專利名稱：通過阻斷腫瘤生長、血管發(fā)生和轉移抵抗癌癥的新型抗體的制作方法
通過阻斷腫瘤生長、血管發(fā)生和轉移抵抗癌癥的新型抗體相關申請的交叉參考本申請要求2008年4月4日提交的美國專利申請61/042，604和2008年11月10 日提交的美國專利申請61/113，053的優(yōu)先權，通過引用將它們的全部內(nèi)容納入本文。對于聯(lián)邦資助研發(fā)作出的發(fā)明的權益聲明本發(fā)明得到NIH/NCI SOMI Training Grant R25 CA 098010 和 NIH/NCI UCLA Prostate SPORE, P50 CA 092131的部分支持。政府享有本發(fā)明的某些權利。
背景技術：
前列腺癌是最常見的惡性腫瘤，并且是美國男性的第二大癌癥死因。前列腺癌是一種生物學和臨床異質疾病。大多數(shù)患有這種惡性腫瘤的男性具有可能不會影響個體壽命的緩慢生長的腫瘤，但其他人會受到快速生長的轉移性腫瘤的攻擊。PSA篩選的局限性在于缺乏特異性以及無法預測哪些患者有患上激素難治性轉移性疾病的風險。最近的研究提出，PSA診斷閾較低有可能增加前列腺癌診斷的數(shù)量，從而使緩慢進展癌癥患者和侵襲性癌癥患者之間的鑒定更加復雜(Punglia等，N Engl J Med, 349 :335-342 (2003))。迫切需要能與臨床結果相關聯(lián)或能鑒別患有潛在的侵襲性疾病的患者的新血清和組織標記物(Welsh 等，Proc Natl Acad Sci USA，100 :3410-3415 (2003))。最近的表達概況研究提示，轉移性腫瘤和非轉移性腫瘤的表達特征(signature) 可能存在于原發(fā)性腫瘤中(Ramaswamy 等，Nat Genet, 33 :49-54(2003) ；Sotiriou 等，Proc Natl Acad Sci USA, 100 10393-10398 (2003)) 使腫瘤易于轉移到特定器官的其他特征也可能以一定概率存在于原發(fā)性腫瘤中(Kang等，Cancer Cell, 3 =537-549 (2003)) 0這些最近的觀察結果提示，可在疾病早期階段鑒別轉移前或激素難治性前列腺癌前的新型標記物。這些標記物也在轉移性或激素難治性前列腺癌進展的生物學中發(fā)揮作用。與結果相關并在前列腺癌進展的生物學中發(fā)揮作用的存在于原發(fā)性腫瘤中的基因的最新例子包括 EZH2 和 LIM 激酶(Varambally 等，Nature,419 :624-629(2002) ；Yoshioka 等，Proc Natl Acad Sci USA,100 =7247-7252 (2003)) 然而這兩種基因都不是分泌型的。為鑒定激素難治性前列腺癌的新候選血清或組織標記物，我們比較了成對的激素依賴性和激素難治性前列腺癌異種移植物的基因表達特征。LAPC-9異種移植物建立于成骨細胞骨轉移，并在閹割免疫缺陷小鼠后從雄激素依賴進展到不依賴(Craft等， Cancer Research，付印(In Press，1999))。之前，其已用來鑒定前列腺癌的候選治療靶。 驗證了差異表達基因，然后測試了相對于分泌蛋白或細胞表面蛋白的序列同源性。同時在激素難治性前列腺癌和膀胱癌中表達的N-鈣粘蛋白的鑒定、表征和最初確認已被報道 (W0/2007/109347)。我們之前已經(jīng)披露，我們將N-鈣粘蛋白鑒定為前列腺癌和膀胱癌的假定診斷和治療靶(W0/2007/109347)。我們之前披露的內(nèi)容證實，該靶標在高風險性和進行性前列腺和膀胱腫瘤中顯著表達，并顯示該靶標的表達與預后不良和進展成雄激素非依賴性相關。 盡管之前曾推測，N-鈣粘蛋白可能是有用的治療靶，但唯一存在的藥物是肽拮抗劑，它對于前列腺癌不顯示出任何臨床前活性。據(jù)我們所了解，我們的發(fā)明首次提供了有效抵抗表達
4該靶標的癌癥的單克隆抗體。此外，現(xiàn)有N-鈣粘蛋白拮抗劑僅靶向該蛋白的第一胞外結構域。我們描述了靶向第一和第四胞外結構域的抗體。全部(抗體)都具有明顯的抗腫瘤活性。據(jù)我們所知，這是第一次描述靶向第四胞外結構域的概念。我們的抗體可用作單一試劑、組合使用，并且在理論上可以與N-鈣粘蛋白平行途徑或下游途徑的拮抗劑組合使用。本發(fā)明包括多種針對N-鈣粘蛋白第一和第四胞外結構域的單克隆抗體。這些抗體在前列腺癌和其他癌癥的體內(nèi)模型中阻斷腫瘤生長、血管發(fā)生和轉移。它們通過阻斷負責腫瘤生長、侵襲、血管發(fā)生和轉移的N-鈣粘蛋白信號轉導途徑而發(fā)揮作用。所述抗體還可用于體內(nèi)控制N-鈣粘蛋白陽性腫瘤和/或用于組織診斷和預后。本發(fā)明可僅作為單一抗體使用以治療或預防腫瘤生長和轉移。它們也可用作佐劑或作為已有腫瘤的治療劑。它們可組合使用以阻斷N-鈣粘蛋白的多個結構域。它們也可與化療劑或其他靶向癌癥藥劑組合使用，尤其是與那些靶向協(xié)同信號轉導途徑或那些靶向 N-鈣粘蛋白介導的信號轉導下游或上游途徑的藥劑組合使用。目前尚沒有獲得批準的靶向N-鈣粘蛋白的療法或診斷方法。靶向該途徑的唯一藥物在II期臨床中不是很成功，它在臨床前模型中無活性，而我們的發(fā)明對該臨床前模型是有活性的，這說明我們的方法和試劑有明顯的優(yōu)越性。因此，本發(fā)明提供了靶向N-鈣粘蛋白的組合物和方法，以診斷、預后和治療表達 N-鈣粘蛋白的癌癥，其中包括但不限于前列腺癌和膀胱癌。發(fā)明簡述一方面，本發(fā)明提供了以ATCC登錄號PTA-9387保藏的雜交瘤細胞系以及由該雜交瘤細胞系產(chǎn)生的抗體，以及另一種以ATCC登錄號PTA-9388保藏的雜交瘤細胞系和由該雜交瘤細胞系產(chǎn)生的抗體。還提供了一種能夠在體內(nèi)或體外結合N-鈣粘蛋白結構域1-3 的抗體或其片段，該結構域1-3與以ATCC登錄號PTA-9387保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏所的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體結合的N-鈣粘蛋白抗原決定簇相同，或能夠在體內(nèi)或體外結合N-鈣粘蛋白結構域4的抗體或其片段，該結構域4與以ATCC登錄號PTA-9388 保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏所的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體結合的N-鈣粘蛋白抗原決定簇相同。這種抗體可以是人源化的或完全人的；或者它可以是雙特異性抗體或單鏈抗體(scFv) ο在第二方面，本發(fā)明提供了一種抑制癌細胞在患者體內(nèi)生長的方法。該方法包括以下步驟在足以使所述抗體(或其片段)結合表達或過表達N-鈣粘蛋白的癌細胞的條件下，給予患者本發(fā)明的抗體(或其片段)。所述抗體(或其片段)通過以下途徑抑制癌細胞生長(a)激活或抑制NFK-β信號傳導和轉錄；(b)激活或抑制N-鈣粘蛋白內(nèi)在化；(c) 激活或抑制PI3激酶或Akt途徑；(d)激活或抑制連環(huán)蛋白信號傳導；(e)阻斷N-鈣粘蛋白與FGFR或其他酪氨酸激酶受體的異二聚化；或(f)阻斷或增強被ADAMlO或其他金屬肽酶切割。在一些實施方式中，所述癌細胞是泌尿生殖器癌細胞、前列腺癌細胞或膀胱癌細胞。在第三個方面，本發(fā)明提供一種治療癌癥患者的方法。該方法包括以下步驟(a) 從有患上表達N-鈣粘蛋白的癌癥的風險的個體獲得測試組織樣品；(b)與已知為癌癥陰性的患者的對照組織樣品相比，確定測試組織樣品中N-鈣粘蛋白的存在與否或含量；從而診斷所述表達N-鈣粘蛋白的癌癥，其中所述N-鈣粘蛋白以正?；虻退奖磉_，或由細胞亞群表達，或是過表達的；和(C)給予有患上表達N-鈣粘蛋白的癌癥的風險的個體有效量的本發(fā)明N-鈣粘蛋白抗體(或其片段)。在一些實施方式中，所述組織樣品是前列腺或膀胱組織。在一些實施方式中，所述癌癥是前列腺癌或膀胱癌，或者可以是轉移癌。在一些實施方式中，所述抗體(或其片段) 阻斷激素難治性前列腺癌，或所述抗體阻斷癌癥干細胞。在一些情況下，所述抗體是單克隆抗體、scFv或雙特異性抗體。在其他一些實施方式中，所述組織樣品是前列腺或膀胱組織。在第四個方面，本發(fā)明提供一種診斷癌癥患者的方法。該方法包括以下步驟(a) 從有患上表達N-鈣粘蛋白的癌癥的風險的個體獲得測試組織樣品；(b)與已知為癌癥陰性的患者的對照組織樣品相比，通過使樣品接觸有效量的本發(fā)明的N-鈣粘蛋白抗體(或其片段)來確定測試組織樣品中N-鈣粘蛋白的存在與否或含量；從而診斷所述表達N-鈣粘蛋白的癌癥，其中所述N-鈣粘蛋白以正常或低水平表達，或由細胞亞群表達，或是過表達的。在第五個方面，本發(fā)明提供一種鑒定癌癥干細胞的方法。該方法包括以下步驟 (a)從有患上表達N-鈣粘蛋白的癌癥的風險的個體獲得測試組織樣品；(b)與已知為癌癥陰性的患者的對照組織樣品相比，采用本發(fā)明的抗體(或其片段)確定測試組織樣品中癌癥干細胞的存在與否；其中所述N-鈣粘蛋白以正?；虻退奖磉_，或由干細胞亞群表達且不是過表達的。在一些實施方式中，所述組織樣品是前列腺或膀胱組織。在一些實施方式中，所述癌癥是前列腺癌、膀胱癌、激素難治性前列腺癌或轉移癌。在第六個方面，本發(fā)明提供了一種鑒定抗-N-鈣粘蛋白抗體或抑制患者體內(nèi)癌細胞生長的化合物的方法。該方法包括以下步驟(i)使候選化合物或抗體接觸表達或過表達N-鈣粘蛋白多肽的細胞；和(ii)通過確定所述候選化合物或抗體是否具有以下作用來確定所述化合物或抗體對N-鈣粘蛋白多肽的功能效應(a)激活或抑制NF κ-β信號傳導和轉錄；(b)激活或抑制N-鈣粘蛋白內(nèi)在化；(c)激活或抑制PI3激酶或Akt途徑；(d)激活或抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導；(e)阻斷N-鈣粘蛋白與FGFR或其他酪氨酸激酶受體的異二聚化；或(f)阻斷或增強被ADAMlO或其他金屬肽酶切割。如果候選化合物或抗體顯示出具有(a)-(f)中任一項所述的活性，則該抗體或化合物被認為是抗-N-鈣粘蛋白抗體或是抑制患者體內(nèi)表達N-鈣粘蛋白的癌癥的生長的化合物。例如，當抗體或化合物抑制NF κ - β 信號傳導或轉錄；或者當抗體或化合物抑制N-鈣粘蛋白內(nèi)在化時，所述抗體或化合物被認為是抗-N-鈣粘蛋白抗體或是抑制患者體內(nèi)表達N-鈣粘蛋白的癌癥的生長的化合物。附圖簡要說明

圖1.前列腺癌中N-鈣粘蛋白的信號傳導模式。圖2. N-鈣粘蛋白活化NF- γ β。圖3. N-鈣粘蛋白活化NF- γ β。圖4. N-鈣粘蛋白在Cl細胞的細胞表面表達。圖5.NF-Y β局限于N-鈣粘蛋白陽性細胞(Cl)的細胞核。圖6. N-鈣粘蛋白表達導致誘導IL-6、IL-8、TGF β 2和bcl_2。圖7 誘導基因與N-鈣粘蛋白水平相關。圖8 =N-鈣粘蛋白敲減導致IL-6和IL-8下調。
圖9. N-鈣粘蛋白抗體處理后的NF- γ β活性。
圖10. PC3細胞中的N-鈣粘蛋白48小時抗體培育。
圖11. N-鈣粘蛋白敲減導致活化的Akt下調。圖12. N-鈣粘蛋白特異性抗體活化，然后下調Akt活性。圖13.靶向N-鈣粘蛋白第一胞外結構域的抗體克隆的FACS分析。圖14.靶向N-鈣粘蛋白第四胞外結構域的抗體克隆的FACS分析。圖15.純化的單克隆N-鈣粘蛋白抗體克隆的FACS分析。圖16.單克隆N-鈣粘蛋白抗體克隆的體外侵襲試驗。圖17.用抗N-鈣粘蛋白抗體1H7和EC4處理的N-鈣粘蛋白空白腫瘤(null tumors)的生長曲線，未顯示出顯著的抑制效應(17a)。用相同抗體處理的PC3前列腺癌細胞的腫瘤生長曲線，證明對生長抑制有效(17b)。用1H7和EC4抗體處理下建立的大PC3腫瘤的生長曲線(17c)。用EC4抗體處理下PC3腫瘤的長期生長曲線(17d)。圖18.顯示抗體對N-鈣粘蛋白的影響的體內(nèi)實驗。圖19. (a)雄激素非依賴性LAPC9前列腺癌的免疫組織化學染色；(b)用N-鈣粘蛋白抗體治療雄激素依賴性和非依賴性LAPC-9腫瘤。圖20.分選的和未分選的LAPC9AI細胞的腫瘤生長曲線。圖21和22.進展的N-鈣粘蛋白分選腫瘤的FACS結果。圖23. LNCaP-Cl腫瘤的生長曲線，顯示了 N-鈣粘蛋白抗體的抑制效應。圖N-鈣粘蛋白抗體抑制建立的LAPC-9雄激素非依賴性腫瘤(Ma)和建立的大LAPC-9雄激素非依賴性腫瘤的生長。圖25.抗體EC4以劑量相關方式抑制裸鼠中PC3腫瘤生長。圖26.在長達45天和70天監(jiān)測的腫瘤進展的兩項研究中，N-鈣粘蛋白抗體1H7和EC4對LAPC-9雄激素依賴性腫瘤生長顯示出抑制效應。性。
