專利名稱：抗血管發(fā)生組合物及其治療應(yīng)用的制作方法
抗血管發(fā)生組合物及其治療應(yīng)用本發(fā)明涉及人皰疹病毒6型(HHV_6)U94基因及其產(chǎn)物蛋白質(zhì)Rep在人類治療中 的用途。根據(jù)本發(fā)明，將蛋白質(zhì)R印或編碼R印的人皰疹病毒6型(HHV-6)U94基因遞送至 人血液(BEC)和淋巴(LEC)內(nèi)皮細(xì)胞，藉此抑制血管發(fā)生和淋巴管發(fā)生(lymphangiogenic) 的過程。本發(fā)明還提供適合用于遞送U94基因或從其編碼的蛋白質(zhì)至治療部位的表達(dá)載體 和藥物組合物。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生描述了從預(yù)先存在的微脈管系統(tǒng)(microvasculature)形成新的血管。 在生理條件下，血管發(fā)生是高度調(diào)節(jié)的現(xiàn)象，由許多促血管發(fā)生(proangiogenic)和抗血 管發(fā)生(antiangiogenic)因子的受緊密控制和平衡的合成介導(dǎo)(Hanahan和FoIkman， 1996, Cell 86:353-364)。在生理條件中，血管發(fā)生發(fā)生在胚胎發(fā)生過程中和出生后早期， 以及在成年人中在創(chuàng)傷愈合和女性生殖周期期間。在生理條件下，細(xì)胞處于距離血管(它 們的氧氣源)100-200 μ m內(nèi)。多細(xì)胞生物體生長時，為了補(bǔ)充新的血液供應(yīng)，細(xì)胞誘導(dǎo)血 管發(fā)生和脈管發(fā)生(vasculogenesis)。不受調(diào)節(jié)的血管發(fā)生見于病理病癥中，如慢性炎 性疾病銀屑病、嬰兒期血管瘤、消化性潰瘍、眼新血管形成、動脈粥樣硬化和癌(Mauriz和 Gonzalez-Gallego, 2008, J Pharm ki，先于印刷版的電子出版)。癌作為快速增殖和擴(kuò)大的異常細(xì)胞的小群而起始。此過程是血管發(fā)生依賴性的， 因為處于血管100 μ m之外的腫瘤細(xì)胞變得缺氧。在沒有足夠血液供應(yīng)的情況下，腫瘤不 能生長超過l_2mm大小。在腫瘤細(xì)胞獲得產(chǎn)生其自身或改變其環(huán)境以從頭產(chǎn)生血管發(fā)生 刺激物的能力前，其細(xì)胞可以保持休眠或甚至由于其他宿主因子而消失。腫瘤從休眠至活 性狀態(tài)的進(jìn)程依賴于包含轉(zhuǎn)換為血管發(fā)生表型的一系列事件(John等，2007，Br J Surg 95 =281-293)。這可以通過包含低氧、代謝性應(yīng)激、機(jī)械性應(yīng)激和免疫/炎癥反應(yīng)的多種信 號觸發(fā)。此轉(zhuǎn)換還可以通過抗血管發(fā)生因子的喪失引發(fā)。為了產(chǎn)生毛細(xì)管芽(capillary sprout)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、降解基膜并形成新管腔組織(new lumen organisation)的 結(jié)構(gòu)。為了刺激血管發(fā)生，腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞都分泌多種因子。迄今，已報道了超過12 種促血管發(fā)生分子，其中最有效力的是堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長 因子(VEGF)?？寡馨l(fā)生治療抑制血管出芽并發(fā)揮作用以阻斷血管發(fā)生轉(zhuǎn)換通過針對干擾腫瘤血管發(fā)生的治療來阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的想法最先由R)lkman 發(fā)表(Folkman 1971,N Engl J Med 285 :1182-1186)?？寡馨l(fā)生治療的理論優(yōu)勢是基于 以下觀察，避開藥物抗性亞群的選擇，內(nèi)皮細(xì)胞是同質(zhì)的、二倍體的、遺傳上穩(wěn)定的靶標(biāo)。這 與腫瘤細(xì)胞的高遺傳不穩(wěn)定性、異質(zhì)性和突變率相反。此外，由于單個血管網(wǎng)可以支持不同 腫瘤細(xì)胞群體生長的事實，血管生長的抑制可以影響許多腫瘤細(xì)胞的存活。目前，已描述 了不同的抗血管發(fā)生抑制劑干擾血管發(fā)生因子或其他受體、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制、金屬蛋 白酶(MMP)的抑制、內(nèi)皮細(xì)胞黏附的抑制和概述于Mauriz和Gonzalez-Gallego (J Pharm Sci, 2008)中的其他抑制劑。通過靶向VEGF信號發(fā)放抑制腫瘤血管發(fā)生是理性和具有潛在價值的治療策略，且它是目前抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移形成的最有前景的新策略之一。FDA 已于2004年和2006年批準(zhǔn)了首批藥物。如在Drevs和khneider(J Int Med 2006,260 517-529)中所概述，貝伐單抗(Bevacizumab, Avastin, Genentech)是抗-VEGF-As 的人 源化重組單克隆抗體，其與某些化療方案組合已在結(jié)腸直腸癌、肺癌和乳腺癌中顯示臨床 上相關(guān)的存活率改善。已用小分子如Sorafenib (Nexavar，Bayer)和Sunitinib (Sutent， Pfizer)顯示了抗腫瘤活性(當(dāng)加至結(jié)腸直腸癌、腎細(xì)胞癌、黑素瘤和胃腸基質(zhì)瘤(GIST)的 標(biāo)準(zhǔn)治療時)，二者均具有針對VEGF受體酪氨酸激酶的活性?？寡馨l(fā)生治療的問題目前的抗血管發(fā)生治療使用能夠特異性阻斷單個促血管發(fā)生分子活性的抑制劑。 隨著腫瘤的發(fā)展，促血管發(fā)生因子的數(shù)目趨于增加(Fidler，2001，J Natl Cancer Inst 93:1040-1041)。這可限制具有窄作用譜的單個藥劑的用途，并可導(dǎo)致抗藥性或耐藥性。實 際上，已描述了在幾乎所有患者中，腫瘤最終對抗血管發(fā)生治療產(chǎn)生抗藥性，但尚未闡明潛 在的抗藥性機(jī)制。腫瘤可激活替代途徑來刺激血管發(fā)生過程；例如，在小鼠中，VEGF抑制 可以誘導(dǎo)bFGF途徑的增加。因此，已開展組合策略來獲得最大效應(yīng)。已用實驗?zāi)Ｐ?，其顯 示若組合使用長春花堿和抗血管發(fā)生劑DClOl (靶向VEGFR2的單克隆抗體)，則接種入免 疫缺陷小鼠的人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系不形成腫瘤(Klement等，2000，J Clin Invest 105 R15-R24)。