專利名稱：B因子、補體旁路的抑制及與此相關的方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及補體旁路的新型抑制劑，特別涉及新型抗B因子抗體。本發(fā)明一般還涉及該抑制劑降低或預防氣道高反應性和氣道炎癥、由此治療該病癥起作用的疾病的用途。
背景技術：
補體激活主要通過三種途徑所謂的經典途徑、凝集素途徑和旁路途徑。參與旁路途徑激活的關鍵蛋白是B因子(fB)和D因子(fD)。這些蛋白共同起作用，以啟動和/或放大C3的激活，這然后引起許多炎性事件的啟動。第三種蛋白備解素可穩(wěn)定C3和B因子的復合物，但是它不是旁路途徑起作用所必需的。B因子還有助于溶解免疫復合物，并被報道起B(yǎng)細胞生長因子的作用并能激活單核細胞(Takahashi，1980；Hall，1982；Peters，1988)。已培育出B因子缺失的小鼠(fB-/-小鼠)，并且在這些小鼠中，針對依賴T細胞的抗原的IgG1抗體應答和對內毒素休克的敏感性似乎是正常的(Matsumoto，1997)。
補體旁路通常由細菌、寄生蟲、病毒或真菌所啟動，但也有報道說IgA Ab和某些Ig L鏈可激活該途徑。當循環(huán)B因子與激活的C3(C3b或C3H2O)相結合時，旁路途徑激活被啟動。然后該復合物被循環(huán)D因子剪切產生具有酶學活性的片段C3Bb。C3Bb剪切C3形成C3b，這驅動炎癥，同時還進一步放大激活過程，形成正反饋環(huán)。需要兩種組分(B因子和D因子)才能激活旁路途徑。
最近的研究表明補體旁路在幾種動物疾病模型的發(fā)病機理中起著重要的作用。I/R后腎臟內的補體激活基本僅受旁路途徑的介導(Thurman)，同時旁路途徑在關節(jié)炎的進展中起著關鍵作用。尤其令人吃驚的是，已表明缺失旁路途徑的小鼠在狼瘡腎炎MRL/Ipr模型中不會患腎炎(Watanabe)，并且不會引起抗磷脂介導的胎兒丟失(Girardi)，該模式通常被認為受到經典補體途徑介導。
已開發(fā)出幾種在不同激活期抑制補體系統(tǒng)的抑制劑(Holers)，但是在本發(fā)明前旁路途徑的特定抑制劑尚未廣泛報道。2001年7月4日公開的PCT公布文本W(wǎng)O 01/47963描述了來自外寄生水蛭的多肽，它在體外抑制補體激活的旁路途徑，并且它對通過經典途徑的補體激活基本沒有影響。已表明這些肽結合D因子，但是，未說明這些多肽在體內應用。能在體內特異性抑制旁路途徑的試劑與現(xiàn)有的補體聯(lián)級反應的抑制劑相比在理論上具有幾方面優(yōu)點。首先，就基本由旁路途徑介導的模型而言，如腎I/R和抗磷脂介導的胎兒丟失，這種抑制劑應該與廣譜補體抑制劑一樣有效，還應該具有較少的免疫抑制副作用。盡管報道只有一例先天性B因子缺失的人類患者(Densen)，對基因打靶的B因子缺失小鼠(fB-/-)的研究尚未發(fā)現(xiàn)該因子具有免疫調節(jié)作用(Densen；Matsumoto)。相反，先天缺失經典途徑組分的患者似乎具有更大的感染風險(最常見的是葡萄球菌和鏈球菌)。抑制經典途徑組分或C3(所有補體途徑所共有的)可能還與自身免疫有關(Figueroa)，這可能解釋了為什么B因子缺失使得MRL/Ipr小鼠不會患腎小球腎炎，而缺失C3卻相反(Watanabe)。因此，旁路途徑的抑制可能具有更好的耐受性，并且在某些情況下它較經典途徑的補體抑制更為有效。
過敏性哮喘是一種常見的氣道炎癥和氣道高反應性(AHR)相關綜合征(Busse)?；歼^敏性哮喘的患者暴露于吸入的過敏原后導致AHR和氣道炎癥增強，研究表明來自補體C3、C4和C5蛋白家族的具有生物活性的片段水平提高，特別是在支氣管肺泡灌洗(BAL)液中的C3a(Humbles)和C5a(Krug)的水平提高。這表明這些患者在暴露于過敏原后通過過敏原誘導機制的補體途徑的激活出現(xiàn)在肺部。動物模型進一步提供了補體在過敏性氣道疾病進展中的作用。C3或C3a受體缺失的動物似乎不會出現(xiàn)由過敏原誘導的氣道疾病(Humbles，Drouin；Bautsch；Walters)。
推測在暴露于過敏原后誘導補體激活有幾種可能性。例如，過敏原-IgG免疫復合物可激發(fā)經典途徑的激活，并且某些抗原可通過旁路途徑直接激活C3(Kohl)。另外，肥大細胞或肺巨噬細胞釋放的中性類胰蛋白酶可直接剪切(蛋白水解)C3或C5(Schwartz；Mulligan)。補體激活的三種途徑(經典途徑、旁路途徑和凝集素途徑)會合于中心補體組分C3。因此，C3激活的抑制可防止其被剪切形成活性C3片段，還大大減少了C5的下游激活以及來源于C5的活性片段的釋放(Sahu)。最近的研究表明在被敏化動物暴露于過敏原時通過使用C3轉變酶抑制劑抑制補體激活(由此抑制全部三種激活途徑)，減弱了晚期氣道反應(Abe)并減慢了AHR和氣道炎癥的進展(Taube)。2004年3月18日公布的PCT公布文本W(wǎng)O 2004/022096描述了補體旁路的抑制，優(yōu)選通過所有途徑共有的C5-C9的末端補體組分，最優(yōu)選通過C5a的抑制。
目前，治療涉及AHR的炎癥疾病(如中度到重度哮喘以及慢性阻塞性肺部疾病)的治療方法主要包括糖皮質激素和其它消炎藥的使用。但是，這些藥劑可能具有嚴重的副作用，包括但不限于提高了對感染的易感性、肝臟毒性、藥物引起的肺部疾病以及骨髓抑制。因此，這些藥劑在治療氣道高反應性相關肺部疾病的臨床使用上具有局限性。消炎藥和癥狀緩解藥劑的使用是個嚴重的問題，這是由于它們的副作用，或者它們不能侵襲炎性反應的根本原因。一直都需要治療炎癥的毒性更小并且更為有效的藥劑。因此，需要使用具有較少的副作用、毒性小并且對過敏性氣道疾病如哮喘和AHR病癥的根本原因更特異的試劑的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個實施方案涉及分離抗體或其抗原結合片段，它選擇性結合B因子的第三短同源重復序列(short consensus repeat，SCR)結構域，其中所述抗體阻止了C3bBb復合物的形成。一方面，抗體或其抗原結合片段結合B因子，并防止或抑制D因子剪切B因子。另一方面，抗體或抗原結合片段結合人B因子的第三短同源重復序列(SCR)結構域。另一方面，抗體或抗原結合片段結合選自下列B因子的第三SCR結構域的表位(a)包括至少一部分人B因子(SEQ IDNO2)的B因子的表位，包括從約Tyr139位到約Ser185位，或其在非人類B因子序列中的等效位置；(b)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括從約Try139位到約Ser141位，或其在非人類B因子序列中的等效位置；(c)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括從約Glu182位到約Ser185位，或其在非人類B因子序列的等效位置；或者(d)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括任何一個或多個下列位置或其在非人類B因子序列中的等效位置Tyr139，Cys140，Ser141，Glu182，Gly184或Ser185。另一方面，抗體或其抗原結合片段選擇性結合B因子(SEQ ID NO2)的第三SCR結構域的表位，該表位包括一個或多個下列氨基酸位置或其在非人類B因子序列中的等效位置Ala137，Tyr139，Ser141，Glu182，Ser185，Thr189，Glu190和Ser192。另一方面，抗體或其抗原結合片段選擇性結合B因子(SEQ ID NO2)的第三SCR結構域的表位，該表位包括下列氨基酸位置或其在非人類B因子序列的等效位置Ala137，Tyr139，Ser141，Glu182，Ser185，Thr189，Glu190和Ser192。另一方面，抗體或其抗原結合片段選擇性結合B因子(SEQ ID NO2)的第三SCR結構域的表位，該表位由下列氨基酸位置或其在非人類B因子序列的等效位置組成Ala137，Tyr139，Ser141，Glu182，Ser185，Thr189，Glu190和Ser192。該抗體或抗原結合片段可結合B因子的第三SCR結構域的一部分的三維結構中的非線性表位，其中該部分被定義為至少為SEQ ID NO2的氨基酸位置Ala137-Ser192，或其在非人類B因子序列中的等效位置。另一方面，抗體或其抗原結合片段選擇性結合多種哺乳動物物種(如人類和選自除人類外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔的動物)的B因子?？贵w或抗原結合片段可為非補體激活同種型或亞類，可為單克隆抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或單價抗體?？乖Y合片段可包括Fab片段。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體為單克隆抗體1379(由ATCC生產，保藏號PTA-6230)。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及選擇性結合多種哺乳動物物種的B因子的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體阻止了C3bBb復合物的形成。一方面，抗體或其抗原結合片段選擇性結合人和選自除人外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔的動物的B因子。一方面，抗體為非補體激活同種型或亞類。另一方面，抗體為單克隆抗體。另一方面，抗原結合片段為Fab片段。
本發(fā)明的另一實施方案涉及抗原結合多肽，它選擇性結合B因子的第三短同源重復序列(SCR)結構域，其中所述抗原結合多肽阻止了C3bBb復合物的形成，或者涉及選擇性結合多種哺乳動物物種的B因子的抗原結合多肽，其中該抗原結合多肽阻止了C3bBb復合物的形成。
本發(fā)明的另一實施方案涉及選擇性結合B因子的分離抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其片段競爭性抑制單克隆抗體1379(由ATCC生產，保藏號PTA-6230)對人B因子的特異性結合，并且其中，當抗體或其抗原結合片段結合人B因子時，單克隆抗體1379抑制補體旁路的能力被抑制。一方面，抗體或其抗原結合片段競爭性抑制單克隆抗體1379結合人B因子，此時通過抗體-抗體競爭性分析在人B因子存在時檢測比較結合特異性。
本發(fā)明的另一實施方案涉及選擇性結合人B因子的分離抗體或其片段，其中所述分離抗體或其片段競爭性抑制二抗或其抗原結合片段特異性結合人B因子，并且其中所述二抗或其抗原結合片段結合人B因子的第三SCR結構域。
本發(fā)明還包括包含任何上述抗體、抗原結合片段或抗原結合多肽的組合物。
本發(fā)明的另一實施方案涉及降低或預防動物的氣道高反應性(AHR)或氣道炎癥的方法。該方法包括下述步驟將上述抗體或其抗原結合片段給予患有炎癥相關氣道高反應性或氣道炎癥或有患該病風險的動物。一方面，通過下述途徑給予抗體或抗原結合片段口服、鼻部、局部、吸入、氣管內、經皮、直腸或非腸道途徑。另一方面，將抗體或抗原結合片段以有效顯著降低動物的氣道高反應性的量(與給予抗體或抗原結合片段前相比)給予動物。另一方面，將抗體或抗原結合片段以有效顯著降低動物的氣道高反應性的量(與許多有炎癥的動物的氣道高反應性的水平相比，其中沒有給予所述抗體或抗原結合片段)給予動物。一方面，抗體或抗原結合片段的給予降低了動物對乙酰甲基膽堿或組胺的反應性。另一方面，抗體或抗原結合片段與可藥用的選自下列的載體一起給予可分散干粉、無水乙醇、小膠囊、脂質體、霧化噴霧劑和可注射賦形劑。另一方面，抗體或抗原結合片段可在選自下列的載體或裝置中給予無水乙醇、干粉吸入系統(tǒng)、超聲吸入系統(tǒng)、壓力計量吸入器和計量溶液裝置。另一方面，抗體或抗原結合片段與選自下列的試劑一起給予所述哺乳動物皮質類固醇、β-激動劑(長效或短效)、白三烯調節(jié)物、抗組胺、磷酸二酯酶抑制劑、色甘酸鈉、奈多羅米(Nedocromil)、茶堿、細胞因子拮抗劑、細胞因子受體拮抗劑、抗IgE和T細胞功能的抑制劑。另一方面，氣道高反應性或氣道炎癥與選自下列的疾病相關哮喘、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、過敏性支氣管肺曲菌病、過敏性肺炎、嗜酸粒細胞性肺炎、肺氣腫、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管擴張、囊性纖維化病、結核病、過敏性肺炎、職業(yè)性哮喘、結節(jié)病、反應性氣道病綜合征、間質性肺病、嗜酸細胞增多綜合征、鼻炎、鼻竇炎、運動誘發(fā)哮喘、污染誘發(fā)哮喘(pollution-induced asthma)、咳嗽變異性哮喘、肺寄生蟲病、呼吸道合胞體病毒(RSV)感染、副流感病毒(PIV)感染、鼻病毒(RV)感染和腺病毒感染。一方面，氣道高反應性與過敏性炎癥相關。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法可在哺乳動物中實施，更優(yōu)選在人中實施。


圖1為示出構建B因子-Ig融合蛋白的示意圖。
圖2A為示出3μg抗B因子加入含10μl血清的反應體系時，在酵母聚糖分析中抗B因子完全抑制補體旁路的線圖。
圖2B為示出6μg抗B因子抗體加入10μl人血清時，在兔紅細胞裂解分析中該抗B因子完全抑制了補體旁路的線圖。
圖3為示出將抗B因子給予小鼠抑制補體旁路的線圖。
圖4A為氣道阻力(RL)的線圖，該圖示出過敏原敏化和攻擊的fB+/+小鼠與僅被攻擊的fB+/+小鼠相比其對乙酰甲基膽堿的反應性增強，但是fB-/-小鼠對乙酰甲基膽堿的反應性顯著降低。
圖4B為動態(tài)順應性(Cdyn)的線圖，該圖示出過敏原敏化和攻擊的fB+/+小鼠與僅被攻擊的fB+/+小鼠相比其對乙酰甲基膽堿的反應性增強，但是fB-/-小鼠對乙酰甲基膽堿的反應性顯著降低。
圖5為表征氣道敏化和攻擊后的fB-/-小鼠的BAL液和肺部組織的柱狀圖。
圖6A為氣道阻力(RL)的線圖，該圖示出豚草敏化和攻擊的fB-/-小鼠對乙酰甲基膽堿的反應性降低，但是fB+/+小鼠對乙酰甲基膽堿的反應性較強。
圖6B為動態(tài)順應性(Cdyn)的線圖，該圖示出豚草敏化和攻擊的fB-/-小鼠對乙酰甲基膽堿的反應性降低，但是fB+/+小鼠對乙酰甲基膽堿的反應性較強。
圖6C為表征BAL液和肺部組織的柱狀圖，該圖示出豚草敏化和攻擊的fB-/-小鼠的BAL液中的氣道炎癥與fB+/+小鼠相比有所降低。
圖7A為線圖，該圖示出在每次攻擊前用B因子處理的被敏化和攻擊的fB-/-小鼠對乙酰甲基膽堿的反應性降低，這與用PBS處理的被敏化和攻擊的fB-/-小鼠相似，但是與被敏化和攻擊的fB+/+小鼠相比顯著降低。
圖7B為示出B因子的給予在fB-/-小鼠中重構出現(xiàn)AHR和氣道炎癥的能力的柱狀圖。
圖8A為氣道阻力(RL)的線圖，該圖示出全身和噴霧給予B因子中和抗體抑制了被敏化和攻擊的小鼠中AHR的進展。
圖8B為動態(tài)順應性(Cdyn)的線圖，該圖示出全身和噴霧給予B因子中和抗體抑制了被敏化和攻擊的小鼠中AHR的進展。
圖8C為表征BAL液和肺部組織的柱狀圖，該圖示出用抗B因子全身或噴霧處理降低了BAL液中的嗜酸性粒細胞的數(shù)量，支氣管周炎癥、支氣管周嗜酸性粒細胞的數(shù)量以及氣道上皮中的粘液陽性細胞的數(shù)量。
圖9為線圖，該圖示出被敏化和攻擊的C4-/-小鼠(實心菱形，n＝10)對吸入的MCh表現(xiàn)出與被敏化和攻擊的C4+/+小鼠(實心方塊，n＝10)相似的反應性，并且與僅被攻擊的C4-/-小鼠(空心菱形，n＝10)和僅被攻擊的C4+/+小鼠(空心方塊，n＝10)相比反應性顯著增強(*與被敏化和攻擊的fB-/-小鼠、被攻擊的fB+/+小鼠和被攻擊的fB-/-小鼠相比，p＜0.05；#與被攻擊的fB+/+小鼠和被攻擊的fB-/-小鼠相比，p＜0.05； 與被攻擊的C4+/+小鼠和被攻擊的C4-/-小鼠相比，p＜0.05)。
圖10為線圖，該圖示出被敏化和攻擊的C4-/-小鼠(實心框，n＝8)與僅被攻擊的C4-/-小鼠(空心框，n＝8)相比其對吸入的MCh的氣道阻力增強，該圖還示出用抗B因子單克隆抗體全身處理被敏化和攻擊的C4-/-小鼠降低了其對MCh的氣道反應性(實心圓圈，n＝8)。
圖11為示意圖，該圖示出在人B因子表面上的mAb1379的表位圖模型。
圖12為示意圖，該圖示出mAB1379(一個Fab片段)結合B因子的模型化復合物，并且Fab的抗原結合端被做為覆蓋全部繪出的表位區(qū)域的模型。
圖13為柱狀圖，該圖示出用1379預處理的小鼠與野生型對照相比在再灌注24小時后血清尿素氮升高的水平較低。
具體實施例方式
本發(fā)明的一個實施方案涉及提供選擇性阻斷補體旁路的新型B因子抗體，并涉及該抗體抑制在需要該抑制、該抑制是有用的或被期待有用的任何病癥或疾病中的補體旁路的用途。具體而言，考慮到特異性針對補體旁路的抑制劑在用于治療多種疾病的方法中的較好的潛在的治療效果，本發(fā)明人開發(fā)了幾種針對B因子的新型抑制型單克隆抗體。已經鑒定了幾種抗體，并且其中一種抗體已被非常詳細地鑒定。該抗體在廣泛接受的過敏性炎癥和哮喘模型以及在腎臟缺血-再灌注損傷模型(通常應用到缺血-再灌注損傷)中在體外和體內進行了檢驗。為生產該抗體，用融合蛋白注射基因打靶的B因子缺失小鼠(fB-/-)，該融合蛋白由與免疫球蛋白相連的B因子的第二和第三短同源重復序列(SCR)結構域組成。就對B因子的免疫應答篩選小鼠，并將來自其中一只注射小鼠的脾細胞融合到骨髓瘤細胞。所得到的其中一種雜交瘤細胞-稱為1379-生產在體外和體內抑制補體旁路激活的IgG1抗體，盡管本發(fā)明人已生產和鑒定了具有抑制補體旁路能力的多種單克隆抗體(參見表4)。1379抗體(在本文中也被稱為mAb1379)抑制來自多種動物物種的血清中的旁路途徑激活，這些動物包括小鼠、大鼠、人、狒狒、獼猴、短尾猴(cyno monkey)、豬、兔和馬。來自該抗體的Fab片段也可完全抑制旁路途徑。發(fā)明人還表明該抗體可完全抑制人血清對紅細胞的裂解，由此確定該試劑完全阻斷補體旁路激活的能力。表位圖用于說明該抗體結合B因子的第三短同源重復序列(SCR)結構域，并且該抗體阻止了C3bBb復合物的形成。關于由該抗體識別的表位的詳細描述參見下文。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及補體旁路的選擇性抑制劑，特別涉及那些新型B因子抗體，它們具有較寬的物種反應性，證明了在體外和體內的有效性，并且是用于多種病癥和疾病中任一種中高度有效的治療工具，這些疾病中對補體旁路的選擇性抑制是有用的、必要的和/或優(yōu)選的(如與氣道高反應性和氣道炎癥相關的病癥(參見下文)、缺血-再灌注損傷等等)。這些抗體還可被人源化或進行其他加工以降低來自免疫系統(tǒng)的潛在副作用，由此成為一種有價值的新型治療藥劑。