圖27. N-鈣粘蛋白分選細胞在閹割SCID小鼠中顯示出生長優(yōu)勢。 圖28.在LAPC9腫瘤細胞連續(xù)傳代中N-鈣粘蛋白表達和雄激素受體水平的相關
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及用于治療表達N-鈣粘蛋白的癌癥的靶向細胞表面蛋白N-鈣粘蛋白的新型單克隆抗體。所述癌癥可以是前列腺癌、膀胱癌、或表達N-鈣粘蛋白的其他癌癥。本發(fā)明還涉及用靶向N-鈣粘蛋白的抗體治療癌癥的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，所述抗體可通過如下方式發(fā)揮作用激活或抑制NF κ-β信號傳導和轉錄；激活或抑制N-鈣粘蛋白內(nèi)在化；激活或抑制ΡΙ3激酶或Akt途徑；激活或抑制連環(huán)蛋白信號傳導；阻斷N-鈣粘蛋白與FGFR或其他酪氨酸激酶受體的異二聚化；或阻斷或增強被ADAMlO或其他金屬肽酶的切割。圖1是N-鈣粘蛋白介導的信號轉導的概述。圖1顯示了 NF-K i3、Akt和β-連環(huán)蛋白途徑的活化。本發(fā)明人提出的證據(jù)顯示，N-鈣粘蛋白抗體通過改變這些途徑中的一個或多個而發(fā)揮作用。^X“N-鈣粘蛋白和E-鈣粘蛋白”表示具有以下特點的核酸(例如，基因、前-mRNA、 mRNA)以及多肽、多態(tài)變體、等位基因、突變體和種間同源物)(1)所具有的氨基酸序列優(yōu)選在至少約25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸的區(qū)域上與由各參考核酸編碼的多肽或本文所述氨基酸序列(例如描述于GenBank登錄號NM_001792 (N-鈣粘蛋白mRNA)、NP_001783 (N-鈣粘蛋白)、ΝΜ_004360 (Ε-鈣粘蛋白 mRNA)和 ΝΡ_004351 (Ε-鈣粘蛋白))具有高于約60%的氨基酸序列相同性，6570%,75%,80%,85%,90%、優(yōu)選91 %、92%、 93% ,94^^95% ,96^^97^^98%或99%或更高的氨基酸序列相同性；(2)特異性結合于抗體(例如，多克隆抗體)，所述抗體針對包含如GenBank登錄號NP_001783(N_鈣粘蛋白)或NP_004351(E-鈣粘蛋白)所述參考氨基酸序列的免疫原；其各自的免疫原性片段，以及其各自的保守性修飾變體；(3)在嚴格雜交條件下與編碼分別如GenBank登錄號 NP_001783(N-鈣粘蛋白)或NP_004351 (E-鈣粘蛋白)所述的參考氨基酸序列的核酸及其各自的保守性修飾變體特異性雜交；(4)具有的核酸序列優(yōu)選在至少約25、50、100、150、 200、500、1000或更多核苷酸的區(qū)域上與如GenBank登錄號NM_001792 (N-鈣粘蛋白mRNA) 或ΝΜ_004360 (Ε-鈣粘蛋白mRNA)所示的參考核酸序列具有高于約95%，優(yōu)選高于約96%、 97^^98^^99%或更高的核酸序列相同性。多核苷酸或多肽序列通常來自哺乳動物，包括但不限于靈長類，例如人；嚙齒類，如大鼠、小鼠、倉鼠；牛、豬、馬、綿羊或任何哺乳動物。 本發(fā)明的核酸和蛋白質包括天然產(chǎn)生的或重組的分子。“癌癥”表示人的癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括實體瘤和淋巴樣癌、腎癌、 乳腺癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、結腸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、腦癌、頭頸癌、皮膚癌、子宮癌、睪丸癌、食道癌、肝癌、淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤)、白血病、以及多發(fā)性骨髓瘤?！懊谀蛏称靼┌Y”表示泌尿道和生殖組織的人類癌癥，所述組織包括但不限于腎臟、膀胱、泌尿道、尿道、前列腺、陰莖、睪丸、外陰、陰道、宮頸和卵巢組織。文中，要治療的癌癥可以是以N-鈣粘蛋白過度活化為特征的癌癥。或者，本文的要治療的癌癥可以是N-鈣粘蛋白以正?；蜉^低水平表達的癌癥，或是N-鈣粘蛋白被某細胞亞群表達的癌癥，以及N-鈣粘蛋白未過表達的癌癥。在本發(fā)明的一個實施方式中，將進行診斷或預后試驗以確定患者的癌癥是否以表達N-鈣粘蛋白為特征。可考慮各種確定這種擴增/表達的試驗，包括免疫組織化學、FISH和流出抗原試驗(shed antigen assay), DNA印跡、或PCR技術。此外，可用體內(nèi)診斷試驗，例如通過給予結合待檢測分子并被可檢測標記(例如，放射性同位素)標記的分子(如抗體)并在外部掃描患者以確定標記的定位， 來評價N-鈣粘蛋白的表達或擴增。在一些實施方式中，待治療的癌癥還不是侵襲性的，但表達N-鈣粘蛋白?！隘煼剐缘摹卑┌Y、腫瘤細胞和腫瘤表示對凋亡-介導的(例如，通過死亡受體細胞信號傳導，如，F(xiàn)as配體受體，TRAIL受體，TNF-Rl，化療藥物，射線)或非-凋亡介導的 (例如，毒藥，化學藥劑)癌癥療法(包括化療、激素療法、放療和免疫療法)產(chǎn)生抗性的或難治性的癌癥?！斑^表達”表示N-鈣粘蛋白、LY6-E和E-鈣粘蛋白在測試組織樣品中的RNA或蛋白質表達明顯高于N-鈣粘蛋白、LY6-E和E-鈣粘蛋白分別在對照組織樣品中的RNA或蛋白質表達。在一個實施方式中，所述組織樣品是自體的。與來自不太可能發(fā)展到轉移的患者的癌組織或與正常(即，非癌性)組織樣品的N-鈣粘蛋白或LY6-E表達相比，與侵襲、轉移、 激素非依賴性(例如，雄激素非依賴性)或治療難治性相關或類似可能性增加的癌性測試組織樣品(例如，膀胱，前列腺)的N-鈣粘蛋白或LY6-E mRNA或蛋白質的表達通常至少是 2倍，通常高達3、4、5、8、10或更高倍數(shù)。當觀察大致相似地負載有測試樣品和對照樣品的凝膠條帶時，更容易發(fā)現(xiàn)這種差異。表達增量的N-鈣粘蛋白或Ly6-E的前列腺癌更可能變
8成侵襲性、轉移性、或發(fā)展成雄激素非依賴性或治療難治性癌癥。由于原發(fā)性腫瘤中的小比例N-鈣粘蛋白或Ly6-E陽性細胞有可能鑒定出具有高復發(fā)和轉移風險的腫瘤，因此N-鈣粘蛋白或Ly6-E陽性可與各種截斷值(cutoff)相關。術語“過表達”或“過表達的”可互換指代與正常細胞相比，通常在癌細胞中可檢測到更高水平的轉錄或翻譯的基因。因此，過表達是指蛋白質和RNA的過表達(由于轉錄增加、轉錄后加工、翻譯、翻譯后加工、穩(wěn)定性改變以及蛋白質降解改變)，以及由于蛋白質運送模式改變(核定位增加)而導致的局部過表達，和功能活性提高(例如在底物的酶水解作用增加的情況下)。過表達也可以是相比正常細胞或參比細胞(例如，BPH細胞)提高50%、60%、70%、80%、90%或更高。術語“表達N-鈣粘蛋白的癌癥”和“與N-鈣粘蛋白的表達相關的癌癥”可互換使用，表示表達按照上述定義的N-鈣粘蛋白的癌細胞或組織。術語“癌癥相關抗原”或“腫瘤特異性標記物”或“腫瘤標記物”可互換使用，表示相比正常細胞，優(yōu)先在癌細胞中表達并可用來將藥劑優(yōu)先靶向癌細胞的分子(通常是蛋白質、碳水化合物或脂質)。標記物或抗原可在細胞表面或細胞內(nèi)表達。通常，癌癥相關抗原是相比正常細胞，在癌細胞內(nèi)以最小降解狀態(tài)穩(wěn)定或表達的分子，例如，與正常細胞相比表達為2倍、3倍或更高倍數(shù)。通常，癌癥相關抗原是在癌細胞內(nèi)不正常合成的分子，例如，相比在正常細胞上表達的分子，含有缺失、添加或突變的分子。通常，癌癥相關抗原將僅在癌細胞內(nèi)表達，且不會在正常細胞內(nèi)合成或表達。示例性的細胞表面腫瘤標記物包括，乳腺癌的蛋白c-erbB-2和人表皮生長因子受體(HER)，前列腺癌的PSMA，以及包括乳腺癌、卵巢癌和結腸直腸癌在內(nèi)的許多癌癥的碳水化合物粘蛋白類。示例性的胞內(nèi)腫瘤標記物包括，例如，突變的腫瘤抑制劑或細胞周期蛋白，如P53。相反，在來自更可能變成侵襲性、轉移性、或發(fā)展成雄激素非依賴性或治療難治性癌癥的癌癥患者的組織樣品中的癌組織樣品中，E-鈣粘蛋白通常表達不足。這種表達不足可以是2倍、3倍、4倍或至少5倍。在觀察大致類似地負載有測試樣品和對照樣品的凝膠條帶時，更容易發(fā)現(xiàn)這種差異。在更可能變成侵襲性、轉移性、或發(fā)展成雄激素非依賴性或治療難治性癌癥的癌癥中，N-鈣粘蛋白/E-鈣粘蛋白組合值因此更高，可以高到至少2倍、 3倍、4倍、5倍、10倍或者20倍。由于原發(fā)性腫瘤中的小比例N-鈣粘蛋白陽性細胞有可能鑒定出具有高復發(fā)和轉移風險的腫瘤，因此N-鈣粘蛋白陽性/e-鈣粘蛋白陰性可與各種截斷值相關?！凹觿?指結合于本發(fā)明多肽或多核苷酸，并刺激、提高、激活、促進、增強活性、敏化或上調本發(fā)明多肽或多核苷酸的活性或表達的試劑?！稗卓箘?指抑制本發(fā)明多肽或多核苷酸的表達、或結合、部分或完全阻斷刺激、 降低、防止、延遲激活、滅活、降低敏感性或下調本發(fā)明多肽或多核苷酸活性的試劑。表達或活性的“抑制劑”、“激活劑”和“調節(jié)劑”分別用來表示用體外和體內(nèi)表達或活性試驗鑒定的抑制、激活或調節(jié)分子，例如，配體、拮抗劑、激動劑以及它們的同系物和模擬物。術語“調節(jié)劑”包括抑制劑和激活劑。抑制劑是，例如，抑制本發(fā)明多肽或多核苷酸表達，或者結合、部分或完全阻斷刺激或酶活性、降低、防止、延遲激活、滅活、脫敏或下調本發(fā)明多肽或多核苷酸活性的物質，如拮抗劑。激活劑是，例如，誘導或激活本發(fā)明多肽或多核苷酸的表達，或者結合、刺激、提高、打開、激活、促進、增強活化或酶活性、敏化或上調本發(fā)明多肽或多核苷酸活性的物質，如激動劑。調節(jié)劑包括天然產(chǎn)生的和合成的配體、拮抗劑、激動劑、化學小分子等。鑒定抑制劑和激活劑的實驗包括例如，在存在或不存在本發(fā)明多肽或多核苷酸的條件下，將推定的調節(jié)劑化合物施加于細胞，然后測定其對本發(fā)明多肽或多核苷酸活性的功能性影響。將用潛在的激活劑、抑制劑或調節(jié)劑處理的包含本發(fā)明多肽或多核苷酸的樣品或試驗物與沒有抑制劑、激活劑或調節(jié)劑的對照樣品作比較，以檢測影響程度。將對照樣品(未用調節(jié)劑處理)的相對活性值指定為100%。相對于對照，本發(fā)明多肽或多核苷酸的活性值約為80%，任選為50%或25-1%時，實現(xiàn)了抑制。相對于對照，本發(fā)明多肽或多核苷酸的活性值為110%，任選為150%，任選為200-500%，或1000-3000%或更高時，實現(xiàn)了激活。本文所用的術語“測試化合物”或“候選藥物”或“調節(jié)劑”或其語法等價體描述了天然產(chǎn)生或合成的任何分子，例如蛋白質、寡肽(例如，長約5-約25個氨基酸，優(yōu)選長約 10-20或12-18氨基酸，優(yōu)選長12、15或18氨基酸)、有機小分子、多糖、脂質、脂肪酸、多核苷酸、RNAi、siRNA、抗體、寡核苷酸等。測試化合物可以是測試化合物文庫的形式，例如提供足夠多樣性的組合文庫或隨機文庫。測試化合物任選地連接于融合伙伴，如靶向化合物、 拯救化合物、二聚化化合物、穩(wěn)定化合物、可尋址化合物和其它官能部分。一般可通過鑒定具有某些所需特性或活性(例如抑制活性)的測試化合物(稱為“前導化合物”)、產(chǎn)生該前導化合物的變體、并評估那些變體化合物的特性和活性來產(chǎn)生具有有用特性的新化學實體。這種分析中常常采用高通量篩選(HTQ方法。“有機小分子”指天然產(chǎn)生或合成的有機分子，其分子量大于約50道爾頓并小于約 2500道爾頓，優(yōu)選小于約2000道爾頓，優(yōu)選介于約100-約1000道爾頓之間，更優(yōu)選介于約 200-約500道爾頓之間。細胞毒劑包括“細胞周期特異性”或“抗有絲分裂”或“細胞骨架相互作用”藥齊U。 這些術語可互換使用，表示阻斷有絲分裂中的細胞的任何藥劑。這種藥劑可用于化療。通常，細胞周期特異性藥物結合細胞骨架蛋白微管蛋白并阻斷微管蛋白聚合形成微管，從而導致細胞分裂停留在中期。示例性的細胞周期特異性藥物包括長春花生物堿類、紫杉烷類、 秋水仙堿和鬼白毒素。示例性的長春花生物堿類包括長春堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞濱。示例性的紫杉烷類包括紫杉醇和多西紫杉醇。細胞骨架相互作用藥物的其他例子包括 2-甲氧基雌二醇。“siRNA”或“RNAi”表示形成雙鏈RNA的核酸，當siRNA在與某基因或靶基因相同的細胞內(nèi)表達時，該雙鏈RNA能夠降低或抑制所述基因或靶基因的表達。“siRNA”或“RNAi” 因此表示由互補鏈形成的雙鏈RNA。雜交形成雙鏈分子的siRNA的互補部分通常基本相同或完全相同。在一個實施方式中，siRNA表示與靶基因基本相同或完全相同并形成雙鏈 siRNA的核酸。通常，siRNA的長度至少約15-50個核苷酸(例如，雙鏈siRNA每條互補序列的長度為15-50個核苷酸，且雙鏈siRNA的長度為約15-50個堿基對，優(yōu)選約20-30個堿基核苷酸，優(yōu)選長度為約20-25個或約24- 個核苷酸，例如長度為20、21、22、23、對、25、 26,27,28,29或30個核苷酸。siRNA分子和載體的設計和制造是本領域普通技術人員熟知的。例如，設計合適的 siRNA的有效方法是從mRNA轉錄本的AUG起始密碼子開始(例如，參見，圖5)并掃描AA 二核苷酸序列(參見Elbashir等EMBO J 20 :6877-6888 (2001)。每個AA和3，相鄰核苷酸是潛在的siRNA靶位點。相鄰位點序列的長度將決定siRNA的長度。例如，19個相鄰位點