類似地，Kamat 和同事(Cancer Res 2007,67 :281-288)已顯示紫杉燒(taxane) 與AEE788( 二元的表皮生長因子受體(EGFR)和VEGFR抑制劑)組合在卵巢癌鼠模型中的 功效。普遍的觀點是，必須在血管發(fā)生過程的不同階段同時阻斷血管發(fā)生。因此，存在對基于通過干擾導(dǎo)致細(xì)胞獲得抗血管發(fā)生表型和功能的胞內(nèi)信號，通 過作用于內(nèi)皮細(xì)胞水平來阻斷血管發(fā)生的更有效的癌治療的迫切需要。能夠抑制血管發(fā)生的新藥物的可用性可能為需要調(diào)節(jié)血管發(fā)生過程的所有疾病 開啟了有益的應(yīng)用。這對通過作用于內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)部，以明顯的新機(jī)制顯示有效的抗血管發(fā)生特性的藥 物尤其正確。如Rui-Chen 在 Cancer Metastasis Rev (2006, 25 :677-694)中所概述，在過 去幾年中已清楚，最終受生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的淋巴管發(fā)生 (lymphangiogenesis，新淋巴管的形成)有助于腫瘤轉(zhuǎn)移。幾篇研究已發(fā)現(xiàn)淋巴管發(fā)生因 子、淋巴管(lymphatic)侵入、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和(在一些情況下)差的臨床結(jié)果之間的正相關(guān)。 腫瘤衍生的淋巴管發(fā)生因子如VEGF-C的相關(guān)作用對腫瘤淋巴管發(fā)生很關(guān)鍵。實際上，最近 的研究已表明，響應(yīng)快速的腫瘤生長，淋巴管經(jīng)歷引人注目的淋巴管發(fā)生改變，例如淋巴管 內(nèi)皮細(xì)胞(LEC)出芽、腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍(peritumoural)脈管形成和鄰近腫瘤組織的集合 淋巴管膨大。人乳腺癌VEGF-C的過量表達(dá)與腫瘤內(nèi)淋巴管發(fā)生、腫瘤內(nèi)淋巴管的增加的數(shù) 目和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高頻率密切相關(guān)。這些實驗已提供了淋巴管可以在腫瘤內(nèi)增殖并作 為淋巴發(fā)生傳播的管道這一原理的證據(jù)。因此，已提出將腫瘤內(nèi)和外周LEC的靶向或阻斷 淋巴管發(fā)生作為抗轉(zhuǎn)移法的重要途徑。目前不存在能夠干擾淋巴管發(fā)生和預(yù)防癌轉(zhuǎn)移的有效藥物。代表用于轉(zhuǎn)移癌的潛在治療的抗淋巴管發(fā)生治療是腫瘤學(xué)領(lǐng)域中未滿足的需要。能夠抑制淋巴管發(fā)生的新藥物的可用性可能為需要調(diào)節(jié)淋巴管發(fā)生過程的所有疾病開啟了有益的應(yīng)用。最佳的藥物應(yīng)通過干擾導(dǎo)致細(xì)胞獲得淋巴發(fā)生表型和功能的胞內(nèi)信號來在LEC 水平發(fā)揮其抗淋巴管發(fā)生活性。HHV-6U94 基因HHV-6U94 基因首次由 Thomson 等(Thomson 等，nature 351 :78-80,1991)描述。序 列(從完整的HHV-6 DNA序列(Gompels等，Virology 209 =29-51,1995)獲得)以基因識別 號1487994儲存在RefSeq數(shù)據(jù)庫中(國家生物技術(shù)信息中心，http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)。U94是涉及HHV-6復(fù)制調(diào)節(jié)的潛在相關(guān)基因(Caseli等，Virology 346 =402-414, 2007)?，F(xiàn)有技術(shù)Cancer Cell International Q005，5 19)描述了 U94 基因在命名為 PC3 的 人前列腺腫瘤細(xì)胞系中的穩(wěn)定表達(dá)抑制其在培養(yǎng)物中的集落形成和在裸鼠中的腫 瘤發(fā)生。所觀察到的抗腫瘤效應(yīng)由PC3細(xì)胞中纖連蛋白(FNl)的上調(diào)和血管生成 素-樣-4(Angiopoietin-like-4，ANGPTL4)表達(dá)的降低引起。之前的研究表明，在穩(wěn)定表達(dá)U94的NIH3T3細(xì)胞系中，U94抑制癌基因H-ras的 轉(zhuǎn)化(Arauji JC 等，J Virol 1995,69 :4933-4940 ；Araujio JC 等，Oncogene 1997,14 937-943)。這些文章中沒有一篇提出U94基因和所編碼的R印蛋白質(zhì)以正常的人原代血管和 淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞為治療靶點來發(fā)揮其抗(淋巴管)血管發(fā)生的效應(yīng)。本發(fā)明的公開內(nèi)容本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)遞送至人原代BEC或LEC時，HHV-6U94基因(U94)或 U94蛋白質(zhì)產(chǎn)物Rep損傷細(xì)胞在體外形成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)的生理學(xué)能力。在第一個實施方案中，本發(fā)明提供Rep蛋白質(zhì)、其類似物或編碼它們的核酸分子 在抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而在有需要的哺乳動物受試者中，優(yōu)選在有需要的人類受試者中 預(yù)防或治療血管發(fā)生和/或淋巴管發(fā)生相關(guān)狀態(tài)(state)、病癥或疾病中的用途。由血管發(fā)生和/或淋巴管發(fā)生介導(dǎo)并可以從本發(fā)明的治療受益的狀態(tài)、病癥 或疾病包含但不限于血管瘤、實體瘤、卡波希肉瘤、白血病、轉(zhuǎn)移、毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、銀 屑病、硬皮病(scleroderma)、膿性肉芽腫、心肌血管發(fā)生、斑塊新血管形成(plaque neovascularisation) > S ^ II/JC {RiJ (coronary collaterals)、|Sf { J (cerebral collaterals)、云力■ J0C _ (arteriovenous malformations) > ifilifil iW ^ ^ (ischemic limb angiogenesis)、角膜疾病、潮紅、新生血管性青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病、 晶狀體后纖維組織形成、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性新血管形成、黃斑變性、班氏吳 策線蟲感染、巴爾通體感染(Bartonella infection)、創(chuàng)傷愈合、消化性潰瘍、骨折、瘢痕疙 瘩、血管發(fā)生、血細(xì)胞發(fā)生、排卵、月經(jīng)。