本發(fā)明的發(fā)明人所生產的抗體識別幾種哺乳動物(包括人)所共有的B因子上的位點，在這幾種哺乳動物中進行了臨床前的原理驗證實驗，因此使得在人類疾病模型中的發(fā)現(xiàn)易于轉變成為人類治療。在本發(fā)明之前，發(fā)明人并不知曉針對B因子的任何其它如本發(fā)明的抗體那樣表現(xiàn)出對該蛋白具有較寬物種抑制性的抗體。因此，本發(fā)明還鑒定了B因子上獨特的位點，針對該位點可開發(fā)新型抑制劑。補體旁路中作為特定治療靶物質的B因子和其它蛋白的鑒定提供了合理的治療方法以及可治療氣道的炎性疾病和其它疾病的主要化合物。選擇性阻斷旁路途徑具有一些優(yōu)點。例如，C4-/-小鼠(缺少經典途徑、旁路途徑和凝集素補體途徑所共有的C4補體組分)而不是fB-/-(B因子缺失)小鼠似乎對實驗細菌感染更為敏感，這表明通過不破壞經典途徑，旁路途徑的抑制劑對嚴重感染具有較低風險。經典途徑的阻斷還可引起自身免疫，并且先天性經典途徑組分缺失的病人被感染和發(fā)生自身免疫的風險增加。選擇性抑制旁路途徑使得不能形成結合C3a受體和結合補體受體1-4和C5a的來源于C3的配體。由于在激活過程中形成的B因子的Ba或Bb激活產物的受體表征不明確，阻斷旁路途徑的影響事實上可能更直接。
本發(fā)明的另一實施方案涉及本發(fā)明人的不尋常的發(fā)現(xiàn)，該發(fā)現(xiàn)表明通過旁路途徑激活補體聯(lián)級反應在氣道高反應性和氣道炎癥的進展中是至關重要的，并且實際上是必要和充分的。更具體而言，本發(fā)明人在本文中公開了旁路途徑而非經典補體途徑的抑制預防氣道高反應性并降低氣道炎癥的發(fā)現(xiàn)。發(fā)明人使用B因子缺失的小鼠(即通過基因敲除技術)并通過使用單克隆抗體抑制B因子(通過全身或氣霧劑送遞)來證實該發(fā)現(xiàn)。因此，發(fā)明人在本文中公開了通過該手段或其它手段(如通過缺失或抑制D因子或備解素)選擇性抑制補體旁路，以抑制氣道高反應性和氣道炎癥。本發(fā)明人表明B因子是誘導實驗性哮喘所必需的。重要的是，B因子在該模型的攻擊期(或效應期)是不可或缺的，并且將選擇性結合B因子的單克隆抗體吸入肺或通過全身給予阻斷了與過敏性炎性疾病相關的氣道高反應性(AHR)和氣道炎癥的進展，如在實驗哮喘模型中所示例。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該抑制作用通過抑制補體旁路特別獲得，這是由于其它結果表明在該模型系統(tǒng)中，C4基因敲除(C4-/-)小鼠會患AHR，而B因子基因敲除(fB-/-)小鼠不會患AHR。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抑制補體旁路(通過任何手段)是抑制AHR和氣道炎癥以及由此治療或預防與此相關的病癥和疾病所必要和充分的。另外，發(fā)明人表明抑制經典補體途徑不是抑制AHR或氣道炎癥所必需的，因此，如上所述，遵循本發(fā)明的教導，可避免與抑制經典補體途徑相關的不受歡迎的結果。
B因子抗體因此，本發(fā)明的第一個實施方案涉及選擇性抑制補體旁路的抗體或其抗原結合片段，特別涉及B因子抗體。同樣，具有相同特異性的抗原結合多肽也特別優(yōu)選用于本發(fā)明。一方面，抗體以補體旁路的蛋白被抑制或阻止與另一種蛋白結合的方式(通常情況即天然或生理條件下這兩種蛋白相互作用)選擇性結合該補體旁路的蛋白。另一方面，抗體以蛋白被抑制或阻止激活另一種蛋白的方式(通常情況下兩者相互作用)選擇性結合該蛋白，即使該蛋白可能至少部分結合其它蛋白。用于選擇性抑制補體旁路的特別優(yōu)選的抗體及其抗原結合片段包括本文所描述的B因子抗體，特別是本文所詳細描述的mAb1379抗體。
本文詳細描述和舉例說明了根據(jù)本發(fā)明選擇性結合B因子和抑制補體旁路的抗體(及其抗原結合片段)。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合在動物物種中(特別是哺乳動物物種中)保守的該蛋白(如B因子)的保守結合表面或表位(即該抗體與兩種或多種不同哺乳動物物種的蛋白發(fā)生交叉反應)。具體而言，本發(fā)明包括結合來自至少兩種、優(yōu)選幾種不同哺乳動物物種的B因子的抗體，這些哺乳動物包括但不限于人、除人外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔。優(yōu)選地，本發(fā)明包括結合B因子的抗體，該B因子來自人和至少另一種動物物種，優(yōu)選至少另一種哺乳動物物種，包括但不限于除人外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合B因子的第三同源重復序列(SCR)。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合阻止D因子剪切B因子的B因子的區(qū)域。在一個實施方案中，抗體為單克隆抗體。在一個實施方案中，抗體為本文所稱的1379的抗體(即由相同編號的雜交瘤細胞系生產的抗體，ATCC保藏號PTA-6230)或其抗原結合片段。
本文所述雜交瘤細胞1379(或mAb1379)于2004年9月21日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，位于10801University Blvd，Manassas，VA 20110-2209)，該保藏中心符合國際承認的用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約的條款，并且該雜交瘤細胞已獲得ATCC保藏號PTA-6230。
根據(jù)本發(fā)明，蛋白、蛋白的一部分(如片段、一部分、結構域等)或蛋白的區(qū)域或表位的最小尺寸其大小足以起到作為抗體形成的表位或保守結合表面或作為體外分析的靶物質。在一個實施方案中，本發(fā)明的蛋白至少長約4、5、6、7或8個氨基酸(如在分析中適合作為抗體表位或作為可檢測肽)或至少長約25個氨基酸、或至少長約50個氨基酸、或至少長約100個氨基酸、或至少長約150個氨基酸等任何介于4個氨基酸到最高達蛋白或其部分的全長或更長之間的全部整數(shù)的長度(如8、9、10、......25、26......500、501......)。
本領域熟知編碼人B因子和其它補體蛋白的基因和編碼區(qū)的核苷酸序列以及這些蛋白的氨基酸序列。例如，編碼人B因子和其它補體蛋白的基因在NCBI數(shù)據(jù)庫中的編號為No.NG_000013。B因子的編碼序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的編號為No.NM_001710，B因子前蛋白原的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的編號為No.NP_001701或P00751。NCBI數(shù)據(jù)庫編號為No.P00751的氨基酸序列是人前蛋白原B因子序列，在本文中表示為SEQ ID NO1。本領域還熟知來自其它動物物種的序列。通過比較，在小鼠B因子序列中(例如參見NCBI數(shù)據(jù)庫編號No.P04186，在本文中表示為SEQ ID NO6)，第三SCR結構域位于該761氨基酸前蛋白的160-217位，并且成熟的鼠類B因子蛋白跨越SEQ ID NO6的23-761位。
表示為SEQ ID NO1的人B因子前蛋白為具有跨越氨基酸1-25位的信號肽的764個氨基酸的蛋白。B因子的成熟鏈對應SEQ ID NO1的26-764位，在本文中表示為SEQ ID NO2。人B因子的三個SCR區(qū)域在本文中表示為SEQ ID NO3(SCR1，也為Sushi 1，跨越SEQID NO1的從約35位到約100位，或跨越SEQ ID NO2的從約5位到約75位)、SEQ ID NO4(SCR2，也為Sushi 2，跨越SEQ IDNO1的從約101位到約160位，或跨越SEQ ID NO2的從約76位到約135位)以及SEQ ID NO5(SCR3，也為Sushi 3，跨越SEQID NO1的從約163位到約220位，或跨越SEQ ID NO2的從約138位到約195位)。
基于使用Hourcade所描述的片段(參見Hourcade，1995，J.Biol.Chem.)對本發(fā)明的示例性抗體進行的表位作圖(參見實施例)，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗B因子抗體優(yōu)選結合在部分第三SCR結構域中的或含有部分第三SCR結構域的表位或保守結合表面，更優(yōu)選結合包括至少一部分包含成熟B因子蛋白(SEQ ID NO2)從約Try139位到約Ser185位的序列的人B因子的表位，結合包括至少一部分包含成熟B因子蛋白(SEQ ID NO2)從約Try139位到約Ser141位的序列的人B因子的表位，結合包括至少一部分包含成熟B因子蛋白(SEQ ID NO2)從約Glu182位到約Ser185位的序列的人B因子的表位，結合包括至少一部分包含任何一個或多個下列位置或非人類B因子序列的等效位置的人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位Try139，Cys140，Ser141，Glu182，Gly184或Ser185，或結合包括至少一部分除人外的動物物種的等效位置的B因子的表位。本領域的技術人員能容易地將人B因子的序列與來自其它動物物種的B因子的序列進行比對，檢測SCR區(qū)的位置以及對應上述氨基酸位置的第三SCR區(qū)的特定部分。例如，使用Tatusova和Madden描述的BLAST2序列(Tatusova and Madden，(1999)，“Blast 2 sequences-a newtool for comparing protein and nucleotide sequences”，F(xiàn)EMS Microbiollett.174247-250，通過援引全文納入本文中)將兩個特定序列彼此進行比對。
以本發(fā)明的示例性抗體的另一個表位模型以及圖譜為基礎，在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗B因子抗體優(yōu)選結合B因子的部分第三SCR結構域中的或含有B因子的部分第三SCR結構域的表位(保守結合表面)，該部分包括SEQ ID NO2的至少一個或多個下列氨基酸位置或者其在非人類B因子序列中的等效位置A137，Y139，S141，E182，S185，T189，E190和S192。本發(fā)明的一方面，表位位于B因子的部分第三SCR結構域中或含有B因子的部分第三SCR結構域，該部分包括全部或基本全部(至少五個、六個或七個)SEQ IDNO2的下列氨基酸位置或者其在非人類B因子序列中的等效位置Ala137，Tyr139，Ser141，Glu182，Ser185，Thr189、Glu190和Ser192。另一方面，本發(fā)明的抗B因子抗體識別的表位位于B因子的部分第三SCR結構域中或含有B因子的部分第三SCR結構域，該部分由SEQ IDNO2的下列氨基酸位置或其在非人類B因子序列中的等效位置組成Ala137，Tyr139，Ser141，Glu182，Ser185，Thr189，Glu190和Ser192。
在一個實施方案中，本發(fā)明的B因子抗體識別的表位還可更為具體地定義為位于B因子的第三SCR結構域的一部分的三維結構中的非線性表位。包含表位的部分為SEQ ID NO2的幾乎全部(如至少約90％)的氨基酸位置Ala137-Ser192或者非人類B因子序列的等效位置所確定的B因子三維結構，前提是該序列在構象上被排列成天然全長B因子序列出現(xiàn)的構象。B因子的三維結構的模型闡明了mAb1379的表位，例如可參見圖11和12。本文所使用的蛋白的“三維結構”或“三級結構”指蛋白組分在三維中的排列。該術語為本領域的技術人員所熟知。本文所使用的術語“模型”指蛋白、多肽或肽的三維結構的在有形介質中的代表。例如，模型可為三維結構在電子文件中、計算機屏幕上、紙件(即在二維介質)上的表示和/或表示為球棍圖。
根據(jù)本發(fā)明，給定蛋白或肽或其它分子的“表位”一般被定義為與抗體有關的大分子的一部分或其上的位點，抗體或其抗原結合片段將結合該部分或位點，并且針對該部分或位點可產生抗體。術語表位可與給定蛋白或抗原的術語“抗原決定簇” “抗體結合位點”或“保守結合表面”互換使用。更具體而言，表位可被定義為參與抗體結合的氨基酸殘基，還可被定義為三維空間的構象(如構象表位或保守結合表面)。表位可包含于小至約4-6個氨基酸殘基的肽中，或可包含于蛋白的較大片段中，并且在指表位的三維結構、特別是指抗體結合表位時，表位無需由連續(xù)氨基酸殘基構成?？贵w結合表位通常為構象表位，而不是順序表位(即線性表位)，換句話說，即抗體與之結合的、蛋白或多肽表面上三維排列的氨基酸殘基所確定的表位。如上所述，構象表位不由氨基酸殘基的連續(xù)序列構成，但是取而代之的是，該殘基可能在一級蛋白序列中被廣泛分隔，通過蛋白折疊形成三維天然構象，該殘基一起形成結合表面。mAb1379所識別的表位為構象表位，而非線性表位。
使用已知方法，本領域的技術人員可鑒定和/或組裝構象表位和/或順序表位，這些方法包括突變分析(如定向誘變)、預防蛋白水解性降解法(蛋白足印法)、使用如合成肽和肽掃描、BIACORE或ELISA的模擬表位分析、抗體競爭圖譜、組合肽文庫篩選、基質輔助激光解析-電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜術或三維模型(如使用任何適合的軟件程序，包括但不限于MOLSCRIPT 2.0(Avatar Software AB，Heleneborgsgatan 21C，SE-11731 Stockholm，Sweden)、圖形顯示程序O(Jones et.al.，Acta Crystallography，vol.A47，p.110，1991)、圖形顯示程序GRASP或圖形顯示程序INSIGHT)。例如，可使用分子置換或其它技術以及相關蛋白已知的三維結構以模擬B因子的三維結構，并可推測結合該結構的抗體的構象表位。事實上，可使用這些技術中的一種或這些技術的組合，以確定抗體結合表位。圖11和12闡明了結合模擬表位分析和突變分析的信息，使用三維模型鑒定本發(fā)明的B因子抗體的表位。
本文中所使用的術語“選擇性結合”指一種蛋白與另一種蛋白(如抗體、抗體片段或結合抗原的結合配偶體)的特異性結合，其中通過任何標準方法(如免疫分析)測得的結合水平在統(tǒng)計學上顯著高于分析的本底對照。例如，在進行免疫分析時，對照一般包括僅含有抗體或抗原結合片段(即無抗原)的反應孔/管，其中在無抗原時抗體或其抗原結合片段的反應(如非特異結合到孔內)的量被認為是本底?？赏ㄟ^本領域的各種標準方法檢測結合，這些方法包括但不限于蛋白質印跡、免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、免疫沉淀、表面等離子共振技術、化學發(fā)光法、熒光偏振法、磷光法、免疫組織化學分析、基質輔助激光解析-電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜術、顯微細胞術、微陣列、顯微術、熒光激活的細胞分選(FACS)法和流式細胞術。
本發(fā)明的一個實施方案包括抗體或其抗原結合片段，它為B因子結合抗B因子抗體(如單克隆抗體1379)的競爭性抑制劑。根據(jù)本發(fā)明，B因子結合本發(fā)明的抗B因子抗體的競爭性抑制劑為在與本發(fā)明的已知抗B因子抗體(如mAb1379)的相同表位或相似表位結合B因子的抑制劑(如另一種抗體或抗原結合片段或多肽)，因此已知抗B因子抗體與B因子的結合被抑制。競爭性抑制劑可以與抗B因子抗體相比更大的親和力結合靶物質(如B因子)?？梢员疚乃枋龅呐c抗B因子抗體1379相似的方式(如抑制補體旁路、抑制動物的氣道高反應性、抑制動物的氣道炎癥、抑制動物的再灌注缺血損傷等等)使用競爭性抑制劑。例如，本發(fā)明的一個實施方案涉及特異性結合B因子的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段競爭性抑制mAb1379特異性結合B因子，并且其中當該抗體或其片段結合B因子時，補體旁路被抑制，或者，mAb1379抑制補體旁路的能力被抑制。另一實施方案涉及特異性結合B因子的分離抗體或其片段，其中該分離抗體或其片段競爭性抑制二抗或其片段特異性結合B因子，并且其中該二抗或其片段結合B因子的第三SCR結構域。