10將得到21個核苷酸長的siRNA，具有3’突出端UU 二核苷酸的siRNA通常是最有效的。該方法也和用RNA pol III來轉錄發(fā)夾siRNA—致。RNA pol III在4_6個核苷酸poly (T) 處終止轉錄，從而形成具有短poly (U)尾的RNA分子。然而，具有其他3’末端二核苷酸突出端的siRNA也能有效產(chǎn)生RNAi，可根據(jù)經(jīng)驗選擇該序列。在選擇時，可通過BLAST檢索避免與其他編碼序列的同源性超過16-17個毗連堿基對的靶序列(參見美國國家生物技術信息中心(NCBI,National Center for Biotechnology Information),網(wǎng)址ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)?？芍苯邮┯胹iRNA，或用siRNA表達載體來誘導RNAi，其設計標準不同。載體可插入有由短間隔序列隔開并終止于用于終止轉錄的一串T的兩條反向重復序列。預計表達的 RNA轉錄物將折疊成短發(fā)夾siRNA。對于siRNA靶序列、編碼假設的發(fā)夾的莖的反向重復序列的長度、反向重復序列的順序、編碼發(fā)夾的環(huán)的間隔序列的長度和組成、以及是否存在5’ 突出端的選擇是可變的。siRNA表達盒的優(yōu)選順序是有義鏈、短間隔、和反義鏈。具有這些不同莖長度(例如，15-30)的發(fā)夾siRNA是適用的。連接發(fā)夾siRNA的有義鏈和反義鏈的環(huán)的長度是可變的(例如，3-9個核苷酸，或更長)。載體中可包含啟動子和表達增強子或操作性連接于編碼siRNA的核苷酸序列的其他調控元件。表述“控制序列”是指可操作連接的編碼序列在特定宿主有機體內(nèi)表達所必須的DNA序列。適用于原核細胞的控制序列， 例如，包括啟動子、任選操縱子序列以及核糖體結合位點。真核細胞已知利用啟動子、多聚腺苷酸信號和增強子。這些控制元件可設計成允許臨床醫(yī)生通過加入或控制被這些控制元件所響應的外部因素而關閉或打開基因表達。構建含有所需治療基因編碼和控制序列的合適載體時采用了本領域熟知的標準連接和限制技術(參見Maniatis等，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，冷泉港，紐約(1982))。分離的質粒、DNA序列或合成的寡核苷酸可被切割、修整、或重新連接成所需形式。當核酸與另一種核酸序列處于功能性相互關系中時，則該核酸是“可操作連接的”。例如，當前序列或分泌前導子的DNA表達為參與多肽分泌的前蛋白時，則該DNA與多肽的DNA可操作地連接；當啟動子或增強子可影響編碼序列的轉錄時，則該啟動子或增強子與該編碼序列可操作地連接；或者當核糖體結合位點所處的位置能促進翻譯時，則該核糖體結合位點與編碼序列可操作地連接。一般而言，“可操作連接”意味著被連接的DNA序列是相互靠近的，以及在分泌前導序列中是毗連的，并且處于閱讀框架中。然而，增強子不一定是連續(xù)的。在方便的限制性酶切位點上通過連接反應可完成連接。如果這樣的位點不存在，那么可按照常規(guī)實踐合成寡核苷酸接頭或連接子?！皽y定功能效應”表示對升高或降低間接或直接受本發(fā)明的多核苷酸或多肽影響的參數(shù)的化合物的測定，例如，測量物理和化學或表型效應。這種功能效應可通過本領域技術人員已知的任何方法來測定，例如，蛋白質的分光(例如，熒光、吸光度、折射率)、流體動力學(例如，形狀)、色譜或溶解性的改變；測量可誘導標記物或蛋白質轉錄活性；測量結合活性或結合試驗，例如，與抗體的結合；測量配體結合親和力的改變；測量鈣流；測量本發(fā)明多肽的酶產(chǎn)物的累積或者底物的消耗；改變酶活性，例如，激酶活性，測量本發(fā)明多肽蛋白質水平的變化；測量RNA穩(wěn)定性；G蛋白結合；G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)磷酸化或去磷酸化； 信號轉導，例如，受體-配體相互作用，第二信使?jié)舛?例如，cAMP、IP3、或胞內(nèi)Ca2+)；鑒定下游或報告基因(CAT、螢光素酶、β-gal、GFP等)的表達，例如，通過化學發(fā)光、熒光、比色反應、抗體結合、可誘導標記物以及配體結合試驗。將用潛在的激活劑、抑制劑或調節(jié)劑處理的包含本發(fā)明所述核酸或蛋白質的樣品或試驗物與沒有抑制劑、激活劑或調節(jié)劑的對照樣品作比較，以檢測抑制程度。將對照樣品 (未用抑制劑處理)的相對蛋白活性值指定為100%。相對于對照，活性值約為80%，優(yōu)選 50%，更優(yōu)選25-0%時，可實現(xiàn)抑制。當活性值相對于對照(未用激活劑處理)為110%， 更優(yōu)選150%，更優(yōu)選200-500% (即是對照的2-5倍)，更優(yōu)選1000-3000%時，可實現(xiàn)活化?！吧飿悠贰卑ńM織切片，例如活檢和尸檢樣品，以及為組織學目的取得的冷凍切片。這種樣品包括血液和血液組分或產(chǎn)物(例如，血清、血漿、血小板、紅細胞等)、痰、組織、培養(yǎng)細胞，例如原代培養(yǎng)物、外植塊、以及轉化細胞、糞便、尿液等。生物樣品通常獲自真核生物體，最優(yōu)選哺乳動物，例如靈長動物，如黑猩猩或人；牛；犬；貓；嚙齒動物，如豚鼠、 大鼠、小鼠；兔；或鳥類；爬行動物；或魚類。“活檢”指取出組織樣品以供診斷或預后評估的過程，也指組織樣本自身?？蓪⒈绢I域已知的任何活檢技術應用于本發(fā)明的診斷和預后方法。所應用的活檢技術通常取決于待評估的組織類型(即，前列腺、淋巴結、肝臟、骨髓、血細胞)、腫瘤的大小和類型(即實體的或懸浮的(即，血液或腹水))等因素。代表性的活檢技術包括切除活檢、切取活檢、 針吸活檢、手術活檢和骨髓活檢?！扒腥』顧z”表示將整個腫瘤體以及圍繞它的薄薄一層正常組織切離?！扒虚_式活檢”表示切取一包含腫瘤的橫切面直徑的楔形組織。通過內(nèi)窺鏡檢查或熒光顯微術做出的診斷或預后可要求對腫瘤實體進行“芯針活檢”或“細針抽吸活檢”，其通常將獲得腫瘤實體內(nèi)細胞的懸液。關于活檢技術的討論可參見，例如Harrison' s Principles of Internal Medicine (內(nèi)科學哈里森原理)，Kasper 等編，第 16 版，2005，第 70章，以及整個第V部分。就兩條或更多條核酸或多肽序列而言，術語“相同”或“相同性”百分比指利用默認參數(shù)如下所示的BLAST或BLAST 2. 0序列比較算法，或通過手工比對和目測觀察(參見， 例如NCBI網(wǎng)址ncbi. nlm. nih. gov/BLAST等)測定到兩條或更多條序列或子序列相同或具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，當在比較窗或指定區(qū)域進行最大對應性的比較和比對時，在特定區(qū)域上有約60%相同性，優(yōu)選65%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高相同性)。然后稱這些序列“基本上相同”。該定義還指或可適用于測試序列的互補(compliment)。該定義還包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。如下所述，優(yōu)選的算法可說明缺口等。優(yōu)選在至少約25個氨基酸或核苷酸長度，或更優(yōu)選在50-100個氨基酸或核苷酸長度的區(qū)域具有相同性。在序列比較中，一般將一種序列用作與測試序列相比的參比序列。使用序列比較算法時，將測試和參比序列均輸入計算機，如果必要則指定子序列坐標，并指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選使用默認的程序參數(shù)，或者可指定另選的參數(shù)。然后，該序列比較算法根據(jù)程序參數(shù)計算出測試序列相對于參比序列的序列相同性百分數(shù)。本文所用的“比較窗”包括參考選自20-600，通常約50-200，更常見約100-150中任一數(shù)量的毗連位置的區(qū)段，對兩個序列進行最優(yōu)比對后，可將該區(qū)段中的序列與相同數(shù)量毗連位置的參比序列作比較。比對序列進行比較的方法是本領域熟知的。可通過，例如如下的方法進行最優(yōu)序列比對以便比較=Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv. Appl. Math. 2 :482(1981)，Needleman 和 Wunsch 的同源性比對算法，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)， Pearson 和 Lipman 的相似性搜索法，Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 85 :2444(1988)，計算機化執(zhí)行這些算法(遺傳學計算組(Genetics Computer Group)的威斯康星遺傳學軟件包 (Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，575 理學博士(Science Dr.)，威斯康星州麥迪遜(Madison，WI))，或手工比對和目測(參見例如， 《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology) (Ausubel等編， 1995 增刊))。適合測定序列相同性和序列相似性百分數(shù)的算法的優(yōu)選例子分別是BLAST和 BLAST 2. O 算法，參見 Altschul 等，Nuc. Acids Res. 25 :3389-3402 (1977)和 Altschul 等， J. Mol. Biol. 215 =403-410 (1990)。使用BLAST和BLAST 2. 0，設定本文所述的參數(shù)，以確定本發(fā)明核酸和蛋白質的序列相同性百分數(shù)。進行BLAST分析的軟件可從公眾渠道由國家生物技術信息中心(NCBI)網(wǎng)站獲得。該算法包括首先通過在查詢序列中鑒定長度W的短字 (short words)來鑒定高評分序列對(HSP)，該短字與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時， 匹配或滿足一些正值閾值評分Τ。T稱為相鄰字評分閾值(Altschul等，同上)。將這些初始相鄰字的命中用作啟動搜索發(fā)現(xiàn)含有它們的更長的HSP的種子。該字命中在沿各序列的兩個方向上延伸，直到可增加累積的比對評分。對于核苷酸序列而言，利用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎勵評分；總是> 0)和N(錯配殘基的罰分；總是< 0)計算累積評分。對于氨基酸序列而言，用評分矩陣計算累積評分。在以下情況出現(xiàn)時，中止字命中在各個方向上的延伸累積比對評分比最大獲得值降低X ；由于一個或多個負評分殘基比對的累積，累積評分變?yōu)榱慊蛄阋韵?；或者達到各序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對核苷酸序列而言)采用的默認值如下字長(W)ll，期望值(E)10，M =5, N = -4，以及比較兩條鏈。對氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默認值為字長3， 期望值(E) 10，BL0SUM62 評分矩陣(參見 Henikoff 和 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915(1989))比對(B) 50，期望值(E) 10，M = 5，N =-4，以及比較兩條鏈?！昂怂帷敝竼捂溁螂p鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和它們的聚合物及其互補體。該術語包括含有已知核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或連接的核酸，它們是合成、天然產(chǎn)生的和非天然產(chǎn)生的，它們與參比核酸的結合特性類似，它們與參比核苷酸的代謝方式類似。這類類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯 (phosphoramidates)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2_0_甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有表明，特定核酸序列也隱含包括其保守修飾變體(如，簡并密碼子取代)和互補序列，以及明確指出的序列。具體說，可通過產(chǎn)生一個或多個選擇的(或所有)密碼子的第三個位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來獲得簡并密碼子取代(Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19 :5081 (1991) ；Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 2605-2608(1985) ；Rossolini 等，Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。術語核酸與基因、 cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互換使用。特定的核酸序列還隱含包括“剪接變體”。類似地，核酸編碼的特定蛋白質隱含包括該核酸的剪接變體編碼的任何蛋白質。如其名稱所暗示的，“剪接變體”是基因的可變剪接產(chǎn)物。轉錄后，可剪接初始核酸轉錄物，因而不同的(可變)核酸剪接產(chǎn)物能編碼不同多肽。產(chǎn)生剪接變體的機制有所不同，但包括外顯子的可變剪接。該定義還包括通過通讀轉錄而源自同一核酸的可變多肽(alternate polypeptide) 0該定義包括剪接反應的任何產(chǎn)物，包括重組形式的剪接產(chǎn)物。鉀通道剪接變體的例子描述于Leicher等，J.Biol. Chem. 273(52) :35095-35101 (1998)。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文可互換使用，指代氨基酸殘基的聚合物。該術語可應用于一個或多個氨基酸殘基是相應天然產(chǎn)生氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸聚合物，以及天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物和非天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。術語“氨基酸”指天然產(chǎn)生和合成的氨基酸、以及通過與天然產(chǎn)生氨基酸相類似方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產(chǎn)生的氨基酸是遺傳密碼編碼的氨基酸， 以及隨后修飾的氨基酸，如羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指與天然產(chǎn)生的氨基酸具有相同基本化學結構的化合物，即與氫、羧基、氨基和R基結合的 α碳，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物具有修飾的R基 (如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但與天然產(chǎn)生的氨基酸的基本化學結構保持相同。氨基酸模擬物指結構不同于氨基酸的普通化學結構，但作用方式類似于天然產(chǎn)生的氨基酸的化學化合物。在本文中，氨基酸可用IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的通用三字母代號或單字母代號表示。同樣，核苷酸可用其普遍接受的單字母代碼表示?！氨Ｊ匦揎椬凅w”適用于氨基酸和核酸序列。對于特定的核酸序列，保守修飾變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者當核酸不編碼氨基酸序列時，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶都編碼丙氨酸。因此，在密碼子確定為丙氨酸的每個位置上，可將密碼子改變?yōu)樗龅娜魏蜗鄳艽a子而不改變編碼的多肽。核酸變異是“沉默變異”，其是保守修飾變異的一種。本文所述的編碼多肽的每種核酸序列也描述該核酸的每種可能的沉默變異。本領域技術人員將認識到，可修飾核酸中的各個密碼子(除了 AUG和TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)，以產(chǎn)生功能相同的分子。 因此，就表達產(chǎn)物但不針對實際探針序列而言，在所述的各序列中暗示了編碼多肽的核酸的各沉默變異。至于氨基酸序列，本領域技術人員將認識到，對核酸、肽、多肽或蛋白質序列進行單個取代、缺失或加入，以在編碼序列中改變、加入或刪除一個氨基酸或少量氨基酸是“保守修飾變體”，該改變使得某一氨基酸被化學相似的氨基酸所取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本領域熟知的。這類保守修飾的變體包括并不排除本發(fā)明的多態(tài)性變體、 種間類似物和等位基因。以下八組各自含有可互相保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)，谷胺酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K) ；5)異亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸 (W) ；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見例如，Creighton， Proteins(1984))ο“標記”或“可檢測部分”是能通過分光光度方法、光化學方法、生物化學方法、免
14疫化學方法、化學方法或其它物理方法檢測的組成物。例如，有用的標記物包括32P、熒光染料、電子密度試劑、酶(如經(jīng)常用于ELISA)、生物素、地高辛、或可通過例如將放射性標記物摻入肽中而可檢測或可用于檢測與肽特異性反應的抗體的蛋白質和半抗原。在述及例如細胞、核酸、蛋白質或載體時，術語“重組”表示該細胞、核酸、蛋白質或載體已通過引入異源核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質作了修飾，或該細胞源自如此修飾的細胞。因此，例如重組細胞表達在天然(非重組)形式的細胞中未發(fā)現(xiàn)的基因或表達在其它情況下異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。用于核酸部分時，術語“異源”指該核酸包含在天然情況下不存在于同一關系中的兩個或多個子序列。例如，核酸一般是重組產(chǎn)生的，具有兩個或多個來自無關基因的序列， 它們經(jīng)排列組成新的功能性核酸，例如啟動子來自一個來源而編碼區(qū)來自另一來源。相似地，異源蛋白表示該蛋白包含天然情況下不存在于同一關系中的兩個或多個子序列(如融合蛋白)。短語“嚴格雜交條件”指探針與其靶子序列(通常在核酸的復雜混合物中)雜交，但不與其它序列雜交的條件。嚴格條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境中會有差異。較長的序列在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的詳細指導參見Ti jssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes (生物化學和分子生物學技術-用核酸探針雜交)，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays (雜交原理和核酸試驗方案概述)〃(1993)。 嚴格條件通常選擇比具體序列在規(guī)定離子強度PH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5-10°C。Tm是在規(guī)定的離子強度、PH和核酸濃度下，50%的與靶標互補的探針與靶序列雜交平衡時的溫度(由于存在的靶序列過量，Tffl時，在平衡時有50%的探針被占據(jù))。還可進入去穩(wěn)定劑， 例如甲酰胺來獲得嚴格條件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號是背景的至少兩倍，優(yōu)選是背景雜交的10倍。示范性的嚴謹雜交條件可以如下所述50%甲酰胺、5XSSC和 SDS，42°C培育，或者 5XSSC、1% SDS、65°C培育，用 0. 2X SSC 和 0. SDS 在 65°C洗滌。如果編碼的多肽基本相同，那么在嚴格條件下不相互雜交的核酸仍然基本相同。 例如，用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生核酸拷貝時，可能發(fā)生這種情況。在這種情況下，核酸一般在中等嚴格的雜交條件下雜交。示范性“中等嚴格雜交條件”包括37°C， 在40%甲酰胺、IM NaClU% SDS的緩沖液中雜交，45°C，1 XSSC洗滌。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領域普通技術人員不難認識到，可利用其他雜交和洗滌條件提供類似嚴格性的條件。許多參考文獻提供了確定雜交參數(shù)的其它指導，例如《新編分子生物學實驗指南》 (Current Protocols in Molecular Biology), Ausubel^lt 1 ^^^ ] (John ffiley&Sons)。對于PCR，低嚴格性擴增的溫度通常是約36°C，雖然退火溫度可以根據(jù)引物長度而介于約32 °C和48 °C之間不等。對于高嚴格性PCR擴增，典型的溫度是約62 °C，雖然高嚴格性退火溫度可以根據(jù)引物長度和特異性而介于約50°C和約65°C之間不等。高和低嚴格性擴增的典型循環(huán)條件包括90°C -95°C，30秒-2分鐘的變性階段，持續(xù)30秒-2分鐘的退火階段，和約72°C，1-2分鐘的延伸階段。低和高嚴格性擴增反應的方案和指導見，例如Irmis 等，(1990) PCR Protocols, AGuide to Methods and Applications (PCR 方案，方法和應用指南)，學術出版社公司(Academic Press, Inc.)，紐約)。