該治療在于以足以控制病癥或疾病的臨床方面的量 對個體施用Rep蛋白質(zhì)、其類似物或編碼它們的核酸分子。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供Rep蛋白質(zhì)、其類似物或編碼它們的核酸分子 在控制生育中的用途，通過對女性施用有效量的Rep蛋白質(zhì)、其類似物或編碼它們的核酸 分子，使得子宮內(nèi)膜血管形成被抑制和胚胎植入不能發(fā)生或持續(xù)。還在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于治療上文所述疾病或病癥的藥物制劑。該藥物制劑包含與可藥用載體組合的Rep蛋白質(zhì)、其類似物或編碼它們的核酸分子。Rep蛋 白質(zhì)、其類似物或編碼它們的核酸分子在該劑型中的量必須足以基本減輕疾病的表現(xiàn)或緩 解狀態(tài)或病癥的癥狀?？梢酝ㄟ^與疾病相關(guān)的臨床癥狀和通過非侵入性和/或侵入性儀器 和實驗室方法測定疾病的表現(xiàn)。還在另一個實施方案中，本發(fā)明提供R印蛋白質(zhì)、其類似物或編碼它們的核酸分 子對通過促進(jìn)或阻斷血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞或其他細(xì)胞類型在胞外環(huán)境中釋放生物活性 分子來抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能的用途。附圖描述圖 1 顯示通過 AMAXA 核轉(zhuǎn)染(nucleofection)pSR2ph_U94 后 U94 轉(zhuǎn)錄物在 BEC 中的存在。已將pSR2ph-U94質(zhì)粒DNA用作陽性對照(C+)，而已進(jìn)行了持家基因β -肌動 蛋白cDNA的擴(kuò)增，以驗證獲自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的所有樣品都已被正確處理。所獲得的結(jié)果顯示， pSR2ph-U94轉(zhuǎn)染后，U94基因在BEC中轉(zhuǎn)錄至多5天。圖2顯示，與pSR2ph轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染(NT)的細(xì)胞相比，pSR2ph_U94轉(zhuǎn)染的BEC和 LEC在接種于Cultrex BME上后M小時未形成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)。圖3顯示，與未處理的細(xì)胞或用熱滅活的R印(5μ g/ml)處理的細(xì)胞相比，用重組 R印蛋白質(zhì)(5yg/ml)處理M小時的BEC在接種于Cultrex BME上后M小時未形成毛
細(xì)管樣結(jié)構(gòu)。圖4顯示，與pSR2ph轉(zhuǎn)染的BEC相比，pSR2ph_U94轉(zhuǎn)染的BEC具有受損的遷移 能力。實際上，如靠下的圖中所示，與pSR2ph轉(zhuǎn)染的BEC超過60%的封閉(seal)相比， pSR2ph-U94轉(zhuǎn)染的BEC在用200 μ 1吸頭產(chǎn)生創(chuàng)傷劃痕后8小時僅達(dá)到20%封閉。圖5R印對血管發(fā)生的影響。與未處理的環(huán)(平板Α)相比，按5 μ g/ml的濃度用 重組R印處理主動脈環(huán)7天導(dǎo)致自發(fā)血管發(fā)生(平板B)的完全降低。用20mg/ml的VEGF 刺激主動脈環(huán)7天強(qiáng)烈增加微血管派生(平板C)，而在VEGF刺激開始時將R印(μ g/ml)加 至環(huán)顯著減少了微血管的數(shù)目(平板D)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于在有需要的哺乳動物受試者中，尤其是在有需要的人類受試者中 抑制血管發(fā)生和/或淋巴管發(fā)生的治療組合物，所述組合物以能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能的量 包含a)編碼具有抗血管發(fā)生和抗淋巴管發(fā)生活性的蛋白質(zhì)的HHV-6核酸分子，其中所 述核酸分子具有選自以下的序列i) SEQ ID NO 1 (U94 基因)；ii)由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ ID NO 1的序列；iii)在嚴(yán)格條件下，尤其是在50°C或更高溫度和0. IxSSC (15mM氯化鈉/1. 5mM檸 檬酸鈉)下與SEQ ID NO 1雜交的序列；和/或b)包含上文所定義的核酸分子的表達(dá)載體；和/或c)由上文所定義的核酸分子編碼的R印蛋白質(zhì)，優(yōu)選SEQ ID NO :2的蛋白質(zhì)或其 攜帶保守取代的類似物。所提供的HHV U94基因和R印蛋白質(zhì)令人驚奇地能夠抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴 管內(nèi)皮細(xì)胞的體外毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)形成和創(chuàng)傷愈合修復(fù)。
可以將抗血管發(fā)生/抗淋巴管發(fā)生的U94和/或R印、其類似物、同源物或衍生物 與治療有效量的負(fù)調(diào)血管發(fā)生/淋巴管發(fā)生的其他分子，如血小板因子4、血小板反應(yīng)蛋 白-1、金屬蛋白酶組織抑制劑、促乳素、制管張素、內(nèi)皮抑制素、bFGF可溶性受體、VEGF可溶 性受體、VEGF抗體、bFGF抗體、轉(zhuǎn)化生長因子β、干擾素α和胎盤增殖蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)組合。本發(fā)明的抗血管發(fā)生/抗淋巴管發(fā)生分子還可以與化療劑組合。本發(fā)明包含抗血管發(fā)生/抗淋巴管發(fā)生R印的類似物，其可以通過提供功能上等 同的分子的取代、添加或缺失來改變蛋白質(zhì)序列而獲得。這包括改變序列，其中用功能上等 同的氨基酸殘基取代序列內(nèi)的殘基，產(chǎn)生沉默改變(保守取代)。例如，可以用起功能等同 物作用的具有相似極性的另一個氨基酸取代序列內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基，產(chǎn)生沉默改 變。