可使用本領域的標準方法(如競爭性ELISA或其它結合分析)進行競爭性分析。例如，通過抑制B因子與已知的標記的抗B因子抗體(如mAb1379)的結合的能力可檢測競爭性抑制劑并對其進行定量。人B因子存在時的抗體-抗體競爭性分析在例如實施例3中描述。實施例3和表4中描述了B因子結合抗B因子1379的競爭性抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明，抗體的特征在于它們包含免疫球蛋白結構域，因此它們是蛋白的免疫球蛋白蛋白大家族的成員。一般而言，抗體分子包括兩種類型的鏈。其中一種鏈指重鏈或H鏈，另一種鏈指輕鏈或L鏈。兩種鏈以等摩爾比存在，并且每個抗體分子一般具有兩條H鏈和兩條L鏈。兩條H鏈通過二硫鍵連接在一起，每條H鏈和每條L鏈通過二硫鍵連接在一起。只有兩種類型的L鏈，為lambda(λ)鏈和kappa(κ)鏈。相反，有五種被稱為同種型的主要H鏈。這五類包括免疫球蛋白M(IgM或μ)、免疫球蛋白D(IgD或δ)、免疫球蛋白G(IgG或λ)、免疫球蛋白A(IgA或α)以及免疫球蛋白E(IgE或ε)。這些同種型之間的區(qū)別性特征通過免疫球蛋白的恒定區(qū)確定并在下文中詳細討論。人免疫球蛋白分子包括九種同種型IgM、IgD、IgE、IgG的四種亞類(包括IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)和IgG4(γ4))和IgA的兩種亞類(包括IgA1(α1)和IgA2(α2))。人的IgG亞類3和IgM為最有效的補體激活劑(經典補體系統(tǒng))，而IgG亞類1和亞類2(程度較低)為經典補體系統(tǒng)的中低度的激活劑。IgG4亞類并不激活補體系統(tǒng)(經典途徑或旁路途徑)。已知激活補體旁路系統(tǒng)的唯一的人免疫球蛋白同種型為IgA。在小鼠中，IgG亞類為IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。鼠類IgG1并不激活補體，而IgG2a、IgG2b和IgG3是補體激活劑。
免疫球蛋白分子的每條H鏈或L鏈包括兩個區(qū)域，稱為L鏈可變區(qū)(VL區(qū))和L鏈恒定區(qū)(CL區(qū))，以及H鏈可變區(qū)(VH區(qū))和H鏈恒定區(qū)(CH區(qū))。完整的CH區(qū)包括三個亞區(qū)(CH1、CH2、CH3)和一個鉸鏈區(qū)。總的來說，一條H鏈和一條L鏈可形成具有免疫球蛋白可變區(qū)的免疫球蛋白分子的臂。完整的免疫球蛋白分子包括兩個相連的(如二硫鍵連接的)臂。因此，整個免疫球蛋白的每個臂包括VH+L區(qū)和CH+L區(qū)。本文所使用的術語“可變區(qū)”或“V區(qū)”指VH+L區(qū)(也稱為Fv片段)、VL區(qū)或VH區(qū)。另外在本文中使用的術語“恒定區(qū)”或“C區(qū)”指CH+L區(qū)、CL區(qū)或CH區(qū)。
用蛋白酶對免疫球蛋白進行限制性消化可產生兩種片段?？乖Y合片段指Fab、Fab’、或F(ab’)2片段。缺乏結合抗原的能力的片段指Fc片段。Fab片段包括含有與VH區(qū)和部分CH區(qū)(CH1區(qū))相匹配的L鏈(VL+CL區(qū))的免疫球蛋白的一個臂。Fab′片段對應具有與CH1區(qū)附著的部分鉸鏈區(qū)的Fab片段。F(ab’)2片段對應通常在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵通常彼此共價連接的兩個Fab’片段。
CH區(qū)確定了免疫球蛋白的同種型，并根據(jù)不同的同種型賦予不同的功能特征。例如，μ恒定區(qū)使IgM分子的五聚體能夠形成，α恒定區(qū)使二聚體能夠形成。
免疫球蛋白分子的抗原特異性通過可變區(qū)或V區(qū)的氨基酸序列賦予。因此，不同免疫球蛋白分子的V區(qū)根據(jù)其抗原特異性可顯著不同。V區(qū)的某些部分較其它部分更為保守，被稱為骨架區(qū)(FW區(qū))。相反，V區(qū)的某些部分高度可變，被稱為高變區(qū)。VL和VH區(qū)在免疫球蛋白分子內配對時，每個區(qū)域的高變區(qū)聯(lián)合組成形成抗原結合位點的高變環(huán)(hypervariable loop)。因此，高變環(huán)決定了免疫球蛋白的特異性，被稱為互補決定區(qū)(CDR)，這是因為其表面與抗原是互補的。
V區(qū)的其它可變性通過編碼免疫球蛋白V區(qū)的基因區(qū)段的組合可變性賦予。免疫球蛋白基因包括多種系基因區(qū)段，該區(qū)段在體內重排形成編碼免疫球蛋白分子的重排免疫球蛋白基因。L鏈V基因區(qū)段和J基因區(qū)段(連接區(qū)段)編碼VL區(qū)。H鏈V基因區(qū)段、D基因區(qū)段(多變區(qū)段)和J基因區(qū)段(連接區(qū)段)編碼VH區(qū)。
L鏈和H鏈V基因區(qū)段均含有具有基本氨基酸序列可變性的三個區(qū)域。該區(qū)域分別指L鏈CDR1、CDR2和CDR3以及H鏈CDR1、CDR2和CDR3。L鏈CDR1的長度可在不同VL區(qū)顯著變化。例如，CDR1的長度可在約7個氨基酸到約17個氨基酸之間變化。相反，L鏈CDR2和CDR3的長度一般在不同VL區(qū)沒有變化。H鏈CDR3的長度可在不同VH區(qū)顯著變化。例如，CDR3的長度可在約1個氨基酸到約20個氨基酸之間變化。每個H鏈和L鏈CDR區(qū)的側翼區(qū)為FW區(qū)。
免疫球蛋白分子的其它功能方面包括免疫球蛋白分子的配價、免疫球蛋白分子的親和力以及免疫球蛋白分子的親合力。本文所使用的親和力指在免疫球蛋白分子單個位點上的免疫球蛋白分子結合抗原的強度(如單價Fab片段結合單價抗原)。親和力不同于親合力，后者指免疫球蛋白結合抗原的強度的總和。免疫球蛋白結合親和力的測量可通過使用本領域的標準技術，如競爭性結合技術、平衡透析法或BIAcore法。本文所使用的配價指每個免疫球蛋白分子的不同抗原結合位點數(shù)(即每個抗原結合片段的抗體分子上抗原結合位點數(shù))。例如，單價免疫球蛋白分子同時只能結合一個抗原，而二價免疫球蛋白分子可同時結合兩個或多個抗原等。選擇性結合補體旁路的蛋白的單價和二價抗體均包含于本文中。
在一個實施方案中，抗體為雙特異性抗體或多特異性抗體。如二價(或多價)抗體結合抗原那樣，雙特異性(或多特異性)抗體能結合兩個(或多個)抗原，但在這種情況下，抗原為不同的抗原(即抗體表現(xiàn)出雙特異性或更多的特異性)。例如，選擇性結合本發(fā)明的補體旁路中的蛋白的抗體(如本文中所描述的抗B因子抗體)可被構建成雙特異性抗體，其中第二抗原結合特異性針對所需靶物質。因此，本發(fā)明所包含的一種雙特異性抗體包括具有如下組成的抗體(a)結合補體旁路中的蛋白(如B因子)第一部分(如第一抗原結合部分)；和(b)結合細胞表達的細胞表面分子的第二部分。在該實施方案中，第二部分可結合任何細胞表面分子。一種優(yōu)選的細胞表面分子為受體或配體，因此該抗體靶向特定的細胞或組織類型和/或給予抗體的動物體內的特定位點。在一個實施方案中，第二抗原結合特異性針對補體受體。一種特別優(yōu)選的補體受體包括但不限于II型補體受體(CR2)。選擇性結合CR2并因此能用于本發(fā)明的該實施方案中的抗體在例如美國專利No.6,820,011中描述。
在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包括人源化抗體。人源化抗體是這樣一種分子，其抗原結合位點來自除人外的物種的免疫球蛋白，該分子的剩余的免疫球蛋白來源的部分來源于人免疫球蛋白。抗原結合位點可包括融合到人恒定區(qū)的完整可變區(qū)或僅包括嫁接到可變區(qū)中合適的人骨架區(qū)上的互補決定區(qū)(CDR)。人源化抗體可通過例如模擬抗體可變區(qū)并通過使用遺傳工程技術(如CDR嫁接)生產抗體來生產(參見下文)。已發(fā)現(xiàn)對多種生產人源化抗體的技術的描述，例如參見Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-55；Whittle et al.(1 987)Prot.Eng.1499-505；Co et al.(1990)J.Immunool.1481149-1154；Co et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882869-2873；Carter et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.894285-4289；Routledge et al.(1991)Eur.J.Immunol.212717-2725和PCT專利公布文本W(wǎng)O 91/09967、WO91/09968和WO 92/113831。
本發(fā)明的分離抗體可包括含該抗體的血清或不同程度純化的抗體。本發(fā)明的全部抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體?；蛘撸景l(fā)明可使用下述抗體全部抗體的功能等價物，如一個或多個抗體結構域被截短或缺失的抗原結合片段(如Fv、Fab、Fab’或F(ab)2片段)以及遺傳工程抗體或其抗原結合片段，包括單鏈抗體、人源化抗體(如上所述)、結合多于一個表位的抗體(如雙特異性抗體)或可結合一個或多個不同抗原的抗體(如雙特異性抗體或多特異性抗體)。
本發(fā)明的遺傳工程抗體包括通過標準重組DNA技術生產的抗體，這些技術涉及編碼抗體可變區(qū)和/或恒定區(qū)的DNA的操控和再表達。具體的實例包括嵌合抗體(抗體的VH區(qū)和/或VL區(qū)與余下抗體部分來自不同來源)以及CDR嫁接抗體(及其抗原結合片段)，其中至少一個CDR序列并且任選地至少一個可變區(qū)骨架氨基酸來自于一種來源并且余下可變區(qū)和恒定區(qū)部分(合適時)來自于不同來源。嵌合抗體和CDR嫁接抗體的構建在例如歐洲專利申請EP-A0194276、EP-A0239400、EP-A0451216和EP-A0460617中描述。
在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明生產嵌合抗體，該抗體包含結合補體旁路的蛋白(如B因子)的抗體可變區(qū)，以及與該區(qū)融合的、作為第二靶向部分的蛋白。例如，靶向部分可包括與靶向的細胞或組織相關，或與動物內的特定系統(tǒng)相關的蛋白。例如，靶向部分可為一部分補體受體。用于本發(fā)明這方面的一種優(yōu)選的補體受體包括II型補體受體(CR2)。在融合蛋白或嵌合蛋白中使用CR2及其部分(如作為送遞系統(tǒng))在美國專利No.6,820,011中詳細描述。
一般而言，在抗體的生產中，將抗原(針對該抗原可產生所需抗體)暴露給合適的實驗動物，例如但不限于兔、綿羊、倉鼠、豚鼠、小鼠、大鼠或雞。一般而言，通過將有效量的抗原注射給動物來免疫動物。抗原的有效量指誘導動物產生抗體所需要的量。然后，動物的免疫系統(tǒng)能在預定的一段時間內起反應。免疫過程可反復進行直到發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)產生針對抗原的抗體。為獲得特異性針對抗原的多克隆抗體，收集含有所需抗體的動物的血清(就雞而言，抗體可從雞蛋中收集)。該血清可作為試劑使用。多克隆抗體可通過例如用硫酸銨處理從血清(或雞蛋)中純化。
單克隆抗體可根據(jù)Kohler和Milstein的方法(Nature 256495-497，1975)生產。例如，從免疫動物的脾臟(或任何合適的組織)收集B淋巴細胞，然后與骨髓瘤細胞融合，以獲得能在合適的培養(yǎng)基中連續(xù)生長的雜交瘤細胞群。生產所需抗體的雜交瘤細胞可通過檢測雜交瘤細胞生產的抗體結合所需抗原的能力進行篩選。
生產本發(fā)明的抗體的優(yōu)選的方法包括(a)給予動物有效量的蛋白或肽(如B因子蛋白或含其結構域的肽)以生產抗體，并(b)回收抗體。在另一種方法中，本發(fā)明的抗體通過重組生產。例如，一旦獲得表達本發(fā)明的抗體的細胞系，如雜交瘤細胞，那么能從其中克隆cDNA并能鑒定編碼所需抗體的可變區(qū)基因，包括編碼CDR的序列。因此，本發(fā)明的抗體或抗原結合片段可通過制備一種或多種可復制的表達載體并將其轉化/轉染合適的宿主細胞獲得，并在該宿主細胞中生產抗體，其中所述的表達載體至少含有編碼抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)的DNA序列，并任選地含有編碼所需重鏈和/或輕鏈的余下部分的其他DNA序列。合適的表達宿主包括細菌(如大腸桿菌菌株)、真菌(特別是酵母菌，如畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的成員)和哺乳動物細胞系，如非生產型骨髓瘤細胞系，如小鼠NSO系或CHO細胞。為獲得有效的轉錄和翻譯，每個載體中的DNA序列應該包括合適的調控序列，特別是有效連接到可變區(qū)序列上的啟動子和前導序列。通過該途徑生產抗體的具體方法普遍熟悉并常規(guī)使用。例如，基礎分子生物學方法為Maniatis等人所描述(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1989)；可根據(jù)Sanger等人的描述(PNAS74，5463，(1977))和Amersham International plc測序手冊進行DNA測序，并可根據(jù)Kramer等人的方法(Nucl.Acids Res.12，9441，(1984))和AnglianBiotechnology Ltd.的手冊可進行定向誘變。另外，有很多包括專利說明書在內的出版物詳細描述了適合通過操控DNA、構建表達載體和轉化合適的細胞來制備抗體的技術，例如如Mountain A和Adair，JR在《生物技術和遺傳工程綜述》(Biotechnology and GeneticEngineering Reviews)(ed.Tombs，M P，10，Chapter 1，1992，Intercept，Andover，UK)和在前面提到的歐洲專利申請中總結的那樣。
其它采用例如噬菌體展示技術(參見例如US5969108、US5565332、US5871907、US5858657)的方法或者所選的US5627052中的淋巴細胞抗體方法也可用于生產本發(fā)明的抗體和/或抗原片段，這對技術人員而言是非常顯而易見。
因此，本發(fā)明的另一方面一般涉及用于選擇性抑制動物的補體旁路的組合物和方法，該動物患有補體旁路激活起作用的病癥或疾病或有患該病風險(如補體旁路的激活有助于病癥或疾病的進展，加重了該病癥或疾病的至少一個癥狀，或者引起病癥或疾病)。該方法包括使用本發(fā)明的新型B因子抗體(上文已詳細描述)。該病癥或疾病包括但不限于與氣道高反應性(包括炎癥相關氣道高反應性)、缺血-再灌注損傷以及胎兒丟失相關的病癥。下面將詳細描述含該抗體及其抗原結合片段以及模擬本文所描述的B因子抗體的特異性的抗原結合多肽的組合物和制劑，以及給予方法和劑量的討論。
預防或抑制氣道高反應性和氣道炎癥的方法基于本發(fā)明人的補體旁路是抑制氣道高反應性和氣道炎癥所必要的和充分的這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的另一實施方案涉及抑制患有炎癥相關氣道高反應性或氣道炎癥或者有患該病風險的動物的氣道高反應性和/或氣道炎癥的方法。該方法包括選擇性抑制患有氣道高反應性或有患該病風險的動物的補體旁路的步驟，所述氣道高反應性包括炎癥相關氣道高反應性(即氣道高反應性的出現(xiàn)是由于炎癥或者炎性過程，或者與氣道中的炎癥同時出現(xiàn)或先于炎癥出現(xiàn))。
下文中的討論對治療或預防動物的氣道高反應性和/或氣道炎癥或與此相關的病癥或疾病方面進行了詳細說明。但是，應該理解的是對抑制劑、給藥途徑、劑量、治療指示劑、對制劑的描述等等的一般性討論可應用到本文所描述的發(fā)明的任何實施方案中(即針對與氣道高反應性和氣道炎癥相關的那些疾病或病癥以外的其它病癥或疾病)。例如，下文所描述的發(fā)明的許多概括方面可應用到補體旁路的特定抑制，以治療其它的病癥，如缺血-再灌注損傷。
根據(jù)本發(fā)明，抑制動物的補體旁路指抑制作為補體旁路的一部分的至少一種蛋白的表達和/或生物活性。該蛋白包括但不限于B因子、D因子或備解素。“選擇性”抑制補體旁路意味著本發(fā)明的方法優(yōu)先地或唯一地抑制補體旁路，但是不抑制或至少不顯著抑制補體激活的其它途徑(包括經典補體途徑或凝集素途徑)。例如，本發(fā)明的新型B因子抗體及其抗原結合片段為選擇性抑制補體旁路的試劑的一個實例。該定義應用到本文所描述的其它方法中，其中補體旁路被選擇性抑制。
本發(fā)明的補體旁路的抑制可通過直接影響補體旁路的蛋白表達(轉錄或翻譯)或生物活性完成，或通過直接影響蛋白結合補體旁路的蛋白或影響蛋白以其他方式幫助激活旁路途徑中的補體的能力完成。更具體而言，在一個實施方案中，蛋白的表達指蛋白的轉錄或蛋白的翻譯。因此，本發(fā)明的方法可抑制天然表達該蛋白的動物中蛋白的轉錄和/或翻譯(如通過給予抑制蛋白表達的試劑以及對動物進行遺傳修飾以減少蛋白表達)。在另一實施方案中，補體旁路的抑制在本文中被定義為該途徑活性的任何可測量的(可檢測的)降低(即減少、下調、抑制)，例如通過補體旁路的蛋白表達和/或生物活性的可測量的降低。