“抗體”指包含免疫球蛋白基因的框架區(qū)的多肽，或其特異性結合和識別抗原的片段。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε、和μ恒定區(qū)基因以及大量免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為Y、μ、α、δ或ε，進而分別限定了免疫球蛋白類別，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗體的抗原結合區(qū)對于結合的特異性和親和力至關重要。示例性免疫球蛋白(抗體)結構單位包含四聚體。各四聚體由相同兩對多肽鏈構成，各對具有一條“輕鏈”(約25kDa)和一條“重鏈”(約50-70kDa)。各鏈的N-末端限定了主要負責抗原識別的約100-110或更多個氨基酸的可變區(qū)。術語可變輕鏈和可變重鏈(Vh)分別指這些輕鏈和重鏈。存在的抗體可以是，例如完整的免疫球蛋白或用各種肽酶消化產(chǎn)生的許多充分表征的片段。因此，例如，胃蛋白酶消化抗體絞鏈區(qū)下的二硫鍵以產(chǎn)生F(ab) ’2，即Fab的二聚體，F(xiàn)ab本身是通過二硫鍵連接于Vh-ChI的輕鏈。F(ab)’2可在溫和條件下還原以打開絞鏈區(qū)的二硫鍵，從而將F(ab)’ 2 二聚體轉化成Fab’單體。Fab’單體實質上是具有絞鏈區(qū)部分的Fab (參見Fundamental Immunology (基礎免疫學)(Paul編，第3版，1993)。雖然根據(jù)完整抗體的消化定義了各種抗體片段，技術人員應知道，可通過化學方法或采用重組DNA 技術從頭合成這些片段。因此，本文所用的術語“抗體”還包括通過修飾完整抗體產(chǎn)生的抗體片段，或采用重組DNA方法從頭合成的那些(例如，單鏈Fv)或利用噬菌體展示文庫鑒定的那些(參見，例如 McCafferty 等，Nature 348 :552-554 (1990)) 為了制備合適的本發(fā)明抗體以及為了本發(fā)明的應用，如重組體、單克隆或多克隆抗體，可適用本領域已知的多種技術(參見，例如，Kohler&Milstein，Nature 256 495-497(1975) ；Kozbor 等，Immunology Today 4:72(1983) ；Cole 等，第 77-96 頁，《單克隆抗體禾口癌癥治療》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy), Alan R. Liss, Inc. (1985) ；Coligan，《免疫學最新實驗指南》(Current Protocols in Immunology) (1991)； Harlow&Lane，《抗體實驗室手冊》(Antibodies，A Laboratory Manual) (1988)；和 Goding， 《單克隆抗體原則與實踐》(Monoclonal Antibodies =Principles and Practice)(第二版， 1986))。編碼感興趣抗體重鏈和輕鏈的基因可從細胞克隆，例如，編碼單克隆抗體的基因可從雜交瘤克隆并用來制造重組單克隆抗體。編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因文庫也可從雜交瘤或血漿細胞制造。重鏈和輕鏈基因產(chǎn)物的隨機組合將產(chǎn)生大量具有不同抗原特異性的抗體(參見，例如，Kuby，Immunology (第三版，1997))。制造單鏈抗體或重組抗體的技術 (美國專利4，946，778，美國專利4，816，567)也適用于制造本發(fā)明多肽的抗體。同時，轉基因小鼠或其他生物(如其他哺乳動物)也可用來表達人源化抗體或人抗體(參見，例如，美國專利 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016，Marks 等， Bio/Technology 10:779-783(1992) ；Lonberg 等，Nature 368:856-859(1994) ；Morrison, Nature 368:812-13(1994) ；Fishwild 等，Nature Biotechnology 14:845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996)； 禾口 Lonberg&Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93 (1995))?；蛘?，噬菌體展示技術可用來鑒定特異性結合所選抗原的抗體和異聚 Fab 片段(參見，例如，McCafferty 等，Nature348 :552-554(1990) ；Marks 等， Biotechnology 10 :779-783 (1992))?？贵w可被制成雙特異的，即能夠識別兩種不同抗原(參見，例如，WO 93/08829，Traunecker 等，EMBO J. 10 :3655-3659(1991)；禾口 Suresh等，《酶學方法》(Methods in Enzymology) 121 :210(1986)) 0抗體也可以是異源偶聯(lián)物， 例如，兩個共價結合的抗體，或免疫毒素(參見，例如，美國專利4，676，980，WO 91/00360 ； W092/200373 ；和 EP 03089)。人源化或靈長動物化非人抗體的方法是本領域熟知的。通常，人源化抗體含有從非人來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常稱為輸入殘基(import residue)，它們通常取自輸入可變區(qū)。人源化實質上可根據(jù)Winter及其同事(參見，例如，Jones 等，Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen 等，kience 239:1534-1536(1988)和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992))的方法，用嚙齒類CDR或CDR序列取代人抗體的相應序列。因此，這種人源化抗體是嵌合抗體(美國專利號4，816，567)，其中基本上短于完整的人可變區(qū)被非人種類的相應序列取代。在實踐中，人源化抗體一般是一些CDR殘基，可能是一些FR殘基被嚙齒動物抗體中相似位點的殘基所取代的人抗體。“嵌合抗體”是滿足以下條件的抗體分子，其中(a)恒定區(qū)，或其部分，是改變的、 取代的或交換的，從而抗原結合位點(可變區(qū))連接于類別、效應功能和/或種類不同或改變的恒定區(qū)，或連接于能賦予嵌合抗體新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區(qū)，或其部分，是改變的、取代的或交換的，從而可變區(qū)具有不同的或改變的抗原特異性。優(yōu)選本發(fā)明的抗體以及優(yōu)選用于本發(fā)明的抗體包括人源化抗體和 /或嵌合單克隆抗體。一個實施方式中，所述抗體偶聯(lián)于“效應物”部分。效應物部分可以是任何數(shù)量的分子，包括標記物部分，例如放射性標記物或熒光標記物，或者可以是治療部分。在一方面， 抗體調節(jié)蛋白質的活性。這種效應物部分包括，但不限于，抗腫瘤藥、毒素、放療劑、細胞因子、第二抗體或酶。此外，本發(fā)明提供的一個實施方式中，本發(fā)明的抗體連接于將前藥轉變?yōu)榧毎緞┑拿浮Ｃ庖吲悸?lián)物可用來將效應物部分靶向N-鈣粘蛋白陽性細胞，尤其是表達N-鈣粘蛋白或Ly6蛋白的細胞。通過觀察類似地負載有測試樣品和對照樣品的凝膠條帶，很容易發(fā)現(xiàn)這種差異。細胞毒劑的例子包括，但不限于蓖麻蛋白，多柔比星，柔紅霉素，紫杉醇， 溴化乙錠，絲裂霉素，依托泊甙，替尼泊甙，長春新堿，長春堿，秋水仙堿，二羥基炭疽菌素二酮，放線菌素D，白喉毒素，假單胞菌外毒素(PE)A，PE40，相思豆毒蛋白，和糖皮質激素和其他化療劑，以及放射性同位素。合適的檢測標記物包括，但不限于，放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學發(fā)光化合物、金屬螯合劑或酶。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了抗N-鈣粘蛋白的抗體。N-鈣粘蛋白抗體可全身使用以治療癌癥(例如，前列腺或膀胱癌)，可單獨使用或與效應物部分偶聯(lián)。偶聯(lián)于毒劑(如蓖麻蛋白)的N-鈣粘蛋白抗體、以及未偶聯(lián)的抗體可為天然靶向帶有N-鈣粘蛋白的前列腺癌細胞的有用的治療劑。這種抗體可用于阻斷侵襲。適用于本發(fā)明的N-鈣粘蛋白抗體包括，但不限于，GC4、1H7、1F12和2B3。此外，包含任何一種本發(fā)明所述單克隆抗體的抗原結合區(qū)的本發(fā)明的重組蛋白可用來治療癌癥。在這種情況下，重組蛋白的抗原結合區(qū)結合于具有治療活性的第二蛋白的至少一個功能活性部分。所述第二蛋白可包括，但不限于酶、淋巴因子、制瘤素或毒素。 合適的毒素包括多柔比星，柔紅霉素，紫杉醇，溴化乙錠，絲裂霉素，依托泊甙，替尼泊甙，長春新堿，長春堿，秋水仙堿，二羥基炭疽菌素二酮，放線菌素D，白喉毒素，假單胞菌外毒素 (ΡΕ) A，PE40，蓖麻蛋白，相思豆毒蛋白，糖皮質激素和放射性同位素。將治療劑偶聯(lián)于抗體的技術是公知的，參見例如，Arnon等，“在癌癥治療中用藥物的免疫革巴向的單克隆抗體” (Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)，刊于《單克隆抗體和癌癥治療》(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)，Reisfeld 等(編)，第對3_56 頁(ARL 公司(Alan R. Liss, Inc.) 1985)； Hellstrom等，“用于藥物遞送的抗體”(Antibodies For Drug Delivery)，刊于《控制的藥物遞送》(Controlled Drug Delivery)(第 2 版)，Robinson 等(編)，第 623-53 頁 (MD公司(Marcel Dekker，Inc). 1987) Jhorpe，“癌癥治療中細胞毒劑的抗體載體綜述，，(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review),干丨J于《單克隆抗體，84 :生物和臨床應用》(Monoclonal Antibodies' 84 =Biological and Clinical Applications) ,Pinchera等(編)，第 475-506 頁(1985)；和 Thorpe 等，“抗體-毒素偶聯(lián)物的制備禾口細胞毒特性”(The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates), Immunol. Rev. ,62 :119-58(1982))。涉及蛋白質或肽時，術語“特異性(或選擇性)結合”于抗體或“與...發(fā)生特異性(或選擇性)免疫反應”指能在蛋白質和其它生物物質的異質群體中確定該蛋白質的存在的結合反應。因此，在指定的免疫試驗條件下，該特異性抗體與特定蛋白質的結合至少為背景的兩倍，更一般是背景的10-100倍以上。在這些條件下，抗體的特異性結合需要根據(jù)其與特定蛋白質的特異性而選擇的抗體。例如，可選擇多克隆抗體，以便只獲得與所選抗原而不與其他蛋白質發(fā)生特異性免疫反應的多克隆抗體?？赏ㄟ^減去與其他分子發(fā)生相互作用的抗體來實現(xiàn)這種選擇?？衫酶鞣N免疫測定形式選擇與特定蛋白質發(fā)生特異性免疫反應的抗體。例如，通常用固相ELISA免疫測定來選擇與蛋白質發(fā)生特異性免疫反應的抗體(參見,例如，Harlow&Lane,《抗體應用實驗室手冊》(Using Antibodies, A Laboratory Manual) (1998)中描述了用來確定特異性免疫反應性的免疫測定形式和條件)。本文的“治療有效量或劑量”表示產(chǎn)生給藥所需作用的劑量。準確劑量和制劑將取決于治療目的，并將由本領域技術人員采用已知技術確定(參見，例如，Lieberman，《藥物劑型》(Pharmaceutical Dosage Forms)(第1-3卷，1992) ；Lloyd，《制藥工藝、科學與技術》 (The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding) (1999)；《雷明頓藥物禾斗學與實踐〉〉(Remington :The Science and Practice of Pharmacy),第 20 版,Gennaro 編(2003)；以及 Pickar，《劑量計算》(Dosage Calculations) (1999))。術語"藥學上可接受的鹽"或"藥學上可接受的載體"應包括根據(jù)本文所述化合物上發(fā)現(xiàn)的具體取代基，用相對無毒的酸或堿制備的活性化合物的鹽。當本發(fā)明化合物含有相對酸性的官能團時，可通過將該化合物的中性形式接觸足量所需堿來獲得堿加成鹽，所述堿可以是純的堿形式或在合適惰性溶劑中的形式。藥學上可接受的堿加成鹽的例子包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、銨鹽、有機氨基或鎂鹽，或類似鹽。當本發(fā)明化合物含有相對堿性的官能團時，可通過將該化合物的中性形式接觸足量所需酸來獲得酸加成鹽，所述酸可以是純酸形式或在合適惰性溶劑中的形式。藥學上可接受的酸加成鹽的例子包括衍生自無機酸的鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽，磷酸鹽、磷酸氫鹽，磷酸二氫鹽、 硫酸鹽、硫酸氫鹽、氫碘酸鹽或亞磷酸鹽等，以及衍生自相對無毒的有機酸的鹽，如乙酸鹽、