序列內(nèi)氨基酸的取代物可以選自該氨基酸所屬類別的其他成員。例如，非極性(疏水) 氨基酸包含丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性 中性氨基酸包含甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電 荷(堿性)氨基酸包含精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸包含天冬氨酸 和谷氨酸?？寡馨l(fā)生/抗淋巴管發(fā)生R印及其類似物可以衍生自組織或通過本領(lǐng)域已知的 多種方法產(chǎn)生。導(dǎo)致它們的產(chǎn)生的操作可以發(fā)生在基因或蛋白質(zhì)水平。例如，可以通過本 領(lǐng)域已知的眾多策略(Sambrook 等，1990，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第 2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.)中的ft—禾中: !^7 )^3 隆的編碼抗血管發(fā)生/抗淋巴管發(fā)生Rep及其類似物的基因序列?？梢杂靡环N或多種限制 性內(nèi)切酶在適當(dāng)?shù)奈稽c處切割序列，然后在需要時進(jìn)行其他酶修飾、分離和在體外連接。在 編碼衍生物或類似物的基因的產(chǎn)生中，應(yīng)注意確保所修飾的基因保留在相同的翻譯閱讀框 之內(nèi)，不被翻譯終止信號間斷。優(yōu)選通過重組法產(chǎn)生抗血管發(fā)生/抗淋巴管發(fā)生R印及其類似物。術(shù)語“分離的”指從其最初的環(huán)境移出Rep。例如，存在于活個體中的天然存在的 Rep不是分離的，但從天然系統(tǒng)中的一些或所有共存物質(zhì)分開的相同的Rep是分離的。Rep 可以是載體的部分和/或組合物的部分，且還可以是分離的，其中這種載體或組合物不是 其天然環(huán)境中的部分。希望表達(dá)Rep時，可以使用任意適合的系統(tǒng)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，適合的載 體、表達(dá)載體及其構(gòu)建的一般性質(zhì)是顯而易見的。適合的表達(dá)載體可以基于噬菌體或質(zhì)粒，二者一般都是宿主特異性的，雖然通常 可以改造它們用于其他宿主。其他適合的載體包含粘粒和反轉(zhuǎn)錄病毒和任意其他載體，其 可以是給定系統(tǒng)特異性或非特異性的。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，表達(dá)調(diào)節(jié)中必需和/或有 用的控制序列，如識別、啟動子、操縱子、誘導(dǎo)物、終止子和其他序列是顯而易見的?？梢匀菀椎貙⒕幋aR印或R印樣蛋白質(zhì)的DNA插入適合的載體。理想地，接收載體 具有便于插入的適合的限制位點，但也可以使用例如平端連接，雖然這可以導(dǎo)致閱讀框和 插入方向的不確定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自然地按希望的表達(dá)系統(tǒng)來選擇適合的載體。可以通過用所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適合的生物或真核細(xì)胞系，用氨芐青霉素、卡那霉 素或需要時通過其他適合的方式選擇轉(zhuǎn)化體，并在必要時加入色氨酸或其他適合的啟動子誘導(dǎo)物(如吲哚丙烯酸)來表達(dá)R印。可以通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳-SDS-PAGE和通 過Western印跡分析來分析表達(dá)的程度。用于培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物等的適合的方法有用地闡述于例如Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 2 版，Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis, Cold Spring Harbor)； Current Protocols in Molecular Biology(Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith 禾口 Stuhl 編輯，Greene Publ. Assoc.，ffiley-Interscience, NY, N. Y. 1992)中?？?以從發(fā)酵或細(xì)胞培養(yǎng)物分離Rep并用多種常規(guī)方法中的任一種進(jìn)行純化，這些常規(guī)方法包 括使用HPLC和FPLC的液相層析，如正相或反相；親和層析(如用無機(jī)配體或抗體)；大小 排阻層析；固定化金屬螯合層析；凝膠電泳。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇最適當(dāng)?shù)姆蛛x和純 化技術(shù)而不背離本發(fā)明的范圍?？梢酝ㄟ^幾種化學(xué)技術(shù)中的任一種產(chǎn)生R印。例如，可以用最初由 R.B.Merrifield, "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis Of A TetrapeptideJ. Am. Chem. Soc.，83，2149-54 頁(1963)描述的固相合成技術(shù)來制 備R印，或可以通過在溶液中合成來制備R印。肽合成技術(shù)的概述可見于E. Gross & H.J.Meinhofer, The Peptides :Analysis, Synthesis, Biology；Modern Techniques Of Peptide And Amino Acid Analysis, John Wiley & Sons, (1981)禾口 M. Bodanszky, Principles Of Peptide Synthesis, Springer-Verlag(1984)中。可以通過多種方法在體外測定Rep或其編碼核酸的功能活性和/或治療有效劑 量。例如，測定血管發(fā)生抑制性Rep在體外抑制或干擾內(nèi)皮細(xì)胞在胞外基質(zhì)上形成毛細(xì)管 樣結(jié)構(gòu)的性能的能力時，可以使用本領(lǐng)域已知的多種生物測定，其包含但不限于創(chuàng)傷愈合、 內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制、內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制和細(xì)胞計數(shù)。