根據(jù)本發(fā)明，“氣道高反應性”或“AHR”指氣道的異常，它使得氣道對能引起氣流受限的刺激非常易于變窄和/或過度變窄。AHR可為呼吸系統(tǒng)的功能性改變，這是由于氣道中的炎癥(即炎癥相關AHR)或由于氣道重建(如通過膠原沉積)。氣流受限是指氣道的不可逆的或可逆的變窄。氣流受限或氣道高反應性可由下述現(xiàn)象引起膠原沉積、支氣管痙攣、氣道平滑肌肥大、氣道平滑肌收縮、粘液分泌、細胞沉積、上皮的破壞、上皮穿透性的改變、平滑肌功能或敏感性的改變、肺實質的異常以及氣道內和周圍的浸潤性疾病。盡管AHR是與炎癥不同的癥狀，但是這些誘因中還是有許多與炎癥相關(即AHR為上文所描述的特定病癥或癥狀，它可(但不總是)與氣道的前期炎癥或并發(fā)炎癥相關)。通過暴露于激發(fā)劑或刺激物(在本文中也稱為AHR激發(fā)刺激物)，AHR可在具有與上述誘因相關的病癥的患者內激發(fā)。該刺激物包括但不限于過敏原、乙酰甲基膽堿、組胺、白三烯、鹽水、通氣增強、運動、二氧化硫、腺苷、心得安(propranolol)、冷空氣、抗原、緩激肽、乙酰膽堿、前列腺素、臭氧、環(huán)境空氣污染物及其混合物。本發(fā)明涉及與具有炎癥的任何呼吸病癥相關的氣道高反應性，特別涉及過敏原誘導的氣道高反應性。
氣道高反應性通常與過敏性炎癥和/或病毒誘導的炎癥相關。與過敏性炎癥相關的氣道高反應性可出現(xiàn)在患有包括但不限于慢性阻塞性氣道疾病的病癥或有患該病風險的病人中。該病癥包括但不限于哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、過敏性支氣管肺曲霉病、過敏性肺炎、嗜酸粒細胞性肺炎、肺氣腫、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管擴張、囊性纖維化病、結核病、過敏性肺炎、職業(yè)性哮喘、結節(jié)病、反應性氣道病綜合征、間質性肺病、嗜酸細胞增多綜合征、鼻炎、鼻竇炎、運動誘發(fā)哮喘、污染誘發(fā)哮喘和肺寄生蟲病。與病毒誘導的炎癥相關的氣道高反應性出現(xiàn)在被病毒感染或有被感染風險的患者內，這些病毒包括但不限于呼吸道合胞體病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、鼻病毒(RV)和腺病毒。使用本發(fā)明的方法和試劑治療的其它疾病或病癥包括涉及疾病(如全身性自身免疫疾病)引起的炎癥和/或氣道高反應性的任何肺部病癥或肺部并發(fā)癥。例如，使用本發(fā)明可治療全身性紅斑狼瘡中的肺部并發(fā)癥。
炎癥的特征一般在于炎性介質(如細胞因子或趨化因子)的釋放，該炎性介質將參與炎癥的細胞募集至組織中。氣道炎癥為出現(xiàn)在動物氣道(肺組織、呼吸細胞和組織)中的炎癥。與過敏性炎癥相關的病癥或疾病是這樣一種病癥或疾病，即在動物中誘發(fā)針對敏化劑(如過敏原)的一類免疫應答(如Th2型免疫應答)可導致炎性介質的釋放，炎性介質募集參與炎癥的細胞，它的存在可導致組織損害，并且有時會引起死亡。如上所述，AHR通常與氣道炎癥相關(與氣道炎癥同時出現(xiàn)，或者可能由氣道炎癥引起)。應該注意的是AHR的癥狀或病癥有時可不依賴炎癥癥狀治療，反之亦然(如對AHR的治療可能對炎癥有影響，也可能沒有-它們是獨立的病癥)。
AHR可通過負荷試驗(stress test)檢測，該試驗包括檢測動物對激發(fā)劑(即刺激物)應答的呼吸系統(tǒng)功能。AHR可以呼吸功能相對基線的改變對激發(fā)劑的劑量所作的曲線圖的形式測量(該檢測的方法以及所使用的哺乳動物模型在下文的實施例中描述)。呼吸功能(以及AHR的生物特征)可通過下述方式檢測，例如肺活量測定法、體積描記法、峰值氣流量、癥狀得分、體征(即呼吸速率)、哮嗚、運動耐受、救援藥劑(即支氣管擴張藥)的使用、咳嗽和血液氣體。人的肺活量測定法與激發(fā)劑如乙酰甲基膽堿或組胺一起測量呼吸功能的改變。通過要求人深呼吸并將氣體最長時間、最大力、最快速地吹入測量氣流和體積的計量器中對人的肺活量進行測量。已知第一秒呼出的空氣體積為用力呼氣量(FEV1)，呼出氣體的總體積為用力肺活量(FVC)?？色@得人的正常預計FEV1和FVC，并根據(jù)體重、身高、性別和種族對其進行標準化。未患病個體的FEV1和FVC為特定人的正常預計值的至少約80％，并且FEV1/FVC的比率為至少約80％。分別在吸入激發(fā)劑前(即表示患者的靜息狀態(tài))后(即表示患者較高的肺阻力狀態(tài))測定該數(shù)值。所得到的曲線的位置表明氣道對激發(fā)劑的敏感性。
激發(fā)劑的劑量或濃度的增加對肺功能的影響通過測量用激發(fā)劑攻擊的動物在第一秒的用力呼氣量(FEV1)以及FEV1比用力肺活量(FEV1/FVC比率)檢測。引起人的FEV1下降20％的激發(fā)劑(即乙酰甲基膽堿或組胺)的劑量或濃度(PC20FEV1)為AHR的程度的指標。使用本領域的技術人員所熟知的方法可檢測FEV1和FVC值。
通過測量跨肺壓(氣道開放和身體體積描記器之間的壓力差)可檢測肺部功能量度氣道阻力(RL)、動態(tài)順應性(CL)和高反應性。體積為身體體積描記器中所計算的壓力變化，氣流為體積信號的數(shù)字差異。使用本領域技術人員所熟知的方法(如通過使用運動平衡的遞歸最小二乘方方案)獲得阻力(RL)和順應性(CL)。應該注意的是測量除人外的哺乳動物(如小鼠)中的氣道阻力(RL)值可用于診斷氣流阻塞(airflow obstruction)，這同測量人的FEV1和/或FEV1/FVC比率相似。
可使用多種激發(fā)劑測量AHR值。合適的激發(fā)劑包括直接和間接刺激物，并通常為體內激發(fā)AHR的激發(fā)劑。本文所使用的短語“激發(fā)劑”可與短語“AHR激發(fā)刺激物”互換使用。優(yōu)選的激發(fā)劑或刺激物包括例如過敏原、乙酰甲基膽堿、組胺、有機刺激物、刺激性氣體和化學藥品、白三烯、鹽水、通氣增強、運動、二氧化硫、腺苷、心得安、冷空氣、抗原、緩激肽、乙酰膽堿、前列腺素、臭氧、環(huán)境空氣污染物及其混合物。優(yōu)選地，對AHR的試驗性誘導而言，乙酰甲基膽堿(Mch)用作激發(fā)劑。用于濃度-反應曲線中的Mch的優(yōu)選濃度介于約0.001到約100毫克每毫升(mg/ml)之間。用于濃度-反應曲線中的Mch的更優(yōu)選濃度介于約0.01到約50mg/ml之間。用于濃度-反應曲線中的Mch的更優(yōu)選濃度介于約0.02到約25mg/ml之間。當Mch用作激發(fā)劑時，AHR的程度被定義為引起動物的FEV1下降20％所需要的Mch的激發(fā)濃度(PC20乙酰甲基膽堿FEV1)。例如，在人中，并使用并領域的標準方法，一個正常人的PC20乙酰甲基膽堿FEV1一般大于8mg/ml Mch。因此，在人中，AHR被定義為PC20乙酰甲基膽堿FEV1小于8mg/ml Mch。
根據(jù)本發(fā)明，呼吸功能可通過各種靜態(tài)試驗評估，該試驗包括檢測在不存在激發(fā)劑時動物的呼吸系統(tǒng)功能。靜態(tài)試驗的實例包括例如肺活量測定法、體積描記法、峰值氣流量、癥狀得分、體征(即呼吸速率)、哮鳴、運動耐受、救援藥劑(即支氣管擴張藥)的使用、血液氣體和咳嗽。通過測量下述指標可在靜態(tài)試驗中進行評估肺部功能，例如總肺活量(TLC)、胸腔氣體容量(TgV)、肺功能殘氣量(FRC)、殘氣量(RV)和肺體積的電導率(SGL)，肺一氧化碳彌散量(DLCO)、動脈血液氣體，包括用于氣體交換的pH、PO2和PCO2。FEV1和FEV1/FVC均可用于檢測氣流受限。若在人中使用肺活量測定法，個人的FEV1可與FEV1的預計值相比較。FEV1預計值可通過以動物的年齡、性別、體重、身高和種族為基礎的標準正常圖獲得。正常動物的FEV1一般為動物的預計FEV1的至少約80％。氣流受限引起FEV1或FVC小于預計值的80％。另一種檢測氣流受限的方法以FEV1與FVC的比率(FEV1/FVC)為基礎。未患疾病的個體被定義為其FEV1/FVC的比率至少約為80％。氣流阻塞引起FEV1/FVC的比率下降到小于預計值的80％。因此，具有氣流受限的動物被定義為其FEV1/FVC小于約80％。
本文所使用的降低氣道高反應性指氣道高反應性中的任何可測量的降低和/或氣道高反應性出現(xiàn)在患者中的出現(xiàn)率或頻率的任何降低。AHR的降低可通過使用任何上述技術或任何其他本領域所熟知的適合的方法進行測量。優(yōu)選地，氣道高反應性或可能的氣道高反應性被降低，最佳被降低到動物不再忍受由氣道高反應性引起或與之相關的不舒適和/或功能改變。預防氣道高反應性指在本文所述的氣道高反應性的生物學特征可在患者內被明顯檢測或測量前預防或中止氣道高反應性的誘導。一旦一個或多個氣道高反應性的生物學特征可被明顯檢測或測量，急性起病的氣道高反應性被認為已經出現(xiàn)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法減少了動物的乙酰甲基膽堿的反應性。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法引起動物的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值提高，因此在使用本發(fā)明的方法前(此時動物用乙酰甲基膽堿的第一濃度激發(fā))所獲得的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值與在使用本發(fā)明的方法后(此時動物用二倍于乙酰甲基膽堿的第一濃度激發(fā))所獲得的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值相同。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法引起動物的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值提高，因此，在使用本發(fā)明的方法前(此時動物用約0.01mg/ml到約8mg/ml的乙酰甲基膽堿激發(fā))所獲得的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值與在使用本發(fā)明的方法后(此時動物用約0.02mg/ml到約16mg/ml的乙酰甲基膽堿激發(fā))所獲得的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值相同。
在另一實施方案中，本發(fā)明的方法將動物的FEV1提高了動物預計FEV1的至少約5％，更優(yōu)選提高了約6％到約100％，更優(yōu)選提高了約7％到約100％，更優(yōu)選提高了約8％到約100％。在另一實施方案中，本發(fā)明的方法將動物的FEV1提高了至少約5％，優(yōu)選至少約10％，更優(yōu)選至少約25％，更優(yōu)選至少約50％，更優(yōu)選至少約75％。
在另一實施方案中，本發(fā)明的方法引起動物的PC20乙酰甲基膽堿FEV1相對于正常動物的PC20乙酰甲基膽堿FEV1提高了約兩倍濃度。正常動物指已知未患有異常AHR或對其不敏感的動物。患者或待測動物指疑似患有異常AHR或對其敏感的動物。
因此，患氣道高反應性的動物為其氣道高反應性例如可通過使用上述用于測量氣道高反應性的其中一種方法被測量或檢測的動物，其中如上所述，氣道高反應性一般通過暴露于AHR激發(fā)刺激物被誘導。同樣，患有過敏原誘導的氣道高反應性的動物為其氣道高反應性例如可通過使用上述用于測量氣道高反應性的其中一種方法被測量或檢測的動物，其中，氣道高反應性可通過暴露給過敏原誘導。為了通過AHR激發(fā)刺激物如過敏原誘導，氣道高反應性可通過暴露于刺激物明顯地直接或間接引發(fā)(如由后者引起，為后者的癥狀、指標，或者與后者同時出現(xiàn)的事件)。AHR的癥狀或生物學特征包括但不限于改變了的呼吸功能(參見上文詳述))的指標、呼吸速率的改變、哮嗚、降低了的運動耐受、咳嗽和改變了的血液氣體。任何一個或多個這些癥狀的檢測或測量是急性AHR發(fā)作的指標。
就過敏原而言，氣道高反應性由先前敏化動物的過敏原明顯、直接或間接引發(fā)。對過敏原敏化指之前一次或多次暴露給過敏原，由此出現(xiàn)針對該過敏原的免疫應答。與過敏反應相關的應答(如組胺釋放、鼻炎、水腫、血管舒張、支氣管壓縮(bronchial constriction)或氣道高反應性、氣道炎癥)一般在新個體第一次暴露給過敏原時不出現(xiàn)，但是一旦產生了針對過敏原的細胞免疫應答和體液免疫應答，個體就對該過敏原“敏化”。然后，當敏化個體再次暴露于相同過敏原(如過敏原攻擊)時，就會出現(xiàn)過敏反應。一旦個體對過敏原敏化，過敏反應會隨著接下來的每次暴露給過敏原而變嚴重，因為每次再暴露不僅產生了過敏癥狀，還進一步提高了針對過敏原所產生的的抗體的水平以及針對過敏原的T細胞應答的水平。
一般而言，與針對抗原(即過敏原)的過敏反應相關的病癥其特征至少部分在于肺部組織的炎癥。這些病癥或疾病在上文中已描述。應該注意的是盡管本發(fā)明的效果可能涉及過敏炎癥的抑制，但是本發(fā)明的本實施方案特別針對AHR的治療，因此不需要引起AHR如過敏炎癥的相關病癥或誘因能得以顯著降低或“治愈”。本發(fā)明的方法甚至在動物的肺部的炎性反應完全確立后可完全有效地降低AHR。有患氣道高反應性風險的動物為已暴露于足以引發(fā)AHR的AHR激發(fā)刺激物或有暴露于該刺激物風險，但尚未表現(xiàn)出氣道高反應性的可測量或檢測的特征或癥狀(已在前文中描述的那些癥狀)的動物。有患過敏原誘導的氣道高反應性風險的動物為先由過敏原敏化并且已暴露于足以引發(fā)AHR的過敏原的量(即過敏原的引發(fā)量或攻擊量)或有暴露于其中的風險，但尚未表現(xiàn)出氣道高反應性的可檢測或測量的特征或癥狀的動物。有患氣道高反應性風險的動物還包括被認為易患該病癥或疾病或對其敏感的動物。
本發(fā)明的方法還可抑制或降低動物的氣道炎癥。炎癥，特別是嗜酸性炎癥，是包括哮喘在內的多種呼吸疾病的標志。通過使用幾個參數(shù)可評估氣道炎癥，這幾個參數(shù)包括但不限于肺內炎性細胞的累積(如嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的多種細胞因子(如IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13和IFN-γ)的水平改變和/或肺內粘液生成的變化。實施例中示出了多種這些參數(shù)的測量方法。
本發(fā)明的試劑和制劑可給予任何動物患者，優(yōu)選給予人。根據(jù)本發(fā)明，試劑或制劑的給予可用于抑制AHR、氣道炎癥或治療與這些病癥相關的疾病。本發(fā)明的方法的適合的候選患者包括但不限于患有該病癥或疾病或有患該病風險(如易于患該病)的患者。盡管本發(fā)明的效果可能涉及對患者的顯著治療益處，但是如上所述，本發(fā)明主要涉及AHR和/或氣道炎癥的治療，因此不需要引起AHR或氣道炎癥的病癥或誘因，或與這些病癥相關的疾病被顯著降低或“治愈”。這個概念也普遍應用于補體旁路起作用的其它病癥或疾病中。
因此，治療益處不一定是治愈特定疾病或病癥(包括本文所描述的任何疾病或病癥)，而是優(yōu)選包括最通常包括下述的結果緩解疾病或病癥、消除疾病或病癥、減少與疾病或病癥相關的癥狀、預防或緩解由于原發(fā)性疾病或病癥的出現(xiàn)而引起的繼發(fā)性疾病或病癥和/或預防疾病或病癥。本文所使用的短語“免于感染疾病”指減少疾病癥狀、減少疾病的出現(xiàn)率和/或降低疾病的嚴重程度。保護患者可指本發(fā)明的組合物給予患者時它阻止疾病出現(xiàn)和/或治愈或減輕疾病癥狀、征兆或原因的能力。因此，使患者免于感染疾病包括預防疾病的發(fā)生(預防性治療)和治療患病的患者(治療性治療)。有益效果很容易由本領域的技術人員和/或經過專門訓練的治療患者的臨床醫(yī)生所評估。術語“疾病”指哺乳動物從正常健康的任何偏離，包括疾病癥狀存在時的狀態(tài)，以及偏離(如感染、基因突變、遺傳缺失等)已出現(xiàn)但癥狀尚未得到證實的病癥。
因此，本發(fā)明的方法包括多種試劑(即調控化合物)的用途，這些試劑通過直接對補體旁路的蛋白起作用選擇性抑制補體旁路的一種或多種蛋白的表達和/或生物學活性，由此降低動物的氣道高反應性和/或氣道炎癥。用于本發(fā)明的試劑包括例如蛋白、核酸分子、抗體和為推理性藥物設計的產物的化合物(即藥物)。這些試劑在本文中一般指抑制劑。根據(jù)本發(fā)明，抑制劑為任何抑制(直接抑制或競爭性抑制)蛋白(如補體旁路的蛋白)的表達和/或生物學活性的試劑，包括對B因子、D因子或備解素起作用的試劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，補體旁路或補體旁路的蛋白的抑制在本文中被定義為任何可測量的(可檢測的)補體旁路的蛋白的生物學活性的降低(即減少、下調、抑制)。蛋白的生物學活性或生物學作用指天然存在形式的蛋白體內(即蛋白的天然生理環(huán)境)或體外(即在實驗室條件下)檢測或觀察所展現(xiàn)或執(zhí)行的任何功能。例如，B因子的生物學活性包括但不限于結合激活的C3，溶解免疫復合物、B細胞生長因子活性和單核細胞激活。根據(jù)本發(fā)明，蛋白的生物學活性通過直接阻止或抑制(降低、減少)蛋白結合和/或激活另一種蛋白(如C3)的能力可被抑制，由此抑制該結合所引起的下游事件。優(yōu)選地，補體旁路的生物學活性通過給予抑制該途徑中的至少一種蛋白的試劑被抑制，該試劑包括但不限于以蛋白結合和/或激活另一種蛋白的能力被抑制或阻止的方式結合該途徑中至少一種蛋白或與該途徑中的蛋白競爭的試劑。這種試劑包括但不限于蛋白的拮抗劑、抗體(包括其抗原結合片段)、其它抗原結合多肽以及小分子(如合成化合物或藥物)。