18丙酸鹽、異丁酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、富馬酸鹽、乳酸鹽、 扁桃酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、苯磺酸鹽、對甲基苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽等。也包括氨基酸的鹽，如精氨酸鹽等，和有機酸的鹽，如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的鹽(參見例如，Berge 等，Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19(1977))。本發(fā)明的某些特定化合物含有能夠使該化合物轉變?yōu)閴A或酸加成鹽的堿性和酸性官能團。本發(fā)明適合使用本領域技術人員已知的其它藥學上可接受的載體?？蓪⒃擕}與堿或酸接觸，并以常規(guī)方式分離母體化合物，從而再生該化合物的中性形式。該化合物的母體形式的某些物理特性(例如在極性溶劑中的溶解度)與各種鹽形式不同，但在本發(fā)明目的的其它方面該鹽等同于該化合物的母體形式。除鹽形式以外，本發(fā)明還提供前藥形式的化合物。本文所述化合物的前藥是在生理條件下容易通過化學改變而提供本發(fā)明的化合物。此外，在離體環(huán)境下，前藥可通過化學或生化方法轉變?yōu)楸景l(fā)明化合物。例如，放置在含有合適酶或化學試劑的透皮貼片儲庫中時，前藥可緩慢轉變?yōu)楸景l(fā)明化合物。本發(fā)明的某些化合物可以非溶劑合形式以及溶劑合形式(包括水合形式)存在。 通常，溶劑合形式等同于非溶劑合形式，均應落入本發(fā)明范圍。本發(fā)明某些化合物可以多晶形式或無定形形式存在。通常，在本發(fā)明所考慮的應用中所有物理形式是等同的，這些物理形式均應落入本發(fā)明范圍。本發(fā)明某些化合物具有不對稱碳原子(光學中心)或雙鍵；外消旋物、非對映異構體、幾何異構體和單個異構體均應落入本發(fā)明范圍。上皮向間質轉化(EMT)表示上皮腫瘤細胞獲得了間質特征。在癌癥中，EMT與侵襲和運動行為(motile behavior)相關，并且可能是轉移情況下的主要過程。EMT與預后不良相關，并由多種轉錄因子(如SNAIL、SLUG和TWIST)介導。E-鈣粘蛋白是一種細胞表面蛋白，它參與上皮細胞-細胞黏附，且通常在侵襲性和轉移性實體瘤中消失。詳細實施方式本發(fā)明描述了兩種產(chǎn)生能結合N-鈣粘蛋白抗原決定簇的單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞系。所述小鼠雜交瘤細胞系以ATCC登錄號PTA-9387(1H7)和ATCC登錄號 PTA-9388 (EC4)保藏。在本發(fā)明的一個實施方式中，抗體是由以ATCC登錄號PTA-9387保藏的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的。在本發(fā)明的另一個實施方式中，抗體是由以ATCC登錄號PTA-9388保藏的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的。以ATCC登錄號PTA-9387和ATCC登錄號PTA-9388保藏的細胞遵照布達佩斯條約，于2008年7月23日保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，10801大學路(University Boulevard)，馬納薩斯，弗吉尼亞州，20110。在2008年8月29日檢測并證實了存活。在本發(fā)明的一些實施方式中，制造了能夠在體內(nèi)或體外結合與以ATCC登錄號 PTA-9387保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏所的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體相同的N-鈣粘蛋白抗原決定簇的抗體或其片段。在本發(fā)明的一些實施方式中，制造了能夠在體內(nèi)或體外結合與以ATCC登錄號PTA-9388保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏所的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體相同的N-鈣粘蛋白抗原決定簇的抗體或其片段。
在一些實施方式中，所述抗體能夠結合N-鈣粘蛋白的第一胞外結構域。在一些實施方式中，所述抗體能夠結合N-鈣粘蛋白的第二胞外結構域。在一些實施方式中，所述抗體能夠結合N-鈣粘蛋白的第三胞外結構域。在一些實施方式中，所述抗體能夠結合N-鈣粘蛋白的第一到第三胞外結構域。在一些實施方式中，所述抗體能夠結合N-鈣粘蛋白的第四胞外結構域。本發(fā)明還涉及抑制患者體內(nèi)癌細胞生長或將所述癌細胞殺死的方法。所述方法通常包括在下述條件下，將權利要求5或11所述的抗體或其結合片段給予患者足以使所述抗體或其結合片段結合所述腫瘤細胞或前列腺癌腫瘤細胞；調節(jié)細胞活性；抑制腫瘤細胞血管發(fā)生；以及造成腫瘤細胞生長抑制或死亡，其中所述癌細胞表達或過表達N-鈣粘蛋白。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述抗體通過激活或抑制NF κ-β信號傳導和轉錄而調節(jié)細胞活性。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述抗體通過激活或抑制N-鈣粘蛋白內(nèi)在化而調節(jié)細胞活性。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述抗體通過激活或抑制ΡΙ3激酶或Akt 途徑而調節(jié)細胞活性。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述抗體通過激活或抑制連環(huán)蛋白信號傳導而調節(jié)細胞活性。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述抗體通過阻斷N-鈣粘蛋白與FGFR或其他酪氨酸激酶受體的異二聚化而調節(jié)細胞活性。在本發(fā)明的一些其他實施方式中，所述抗體通過阻斷或增強ADAMlO或其他金屬肽酶的切割作用而調節(jié)細胞活性。在一些實施方式中，所述抗體抑制患者體內(nèi)泌尿生殖器癌細胞生長或將所述癌細胞殺死。在一些實施方式中，所述抗體抑制患者體內(nèi)前列腺癌細胞生長或將所述癌細胞殺死。在一些其他實施方式中，所述抗體抑制患者體內(nèi)膀胱癌細胞生長或將所述癌細胞殺死。制劑和給藥按照已知方法將抗-N-鈣粘蛋白抗體或免疫偶聯(lián)物給予人類患者，如靜脈內(nèi)給藥，例如作為推注或通過在一段時間內(nèi)連續(xù)灌注，通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi) (intracerobrospinal)、皮下、關節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑。優(yōu)選通過靜脈內(nèi)或皮下給予抗體。給藥可以是局部給藥或全身給藥。要給予的組合物通常包含溶于藥學上可接受載體(優(yōu)選水性載體)的本文所述藥劑(例如，N-鈣粘蛋白抑制劑，N-鈣粘蛋白抗體和免疫偶聯(lián)物，N-鈣粘蛋白siRNA以及它們的載體)。可使用各種水性載體，如緩沖鹽水等等。這些溶液是無菌的且通常不含不需要的物質。這些組合物可通過常規(guī)的已知滅菌技術除菌。該組合物可含有模擬生理條件所需的藥學上可接受的輔助物質，如PH調節(jié)劑和緩沖劑、毒性調節(jié)劑等，例如，乙酸鈉、氯化鈉、 氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些制劑中的活性劑濃度可廣泛變化，主要根據(jù)液體體積、粘度、體重等因素，按照所選的特定給藥方式和患者需要進行選擇。因此，典型的供靜脈內(nèi)給藥的藥物組合物將隨藥劑而不同。制備可通過胃腸外途徑給藥的組合物的實際方法是本領域技術人員所熟知的，更詳細描述參見《雷明頓藥物科學》，第15版，麥克出版公司(Mack Publishing Co.，Easton，PA，1980)等出版物中?？筛鶕?jù)給藥方法以各種單位劑型給予藥物組合物。例如，適合口服給藥的單位劑型包括但不限于粉末、片劑、藥丸、膠囊和錠劑。已知當通過口服給予抗體時，應對其進行保護以避免被消化。這通常是通過將分子與使分子抵抗被酸和酶水解的組合物進行復合， 或通過將分子包裝在具有恰當抗性的載體(如脂質體或保護屏障)中實現(xiàn)的。保護藥劑避免被消化的方法是本領域已知的。藥物制劑，尤其是用于本發(fā)明的抗體和免疫偶聯(lián)物以及抑制劑的藥物制劑，可通過將具有所需純度的抗體與任選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合制成。這種試劑可以是凍干制劑或水性溶液?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用劑量和濃度下對受體無毒。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑可以是乙酸、磷酸、檸檬酸、以及其他有機酸；抗氧化劑(例如，抗壞血酸)防腐劑；低分子量多肽；蛋白質，如血清白蛋白或明膠，或親水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；以及氨基酸、單糖、二糖、以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑；以及離子和非離子表面活性劑(例如，聚山梨酯)；成鹽抗衡離子如鈉；金屬絡合物(例如Zn-蛋白絡合物)；和/或非離子表面活性劑?？蓪⒖贵w的濃度配制成 0. 5-200mg/ml 或 10-50mg/mlo制劑中也可提供其他活性化合物，包括化療劑、細胞毒劑、細胞因子、生長抑制劑和抗激素試劑?；钚猿煞忠部杀恢瞥删忈屩苿?例如，固體疏水聚合物的半透基質(例如， 聚酯，水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚丙交酯。抗體和免疫偶聯(lián)物也可包入通過(例如)凝聚技術或界面聚合制備的微膠囊中，例子分別是羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，或包入膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)或包入粗滴乳液(macroemulsion)中。可給予所述組合物進行治療或預防處理。在治療應用中，可將“治療有效量”的組合物給予患病(例如，癌癥)患者。對這種應用有效的量將取決于疾病的嚴重性以及患者的總體健康狀態(tài)。根據(jù)所需劑量和頻率以及患者的耐受性采取單次或多次給予組合物。出于本發(fā)明的目的，“患者”或“對象”包括人和其他動物，尤其是哺乳動物。因此，所述方法可用于人類治療和獸醫(yī)應用。在優(yōu)選實施方式中，所述患者是哺乳動物，優(yōu)選靈長類，在最優(yōu)選實施方式，所述患者是人。其他已知癌癥療法可與本發(fā)明方法組合使用。例如，用于本發(fā)明的組合物也可用來將細胞靶向其他癌癥治療劑或使細胞對其他癌癥治療劑敏感，所述其它癌癥治療劑為例如5FU、長春堿、放線菌素D、順鉬、甲氨蝶呤等。在其他實施方式中，本發(fā)明方法與其他癌癥療法(例如，根治性前列腺切除術)， 放療(外線束或近距離放射療法)，激素療法(例如，睪丸切除術，抑制睪酮產(chǎn)生的LHRH-類似物療法，抗-雄激素療法)，或化療組合使用。根治性前列腺切除術包括除去完整前列腺和某些外圍組織。當癌癥還未擴散出該組織時通常采用這種處理。放療通常用來治療仍舊局限在前列腺內(nèi)或已經(jīng)擴散到周圍組織的前列腺癌。如果疾病進一步發(fā)展，可采用放療來縮小腫瘤體積。激素療法通常用于前列腺癌已經(jīng)擴散到前列腺之外的患者或復發(fā)患者。激素療法的目的是降低男性激素雄激素的水平，從而使前列腺癌縮小或生長更加緩慢。促黃體素釋放素(LHRH)促進睪酮產(chǎn)生的減少。這些藥劑可每月或更長時間注射一次。兩種這樣的類似物是亮丙瑞林和戈舍瑞林。也可采用抗雄激素(例如，氟他胺、比卡魯胺和尼魯米特)。雄激素完全阻斷表示組合使用抗雄激素和睪丸切除術或LHRH類似物?；熆捎糜谇傲邢侔┮呀?jīng)擴散到前列腺外且激素療法失敗的患者。它不能破壞全部的癌細胞，但能減慢腫瘤生長和減輕疼痛。一些化療藥可用來治療用激素療法治療后腫瘤恢復生長或繼續(xù)生長并且發(fā)生擴散的前列腺癌，這些化療藥為例如多柔比星(亞德里亞霉素)、雌氮芥、依托泊甙、米托蒽醌、長春堿和紫杉醇。兩種或多種藥物通常一起給予以降低癌細胞對化療產(chǎn)生耐藥性的可能性。小細胞癌是一種罕見的前列腺癌，相比激素療法，它對化療的響應更強。