用于在體內(nèi)抑制血管發(fā)生的能力的測定包括雞尿囊絨膜測定和小鼠、大鼠或兔角 膜袋(corneal pocket)測定。還可以用多種已知的體內(nèi)和體外測定來測定抗血管發(fā)生蛋白質(zhì)影響血管發(fā)生的 能力。這類測定公開于 Jain 等，(Nature Med 1997,3 =1203-1208)中?？梢詮氖褂帽景l(fā)明的上述組合物或與其他血管發(fā)生抑制因子組合的體外抑制測 定推斷抑制體內(nèi)血管發(fā)生(定義為胞外基質(zhì)毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)形成和內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的 抑制)的治療有效劑量。有效劑量還依賴于遞送的方法和手段。例如，在一些應(yīng)用中，如在 銀屑病或糖尿病性視網(wǎng)膜病的治療中，在局部眼科載體中遞送抑制劑。在其他應(yīng)用中，如在 實體瘤的治療中，利用生物可降解的聚合植入物遞送抑制劑。還可以例如通過聚乙二醇處 理來修飾蛋白質(zhì)?？梢杂帽景l(fā)明的治療組合物治療的與異常血管發(fā)生或新血管形成相關(guān)的疾病、障 礙或病癥包含但不限于視網(wǎng)膜新血管形成、腫瘤生長、血管瘤、實體瘤、白血病、轉(zhuǎn)移、銀屑 病、新生血管性青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位癥和早 產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)。本文所用的術(shù)語“有效劑量”指足以顯示可檢測的療效的本發(fā)明的抗血管發(fā)生蛋 白質(zhì)的量。療效非限制性地包含，例如，抑制不希望的組織或惡性細(xì)胞的生長、抑制不適當(dāng) 的血管發(fā)生(新血管形成)、限制慢性炎癥引起的組織損傷、抑制腫瘤細(xì)胞生長。受試者的 精確有效量可以依賴于受試者的尺寸和健康、待治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重度。因此，不可能預(yù)先指定精確有效量。但是，可以通過基于本文所提供的信息的常規(guī)實驗來測定給定情況的
有效量。本發(fā)明的抗血管發(fā)生蛋白質(zhì)可口服施用、局部施用，或通過腸胃外途徑施用，其包 括皮下和肌內(nèi)注射、植入持續(xù)釋放的長效制劑、靜脈內(nèi)注射或鼻內(nèi)施用。因此，優(yōu)選將本發(fā) 明的抗血管發(fā)生蛋白質(zhì)作為藥物組合物施用，該藥物組合物包含與可藥用載體組合的本發(fā) 明的抗血管發(fā)生蛋白質(zhì)。術(shù)語“可藥用”指可在無過度毒性的情況下對哺乳動物施用的化合 物和組合物。示例性可藥用鹽包含無機(jī)酸鹽，如氫氯化物、氫溴化物、磷酸鹽和硫酸鹽；和有 機(jī)酸鹽，如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽。這類組合物可以是水溶液劑、乳劑、霜劑、 軟膏劑、混懸劑、凝膠劑和脂質(zhì)體混懸劑。適合的載體(賦形劑)包含水、鹽水、林格氏液、葡 萄糖溶液和乙醇、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇(PEG)、磷酸鹽、 醋酸鹽、明膠、膠原、Carbopol 、植物油的溶液。此外，還可以包含適合的防腐劑、穩(wěn)定劑、 抗氧化劑、抗微生物劑和緩沖劑，例如BHA、BHT、檸檬酸、抗壞血酸和四環(huán)素。用于制劑的霜 劑或軟膏劑基質(zhì)包含羊毛月旨、Silvadene (Marion)、Aquaphor (Duke Laboratories)。 其他局部制劑包含氣溶膠、繃帶和其他創(chuàng)傷敷料。備選地，可以將本發(fā)明的治療化合物摻 入或封裝入適合的聚合物基質(zhì)、納米泡(nanobubble)或膜中，從而提供適合用于局部植入 待治療部位附近的持續(xù)釋放遞送裝置。其他裝置包含留置導(dǎo)管和如Alzet 微泵的裝置。 可以用市售載體如 Sorbi-care (Allergan)、Neodecadron (Merck, Sharp & Dohme)、 Lacrilube 配制眼科制劑，或可以利用局部制劑，如描述于美國專利號5，124，155中的局 部制劑，該專利在此引用作為參考。此外，可以以固體形式，尤其是作為凍干粉末提供本發(fā) 明的治療化合物。凍干制劑通常包含穩(wěn)定劑和填充劑，例如人血清白蛋白、蔗糖和甘露醇。 可在Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.)中獲得可藥用賦形劑的透徹 討論。可以以基因治療的形式使用本發(fā)明的編碼抗血管發(fā)生蛋白質(zhì)的DNA，并通過本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的任意方法遞送至宿主，以治療與血管發(fā)生相關(guān)的障礙或組織重塑相關(guān)的 病癥。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及抑制實體瘤的血管發(fā)生以預(yù)防進(jìn)一步的腫瘤生長和 轉(zhuǎn)移的方法。為此目的，基因轉(zhuǎn)移可接近的任意實體瘤或腫瘤周圍區(qū)域可以是進(jìn)行所公開 的治療應(yīng)用的靶點。可以通過本領(lǐng)域已知的很多方法直接將包含于重組病毒的或非基于病 毒的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)內(nèi)的編碼血管發(fā)生多肽的DNA導(dǎo)向腫瘤周圍的靶細(xì)胞，這些方法包括但 不限于(a)與對腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍部位施用有效量的DNA相結(jié)合的外科方法(如果可能， 涉及最初除去部分或全部腫瘤)；(b)將基因轉(zhuǎn)移載體直接注射入腫瘤內(nèi)或鄰近腫瘤的部 位；和(c)用本領(lǐng)域已知的技術(shù)局部或全身遞送基因轉(zhuǎn)移載體和/或基因產(chǎn)物。任意實體 瘤可以是治療的可能靶點。尤其易受基因治療應(yīng)用的實體瘤的不以任意方式旨在作為限 制的實例是(a)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的瘤，例如，但同樣不限于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成神 經(jīng)細(xì)胞瘤、腦膜瘤、室管膜瘤；(b)激素依賴性組織的癌，如前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、宮頸 癌、卵巢癌、乳癌，其包含但不限于原位癌、髓樣癌、導(dǎo)管癌、浸潤性(滲透性)癌和粘液癌； (c)黑素瘤，其包含但不限于皮膚黑素瘤和眼黑素瘤；(d)肺癌，其至少包含鱗狀細(xì)胞癌、梭 形細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌；和(e)胃腸系統(tǒng)，如食管、胃、小腸、結(jié)腸、結(jié)腸直腸、 直腸和肛門區(qū)域的癌，其至少包含大腸腺癌。