用于本發(fā)明的一種試劑為補體旁路的拮抗劑，包括該途徑中的蛋白的拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明，“拮抗劑”指抑制(如拮抗、降低、減少、阻斷、逆轉或改變)指定蛋白的作用的任何化合物。更具體而言，拮抗劑能以相對于指定蛋白的活性的方式起作用，因此該指定蛋白的生物學活性以拮抗(如對抗、逆轉、相反于)指定蛋白的天然作用的方式被降低或阻斷。拮抗劑可包括但不限于抗體或其抗原結合片段、蛋白、肽、核酸(包括核酶和反義鏈)或提供拮抗效果的藥物/化合物/肽設計或選擇的產物。例如，本發(fā)明包括天然蛋白、B因子、D因子或備解素的任何拮抗劑，包括抗體拮抗劑、蛋白/肽拮抗劑、核酸拮抗劑或小分子拮抗劑(如小分子抑制劑)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，用于抑制補體旁路的試劑為抗體或其抗原結合片段。同樣，抗原結合多肽也特別優(yōu)選用于本發(fā)明中。一方面，抗體選擇性結合補體旁路的蛋白，以使該蛋白與另一種蛋白的結合(通常情況下，即天然條件下或生理條件下它們發(fā)生相互作用)被抑制或阻止。另一方面，抗體選擇性結合該蛋白，以抑制或阻止該蛋白激活另一種蛋白(通常情況下相互作用，即便該蛋白與其它蛋白部分結合)。用于選擇性抑制補體途徑中的特別優(yōu)選的抗體及其抗原結合片段已在上文中詳細描述(如本文所描述的B因子抗體，特別是本文詳細描述的mAb1379抗體)。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段結合選自B因子、D因子或備解素中的蛋白。最優(yōu)選地，本發(fā)明包括結合B因子的抗體或其抗原結合片段。本發(fā)明的選擇性結合B因子并抑制補體旁路的抗體(及其抗原結合片段)在本文中詳細描述并舉例說明。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合在動物物種、特別是在哺乳動物物種中保守的該蛋白的保守結合表面或表位(即該抗體與來自兩種或多種不同哺乳動物物種的該蛋白交叉反應)。具體而言，本發(fā)明包括結合來自至少兩種、優(yōu)選幾種不同哺乳動物物種(包括但不限于人、除人外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔)中的補體旁路的蛋白的抗體。
本發(fā)明還涉及設計來選擇性結合并中和或抑制本發(fā)明的蛋白的非抗體多肽，有時指抗原結合配偶體或者抗原結合多肽。具有前述配體特異性的該多肽的設計的實例已由Beste等人給出(Proc.Natl.Acad.Sci.961898-1903，1999)，通過援引全文納入本文。
除了抗體、其抗原結合片段以及抗原結合多肽外，本發(fā)明還包括抑制補體旁路的蛋白的其它試劑。這些試劑包括例如推理性藥物設計的產物的化合物、天然產物以及具有部分明確的調控性質的化合物。調控試劑包括指定蛋白的拮抗劑，可為以蛋白為基礎的化合物、以碳水化合物為基礎的化合物、以脂質為基礎的化合物、以核酸為基礎的化合物、天然的有機化合物、合成的衍生有機化合物、抗體或其片段。在一個實施方案中，本發(fā)明的該調控試劑包括藥劑，這些藥劑包括調節(jié)補體旁路的一種或多種蛋白的產生和/或功能的肽、寡核苷酸、碳水化合物和/或合成有機分子。該試劑可從例如分子多樣性方法(可快速構建較大的具有化學多樣性的分子文庫的相關方法的組合)、天然化合物或合成化合物的文庫中獲得，特別是從化學文庫或組合文庫(即序列或大小不同但是具有相同的結構單元的化合物文庫)中獲得，或通過推理性藥物設計獲得。參見例如Maulik et al.，1997，MolecularBiotechnologyTherapeutic Applications and Strategies，Wiley-Liss，Inc.，通過援引全文納入本文。
在分子多樣性方法中，使用生物學方法、酶學方法和/或化學方法，從例如肽、寡核苷酸、碳水化合物和/或合成有機分子中合成較大的化合物文庫。在進行分子多樣性方法中的關鍵參數(shù)包括亞基多樣性、分子大小和文庫多樣性。篩選該文庫的總的目的在于利用連續(xù)使用組合選擇以獲得針對所需靶物質的高親和力配體，然后通過隨機設計方法或定向設計方法將主要分子最優(yōu)化。分子多樣性的方法已由Maulik等人(上文)詳細描述。
在推理性藥物設計方法中，調控化合物的三維結構可通過例如核磁共振(NMR)或X射線晶體學分析。然后通過例如計算機模型，使用該三維結構預測諸如可能的調控劑的可能的化合物的結構。被預測的化合物的結構可用于將例如通過分子多樣性方法得到的主要化合物最優(yōu)化。另外，被預測的化合物結構可通過例如化學合成、重組DNA技術或通過從天然來源(如植物、動物、細菌和真菌)分離模擬表位生產。
Maulik等人(1997，上文)公開了其它以結構為基礎的藥物設計的各種方法。Maulik等人公開了例如定向設計的方法(其中使用者指導形成來自恰當選擇的片段的片段文庫的新型分子的進程)、隨機設計(其中使用者使用遺傳算法或其它算法隨機突變片段及其組合，同時使用選擇標準以評估候選配體的適配度(fitness))以及以篩網(wǎng)為基礎的方法(其中使用者計算了三維受體結構和小的片段探針之間的互作用能，然后將有利的探針位點連接在一起)。
可用作抑制補體旁路的蛋白的試劑的分離核酸分子為反義核酸分子、核酶或siRNA。本文所使用的反義核酸分子被定義為通過在嚴格條件下與編碼蛋白的基因雜交以減少蛋白表達的分離核酸分子。該核酸分子與編碼蛋白的基因非常相似，該分子能在高度嚴格條件下與編碼天然蛋白的基因或RNA的編碼鏈或互補鏈RNA雜交。RNA干擾(RNAi)是一種方法，藉此，雙鏈RNA以及哺乳動物系統(tǒng)中的短干擾RNA(siRNA)被用于抑制或沉默互補基因的表達。靶細胞中的siRNA已被解鏈，并且與RNA誘導的沉默復合物(RISC)相關，RISC隨后被指導進入與siRNA互補的mRNA序列，藉此RISC剪切了mRNA。核酶為通過結合靶RNA部分起作用并通過在特定剪切位點剪切磷酸二酯骨架使其失活的RNA區(qū)段。
基因包括調控基因編碼蛋白的生產的調控區(qū)(例如但不限于轉錄、翻譯或翻譯后調控區(qū))以及編碼區(qū)自身。編碼補體旁路的多種蛋白(包括B因子、D因子或備解素)的基因已被鑒定并為本領域所熟知。分離核酸分子為已從其天然環(huán)境中取出(即受到人為操控)的核酸分子，可包括DNA、RNA或者DNA或RNA的衍生物。因此，“分離”并不反映核酸分子被純化的程度。本發(fā)明的分離核酸分子可從天然來源分離或使用重組DNA技術(如聚合酶鏈反應(PCR)擴增、克隆)或化學合成生產。
本文所使用的雜交條件指核酸分子用于鑒定相似核酸分子的標準雜交條件。例如，Sambrook等人(Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989)已經公開了這種標準雜交條件。Sambrook等人的該出版物(如前)通過援引全文納入本文(具體參見9.31-9.62頁)。另外，例如Meinkoth等人(Meinkoth et al.，1984，Anal.Biochem.138，267-284)還公開了計算合適的雜交和洗滌條件的公式以獲得不同程度的核苷酸錯配的雜交。Meinkoth等人的該出版物(如前)通過援引全文納入本文。
缺血-再灌注損傷本發(fā)明的另一實施方案涉及本發(fā)明人的使用例如本文所描述的抗B因子抗體或其抗原結合片段抑制B因子并抑制缺血-再灌注損傷這一發(fā)現(xiàn)。該發(fā)現(xiàn)在腎臟缺血-再灌注損傷模型中證實。因此，本發(fā)明的方法和組合物在與缺血-再灌注損傷以及本發(fā)明的一方面——腎臟缺血-再灌注損傷相關的病癥中也具有治療效用。使用該方法可預防或減少的其它類型的缺血-再灌注損傷，包括但不限于心臟缺血-再灌注損傷、中樞神經系統(tǒng)缺血-再灌注、四肢或手指(腳趾)的缺血-再灌注損傷、內臟如肺、肝或小腸的缺血-再灌注或者任何移植器官或組織的缺血-再灌注損傷。
本發(fā)明的方法包括下列步驟選擇性抑制患有缺血-再灌注或有患該病風險的動物內的補體旁路。優(yōu)選地，由于缺血-再灌注而引起的至少一個損傷的癥狀或類型被預防或抑制。缺血-再灌注損傷可提高細胞和組織所產生的各種可能有害的化合物的產生或氧化，該過程可引起細胞和組織的氧化損傷或死亡。例如，腎臟缺血-再灌注損傷可引起腎臟的組織學損傷，包括以急性腎小管壞死(acute tubularnecrosis)為特征的腎小管損害和變化。所引起的腎臟功能障礙使得通常由腎臟所分泌的諸如血清尿素氮(SUN)的含氮廢物的累積。缺血-再灌注還可引起諸如肺的遠端器官的損傷。本方法優(yōu)選利用上文詳細描述的本發(fā)明的新型B因子抗體，在將它給予患有缺血-再灌注或有患該病風險的動物時，它預防、降低或抑制至少一個由于缺血-再灌注引起的損傷癥狀。本文所描述的本發(fā)明的任何B因子抗體、其抗原結合片段或具有相似結合特異性的抗原結合多肽可用于本發(fā)明的該實施方案中。本文提供了在本發(fā)明的各種方法中關于優(yōu)選劑量、給藥途徑、包含該抗體及有關試劑的組合物和制劑的描述并且它們被納入該實施方案中。
應該注意的是，本發(fā)明的該實施方案特別涉及缺血-再灌注損傷的治療，因此，不需要引起缺血-再灌注損傷的相關病癥或誘因被顯著降低或“治愈”。本發(fā)明的方法可完全有效預防或降低與缺血-再灌注相關的損害或損傷，或者改善或減輕該損傷的至少一個癥狀。因此，給予本文所描述的試劑或制劑可用于預防或抑制缺血-再灌注損傷，盡管不需要完全預防該損傷，但是優(yōu)選患者能從該試劑或制劑的使用中獲得至少一種治療效用。
與本發(fā)明的實施方案相關的制劑、組合物和方法本發(fā)明的另一實施方案還包括含有補體旁路抑制劑，特別是上文所描述的補體旁路選擇性抑制劑的制劑或組合物。該制劑或組合物可用于本文所描述的任何方法中并且與本文所描述的任何試劑(如本文所描述的新型B因子抗體)使用。在一個實施方案中，該組合物可用于降低或預防動物的氣道高反應性。在另一實施方案中，該組合物可用于降低或預防動物的缺血-再灌注損傷。在另一實施方案中，該組合物通過選擇性抑制補體旁路用于治療或預防病癥或疾病。該制劑包括(a)上文所描述的補體旁路的抑制劑；(b)可藥用的載體。
在一個實施方案中，該制劑或組合物可包括一種或多種其它試劑，如適用于降低患有氣道高反應性、特別是患有炎癥相關氣道高反應性或有患該病風險的動物的炎癥的消炎藥。消炎藥可為任何適用于降低患有與氣道高反應性相關的炎癥病癥的患者的炎癥的消炎藥，包括但不限于皮質類固醇(口服、吸入和注射)、β-激動劑(長效或短效)、白三烯調節(jié)物(抑制劑或受體拮抗劑)、細胞因子或細胞因子受體拮抗劑、抗IgE、磷酸二酯酶抑制劑、色甘酸鈉、萘多羅米(nedocrimal)、茶堿和T細胞功能抑制劑。用于本制劑的特別優(yōu)選的消炎藥包括皮質類固醇、白三烯調節(jié)物和細胞因子或細胞因子受體拮抗劑。
在另一實施方案中，該制劑或組合物可包括一種或多種其它試劑，如適用于預防或降低動物的缺血-再灌注損傷的其它試劑。該試劑包括但不限于消炎藥或氧化和自由基損害的抑制劑。
在另一實施方案中，該制劑或組合物可包括一種或多種其它試劑，如適用于治療與補體旁路激活相關的另一種疾病或病癥的其它試劑。
根據(jù)本發(fā)明，“可藥用載體”包括適用于將制劑或組合物給予體內的合適位點的可藥用賦形劑和/或可藥用的送遞載體。體內的合適位點優(yōu)選補體旁路可被抑制的任何位點。在一個優(yōu)選的實施方案中，當患者患有氣道高反應性和/或氣道炎癥或有患該病風險時，體內的合適位點優(yōu)選在肺組織或氣道內。體內的其它優(yōu)選位點包括位于與補體旁路相關的病癥的發(fā)病中心的其它組織或器官。在另一優(yōu)選的實施方案中，體內的合適位點為缺血-再灌注損傷出現(xiàn)的任何位點，如在心臟或肺系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)、四肢或手指(腳趾)、內臟(如肺、肝或小腸)內或在任何移植器官或組織內。優(yōu)選的可藥用載體為能以下述方式保持用于本發(fā)明制劑的試劑一旦試劑到達患者的靶位點，試劑便能作用于其靶物質(如為補體旁路的組分的蛋白)，優(yōu)選對患者產生治療效用。
本發(fā)明的合適的賦形劑包括運輸或輔助運輸、但不特異性使組合物靶向細胞或組織(在本文中也指非靶向載體)的賦形劑或制劑(formulary)?？伤幱玫馁x形劑的實例包括但不限于水、磷酸鹽緩沖的鹽水、Ringer溶液、葡萄糖溶液、含血清溶液、Hank溶液、其它在生理學上平衡的水性溶液、油類、酯類和乙二醇。水性載體可含被要求接近受試者的生理條件的合適的輔助物質，例如通過提高化學穩(wěn)定性和等張性。合適的輔助物質包括例如乙酸鈉、氯化納、乳酸鈉、氯化鉀、氯化鈣和其它用于生產磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和碳酸氫鹽緩沖液的物質。輔助物質還可包括防腐劑，如硫柳汞、間甲酚或鄰甲酚、福爾馬林和苯甲醇(benzol alcohol)?？赏ㄟ^常規(guī)方法和/或低壓凍干法對本發(fā)明的制劑進行滅菌。
一種可藥用的載體包括能將本發(fā)明的組合物緩慢釋放到動物的控釋制劑。本文所使用的控釋制劑包括在控釋載體中的本發(fā)明的試劑。合適的控釋載體包括但不限于生物相容的聚合物、其它聚合基質、膠囊、微膠囊、微粒、推注制劑、滲透泵、分散裝置、脂質體、脂質球(liposphere)和經皮送遞系統(tǒng)。其它合適的載體包括可結合延長待送遞試劑的半衰期的試劑或納入該試劑中。該載體可包括任何合適的蛋白載體，甚至包括在體內送遞時延長蛋白的半衰期的融合區(qū)段。前文描述了合適的送遞載體，它們包括但不限于脂質體、病毒載體或包括核酶在內的其它送遞載體。天然的含脂質的送遞載體包括細胞和細胞膜。人工的含脂質的送遞載體包括脂質體和微團。如上所述，可修飾本發(fā)明的送遞載體以靶向患者的特定位點，由此靶向和利用該位點的抑制劑。合適的修飾包括操控送遞載體的脂質部分的化學制劑和/或在載體中導入能特異性靶向送遞載體至優(yōu)選位點(例如一種優(yōu)選的細胞類型)的靶向試劑。其它合適的送遞載體包括金顆粒、聚-L-賴氨酸/DNA-分子綴合物以及人工染色體。
在一個實施方案中，用于本方法的試劑以適用于肺部送遞或鼻部送遞、特別是適用于氣霧劑送遞(在本文中還指氣霧制劑)的制劑給予。這種送遞途徑特別適用于預防或抑制患者的AHR和/或氣道炎癥的方法中，但也可用于需要將其送遞到肺或氣道中的其他病癥中。另外，這些制劑特別適用于送遞抗體。該制劑一般包括載體，優(yōu)選可藥用載體。本發(fā)明的特別適用于氣霧劑送遞的載體包括但不限于無水乙醇、可分散干粉、小型膠囊(如微膠囊或微粒)、脂質體、可注射賦形劑和噴霧劑。已描述了用于送遞蛋白和肽的無水乙醇，例如參見Choi et al.，2001，PNAS USA 98(20)11103-11107。詳細描述了適用于氣霧送遞試劑的可分散干粉，例如參見美國專利No.6,165,463，通過援引全文納入本文(還可參見來自Inhale Therapeutic Systems，Inc.，nowNektar和Quadrant Technology的產品)。用于噴霧劑的合適脂質體包括任何脂質體，特別包括本發(fā)明的方法中由氣霧劑送遞的足夠小的任何脂質體。微膠囊和微粒為本領域所熟知。例如，AlliancePharmaceutical Corporation具有稱為PulmoSphere的顆粒工程技術，這通過專有的噴霧-干燥方法制備，并被設計為中空多孔的。Ventolin的產品由懸浮于以CFC為基礎的推進劑的混合物中的微粉化沙丁胺醇(游離堿)顆粒組成。Proventil HFA含有微粉化硫酸舒喘靈(albuterolsulfate)和少量乙醇共溶劑以溶解穩(wěn)定的油酸表面活性劑。將藥物納入脂質體就氣霧劑送遞而言具有幾個優(yōu)點。因為脂質體相對不可溶，所以某些藥物在肺中的保留時間可被延長，提高了藥效。脂質體主要通過吞噬細胞攝入，這使得脂質體特別適用于某些藥物的送遞。噴霧制劑在實施例中描述。送遞氣霧制劑的裝置包括但不限于壓力計量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、計量溶液裝置(metered solutiondevice，MSI)和超聲吸入器，并包括霧化器和吸入器的裝置。多種試劑可用于通過該裝置送遞的制劑中，作為特別用于蛋白送遞的懸液助劑和增溶劑(如低聚乳酸(oligolactic acid)、酰基-酰胺酸(acyl-amideacid)和單功能化(mono-functionalized)的M-PEGS，參見Mckenzieand Oliver；2000；Formulating Therapeutic Proteins and Peptides inPressurized Metered Dosed Inhalers For Pulmonary Delivery；3MHealth Care Ltd.，Morley Street，Loughborough，Leicesteshire LE111EP，UK)。
能靶向的可藥用載體在本文中指“靶向送遞載體”。本發(fā)明的靶向送遞載體能送遞包括抑制劑在內的制劑到患者的靶位點。“靶位點”指需要送遞治療制劑的患者內的位點。例如，靶位點可為由本發(fā)明的抗體或通過使用脂質體、病毒載體或其它送遞載體(包括核酶)直接注射或送遞所靶向的任何細胞或組織?？尚揎棻景l(fā)明的送遞載體或抗體以靶向動物的特定位點，由此在該位點靶向和利用特定化合物、抗體、蛋白或核酸分子。合適的修飾包括操控送遞載體的脂質部分的化學制劑和/或在載體中導入能特異性靶向送遞載體至優(yōu)選位點(例如一種優(yōu)選的細胞或組織類型)的化合物。具體而言，靶向指通過載體內的化合物與細胞表面的分子相互作用使得送遞載體結合到特定細胞。合適的靶向化合物包括能選擇性(即特異性)結合在特定位點的另一種分子的配體。該配體的實例包括抗體、抗原、受體和受體配體。特別有用的實例包括與補體途徑相關的任何配體(如CR2、C3、C3d、C3dg、iC3b、C3b)或與待處理動物的細胞類型、組織類型或位點相關的任何配體。操控送遞載體的脂質部分的化學制劑可調節(jié)送遞載體的胞外或胞內靶向性。例如，可將一種化學物質加到脂質體的脂質制劑上，以改變該脂質體的脂質雙層的電荷，這樣脂質體與具有特定電荷特征的特定細胞相融合。