在一些實施方式中，“保心藥”也與N-鈣粘蛋白抗體、N-鈣粘蛋白結合抑制劑或N-鈣粘蛋白siRNA分子組合用于本發(fā)明(參見，美國專利6，949，M5)。保心藥是一種防止或降低與施用藥物(如給患者施用蒽環(huán)類抗生素)相關的心肌功能障礙(即心肌病和/或充血性心力衰竭)的化合物或組合物。保心藥可以，例如，阻斷或降低自由基介導的心臟毒效應和/或防止或降低氧化應激損傷。該定義所包含的保心藥的離子包括鐵螯合劑右雷佐生(ICRF-187) (Seifert等，《藥物治療年鑒》(The Annals of Pharmacotherapy) 28 :1063-1072(1994))；降脂藥和 / 或抗氧化劑，如普羅布考(Singal 等，J. Mol. Cell Cardiol. 27 :1055-1063(1995))；氨磷汀(氨基硫醇 2_[ (3-氨基丙基) 氨基]乙硫醇-二氫磷酸酯，也稱為WR-2721，以及稱為WR-1065的其脫磷酸細胞攝取形式)和S-3-(3-甲基氨基丙基氨基)丙基磷-硫代酸(WR-151327)，參見Green等，Cancer Research 54:738-741(1994)；地高辛(Bristow, Μ. R.選自 Bristow M R 編的《藥物誘導的心臟病》(DrugHnduced Heart Disease)，紐約Elsevier 191-215 (1980)) ； β -阻斷劑，如美托洛爾(Hjalmarson 等 Drugs 47 =Suppl 4 :31-9(1994)；和 Shaddy 等，Am. Heart J. 129:197-9(1995))；維生素E ；抗壞血酸(維生素C)；自由基清除劑，如齊墩果酸，熊果酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)；自旋捕獲化合物，如α-苯基-叔丁基硝酮(PBN) ； (Paracchini 等，Anticancer Res. 13 :1607-1612 (1993))；有機硒基化合物如 P251 (Elbesen)；等等。組合給藥考慮采用單獨的制劑或單一藥物制劑同時服藥，以及以任意順序連續(xù)給藥，其中優(yōu)選在一定時期內(nèi)兩種(或所有)活性劑同時發(fā)揮它們的生物學活性。經(jīng)鑒定的間接或直接調節(jié)N-鈣調蛋白表達和/或功能的分子和化合物可分別用來治療表達N-鈣調蛋白的癌癥。N-鈣粘蛋白調節(jié)劑可單獨給予或與常規(guī)的化療、放療或免疫療法以及現(xiàn)已開發(fā)的療法組合給予。適合口服給藥的制劑包括(a)液體溶液，如懸浮在稀釋劑(如水、鹽水和/或PEG 400)中的有效量的包裝核酸；(b)膠囊、囊劑或片劑，其各自含有預定量的液態(tài)、固態(tài)、顆粒狀或凝膠狀的活性成分；(c)懸浮在合適液體中的懸浮液；和(d)合適的乳劑。片劑形式可包含以下一種或多種乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸鈣、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、明膠、膠體二氧化硅、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸、以及其他賦形劑、著色劑、填料、粘合劑、稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑、調味劑、染料、崩解劑和藥學上相容的載體。錠劑形式可在調味劑(如蔗糖)中包含活性成分，同時，軟錠劑的活性成分包含在惰性基質中，如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠乳劑、凝膠等，其中除了包含活性成分以外，還含有本領域已知的載體。單獨的或與其他合適化合物組合的所選化合物，可被制成氣溶膠制劑(即可“噴霧”)以便通過吸入給予?？蓪馊苣z制劑放入可接受的加壓推進劑，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等中。適合直腸給藥的制劑包括，例如，栓劑，其由包裝的核酸和栓劑基質構成。合適的栓劑基質包括天然或合成的甘油三酯或鏈烷烴類。此外，也可能使用明膠直腸膠囊，它由選出的化合物和基質組合而成，所述基質包括，例如，液體甘油三酯、聚乙烯二醇和鏈烷烴。適合腸胃外給藥(例如通過節(jié)間(關節(jié)內(nèi))、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、瘤內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、 和皮下途徑給藥)的制劑包含水性和非水性的等滲無菌注射液，其中可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與受者的血液等滲的溶質，以及水性和非水性無菌懸浮液，其中可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。在本發(fā)明的實踐中，可通過例如靜脈輸注、口服、局部、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)或鞘內(nèi)途徑給予組合物。優(yōu)選的給藥方法是腸胃外給藥、口服給藥和靜脈內(nèi)給藥?；衔锏闹苿┛纱嬖谟趩挝粍┝炕蚨鄤┝棵芊馊萜鲀?nèi)，如安瓿或藥瓶?？蓮闹懊枋鲱愋偷臒o菌粉末、顆粒和片劑制備注射溶液或懸浮液。被用于離體療法的核酸轉化的細胞也可通過上述靜脈內(nèi)或腸胃外途徑給予。藥物制品優(yōu)選采取單位劑型。在這種形式中，制品被分成含有適量活性組分的單位劑量。所述單位劑型可以是包裝的制品，所述包裝內(nèi)含有單獨量的制劑，如包裝在藥瓶或安瓿中的藥片、膠囊和粉末。同時，單位劑型也可以是膠囊、藥片、扁膠囊或錠劑本身，或者可以是含合適數(shù)量膠囊、藥片、扁膠囊或錠劑的包裝形式。如果需要，組合物中也可含有其他相容的治療劑。優(yōu)選的藥物制品將一種或多種活性N-鈣粘蛋白調節(jié)劑，任選與一種或多種化療劑或免疫治療劑組合，以緩釋制劑形式遞送。通常，在治療應用中，N-鈣粘蛋白調節(jié)劑作為致敏劑給予，用來提高腫瘤細胞對包括化療、放療、免疫療法和激素療法在內(nèi)的其他細胞毒癌癥療法的敏感型。在治療癌癥的治療用途中，用于本發(fā)明藥物方法的N-鈣粘蛋白調節(jié)劑或抑制劑的最初給藥劑量為每天約0. 001至約1000mg/kg?？刹捎玫娜談┝糠秶鷱募s0. 01mg/kg至約 500mg/kg，或約 0. lmg/kg 至約 200mg/kg，或約 lmg/kg 至約 100mg/kg，或約 10mg/kg 至約 50mg/kg。然而，劑型也可根據(jù)患者的需求、治療的疾病的嚴重性以及所采用的化合物而變化。例如，可考慮特定患者所診斷的癌癥類型和階段，根據(jù)經(jīng)驗決定劑量。就本發(fā)明而言，給予患者的劑量在一段時間后，應足以產(chǎn)生有益治療反應。劑量范圍將取決于特定患者中與給予特定載體或轉導細胞類型相伴的任何不良副作用的存在、性質和程度。醫(yī)師懂得如何決定用于具體情況的合適劑量。通常，用小于該化合物最優(yōu)劑量的較小劑量開始治療。之后，以較小振幅提高劑量，直至在相應條件下達到最佳效果。為簡便起見，如果需要，可將總的日劑量分開并在一天內(nèi)分次給予。用于本發(fā)明的藥物制品(例如，N-鈣粘蛋白siRNA、N-鈣粘蛋白抗體、N-鈣粘蛋白疫苗、N-鈣粘蛋白抑制劑和免疫偶聯(lián)物)通常被遞送給哺乳動物，包括人和其他非人哺乳動物。用本發(fā)明方法治療的非人哺乳動物包括家養(yǎng)動物(即狗類、貓類、鼠類、嚙齒動物類、和兔類)以及農(nóng)業(yè)動物(牛、馬、羊、豬)。
實施例提供以下實施例，以說明而非限制要求保護的本發(fā)明。實施例1 采用TAL作為陰性對照的NF κ β受體實驗。如圖2-3所示，在穩(wěn)定表達N-鈣粘蛋白的細胞中NFk β受體活性提高。在充滿和耗盡雄激素的介質中均如此。還顯示，由于LNCaP-Cl表達的N-鈣粘蛋白多于C2和C3， NFK β活性與N-鈣粘蛋白表達的量相關。實施例2如圖4-5所示，N-鈣粘蛋白在LNCaP-Cl細胞的細胞表面表達，這些細胞具有較高量的NFk β表達，但NF κ β被激活，如Cl細胞中的強核信號所示。對照細胞也表達 NFK β，但主要定位在胞質。
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實施例3圖6-7顯示N-鈣粘蛋白對NF κ β的活化顯示出NFk β靶基因TGF β、IL-6、IL-8 和bcl-2的上調。實施例4如圖8所示，敲減(knockdown)N-鈣粘蛋白造成NF κ β靶基因如IL-6和IL-8表達降低，再次顯示N-鈣粘蛋白調節(jié)NF κ β。實施例5圖9顯示了用N-鈣粘蛋白靶向抗體處理前后的NF κ β啟動子活性。數(shù)據(jù)顯示了這些抗體介導NFk β的立即上調，隨后在第7天發(fā)生下調。這些數(shù)據(jù)顯示，抗體可部分通過改變NF κ β下游信號轉導發(fā)揮作用。實施例6圖10顯示了用或未用N-鈣粘蛋白靶向抗體處理的N-鈣粘蛋白的染色。在對照處理細胞中，大多數(shù)N-鈣粘蛋白出現(xiàn)在胞內(nèi)；而存在抗體時，N-鈣粘蛋白表達穩(wěn)定于細胞表面。這些數(shù)據(jù)提示，將N-鈣粘蛋白穩(wěn)定在細胞表面是N-鈣粘蛋白抗體的另一種作用機制。這可能導致由金屬肽酶(如ADAM 10等)切割和內(nèi)在化N-鈣粘蛋白介導的β-連環(huán)蛋白信號傳導的改變。實施例7如圖11可見，N-鈣粘蛋白下調可造成PII/Akt信號傳導途徑活化降低。實施例8如圖12可見，用N-鈣粘蛋白靶向抗體處理細胞造成Akt磷酸化作用或活化作用改變(上調和下調)，這支持了這些抗體全部或部分通過改變PII-Akt信號轉導發(fā)揮作用的觀點。實施例9 :FACS分析顯示了靶向N-鈣粘蛋白第一胞外結構域的抗體克隆的篩選。圖13顯示了前列腺癌細胞表面蛋白質的識別。實施例10 :FACS分析顯示了靶向N-鈣粘蛋白第四胞外結構域的抗體克隆的篩選。圖14顯示，克隆識別前列腺癌細胞表面的N-鈣粘蛋白。實施例11 :N-鈣粘蛋白抗體的亞克隆。圖15顯示，純化的單克隆識別細胞表面的蛋白質。實施例12 體外侵襲試驗。圖16顯示，由發(fā)明人小組產(chǎn)生的單克隆抗體1F12、1H7和2B3都抑制N-鈣粘蛋白陽性癌細胞的侵襲力。GC4是對照。實施例13 :N-鈣粘蛋白抗體阻斷腫瘤生長和PC3前列腺癌細胞的轉移，但對N-鈣粘蛋白空白腫瘤無效。皮下植入PC3細胞并使其生長。如圖17b所示，當?shù)?5天腫瘤達到可觸階段時給予抗體或對照，每周兩次O00微克)，共兩周。1H7和EC4都能夠減緩腫瘤生長。它們還完全阻斷轉移。5/5的對照小鼠具有淋巴結轉移，相比之下，1H7和EC4治療小鼠分別為0/5 和0/5。相反，1H7和EC4抗體對N-鈣粘蛋白空白腫瘤的生長沒有影響(圖17a)。圖17c 和17d清楚顯示了在處理建立的大腫瘤(從第21天開始處理)或在長期處理(處理持續(xù)長達62天)中N-鈣粘蛋白抗體對PC3腫瘤生長的抑制作用。