在本發(fā)明尤其優(yōu)選的實施方案中，將本發(fā)明的U94基因、所編碼的Rep蛋白質(zhì)或 其類似物用于腫瘤的預(yù)防性和治療性處理，該腫瘤顯示分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞和在適合的基質(zhì) 上形成自身毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)的能力。這些包含人乳腺癌Gerwe等，hvest New Drugs, 2008 年11月14日，先于印刷版的電子版)和人黑素瘤(Mourad-kidan等，Am. J. Pathol. 173 1839-52，2008)，其促進(jìn)其癌要素(cancer element)轉(zhuǎn)化進(jìn)入能夠進(jìn)行血管發(fā)生和支持腫 瘤存活和發(fā)展以及轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散的內(nèi)皮樣細(xì)胞。這是本發(fā)明的區(qū)別性特征，因為迄今針對U94 設(shè)想的治療應(yīng)用不允許預(yù)測其在表征為具有血管發(fā)生能力的要素的腫瘤治療中的特定效
果 ο可以通過基于病毒或非病毒的方法，將編碼抗血管發(fā)生蛋白質(zhì)的DNA遞送至哺乳 動物宿主的全身或遞送至實體瘤周圍的靶細(xì)胞?？梢杂糜诒景l(fā)明的病毒載體系統(tǒng)包含但不 限于腺病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺伴隨病毒載體、單純皰疹病毒載體、SV40載體、多瘤病 毒載體、乳頭瘤病毒載體、小RNA病毒載體和痘苗病毒載體。優(yōu)選通過直接注射入實體瘤和/或?qū)嶓w瘤周圍的靜息組織，如脂肪或肌肉組織， 來對宿主施用包含本發(fā)明的編碼抗血管發(fā)生蛋白質(zhì)的DNA的重組病毒或載體。轉(zhuǎn)染靶脂肪 和肌肉組織區(qū)域內(nèi)的腫瘤細(xì)胞當(dāng)然可以是有用的?？寡馨l(fā)生多肽在這些周圍細(xì)胞中的瞬 時表達(dá)可導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)的局部胞內(nèi)增加?？梢杂糜诒景l(fā)明的非病毒載體包含但不限于DNA-脂質(zhì)復(fù)合物，例如脂質(zhì)體介導(dǎo) 的或配體/聚-L-賴氨酸的綴合物，如唾液酸糖蛋白介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)(見，例如!Signer等， 1994, J. Biol. Chem. 269 :2550-2561 ；Derossi 等，1995, Restor. Neurol. Neuros. 8 :7-10 ； 和 Abcallah 等，1995，Biol. Cell85 :1-7 ;Karmali 和 Chaudhuri，2006，Med Res Rev 27: 696-722)；生物可降解聚合物(見，例如Luten等，2008，J Control Release 126:97-110)； 或負(fù)載質(zhì)粒 DNA 的微泡(microbubble，見，例如 Bekeredjian 等，2003，Circulation 108 1022-1026)。還可以使用“裸”DNA的直接注射(見，例如Lin等，Circulation 1990,82 2217-2221)。本發(fā)明還提供包含一個或多個填充了本發(fā)明藥物組合物的一種或多種成分的包 裝(container)的藥包或藥盒?？蛇x地，這類包裝可以按管理藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用 或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式與公告或傳單結(jié)合，該公告或傳單反映了由生產(chǎn)、使用或銷 售用于人類施用的機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)。本申請通篇引用的參考文獻(xiàn)在此引入作為參考。通過以下實 施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實施例以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。這些實施例并非旨在限制本發(fā)明的范圍。依據(jù)本 公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，權(quán)利要求范圍內(nèi)的大量實施方案是顯而易見的。實施例1原代人內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照之前所述(Rotola等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95 :13911-13916)，通 過HHV-6變體B的ORF U94的PCR擴(kuò)增獲得全長U94基因。將來自HHV-6B Rl菌株的U94 基因(Dewhurst 等，2000，Virology 190:490-493)克隆入 pSR2ph 載體(pSR2ph_U94)。按 照廠家的說明用AMAXA裝置(Koln，德國)核轉(zhuǎn)染pSR2ph_U94 0 μ g)入IO6BEC或LEC。轉(zhuǎn)染后在不同時間點(1、2、3和5天)收獲細(xì)胞并提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄后，按Rotola等，1998， Proc Natl Acad Sci USA 95 :13911-13916 所述，用 U94 特異性引物通過 PCR 擴(kuò)增 cDNA。 如