一種用于各種給藥途徑和試劑的送遞載體為脂質體。脂質體能在動物內在足夠長的時間內保持穩(wěn)定以將本發(fā)明中描述的核酸分子、甚至是蛋白或抗體送遞到動物的優(yōu)選位點。根據(jù)本發(fā)明的脂質體包括能將本發(fā)明中描述的核酸分子送遞到動物的特定或選定位點上的脂質化合物。本發(fā)明的脂質體包括能與靶細胞的質膜相融合以將核酸分子送遞到細胞內的脂質組合物。用于本發(fā)明的合適的脂質體包括任何脂質體。本發(fā)明的優(yōu)選的脂質體包括通常用于例如為本領域的技術人員所熟知的基因送遞方法中的脂質體。更優(yōu)選的脂質體包括具有聚陽離子脂質組合物的脂質體和/或具有與聚乙二醇綴合的膽固醇骨架的脂質體。使用在本領域標準化的方法可聯(lián)合脂質體與本發(fā)明的核酸分子或抑制劑。
另一種送遞載體包括病毒載體。病毒載體包括用于本發(fā)明的方法中的分離核酸分子，其中核酸分子包裝到病毒外殼中，這允許DNA進入到細胞中。可使用多種病毒載體，包括但不限于以α病毒、痘病毒、腺病毒、皰疹病毒、慢病毒、腺病毒伴隨病毒和逆轉錄病毒為基礎的病毒載體。
根據(jù)本發(fā)明，本領域的技術人員可決定可接受的方案，以給予試劑、組合物或制劑，包括給予途徑以及給予動物的試劑的有效量。本發(fā)明的試劑可在體內或體外給予。合適的體內給予途徑可包括但不限于口服、鼻部、吸入、局部、氣管內、經皮、直腸和腸胃外途徑。優(yōu)選的腸胃外途徑可包括但不限于皮下、真皮內、靜脈內、肌內和腹膜內途徑。優(yōu)選的局部途徑包括通過氣霧劑吸入(即噴灑)或局部表面給予到動物的皮膚。優(yōu)選地，試劑通過鼻部、吸入、氣管內、局部或全身途徑(如腹膜內、靜脈內途徑)給藥。體外指在患者的外部進行部分給藥步驟。優(yōu)選的給予抗體的途徑包括腸胃外途徑和氣霧劑/鼻部/吸入途徑。
可使用本領域標準化的方法進行靜脈內、腹膜內和肌內給藥。使用本領域標準化的方法進行氣霧劑(吸入)送遞(參見例如Stribling etal.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 18911277-11281，1992，通過援引全文納入本文中)。適用于氣霧劑送遞的載體已在上文中描述。用于遞送氣霧制劑的裝置包括但不限于壓力計量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和計量溶液裝置(MSI)，并包括霧化器和吸入器的裝置?？诓克瓦f可通過將本發(fā)明的治療組合物與能對抗動物的消化道內的消化酶降解的載體聯(lián)合進行。該載體的實例包括塑料膠囊或片劑，如那些本領域所熟知的塑料膠囊或片劑。直接注射技術特別適用于將重組核酸分子給予通過手術可接近的細胞或組織，特別是給予到身體的表面上或表面附近的細胞或組織。將組合物局部給予到靶細胞區(qū)域指將組合物注射到距靶細胞或組織的幾厘米處，優(yōu)選距其幾毫米處。
已表明本文所公開的各種給藥方法以及送遞載體可將核酸分子有效送遞到靶細胞或組織，由此核酸分子轉染細胞并得以表達。在許多研究中，異源基因的成功送遞和表達在優(yōu)選的細胞類型中和/或使用本發(fā)明的優(yōu)選的送遞載體和給藥途徑實現(xiàn)。例如，使用脂質體送遞，1998年1月6日授權給Dow等人的美國專利No.5,705,151示出了在陽離子脂質體送遞載體中成功地體內靜脈送遞編碼超級抗原的核酸分子以及編碼細胞因子的核酸分子，借此編碼蛋白在動物的組織中、尤其是肺組織中表達。Liu等人(1997)示出靜脈送遞含有基因的含膽固醇的陽離子脂質體可優(yōu)選靶向肺組織并有效調節(jié)體內基因的轉移和表達。通過給予編碼核酸序列的病毒載體可完成多種核酸序列的送遞。
優(yōu)選的用于本文所描述的任何方法中的試劑(包括蛋白、小分子和抗體)的單次劑量含介于約0.01微克×千克-1到約10毫克×千克-1動物體重。更為優(yōu)選的試劑的單次劑量包含介于約1微克×千克-1到約10毫克×千克-1動物體重。更為優(yōu)選的試劑的單次劑量包含介于約5微克×千克-1到約7毫克×千克-1動物體重。更為優(yōu)選的試劑的單次劑量包含介于約10微克×千克-1到約5毫克×千克-1動物體重。若試劑通過氣霧劑送遞，特別優(yōu)選的試劑的單次劑量包含介于約0.1毫克×千克-1到約5毫克×千克-1動物體重。若試劑通過腸胃外送遞，另一特別優(yōu)選的試劑的單次劑量包含介于約0.1微克×千克-1到約10微克×千克-1的動物體重。
在一個實施方案中，本發(fā)明的合適的核酸脂質體復合物的單次劑量為約0.1μg到約100μg/kg給予復合物的患者體重。在另一實施方案中，合適的單次劑量為約1μg到約10μg/kg體重。在另一實施方案中，合適的核酸脂質復合物的單次劑量為至少約0.1μg核酸，更為優(yōu)選至少約1μg核酸，更優(yōu)選至少約10μg核酸，更優(yōu)選至少約50μg核酸，更優(yōu)選至少約100μg核酸。
在一個實施方案中，用于本文所描述的任何方法中的本發(fā)明的試劑的合適劑量為與未給予該試劑相比較有效抑制本文所描述的補體旁路的至少一種蛋白(如B因子、D因子或備解素)的表達或活性的劑量。上文已經描述了檢測蛋白的表達或生物學活性的方法。在另一實施方案中，本發(fā)明的試劑的合適劑量為可顯著抑制本發(fā)明的補體旁路的劑量。使用本領域所熟知的技術/分析可檢測補體激活及其抑制。例如，可在實施例中所描述的酵母聚糖A顆粒上進行C3沉積體外分析。還可測驗該試劑抑制人血清裂解未敏化紅細胞的能力。以這些分析為基礎，由體外結果外推得到體內劑量在本領域的技術人員能力范圍內。
本領域熟知在人中使用常規(guī)方法進行氣霧劑送遞，即使是使用吸入器，一般只有約10％的送遞溶液進入到氣道深處。若氣霧化送遞是通過直接吸入，便可假定劑量為通過噴霧方法所給予劑量的約10％。最后，使用類比法(allometric scaling)，本領域的技術人員易于將小鼠用劑量轉化為人用劑量。實質上，小鼠到人的劑量轉化是以化合物的清除率和小鼠的身體表面為基礎的。mg/kg的轉化取“未觀察到不良作用水平”(NOEL)值的1/12以獲得人用劑量的濃度。該計算假設小鼠和人之間的清除是相同的，對抗體而言人們認為事實確實如此。
因此，優(yōu)選的抗體的單次劑量包含介于約1ng×千克-1到約少于1mg×千克-1動物體重。更優(yōu)選的抗體的單次劑量包含介于約20ng×千克-1到約600μg×千克-1動物體重。更為優(yōu)選的抗體的單次劑量，特別是當抗體制劑在通過噴霧法送遞時，包含介于約20ng×千克-1到約600μg×千克-1動物體重，更優(yōu)選地，介于約20ng×千克-1到約500μg×千克-1，更優(yōu)選地，介于約20ng×千克-1到約400μg×千克-1，更優(yōu)選地，介于約20 ng×千克-1到約300μg×千克-1，更優(yōu)選地，介于約20ng×千克-1到約200μg×千克-1，更優(yōu)選地，介于約20ng×千克-1到約100μg×千克-1，更優(yōu)選地，介于約20ng×千克-1到約50μg×千克-1動物體重。
另一優(yōu)選的抗體的單次劑量，特別是在抗體制劑通過噴霧法送遞時，包含介于約200ng×千克-1到約600μg×千克-1動物體重，更為優(yōu)選地，介于約200ng×千克-1到約500μg×千克-1，更為優(yōu)選地，介于約200ng×千克-1到約400μg×千克-1，更為優(yōu)選地，介于約200ng×千克-1到約300μg×千克-1，更為優(yōu)選地，介于約200ng×千克-1到約200μg×千克-1，更為優(yōu)選地，介于約200ng×千克-1到約100μg×千克-1，更為優(yōu)選地，介于約200ng×千克-1到約50μg×千克-1動物體重。
另一優(yōu)選的抗體的單次劑量，特別是在抗體制劑從吸入器通過直接吸入法送遞時，包含介于約2ng×千克-1到約100μg×千克-1動物體重，更為優(yōu)選地，介于約2ng×千克-1到約50μg×千克-1，更為優(yōu)選地，介于約2ng×千克-1到約10μg×千克-1，更為優(yōu)選地，介于約2ng×千克-1到約5μg×千克-1，更為優(yōu)選地，介于約2ng×千克-1到約1μg×千克-1，更為優(yōu)選地，介于約2ng×千克-1到約0.5μg×千克-1，更為優(yōu)選地，介于約2ng×千克-1到約0.25μg×千克-1，更為優(yōu)選地，介于約2ng×千克-1到約0.1μg×千克-1動物體重。
在另一實施方案中，抗體以少于約500μg抗體/毫升制劑的劑量給予，優(yōu)選少于約250μg抗體/毫升制劑，更優(yōu)選地，少于約100μg抗體/毫升制劑，更優(yōu)選地，少于約50μg抗體/毫升制劑，更優(yōu)選地，少于約40μg抗體/毫升制劑，更優(yōu)選地，少于約30μg抗體/毫升制劑，更優(yōu)選地，少于約20μg抗體/毫升制劑，更優(yōu)選地，少于約10μg抗體/毫升制劑，更優(yōu)選地，介于約5μg抗體到約10μg抗體/毫升制劑。
具體關于降低或預防氣道高反應性和/或氣道炎癥或與此相關的病癥或疾病的方法，合適的給予動物的抑制劑的單次劑量指在一段恰當時間內單次或多次給予時，能降低或預防動物的氣道高反應性和/或氣道炎癥，或降低有待治療的疾病(如哮喘)的至少一種其它癥狀的劑量。當患者患有AHR或有患該病風險時，合適的試劑的單次劑量包括將AHR的激發(fā)劑劑量增加為兩倍或改善動物的靜態(tài)呼吸功能的劑量。
根據(jù)本發(fā)明的方法，給予動物抑制AHR的試劑的有效量包含能降低氣道高反應性(AHR)或氣道炎癥同時對動物沒有毒的量。對動物有毒的量包含任何可引起動物的結構或功能損害(即有毒)的量。
在一個實施方案中，AHR抑制劑使患有AHR或有患該病風險的動物免于感染AHR的有效性可通過雙倍量測量。例如，若動物的PC20乙酰甲基膽堿FEV1在給予試劑前為1mg/ml，而在給予試劑后為2mg/mlMch，那么通過給予指定試劑使動物免于感染AHR的能力(即降低或預防)是顯著的。同樣，若動物的PC20乙酰甲基膽堿FEV1在給予試劑前為2mg/ml，而在給予試劑后為4mg/ml Mch，則試劑被認為是有效的。優(yōu)選的試劑的有效量包括能將經該試劑處理的動物的PC20乙酰甲基膽堿FEV1向正常動物的PC20乙酰甲基膽堿FEV1方向增加至約兩倍濃度的量。如上所述，正常動物指已知未患異常AHR或對其不敏感的動物。待測動物指被懷疑患有異常AHR或對其敏感的動物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在患有AHR的動物中，給予動物的試劑的有效量為與給予試劑前相比顯著降低動物的AHR的量。在另一實施方案中，給予動物的試劑的有效量為與具有AHR相關炎癥而并未給予該試劑的動物群體的氣道AHR的水平相比顯著降低動物的AHR的量。試劑優(yōu)選能降低動物的AHR，甚至是在AHR的身體癥狀發(fā)作后(即急性AHR發(fā)作后)給予試劑時。更優(yōu)選地，試劑的有效量為將AHR的癥狀降低到在患者中AHR不再能檢測到的量。在另一實施方案中，試劑的有效量是在患者暴露于諸如過敏原的AHR激發(fā)刺激物前給予試劑時，可預防或顯著抑制AHR發(fā)作的量，其中該暴露過程在無該試劑的情況下足以誘導AHR。
在另一實施方案中，本發(fā)明的方法的試劑的有效量包括引起動物的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值提高的量，其中在給予該試劑前，動物用第一濃度的乙酰甲基膽堿激發(fā)時所獲得的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值與給予該試劑后，動物用雙倍量的第一濃度的乙酰甲基膽堿激發(fā)時所獲得的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值相同。試劑的優(yōu)選的量包括引起動物的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值提高的量，其中在給予該試劑之前所獲得的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值介于約0.01mg/ml到約8mg/ml乙酰甲基膽堿之間，這與在給予該試劑之后所獲得的PC20乙酰甲基膽堿FEV1值相同，此時該值介于約0.02mg/ml到約16mg/ml乙酰甲基膽堿之間。
如上所述，試劑保護患有AHR或對其敏感的動物的有效性可通過測量給予試劑前后FEV1的提高百分比和/或FEV1/FVC檢測。在一個實施方案中，試劑的有效量包括能降低動物的氣流受限以使動物的FEV1/FVC值至少為約80％的量。在另一實施方案中，試劑的有效量包括能降低動物的氣流受限以使動物的FEV1/FVC值至少提高約5％，或至少約100cc或PGFRG 10L/min的量。在另一實施方案中，試劑的有效量包括使動物的FEV1提高至少約5％、更優(yōu)選提高約6％到約100％、更優(yōu)選提高約7％到約100％、更優(yōu)選提高約8％到約100％(或約200ml)動物的預計FEV1的量。在另一實施方案中，試劑的有效量包括將動物的FEV1至少提高約5％、優(yōu)選至少提高約10％、更優(yōu)選至少提高約25％、更優(yōu)選至少提高約50％、更優(yōu)選至少提高約75％的量。
本領域的技術人員能決定給予動物的試劑的劑量數(shù)取決于氣道高反應性的程度、以該AHR為癥狀的基礎病癥以及有待治療的患者個體的反應性。另外，臨床醫(yī)師能決定有效降低動物的AHR的送遞試劑的恰當時間。優(yōu)選地，在患者暴露于能有效誘導AHR的AHR激發(fā)刺激物的量前48小時內送遞試劑，更優(yōu)選在患者暴露于能有效誘導AHR的AHR激發(fā)刺激物的量前36小時內，更優(yōu)選24小時內，更優(yōu)選12小時內，更優(yōu)選6小時、5小時、4小時、3小時、2小時或1小時內。在一個實施方案中，在患者或臨床醫(yī)師意識到患者已暴露于或將暴露于AHR激發(fā)刺激物、特別是已暴露于或將暴露于敏化患者的AHR激發(fā)刺激物(即過敏原)時(即立即)給予該試劑。在另一實施方案中，在初次發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)AHR(即急性AHR發(fā)作)時就給予試劑，優(yōu)選至少在AHR癥狀出現(xiàn)2小時內、優(yōu)選在出現(xiàn)AHR癥狀至少1小時內，更優(yōu)選至少30分鐘內，更優(yōu)選至少10分鐘內，更優(yōu)選至少5分鐘內。上文已詳細描述了AHR的癥狀以及測量或檢測該癥狀的方法。優(yōu)選地，進行該給予，直到AHR降低的征兆出現(xiàn)，然后根據(jù)需要進行，直到AHR的癥狀消失。
具體關于抑制或預防缺血-再灌注損傷的方法，試劑的有效量，特別是給予動物的B因子抗體或其抗原結合片段(或抗原結合多肽)的有效量為與不給予該試劑相比，顯著抑制動物的組織學損害(包括氧化損害或細胞死亡)的量。就腎臟缺血-再灌注損傷而言，給予動物的試劑的有效量為與未給予該試劑相比顯著抑制血清尿素氮的升高或顯著降低動物腎臟組織的組織學損傷的量。合適的給予動物的抑制劑的單次劑量為在一段合適的時間內給予一次或多次時能降低或預防動物的缺血-再灌注損傷的至少一種癥狀、損傷類型或所引起的損害的劑量。上文已經詳細描述了抗體的合適劑量，包括用于各種給藥途徑的合適劑量。一方面，給予動物的抑制缺血-再灌注損傷的試劑的有效量包括能抑制由缺血-再灌注損傷所引起的至少一種癥狀或損害，同時對動物無毒的量。
本發(fā)明的任何方法可用于任何動物，特別是哺乳類(即哺乳動物)脊椎動物綱的任何動物，包括但不限于靈長類、嚙齒類、家畜和馴養(yǎng)寵物。優(yōu)選的使用本發(fā)明的方法治療的哺乳動物為人類。
以下實施例出于示例性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1下列實施例描述了補體旁路的新型抑制劑的生產。
本發(fā)明人已制造了生產結合小鼠B因子的小鼠單克隆抗體的幾種雜交瘤細胞。在本研究中，發(fā)明人著手鑒定這些抗體中的其中一種抑制補體旁路的能力。發(fā)明人還在抗磷脂介導的胎兒丟失模型中檢驗了該抗體。如前人所述(Girardi)，B因子缺失的小鼠在該模型中免于胎兒丟失，并且發(fā)明人假設旁路途徑的外源抑制劑在這種疾病模型中是有效的治療試劑。
方法B因子-Ig融合蛋白的構建和小鼠B因子的純化。構建了編碼連接小鼠IgG1同種型的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的B因子基因的兩個短同源重復序列(SCR)的質粒(圖1)。選擇這些SCR結構域是因為它們是這些研究中所使用的fB-/-小鼠的B因子基因的缺失區(qū)段的一部分。
小鼠B因子的純化。通過親和純化從正常小鼠血清中純化補體B因子。根據(jù)制造商的說明書，通過將山羊抗人備解素B因子(Diasorin，Stillwater，MN)結合到CNBr-Activated Separose(Amersham，Arlington Heights，IL)制備親和柱。通過心臟穿刺對C57/B6J小鼠進行采血，并將血液收集到含有50μl 500mM EDTA的注射器中，以防止旁路途徑激活。將血液在2000rpm離心15min，收集血漿。然后用緩沖液(含EACA 50 mM、EDTA 10 mM、芐脒2 mM的PBS，pH7.4)1∶1稀釋血漿，然后用0.22μm過濾器(GE Water Technologies)過濾。將血漿加入親和柱，然后用10倍柱體積的緩沖液沖洗該柱。用5 M LiCl2洗脫B因子并用PBS過夜透析。然后在10％Tris-Glycine凝膠上電泳并用考馬氏亮藍染色檢測B因子的純度(未給出數(shù)據(jù))。