實施例14 來自體內(nèi)實驗的腫瘤顯示出抗體對N-鈣粘蛋白的影響。如圖18所示，兩種對照腫瘤顏色非常紅，與深層血管發(fā)生一致。它們還深深附于并侵入局部側面肌肉組織。相反，1H7和EC4處理的小鼠具有不侵入局部肌肉的蒼白、清澈的腫瘤。腫瘤容易從下層組織脫落，證明抗-N-鈣粘蛋白抗體抑制了血管發(fā)生并阻斷局部侵襲，這與未患轉移性疾病的小鼠中發(fā)現(xiàn)的結果一致。實施例15 免疫組織化學染色發(fā)明人對雄激素非依賴性LAPC 9前列腺癌進行了免疫組織化學染色。結果顯示， 僅有一小亞群細胞表達N-鈣粘蛋白(圖19a)。實施例16 雄激素依賴性和非依賴性LAPC-9腫瘤生長為確定即便當N-鈣粘蛋白在細胞內(nèi)未過表達或者僅在細胞亞群內(nèi)表達時，N-鈣粘蛋白是否能夠成為治療和診斷靶點，發(fā)明人研究了雄激素依賴性和非依賴性LAPC-9腫瘤的腫瘤生長。分別用對照PBS或N-鈣粘蛋白抗體1H7和EC4處理雄激素依賴性和非依賴性LAPC-9腫瘤。結果顯示，即便N-鈣粘蛋白僅在一小亞群雄激素非依賴性細胞中表達， 用抗體處理也足以延遲雄激素非依賴性腫瘤的生長和發(fā)展(圖20)。這些結果提示，雄激素非依賴性腫瘤的形成需要N-鈣粘蛋白細胞群，將其阻斷足以延遲腫瘤發(fā)展。這些結果與 N-鈣粘蛋白標記雄激素非依賴性干細胞群的解釋一致。阻斷干細胞生長足以阻斷腫瘤生長。這些結果還顯示，抗體可作用于表達正常水平或者甚至低水平N-鈣粘蛋白的細胞。實施例17 分選和未分選的N-鈣粘蛋白陽性和陰性腫瘤細胞生長為確定N-鈣粘蛋白陽性細胞對腫瘤細胞生長的影響，分選了 N-鈣粘蛋白陽性和陰性細胞，分別得到了 100%和0%陽性的N-鈣粘蛋白細胞群。然后將細胞注入閹割小鼠， 相比N-鈣粘蛋白陰性群體，N-鈣粘蛋白陽性細胞更加快且有效地形成腫瘤(圖20)，這說明N-鈣粘蛋白陽性細胞具有生長優(yōu)勢，或者它們具有干細胞特性且致瘤性強于陰性群體。 未分選的細胞的生長類似于N-鈣粘蛋白陽性細胞。實施例18 來自N-鈣粘蛋白分選細胞的腫瘤的FACS分析FACS分析比較由純N-鈣粘蛋白陽性和陰性細胞生長的腫瘤和對照未分選群體生長的腫瘤。來自100%N-鈣粘蛋白陽性細胞的腫瘤的N-鈣粘蛋白陽性率只有41. 25% (圖 21和22)，說明這些細胞變成了 N-鈣粘蛋白空白細胞。這與N-鈣粘蛋白陽性細胞是可變成分化程度更高的N-鈣粘蛋白陰性細胞的干細胞的假設一致。同時，N-鈣粘蛋白陰性群體產(chǎn)生的腫瘤有9% N-鈣粘蛋白陽性(圖21和22)，與未分選的細胞類似(圖21和22)。 這說明這些細胞的生長要求干細胞樣群體獲得或上調N-鈣粘蛋白以形成雄激素非依賴性腫瘤。使N-鈣粘蛋白形成雄激素非依賴性腫瘤的需要導致了致瘤性的延遲。實施例19 建立的LNCaP-Cl腫瘤的生長被N-鈣粘蛋白抗體抑制。如圖23可見，在第45天到第56天將N-鈣粘蛋白抗體1H7和EC4給予攜帶 LNCaP-Cl腫瘤的小鼠，它們對腫瘤生長的抑制效應在第72天出現(xiàn)。實施例20 =N-鈣粘蛋白抗體抑制LAPC-9雄激素非依賴性腫瘤生長。如圖2 可見，從第15天開始將N-鈣粘蛋白抗體1H7和EC4給予攜帶建立的 LAPC-9雄激素非依賴性腫瘤的小鼠(第7代)，每周兩次，10mg/kgo抑制效應出現(xiàn)在第30 天。1H7和EC4對建立的大LAPC-9雄激素非依賴性腫瘤的抑制效應示于圖Mb，其中，直到第17天時動物未接受抗體處理。
實施例21 :EC4抗體的劑量依賴性生長抑制如圖25可見，PC3腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長受到EC4抗體的抑制(在第13天到第 27天給予)，在給予較高劑量抗體的實驗中觀察到更突出的抑制效果。實施例22:毒性研究由于N-鈣粘蛋白在各種組織內(nèi)廣泛表達，如果將抗-N-鈣粘蛋白抗體用作治療劑應考慮其潛在毒性。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，1H7和EC4抗體與鼠N-鈣粘蛋白交叉反應性，但在長期或劑量遞增小鼠研究中未觀察到體內(nèi)毒性。實施例23 =N-鈣粘蛋白抗體抑制LAPC-9雄激素依賴性腫瘤發(fā)展成雄激素非依賴性腫瘤。如圖26a和26b所示，在閹割小鼠中，N-鈣粘蛋白抗體1H7和EC4有效抑制LAPC-9 雄激素依賴性腫瘤向雄激素非依賴性腫瘤發(fā)展。在第一項研究中(圖^a)，從第0天到第 31天給予抗體，觀察動物45天。在第二項研究中(圖26b)，觀察了長期抗體治療的效果。 1H7對腫瘤發(fā)展顯示出中等延遲，而EC4對阻斷腫瘤發(fā)展顯示出更加長期的效果。實施例M :N-鈣粘蛋白陽性細胞在閹割小鼠中具有生長優(yōu)勢。如圖27所示，在閹割過的SCID小鼠中，N-鈣粘蛋白陽性LAPC-9腫瘤顯示出超過 N-鈣粘蛋白陰性LAPC-9腫瘤的生長優(yōu)勢。另一方面，圖觀顯示，LAPC-9雄激素非依賴性細胞中N-鈣粘蛋白表達水平和雄激素受體表達之間負相關，在連續(xù)傳代的同時，LAPC-9細胞發(fā)展到獲得雄激素非依賴性，同時它們對N-鈣粘蛋白的表達增加而對雄激素受體的表達降低。本申請中引用的所有專利、專利申請和其他出版物，包括GenBank登錄號，全部納入本文用于所有目的。
2權利要求
1.一種以ATCC登錄號PTA-9387保藏的雜交瘤細胞系。
2.一種由權利要求1所述雜交瘤細胞系產(chǎn)生的抗體。
3.一種以ATCC登錄號PTA-9388保藏的雜交瘤細胞系。
4.一種由權利要求4所述雜交瘤細胞系產(chǎn)生的抗體。
5.一種抗體或其片段，其能夠在體內(nèi)或體外結合與以ATCC登錄號PTA-9387保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏所的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體結合的N-鈣粘蛋白抗原決定簇相同的N-鈣粘蛋白結構域1-3。
6.如權利要求5所述的抗體，其特征在于，所述抗體是人源化的或完全的人抗體。
7.如權利要求5所述的抗體，其特征在于，所述抗體是雙特異性抗體或scFv。
8.一種抗體或其片段，其能夠在體內(nèi)或體外結合與以ATCC登錄號PTA-9388保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏所的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體結合的N-鈣粘蛋白抗原決定簇相同的N-鈣粘蛋白結構域4。
9.如權利要求8所述的抗體，其特征在于，所述抗體是人源化的或完全的人抗體。
10.如權利要求8所述的抗體，其特征在于，所述抗體是雙特異性抗體或scFv。
11.一種抑制患者體內(nèi)癌細胞生長的方法，所述方法包括以下步驟在足以使得如權利要求5或8所述抗體或其片段與所述癌細胞結合的條件下，給予該抗體或其片段，其中所述癌細胞表達或過表達N-鈣粘蛋白，且其中所述抗體通過以下途徑抑制癌細胞生長(a)激活或抑制NFk- β信號傳導和轉錄；(b)激活或抑制N-鈣粘蛋白內(nèi)在化；(c)激活或抑制PI3激酶或Akt途徑；(d)激活或抑制連環(huán)蛋白信號傳導；(e)阻斷N-鈣粘蛋白與FGFR或其他酪氨酸激酶受體的異二聚化；或(f)阻斷或增強被ADAMlO或其他金屬肽酶切割。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述癌細胞是泌尿生殖器癌細胞。
13.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述癌細胞是前列腺癌細胞。
14.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述癌細胞是膀胱癌細胞。
15.一種治療癌癥患者的方法，包括以下步驟(a)從有患上表達N-鈣粘蛋白的癌癥的風險的個體獲得測試組織樣品；(b)與獲自己知為癌癥陰性的個體的對照組織樣品相比，確定測試組織樣品中N-鈣粘蛋白的存在與否或含量；從而診斷所述表達N-鈣粘蛋白的癌癥，其中所述N-鈣粘蛋白以正?；虻退奖磉_，或由細胞亞群表達，或是過表達的；和(c)給予有患上表達N-鈣粘蛋白的癌癥的風險的個體有效量的如權利要求5或8所述的抗體或片段。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述組織樣品是前列腺或膀胱組織。
17.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述癌癥是前列腺癌。
18.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述癌癥是膀胱癌。
19.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗體阻斷激素難治性前列腺癌。
20.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗體阻斷癌癥干細胞。
21.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述組織樣品是前列腺或膀胱組織。
22.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述癌癥是轉移癌。
23.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
24.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗體是scFv。
25.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗體是雙特異性抗體。
26.—種診斷癌癥患者的方法，包括以下步驟(a)從有患上表達N-鈣粘蛋白的癌癥的風險的個體獲得測試組織樣品；(b)與獲自己知為癌癥陰性的個體的對照組織樣品相比，通過使樣品接觸有效量的如權利要求5或8所述的N-鈣粘蛋白抗體或片段來確定測試組織樣品中N-鈣粘蛋白的存在與否或含量；從而診斷所述表達N-鈣粘蛋白的癌癥，其中所述N-鈣粘蛋白以正?；虻退奖磉_，或由細胞亞群表達，或是過表達的。
27.一種鑒定癌癥干細胞的方法，包括以下步驟(a)從有患上表達N-鈣粘蛋白的癌癥的風險的個體獲得測試組織樣品；(b)與獲自已知為癌癥陰性的個體的對照組織樣品相比，采用權利要求5或8所述的抗體確定測試組織樣品中癌癥干細胞的存在與否；其中所述N-鈣粘蛋白以正?；虻退奖磉_，或由干細胞亞群表達且不是過表達的。
28.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述組織樣品是前列腺或膀胱組織。
29.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述癌癥是前列腺癌。
30.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述癌癥是膀胱癌。
31.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述癌癥是激素難治性前列腺癌。
32.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述癌癥是轉移癌。
33.一種鑒定抗-N-鈣粘蛋白抗體或抑制患者體內(nèi)癌細胞生長的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(i)使所述化合物或抗體接觸表達或過表達N-鈣粘蛋白多肽的細胞；和 ( )通過確定所述化合物或抗體是否具有以下作用來確定所述化合物或抗體對N-鈣粘蛋白多肽的功能效應(a)激活或抑制NFκ-β信號傳導和轉錄；(b)激活或抑制N-鈣粘蛋白內(nèi)在化；(c)激活或抑制PI3激酶或Akt途徑；(d)激活或抑制連環(huán)蛋白信號傳導；(e)阻斷N-鈣粘蛋白與FGFR或其他酪氨酸激酶受體的異二聚化；或(f)阻斷或增強被ADAMlO或其他金屬肽酶切割。
全文摘要
本發(fā)明提供了靶向N-鈣粘蛋白第一到第三結構域和N-鈣粘蛋白第四結構域的抗體，以診斷和治療N-鈣粘蛋白相關癌癥。還描述了利用這些抗體進行診斷和治療的方法。
文檔編號C12N5/00GK102164956SQ200980121811
公開日2011年8月24日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權日2008年11月10日
發(fā)明者R·E·賴特爾, Z·韋恩伯格 申請人:加利福尼亞大學董事會