圖1中所示，如U94轉(zhuǎn)錄本在所評估的各時間點的存在所表明，U94基因在BEC中持續(xù)表 達(dá)。用LEC進(jìn)行pSR2ph-U94轉(zhuǎn)染獲得了相似的結(jié)果。我們用pSR2ph_U94質(zhì)粒作為反應(yīng)的 陽性對照，而持家基因β-肌動蛋白的擴(kuò)增驗證了 cDNA樣品的適合性。實施例2pSR2ph_U94轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)物基膜提取物(BME)上的索帶(cord)形成用已在使用前于-20°C冷卻的無菌吸頭將200 μ 1 4 V的BME (10mg/ml) (Cultrex ； Trevigen Inc.，Gaithersburg, MA)轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的48孔培養(yǎng)板。輕輕攪動以 確保包被后，將平板在37°C孵育1小時，使Cultrex BME固化。然后將原代BEC或LEC按 6 X IO4/孔的密度接種在EGM中。細(xì)胞接種后M小時觀察索帶形成。在包含VEGF的內(nèi)皮生 長培養(yǎng)基(EGM)存在的情況下，兩種內(nèi)皮細(xì)胞類型都在接種后M小時在Cultrex BME上 自發(fā)形成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)。如圖2中代表性地所顯示，pSR2ph-U94轉(zhuǎn)染后1天收獲并在EGM 存在的情況下培養(yǎng)在Cultrex 上的BEC和LEC未能在接種M小時后形成管。具體而言， 我們觀察到，粘附至Cultrex BME的細(xì)胞形成幾乎不形成空心管樣結(jié)構(gòu)的單層。相反，用 pSR2ph空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BEC或LEC保持形成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的能力。實施例3Rep處理的內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)物基膜提取物(BME)上的索帶形成通過Hindi 11消化從pSR2ph切下R印編碼基因并亞克隆入細(xì)菌pQE30載體 (Qiagen)，獲得重組質(zhì)粒pQE-r印。將基因與氨基端的6個組氨酸殘基(His)6延伸符合讀 框地克隆在T5啟動子/Iac操縱子的控制下。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化M15大腸桿菌(E. coli)菌 株，該菌株含有PREP4質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含編碼Iac阻抑物的IacI基因。加入異丙基硫代半 乳糖苷(IPTG)后，T5/lac啟動子被激活，導(dǎo)致克隆入pQE30的融合蛋白質(zhì)的高產(chǎn)率產(chǎn)生。 按已描述的方法(Caselli等，2006，Virology 346 :402-414)，在無內(nèi)毒素污染的情況下產(chǎn) 生和純化R印蛋白質(zhì)。按從0. 1至5 μ g/ml的劑量范圍用重組R印處理原代BEC或LEC 24小時并懸浮 在EGM中。然后按6 X IO6細(xì)胞/孔的濃度將細(xì)胞接種在BME包被的48孔板上。未處理的 細(xì)胞在細(xì)胞接種后M小時顯示索帶形成。Rep處理后1天收獲并在EGM存在的情況下培養(yǎng) 在Cultrex 上的BEC或LEC未能在接種后M小時形成管。重組R印以劑量依賴的方式 抑制BEC或LEC的血管發(fā)生活性，在5 μ g/ml的蛋白質(zhì)濃度觀察到最佳抑制。為了確認(rèn)特 異性，還用等量(5yg/ml)通過在100°C下煮沸蛋白質(zhì)制劑10分鐘獲得的熱變性Rep進(jìn)行 了實驗(圖3)。結(jié)果顯示，熱變性消除了 Rep活性，表明該蛋白質(zhì)的折疊對其作用很重要。實施例4pSR2ph-U94轉(zhuǎn)染的MDA_MB_231細(xì)胞在培養(yǎng)物基膜提取物(BME)上的索帶形成按照廠家的說明用AMAXA裝置將pSR2ph_U94 (2 μ g)核轉(zhuǎn)染入106MDA_MB_231細(xì) 胞(ATCC編號HTB-沈衍生自人乳腺癌)。然后按6 X IO4/孔的濃度將MDA-MB-231細(xì)胞接 種在RPMI-1640培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)基中不存在任意促血管發(fā)生因子的情況下，細(xì)胞在接種 后M小時在Cultrex 上自發(fā)形成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)。pSR2ph-U94轉(zhuǎn)染后1天收獲并培養(yǎng)在 Cultrex: 上的細(xì)胞未能在接種后M小時形成管。另一方面，用pSR2ph空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞保持形成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的能力。實施例5內(nèi)皮細(xì)胞遷移測定按照廠家的說明用AMAXA裝置(KoIn，德國)將pSR2ph_U94 O μ g)核轉(zhuǎn)染入 IO6BEC或LEC。轉(zhuǎn)染后M小時收獲細(xì)胞，接種(2. 5 X IO5細(xì)胞/孔)在膠原包被的12孔培 養(yǎng)板上并培養(yǎng)至匯合。同時，用重組R印(5yg/ml)處理原代BEC或LEC對小時，按上文接 種在膠原包被的12孔培養(yǎng)板上并培養(yǎng)至匯合。用200 μ 1或Iml吸頭劃開匯合的單層。通 過光學(xué)顯微鏡(Leica DM IRB，Wetzlar，德國)觀察內(nèi)皮細(xì)胞遷移，并用使用數(shù)字分析系統(tǒng) (QffIN LITE版本2. 3 ;Leica)的 CCD光學(xué)器件(Hitachi Denshi Color Camera KP-D50E/K ； Rodgau，德國)拍照。在8小時的時程內(nèi)觀察創(chuàng)傷封閉的百分比。如圖4中所示，對照BEC在 200 μ 1吸頭引起創(chuàng)傷劃痕后8小時達(dá)到60-80%封閉。與對照BEC同時劃開的pSR2ph_U94 轉(zhuǎn)染的BEC在創(chuàng)傷劃開后8小時僅顯示約20-30%封閉。用pSR2ph-U94轉(zhuǎn)染的LEC獲得了 相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，U94基因在細(xì)胞中表達(dá)減弱了 BEC和LEC在創(chuàng)傷愈合測定中 的遷移。用按5 μ g/ml的濃度用重組R印蛋白質(zhì)處理M小時或未處理的BEC和LEC進(jìn)行 了相同的測定。與它們的未處理的副本相比，在Rep處理的BEC或LEC中，細(xì)胞遷移受到強(qiáng) 烈的影響。實際上，Rep處理的細(xì)胞在創(chuàng)傷劃開后8小時僅顯示對照細(xì)胞創(chuàng)傷封閉活性的 10%。實施例6主動脈環(huán)測定按之前所述(NicosiaR. F.和 Ottinetti A. 2000. Lab. Invest. 63 :115-122)進(jìn)行 大鼠主動脈環(huán)測定。