靶向補體B因子的抑制型單克隆抗體的開發(fā)。如前入所述(Matsumoto)完成小鼠B因子的靶向缺失。用胚胎干細胞Sv129細胞株制備B因子缺失的小鼠，然后在F1群體增殖前與C57BL/6小鼠雜交。用弗氏不完全佐劑乳化的重組B因子-Ig融合蛋白125μg免疫B因子缺失的小鼠，然后進行四次加強免疫，每次間隔三周。通過使用小鼠B因子包被培養(yǎng)板的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和補體旁路抑制的體外分析(參見下文)檢驗小鼠血清，以此篩選出現(xiàn)抗B因子的抑制型抗體的小鼠。在最后注射后一天，將被鑒定具有針對B因子的強免疫應答的小鼠的脾細胞與來自美國科羅拉多州大學單克隆抗體中心(University of Colorado Monoclonal Antibody Center)的骨髓瘤細胞系融合。通過有限稀釋法克隆候選雜交瘤細胞，鑒定能抑制旁路途徑活性的克隆。一種雜交瘤細胞A1379被用于這些實驗。用Protein-G Sepharose柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)從組織培養(yǎng)上清液中純化A1379。使用多粘菌素(Sigma)將LPS從純化的mAb中除去。根據(jù)制造商的說明書使用鱟試劑測定(Limulus AmebocyteLysate Assay，BioWhittaker，Inc.，Walkersville，MD)檢驗mAb的LPS水平是否低于1 EU/mg mAb。然后在10％Tris-Glycine凝膠上電泳并用考馬氏亮藍染色檢查mAb的純度。
抗B因子抗體水平的ELISA分析針對純化B因子用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢驗小鼠血清，以此篩選對免疫接種產生免疫應答的小鼠。用溶于包被緩沖液(15mMNa2CO3，35mM Na2HCO3)的純化B因子125 ng包被96孔ELISA板(Costar，Corning，NY)并在4℃過夜保存。然后用200μl PBS沖洗該板。通過用溶于PBS的5％BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)200μl孵育這些板，阻斷非特異性結合。將板用含0.1％Tween 20的PBS 200μl洗滌兩次，然后與稀釋血清孵育1小時。用含0.1％Tween20和0.1％BSA的PBS 1∶100稀釋樣本，然后將該樣本以1∶1進行系列稀釋七次。然后將板洗滌兩次并用50μl綴合山羊抗小鼠IgG的過氧化物酶(Cappel，Durham，NC)孵育。然后將板洗滌四次并與100μl ABTS(含有1∶1000的30％H2O2)(Sigma)一起孵育，并用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(Biorad，Richmond，CA)在405 nm讀取吸光值。
補體旁路抑制的分析。然后將具有可檢測滴度的抗B因子抗體的血清就其抑制旁路途徑的能力進行篩選。這通過使用在酵母聚糖A顆粒(Sigma)上進行C3沉積體外分析進行(Quigg)。將溶于10ml 0.15M NaCl中的50mg酵母聚糖顆粒煮沸60分鐘，然后用PBS洗滌兩次。通過將反應混合物中的1×107酵母聚糖顆粒與終濃度分別為10mM和5mM的EGTA和MgCl2混合分析血清。10微升未操控C57/B6小鼠的血清被作為補體源加入。用最高達70μl免疫小鼠的血清(以篩檢抑制型抗體的形成)或用每次反應用0.0625μg到8μg滴定的純化抗體進行抑制分析。用PBS將樣本稀釋為100μl終體積，并在37℃孵育30min。酵母聚糖顆粒用冷PBS、1％胎牛血清洗滌兩次，然后與FITC綴合的山羊抗小鼠C3(Capple，Durham，NC)冰上孵育1小時。將樣本再洗滌兩次，用0.5ml PBS、1％胎牛血清重懸，然后通過流式細胞術進行分析。使用下列公式計算抑制百分比 還使用酵母聚糖分析就1379克隆的Fab片段抑制旁路途徑的能力對其進行了檢驗。根據(jù)制造商的說明書，通過將純化抗體與木瓜蛋白酶-瓊脂糖(ICN Biomedicals，Aurora，OH)一起孵育形成Fab片段。然后通過將消化的抗體應用到G蛋白柱上除去Fc片段以及未消化的IgG。在流出液中收集Fab片段，然后用0.1M甘氨酸-鹽酸(pH2.8)依次洗脫Fc片段和未消化的IgG。在酵母聚糖反應中使用了1μg Fab。已發(fā)現(xiàn)在本分析中所使用的多克隆抗小鼠C3抗體與多種物種發(fā)生交叉反應。因此，本分析可用于檢驗1379克隆對這些物種的旁路途徑的抑制作用。如上所述對該抑制型抗體進行滴定。
作為另一個對1379克隆抑制補體旁路的能力的分析，發(fā)明人檢驗了該抗體抑制人血清裂解未敏化兔紅細胞的能力。將兔全血與緩沖液1∶1混合，該緩沖液由1升蒸餾水中含20.5g葡萄糖、8.0g(二水合)檸檬酸鈉、4.0g NaCl、0.55g檸檬酸構成。然后將5ml紅細胞溶液與含1.1％NaCl、0.0025％5，5二乙基巴比妥鈉(Na-5，5 diethylbarbiturate)、pH7.35、8mM EGTA、2mM MgCl2的溶液1∶9混合。將該混合物37℃孵育幾分鐘，然后在4℃1000×g離心10分鐘。將該紅細胞再洗滌三次，然后重懸于40ml相同溶液。將50μl上述懸浮液加入人血清(5到100μl)緩沖溶液中，使得終體積為150μl。無血清緩沖液中的紅細胞作為陰性對照，加入100μl蒸餾水中的紅細胞作為陽性對照(完全裂解)。將樣本在37℃孵育30分鐘，并偶爾振蕩以保持細胞懸浮。加入1.5ml冷PBS終止反應，然后將樣本在1000×g離心5分鐘。使用分光光度計(Biorad)在415nm讀取每個上清液的光密度值。發(fā)現(xiàn)10μl血清使得紅細胞完全裂解。然后使用10μl該血清和濃度增加的1379克隆(1μg到12μg/反應)進行相同反應。旁路途徑活性的抑制百分率使用下列公式測定 1379克隆的體內藥代動力學。先將小鼠采血，然后腹腔內注射(IP)或靜脈內注射(IV)1mg或2mg劑量的抗體1379克隆。選擇這些劑量是因為據(jù)估計它們與B因子等摩爾。血清中的B因子大約為～200μg/ml(或～2.2μM，若B因子為90kD的蛋白)。因為1379抗體為150kD且成年小鼠的血管內體積約為3ml，注射1 mg(6.7μMol)將產生～2.2μM的循環(huán)濃度。因為抗體是雙價的，該等摩爾注射有望更為有效地引起旁路途徑的完全抑制。在注射抑制劑后1、2、6、24、48和96小時將小鼠采血。然后將來自這些時間點的血清用于酵母聚糖分析以評估旁路途徑的活性。
結果針對B因子的Ba部分的抑制型單克隆抗體的形成。如在方法部分所描述那樣形成針對小鼠B因子的單克隆抗體。來自免疫小鼠的血清用于分析是否存在抗B因子抗體(未給出數(shù)據(jù))。選擇一種稱為1379的克隆用于進一步表征，這是由于發(fā)現(xiàn)該雜交瘤細胞可快速生長，該抗體為IgG1的亞類(非補體激活)并且發(fā)現(xiàn)其上清是補體旁路的有效抑制劑。將抗體純化后(未給出數(shù)據(jù))，在兩個旁路途徑激活的體外分析中檢驗了該抗體(圖2A和2B)。在將3μg抑制劑加入含10μl血清的反應體系中時，使用酵母聚糖分析發(fā)現(xiàn)該抑制劑完全抑制了旁路途徑。在該濃度下抗B因子抗體和B因子幾乎等摩爾濃度(假設B因子為200μg/ml，分子量為90,000 kD，在10μl血清中為0.022nMol，3μg分子量為150,000 kD的抗體等于約0.02 nMol)。在兔紅細胞裂解分析中，反應中用6μg抗體/10μl人血清可獲得完全抑制。然后使用1379克隆的Fab片段檢驗旁路途徑的抑制。當使用過量摩爾的1379克隆的Fab時，通過該分析觀察到旁路途徑活性的完全抑制。
然后在酵母聚糖分析中檢驗了1379抑制來自于多個不同哺乳動物物種的血清的旁路途徑活性的能力。在所檢測的大部分物種中，1379抗體能完全抑制旁路途徑活性(表1)?？贵w能完全抑制小鼠、大鼠、人以及幾種猴類的血清的旁路途徑活性。但是，未發(fā)現(xiàn)任何針對狗或豚鼠的抑制活性。
表1

1379抗體的藥代動力學。在單次注射抑制型抗體后在不同時間就旁路途徑的抑制檢驗小鼠。在IV注射1小時以及IP注射2小時內1mg抗體引起完全抑制(圖3)。接受1mg IP注射的小鼠在24小時時依然保留對旁路途徑的完全抑制，接受2mg注射的小鼠在注射后長達48小時時依然保留完全抑制。發(fā)明人還每隔一天通過腹膜內注射反復注射2mg 1379抗體，持續(xù)14天，結果表明在最后一次注射后補體旁路的完全抑制至少維持了48小時(未給出數(shù)據(jù))。這些數(shù)據(jù)清楚表明該小鼠mAb并不被識別為“外來的”并且支持其在體內長期使用。最后，使用抗體F(ab)片段的實驗表明旁路途徑的抑制與完整1379抗體一樣獲得幾乎等摩爾水平(未給出數(shù)據(jù))。
1379結合BaSCR3區(qū)的表位。1379抗體結合一系列B因子突變體的能力已有描述(Hourcade，1995，J.Biol.Chem.)，以表征mAb結合位點。實驗表明將某些丙氨酸置換引入人B因子的SCR2和SCR3，而不是SCR1，使得1379抗體不能結合B因子。在所檢測的這25種不同突變體中，1379基本上不結合B17和B23突變體，并保留少于20％其與B18突變體的結合能力。這些都是SCR3突變。更具體而言，突變體B17用His-Cys-Pro置換139-Tyr-140-Cys-141-Ser，該位置與表示為SEQ ID NO2的成熟人B因子相關；突變體B23用Gly-Asn-Gly-Val置換182-Glu-183-Gly-184-Gly-185-Ser，該位置也與表示為SEQ ID NO2的成熟人B因子相關。因此，1379抗體結合到B因子的第三SCR結構域。
結論本發(fā)明人制備了針對小鼠B因子的新型單克隆抗體，被稱為1379克隆。該抗體是補體旁路的特異性抑制劑，它在體外和體內完全抑制該途徑。單次腹膜內注射1 mg引起旁路途徑的完全抑制長達48小時，多次注射延長了對該途徑的抑制。
使用體外分析表明1379完全抑制了多種物種的血清的旁路途徑活性，這些物種包括小鼠、大鼠、猴和人。使用對抗體與一系列B因子突變體的結合親和力分析，測得抗原位點在B因子的SCR3結構域(fB-/-小鼠缺失區(qū)域的一部分)。B因子蛋白的該區(qū)域與D因子剪切位點毗鄰。1379的Fab片段抑制旁路途徑活性的能力表明其不僅僅是由1379引起可防止被剪切的空間位阻，而且該特異性結合位點還是D因子介導的蛋白剪切的關鍵位置。1379針對如此眾多不同物種的血清的有效性說明該位點在高等哺乳動物中高度保守。
已經開發(fā)了幾種其它可溶性補體抑制劑并對其進行了鑒定(Quigg；Weisman；Heller；Granger；Pratt)，但是相信本文所描述的抑制劑是在大范圍動物物種中選擇性抑制旁路途徑的第一個抑制劑。通過選擇性抑制旁路途徑，1379與在C3轉化酶水平起作用的抑制劑相比較具有幾個優(yōu)點。通過不破壞經典途徑，該抑制劑可能具有較少的免疫抑制效應。另外，經典途徑的阻斷實際上可誘導自身免疫。旁路途徑的選擇性阻斷改善了狼瘡腎炎小鼠模型的癥狀(Watanabe)，而C3缺失卻不能改善其癥狀。旁路途徑具體涉及多種疾病模型(Thurman；Watanabe；Girardi)，表明了特異性旁路途徑抑制劑的治療潛能。
參考文獻1.Thurman et al.，2003，JImmunol1701517-15232.Watanabe et al.，2000，JImmunol 164786-7943.Girardi et al.，2003，JClin Invest 1121644-16544.Holers，V.M.2003，Clin Immunol 107140-1515.Densen et al.，l996，Mol Immunol 3368(Abstract 270)6.Matsumoto et al.，1997，Proc Natl Acad Sci USA948720-87257.Figueroa and Densen，1991，Clin Microbiol Rev 4359-3958.Quigg et al.，1998，J Immunol1604553-45609.Weisman et al.，1990，Science 249146-15110.Heller et al.，1999，J Immunol163985-99411.Granger et al.，2003，Circulation 1081184-119012.Pratt et al.，2003，Am JPathol 1631457-1465實施例2下述實施例表明通過旁路途徑的補體激活在氣道高反應性和炎癥的進展中很關鍵，還進一步表明對旁路途徑的補體激活的抑制抑制了氣道高反應性。
考慮到在暴露于過敏原前抑制補體激活的有效性，本發(fā)明人還檢測了補體激活途徑。在本研究中本發(fā)明人報道通過旁路途徑的補體級聯(lián)反應的激活在氣道高反應性和氣道炎癥的進展中很關鍵。
方法動物從Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)獲得8到12周齡的雌性C57BL/6小鼠。如前所述，首先將B因子雜合缺失的小鼠(fB+/-)與C57BL/6品系雜交，然后再在F1代互交，然后互交形成fB-/-品系。然后將這些小鼠與C57BL/6小鼠回交7代。使用同類系的fB+/+同窩小鼠作為對照小鼠。C4缺失小鼠((C4水)，與C57BL/6小鼠回交17代)保留在動物實驗室。在本研究中所使用的全部實驗動物的飲食不含卵清蛋白(OVA)，并遵循國家猶太醫(yī)療和研究中心的實驗動物管理與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee ofthe national jewish medical and research center)批準的協(xié)議。
實驗方案在第1天和14天通過腹膜內注射(i.p.)20μg懸浮于2.25mg氫氧化鋁(Alum Imuject；Pierce，Rockford，IL)的OVA(V級，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)或豚草(Ambrosia artemisiifolia，GreerLaboratories，Lenoir，NC)敏化小鼠，然后在第27、28和29天使用噴霧OVA或豚草(1％，溶于PBS)、超聲噴霧器(De Vibiss HealthCare，Somerset，PA)通過氣道攻擊，每天20分鐘。
為重構fB，在每次氣道攻擊未敏化和敏化fB-/-小鼠前1個小時通過用于鼻部給予10μg、1μg或0.1μg純化fB(50μL，溶于PBS)。作為對照，給予PBS。
在不同的實驗中，在每次OVA攻擊前2小時，將針對fB的抗體(抗fB)通過i.p.注射(2mg/次處理/小鼠)或通過噴霧法給予敏化小鼠。就噴霧法而言，將4只小鼠放入有機玻璃盒中，并使用超聲噴霧器(DeVilbiss Health Care)將0.5mg抗fB(溶于5ml PBS)噴霧。作為對照，相同劑量和體積的大鼠IgG在相同時間點通過i.p.注射或噴霧。在第31天，評估AHR并在同一天將動物處死，收集BAL液、血液和肺組織。
B因子的純化為重構B-/-小鼠的旁路途徑活性，通過親和純化法從正常小鼠血清純化小鼠補體B因子。根據(jù)制造商的說明書，通過將山羊抗人備解素B因子(Diasorin，Stillwater，MN)結合到CNBr-Activated Separose(Amersham，Arlington Heights，IL)制備親和柱。通過心臟穿刺對C57/B6J小鼠進行采血，并將血液收集到含有50μl 500mM EDTA的注射器中，以防止旁路途徑激活。將血液在2000rpm離心15分鐘，然后收集血漿。然后將血漿用緩沖液(含EACA 50 mM、EDTA 10 mM、芐脒2 mM的PBS，pH7.4)1∶1稀釋，并用0.22μm過濾器(GE WaterTechnologies)過濾。將血漿加入親和柱，并用10倍柱體積的緩沖液沖洗。用5 M LiCl2洗脫B因子并用PBS透析過夜。在10％Tris-Glycine凝膠上電泳并用考馬氏亮藍染色檢測B因子的純度。通過鱟試劑測定(BioWhittaker，Inc.，Walkersville，MD)測定LPS的濃度，發(fā)現(xiàn)該濃度低于1 EU/mg純化B因子。
抗B因子抗體的形成抗小鼠B因子單克隆抗體可如實施例1所述生產。簡而言之，用重組融合蛋白免疫B因子缺失的小鼠，該重組融合蛋白是由B因子基因的第二和第三短同源重復序列(SCR)結構域以及免疫球蛋白形成。選擇SCR結構域是由于它們?yōu)閒B-/-小鼠B因子基因缺失區(qū)段的一部分。然后用該蛋白免疫fB-/-小鼠，并加強免疫四次，每次間隔三周。在最后一次注射后一天，將脾細胞與從美國克羅拉多大學單克隆抗體中心獲得的骨髓瘤細胞融合。然后鑒定和表征分泌抗B因子單克隆抗體(mAb)的克隆。一種雜交瘤細胞A1379被用于這些實驗。用Protein-G Sepharose柱(Pharacia，Uppsala，Sweden)從組織培養(yǎng)上清液中純化A1379。使用多粘菌素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)將LPS從純化的mAb中去除。根據(jù)制造商的說明書，使用鱟試劑測定(BioWhittaker，Inc.，Walkersville，MD)來確定mAb的LPS水平是否低于1 EU/mg mAb。然后在10％Tris-Glycine凝膠上電泳并用考馬氏亮藍染色檢測mAb的純度。
