小鼠，也可以 制備全人單克隆抗體。在這些小鼠的免疫接種后(例如，XenoMouse (Abgenix)、HuMAb小鼠 (Medarex/Gerfharm))，單克隆抗體可以根據(jù)標準雜交瘤方法進行制備。這些單克隆抗體將 具有人免疫球蛋白氨基酸序列，并且因此當施用于人時，將不引發(fā)人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。因此，如對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的，本發(fā)明還提供了 F(ab' )2, Fab, Fv和Fd片段；其中Fc和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)已由同源人 或非人序列代替的嵌合抗體；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)已由同 源人或非人序列代替的嵌合F (ab' ) 2片段抗體；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或 輕鏈CDR3區(qū)已由同源人或非人序列代替的嵌合Fab片段抗體；和其中FR和/或CDRl和/ 或CDR2區(qū)已由同源人或非人序列代替的嵌合Fd片段抗體。本發(fā)明還包括所謂的單鏈抗體。在某些實施方案中，通過使細胞與E-鈣粘蛋白的小分子或肽拮抗劑接觸來 抑制E-鈣粘蛋白。在某些實施方案中，使用包含細胞粘附識別(CAR)序列的環(huán)肽， HAV(His-Ala-Val)，任選連同在CAR序列任一側(cè)上的側(cè)翼序列。參見例如，美國專利
發(fā)明者E·S·蘭德爾, M-J·廖, P·古普塔, R·溫伯格, S·馬尼, T·T·昂德爾 申請人:懷特黑德生物制劑研究所, 麻省理工學(xué)院