簡言之，通過(X)2飽和空氣處死大鼠，在解剖顯微鏡下切下背主動脈并 剔除脂肪。制備約Imm厚的環(huán)并在使用前在4°C下在DMEM中保存少于2小時。將8體積從 大鼠尾制備的1型膠原溶液(1. 5mg/ml)與1體積10XDMEM和1體積NaHCO34mg/ml)混 合。將40 μ 1膠原溶液放入4孔板的各孔中并將一個主動脈環(huán)轉(zhuǎn)移至各孔內(nèi)。在37°C下在 潮濕空氣中孵育平板30分鐘以獲得膠凝(jellification)。孵育后，往各孔中加入500 μ 1 EBM,其單獨包含重組R印(0. 5-5 μ g)或包含與20ng/ml VEGF組合的重組R印。將平板孵 育10-12天。通過每三天進(jìn)行拍照并計數(shù)從主動脈環(huán)起始的血管數(shù)目來獲得血管發(fā)生的定 量。實施例7Rep阻斷大鼠主動脈環(huán)的血管發(fā)生還用主動脈環(huán)測定研究了重組R印對血管發(fā)生的影響。此方法允許研究分子干擾 哺乳動物微血管體外生長的能力。用重組R印處理主動脈環(huán)導(dǎo)致自發(fā)微血管派生的急劇降 低。在5μ g/ml的蛋白質(zhì)濃度下孵育7天后觀察到由R印誘導(dǎo)的最大的血管發(fā)生抑制。此 時，與用R印處理的環(huán)中5士4的微血管數(shù)相比，對照培養(yǎng)物中微血管的數(shù)目為45士8(圖 5)。如預(yù)期，用20mg/ml的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)刺激主動脈環(huán)強(qiáng)烈地增加了微血管派 生085 士 74)。R印(5 μ g/ml)加入到VEGF處理的環(huán)降低微血管數(shù)量為285 士 74。較低濃度 的U94 (2. 5-1 μ g/ml)仍然是抑制性的，但有效性較低。在0. 5 μ g/ml的濃度下，Rep不影 響大鼠主動脈血管發(fā)生。此結(jié)果顯示，R印不僅能夠干擾自發(fā)血管發(fā)生的潛在機(jī)制，還使主動脈環(huán)對有效力的VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生活性完全不敏感。
權(quán)利要求
1.用于在哺乳動物受試者中預(yù)防或治療血管發(fā)生和/或淋巴管發(fā)生相關(guān)的疾病、狀態(tài) 或病癥的治療組合物，其單獨包含以下或包含以下的組合a)編碼具有抗血管發(fā)生和抗淋巴管發(fā)生活性的蛋白質(zhì)的HHV-6核酸分子，其中所述核 酸分子具有選自以下的序列i)SEQID NO 1 ；ii)由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQID NO 1的序列；iii)在嚴(yán)格條件下與SEQID NO 1雜交的序列；b)包含如上所定義的核酸分子的表達(dá)載體；c)由如上所定義的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)，或其攜帶保守性取代且保留抗血管發(fā)生和 抗淋巴管發(fā)生活性的類似物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述哺乳動物受試者是人類。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述核酸分子是裸DNA的形式。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述表達(dá)載體是病毒載體。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述病毒載體是以下之一腺病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載 體、腺伴隨病毒載體、單純皰疹病毒載體、SV40載體、多瘤病毒載體、乳頭瘤病毒載體、小 RNA病毒載體和痘苗病毒載體。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述由核酸分子編碼的蛋白質(zhì)具有序列SEQID NO :2。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述蛋白質(zhì)是純化的重組蛋白質(zhì)的形式。
8.權(quán)利要求1的組合物，其是DNA-脂質(zhì)復(fù)合物、脂質(zhì)體介導(dǎo)的或配體/聚-L-賴氨酸 的綴合物、唾液酸糖蛋白介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)、生物可降解聚合物或負(fù)載質(zhì)粒DNA的微泡的形 式。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的組合物，其用于以下疾病或病癥之一的治療血管瘤、實體 瘤、卡波西肉瘤、白血病、轉(zhuǎn)移、毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、銀屑病、硬皮病、膿性肉芽腫、心肌血管發(fā) 生、斑塊新血管形成、冠狀動脈側(cè)枝、腦側(cè)枝、動靜脈畸形、缺血性肢血管發(fā)生、角膜疾病、潮 紅、新生血管性青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織形成、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、糖尿病性新血管形成、黃斑變性、班氏吳策線蟲感染、巴爾通體感染、創(chuàng)傷愈合、消化性 潰瘍、骨折、瘢痕疙瘩、血管發(fā)生、血細(xì)胞發(fā)生、排卵或月經(jīng)。
10.權(quán)利要求1-8中任一項的組合物，其用于顯示分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞和形成毛細(xì)管樣 結(jié)構(gòu)的能力的腫瘤的治療。
11.權(quán)利要求1-8中任一項的組合物，其用于人乳腺癌和人黑素瘤的治療。
12.權(quán)利要求1-8中任一項的組合物，其用于抑制子宮內(nèi)膜血管形成中的或胚胎植入 中的血管發(fā)生和/或淋巴管發(fā)生。
全文摘要
本發(fā)明描述了人皰疹病毒6型(HHV-6)U94基因及其產(chǎn)物蛋白質(zhì)Rep、適合用于遞送U94基因或從其編碼的蛋白質(zhì)至治療部位的表達(dá)載體和藥物組合物對在有需要的受試者中抑制血管發(fā)生和淋巴管發(fā)生過程的用途。
文檔編號C12N15/38GK102066406SQ200980121826
公開日2011年5月18日 申請日期2009年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者A·卡魯索, D·迪盧卡 申請人:福玻斯有限公司