氣道功能的檢測氣道反應性通過給予濃度逐漸增加(6.25、12.5、25、50和100mg/ml)的氣霧化乙酰甲基膽堿(MCh)10秒(每分鐘呼吸60次，潮氣量為500μl)攻擊后氣道功能的變化來評估。麻醉小鼠(戊巴比妥鈉，i.p.，70到90mg/kg)、氣管切開小鼠(18G插管)通過機械通氣(每分鐘呼吸160次，潮氣量為150μl、呼氣末正壓為2-4cm H2O)并評估了肺功能(Takeda，1997)。通過將氣流、體積和壓力代入運動公式連續(xù)計算(Labview，NationalInstruments，TX)氣道阻力(RL)。取RL的最大值，并表示為PBS氣霧劑獲得的相對基線的變化百分率。在各自的缺失小鼠或對照小鼠之間基線RL值沒有顯著差異。
支氣管肺泡灌洗和細胞因子的測量評估完氣道功能后，通過氣管導管用Hank平衡鹽溶液(1×1ml，37℃)灌洗肺。使用細胞計數(shù)器(Coulter Counter；Coulter Co.，Hialeah，F(xiàn)L)獲得BAL細胞數(shù)。將細胞離心制劑進行差異細胞計數(shù)并計算每種細胞類型的百分比和絕對數(shù)。通過ELISA評估BAL液中的細胞因子水平(Tompkinson)。根據(jù)制造商的指示進行IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12(全部購自PharMingen，San Diego，CA)和IL-13(R&DSystems，Minneapolis，MN)ELISA。
根據(jù)制造商的指示(Cedarlane Laboratories，Hornby，Ontario，Canada)，在第一次或第二次過敏原攻擊后24小時和在第三次和最后一次攻擊后24小時和48小時，通過ELISA測量未敏化小鼠和敏化小鼠BAL液中的C3a desArg的水平。
組織學和免疫組織化學研究獲得BAL液后，用2ml 10％福爾馬林通過氣管使肺膨脹，然后用相同溶液通過浸漬法固定。組織切片用蘇木精和伊紅、高碘酸西夫劑(PAS)染色，并用兔抗小鼠MBP抗體(由J.J.Lee，Mayo Clinic，Scottsdale，AZ提供)對含嗜酸性主要堿性蛋白(MBP)的細胞進行免疫組織化學檢測。通過盲目方式檢查了切片并且通過使用NIHScionImage軟件(1.62版，由美國國立衛(wèi)生研究所開發(fā)，在互聯(lián)網(wǎng)上可得)分別對支氣管周組織的嗜酸性粒細胞和杯形細胞進行分析。
總IhE和OVA特異抗體的測量如前人所述(Tompkinson)，通過ELISA測量了總IgE和OVA特異IgE和IgG1的血清水平。樣本的OVA特異抗體滴度與內部收集的標準品相關，它們被人為指定為500 ELISA單位(EU)。通過與已知小鼠IgE標準品(553481，PharMingen)比較計算總IgE的水平。
統(tǒng)計分析方差分析(ANOVA)被用來檢測所有組次之間的差異水平。通過Tukey-Kramer可靠的顯著差異(HSD)進行對全部組次的比較。顯著性的概率值被設為0.05。全部測量值被表示為平均值±平均值的標準誤(SEM)。
結果通過旁路途徑的補體激活在過敏原攻擊敏化小鼠后AHR的進展中很重要為評估旁路途徑在AHR和氣道炎癥的進展過程中的作用，OVA敏化和未敏化fB-/-小鼠和配對對照小鼠(fB+/+)用1％OVA氣霧劑連續(xù)攻擊三天。被敏化和攻擊fB+/+小鼠與僅被攻擊的fB+/+小鼠相比其對MCh的反應性增加(圖4)。相反，被敏化和攻擊fB-/-小鼠與被敏化和攻擊fB+/+小鼠相比其在整個劑量-反應性曲線中表現(xiàn)出對MCh顯著降低的反應性(P＜0.01)，因此表明在被敏化和攻擊后顯然不能出現(xiàn)AHR。
通過旁路途徑的補體激活在過敏原攻擊敏化小鼠后氣道炎癥的進展中很重要氣道炎癥是過敏性氣道疾病的特征性特征。為評估氣道炎癥，在最后一次氣道攻擊后48小時獲得了BAL液和肺組織。被敏化和攻擊fB+/+小鼠與僅被攻擊的小鼠相比其BAL液中的總細胞計數(shù)增加，特別是嗜酸性粒細胞的數(shù)量增加，其中僅被攻擊的小鼠在其BAL液中沒有嗜酸性粒細胞(圖5)。被敏化和攻擊fB-/-小鼠與被敏化和攻擊fB+/+小鼠相比BAL液中的總細胞計數(shù)以及嗜酸性粒細胞數(shù)量顯著降低(p＜0.01)，但是仍然顯著高于僅被攻擊的對照組(p＜0.01)。同樣，fB-/-小鼠與豚草敏化和攻擊的對照組相比在用豚草敏化和攻擊后BAL液中的嗜酸性粒細胞數(shù)量也降低了(圖5)。
過敏原敏化和氣道攻擊與僅被攻擊相比可引起支氣管周炎癥的增加，特別是嗜酸性粒細胞滲入的增加(圖3)。但是被敏化和攻擊fB-/-小鼠與被敏化和攻擊對照小鼠相比支氣管周炎癥顯著降低(表2)。為定量肺中的嗜酸性粒細胞滲入量，組織切片用抗主要堿性蛋白染色(未給出數(shù)據(jù))。在僅被攻擊的小鼠中，在支氣管周組織中僅發(fā)現(xiàn)少量嗜酸性粒細胞。敏化和隨后的過敏原攻擊的fB+/+小鼠使得其支氣管周嗜酸性粒細胞數(shù)量顯著增加(表2)。相反，被敏化和攻擊fB-/-小鼠其支氣管周僅有少量嗜酸性粒細胞滲入(表2)。
過敏性氣道疾病的另一特點在于氣道上皮細胞杯形細胞增生。肺用高碘酸-西夫劑染色，以鑒定氣道上皮中的含有粘液的細胞。被敏化和攻擊小鼠的大量細胞通過染色發(fā)現(xiàn)為粘液陽性(表2)，相反，僅被攻擊的小鼠中未檢測到PAS陽性細胞(表2)。被敏化和攻擊fB-/-小鼠其氣道上皮中含有粘液的細胞顯著低于被敏化和攻擊野生型小鼠(p＜0.001)。
通過旁路途徑的補體激活影響B(tài)AL液中的細胞因子的產生T細胞產生的Th2細胞因子在誘導過敏性氣道炎癥和AHR中起著重要的作用。為評估過敏原攻擊后細胞因子應答，在最后一次OVA攻擊后48小時評估了BAL液中IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13和IFN-γ的濃度。與僅被攻擊的對照組相比，被敏化和攻擊的野生型小鼠其IL-4、IL-5和IL-13顯著提高(p＜0.05)，而IL-10、IL-12和IFN-γ顯著降低(p＜0.05)(未給出數(shù)據(jù))。fB-/-小鼠的BAL液中的TH2細胞因子水平(IL-4、IL-5和IL-13)有所降低(未給出數(shù)據(jù))。
fB缺失并不影響抗原特異抗體的血清水平最后一次氣道攻擊后48小時測量總IgE和OVA特異IgE和IgG1的血清水平。與僅被攻擊的對照組小鼠相比，被敏化和攻擊的fB+/+小鼠其總IgE和OVA特異IgE和IgG1的水平有所提高(表3)。同樣，fB-/-小鼠其總IgE和OVA特異IgE和IgG1的水平也有所提高，這與被敏化和攻擊的fB+/+小鼠在統(tǒng)計學上沒有差異，表明在這些小鼠中對被過敏原敏化和攻擊的體液應答保持完好。
表2.杯形細胞增生和支氣管周嗜酸性粒細胞炎癥的定量

如在方法部分所述，敏化和攻擊小鼠。在最后一次攻擊后48小時估算了杯形細胞(PAS陽性細胞)以及支氣管周嗜酸性粒細胞(抗主要堿性蛋白(MBP)陽性細胞)的數(shù)量。表示為平均值±SEM；fβ-/-B因子缺乏小鼠；fβ+/+同類系野生型對照小鼠；C4-/-補體因子4缺乏小鼠；C4+/+同類系野生型對照小鼠；對照Ab被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠用對照Ab通過i.p.進行處理；抗-fβ，i.p.被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠通過i.p用抗fβ抗體處理；抗fβneb被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠通過吸入用抗fβ抗體處理；BM(基膜)。*p＜0.05，與僅被攻擊的fβ+/+、被攻擊的fβ-/-、被敏化和攻擊的抗fβi.p.以及被敏化和攻擊的抗fβ neb相比較。#p＜0.05與僅被攻擊的fβ+/+相比較。
表3血清免疫球蛋白水平

如在方法部分所述，敏化和攻擊小鼠。在最后一次攻擊后48小時估算了免疫球蛋白的血清水平。表示為平均值±SEM；fβ-/-B因子缺乏小鼠；fβ+/+同類系野生型對照小鼠；對照Ab被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠用對照Ab通過i.p.進行處理；抗-fβ，i.p.被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠通過i.p.用抗fβ抗體處理；抗fβ neb被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠通過吸入用抗fβ抗體處理；EU/ml(Elisa單位/ml)。*p＜0.05，與僅被攻擊的fβ+/+和被攻擊的fβ-/-相比較。
該模型中經典途徑的激活對過敏性氣道疾病的進展并不重要為進一步確定對被敏化和攻擊的小鼠的肺中過敏反應的進展很關鍵的補體途徑，發(fā)明人使用缺失補體組分4(C4-/-，它在經典途徑和凝集素途徑的激活中是必須的)的小鼠與fB-/-小鼠相比較。
為評估補體途徑的激活，估算了BAL液中的C3a desArg水平。僅被攻擊的小鼠C3a desArg水平較低(未給出數(shù)據(jù))。相反，在第一次、第二次以及第三次攻擊后，被敏化小鼠BAL液中C3a desArg水平有所增加，并且在最后一次攻擊后48小時達最高值(未給出數(shù)據(jù))。有趣的是，被敏化和攻擊C4-/-小鼠與被敏化和攻擊野生型小鼠的C3a水平相當，這與被敏化和攻擊fB-/-小鼠相反fB-/-小鼠與其各自的被敏化和攻擊的野生型小鼠相比C3a desArg水平降低(未給出數(shù)據(jù))。這些數(shù)據(jù)表明在敏化小鼠暴露于過敏原后，出現(xiàn)了通過旁路途徑的補體激活。
C4-/-小鼠(出現(xiàn)與被敏化和攻擊C4+/+小鼠相當?shù)腁HR水平(圖9)。同樣，與被敏化和攻擊對照小鼠(n＝10；分別為175±53；35±12；115±32×103細胞)相比，C4-/-小鼠支氣管肺泡灌洗(BAL)液中的總細胞計數(shù)(平均值±SEM，n＝10；163±35×103細胞)或淋巴細胞數(shù)量(28±9×103細胞)和嗜酸性粒細胞(98±23×103細胞)數(shù)量沒有降低(未給出數(shù)據(jù))。與各自的被敏化和攻擊WT小鼠相比，進一步被敏化和攻擊C4-/-小鼠其支氣管周嗜酸性粒細胞數(shù)量和杯形細胞數(shù)量提高水平相當(表2)。這些發(fā)現(xiàn)表明該模型中的經典途徑的激活對過敏性氣道疾病的進展而言并不重要。
在fB缺失小鼠中不出現(xiàn)AHR和氣道炎癥并不是OVA特異的為評估在過敏原敏化和攻擊后不出現(xiàn)氣道高反應性是否是由于對OVA無特異應答，用豚草敏化和攻擊fB-/-小鼠以及野生型小鼠。豚草敏化和攻擊的fB-/-小鼠對MCh的反應性降低，而fB+/+對MCh反應強烈(圖6A和6B)。同樣，與fB+/+相比，豚草敏化和攻擊的fB-/-小鼠BAL液中氣道炎癥降低(圖6C)。
給予B因子重構fB-/-小鼠出現(xiàn)AHR和氣道炎癥的能力為在肺中重構B因子，在每次氣道攻擊前，fB-/-接受單次鼻部使用10μg、1μg或0.1μg純化B因子(圖7)或PBS。在每次攻擊前用0.1μgB因子處理的被敏化和攻擊fB-/-小鼠其對MCh反應性下降，這與用PBS處理的被敏化和攻擊fB-/-小鼠相似，但是與被敏化和攻擊fB+/+小鼠相比顯著降低(圖7A)。與用PBS或0.1μg純化B因子處理的被敏化和攻擊fB-/-小鼠相比，用1μg純化B因子處理的被敏化和攻擊小鼠其氣道反應性有所增強，但是在統(tǒng)計學上沒有差異(圖7A)。相反，與被敏化和攻擊fB+/+小鼠相同，在每次氣道攻擊前用10μg純化B因子處理被敏化和攻擊fB-/-小鼠其對MCh的反應性增強。
與在被敏化和攻擊fB+/+小鼠中所觀察到的細胞數(shù)相同，在每次氣道攻擊前用10μg純化B因子處理被敏化和攻擊fB-/-小鼠，也提高了氣道炎癥，特別是提高了BAL液中的嗜酸性粒細胞數(shù)，但是用0.1μg或1μg純化B因子處理不能提高BAL液中的嗜酸性粒細胞的數(shù)量(圖7B)。若在每次氣道攻擊前將B因子給予未敏化受體，未觀察到AHR或氣道炎癥反應，這表明需要敏化階段以對攻擊做出反應，同時還表明在fB-/-小鼠中敏化階段是完整的。fB-/-小鼠的這些數(shù)據(jù)直接表明旁路途徑的B因子對于過敏性氣道疾病的進展而言是關鍵的。
用fB中和抗體處理抑制被敏化和攻擊小鼠的AHR的出現(xiàn)為評估在被敏化和攻擊的無基因缺失的小鼠中通過旁路途徑的補體激活的作用，按照方法部分所述將C57BL/6敏化。將實施例1中所描述的1379抗B因子抗體通過噴霧法全身或局部給予，這已被表明它是給予其它補體抑制劑的有效途徑。正常小鼠，在被敏化后攻擊階段用抗B因子通過全身或局部(噴霧法)處理后，其AHR顯著降低(圖8A和8B)，同時氣道中的氣道炎癥和嗜酸性粒細胞增多被抑制(圖8C)。另外，在這些抗fB處理的小鼠中組織炎癥、支氣管周嗜酸性粒細胞數(shù)量(表2)以及杯形細胞數(shù)量(表2)降低。另外，fB抗體處理的小鼠的BAL液中IL-4、IL-5和IL-13水平顯著降低(未給出數(shù)據(jù))。同樣，用抗B因子處理被敏化和攻擊C4-/-小鼠降低了其氣道反應性以及氣道炎癥(圖10)。這些結果與使用補體抑制劑的研究相一致在經典途徑和旁路途徑之間沒有區(qū)別，但是阻斷了晚期氣道反應性以及AHR的進展。
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表4

實施例4下述實施例描述了mAb 1379在人B因子表面的表位圖。
對mAb 1379抗體作表位圖的第一個實驗表明B因子上的表位或抗體結合位點并不是線性的。當抗體附著在ELISA板上時，它與全長蛋白結合強烈。構建了長為10個氨基酸的肽以跨越已知出現(xiàn)結合的蛋白區(qū)域(SCR2-3)。當這些肽附著到ELISA板上時，抗體并不識別它們，表明這些線性序列中沒有一個被識別為表位。
將被mAb 1379識別的人B因子的預計保守結合表面或表位模型化。簡而言之，以解析的CR2-SCR1-2的三維結構為基礎構建人B因子的三級結構(Protein Data Bank(PDB)id 1GHQ)。將最終模型改進為最低能量狀態(tài)，并將約束因素固定在每個SCR的四個絕對保守的Cys殘基上。B因子SCR2-3與CR2 SCR1-2的序列的同一性為30％(最高)，與H因子SCR15-16的為25％，與CD46的為20％。圖11示出B因子結構的模型，并指出了對應mAb 1379表位(相對于SEQID NO2)的氨基酸位置。被認為形成mAb 1379抗體的構象表位的殘基為Ala137、Tyr139、Ser141、Glu182、Ser185、Thr189、Glu190和Ser192，但是該表位可能僅含有圖11中所示出的少量殘基、基本上全部殘基或較該圖中所示出的更多殘基。
現(xiàn)在該模型被用于預測之前所討論的來自Hourcade(Hourcade，1995，J。Biol.Chem)的B因子突變體的效果，該突變體最初用于表征結合mAb 1379抗體的表位(參見實施例1)。下文示出來自這一系列的四種突變體，它們含有屬于圖11所示的mAb 1379表位模型的殘基。如下文所示，實施例1中所示出的降低mAb 1379的結合的B17和B23突變體具有預計朝向內部的特定置換(被表示為加粗和傾斜)，因此可能干擾結合mAb 1379的表位或保守結合表面的結構。盡管突變體B16/17含有結合mAb 1379的模型化表位中的殘基，但是它并不認為具有干擾表位結構的突變，這可解釋為什么在首次圖譜實驗中該突變體結合該抗體。同樣，盡管突變體B23/24也含有結合mAb 1379的模型化表位中的殘基，但是該突變體也結合在首次圖譜實驗中的抗體，形成抗體接觸位點的殘基可能不會被這些突變所干擾。本實驗還闡明了本發(fā)明的抗體可結合B因子蛋白或其部分，具有保守突變或基本不干擾該表位的突變。
B17Y139-C140-S141置換H PB23E182-G183-G184-S185置換G N V
Bl6/17G136-A137-G138置換 NSSB23/24S187-G188-T189-E190-P191-S192置換 D ET AV圖12為示意圖，該圖示出結合B因子的mAb1379(一個Fab片段)的模型化復合物，該Fab的抗原結合端被模型化以覆蓋所繪制的全部表位區(qū)域(如圖11所示)。
實施例5下述實施例表明補體旁路的抑制、特別是B因子的抑制抑制和預防動物免受腎臟缺血-再灌注損傷。
進行實驗以檢驗在缺血性急性腎功能衰竭模型中mAb1379在弱化損傷方面的有效性。在該模型中，通過將小鼠麻醉并將腎蒂夾24分鐘，誘導缺血性急性腎功能衰竭。小鼠腹膜內注射1mg mAb一小時后誘導損傷。該方法引起引起缺血性急性腎功能衰竭的逆轉形式，并且損傷峰一般在夾子拿離腎蒂并且血液回流到腎臟后24小時出現(xiàn)。然后通過測量諸如SUN和血清肌酸酐的含氮廢物的累積以及由腎臟病理學家評估腎臟的形態(tài)學損傷評估腎臟損傷。發(fā)明人進一步表明在腎臟再灌注后補體的旁路途徑很快被激活，還表明該激活有助于所引起的腎臟損傷。
免疫熒光法和蛋白質印跡分析檢測確認本文所描述的1379抗體在I/R后有效阻止了補體激活。如圖13所示，用1379預處理的小鼠與野生型對照組相比，在再灌注24小時后其血漿尿素氮(SUN)提高幅度較小(78±15mg/dL對119±15mg/dL，p＜0.05，每組n＝11)。在用1379處理的小鼠中也有更輕微的組織學損傷。以盲目形式由病理學家分級時，1379處理小鼠較對照小鼠其腎小管損害顯著降低(3.3±0.5對4.9±0.1，p＜0.01，每組n＝10)。因此，1379有效預防了在I/R后小鼠腎臟中的補體激活，1379預處理緩解了I/R后功能損傷和組織學損傷。
在另一個實驗中，通過與抗霉素一起培養(yǎng)使培養(yǎng)物中的腎小管上皮細胞化學缺氧兩個小時。然后將細胞暴露于新鮮小鼠血清(作為補體來源)，測量作為細胞死亡標記的乳酸脫氫酶(LDH)，并使用商業(yè)分析試劑盒(Promega，Madison，WI)在任意單位中表達。暴露于抗霉素和血清中的細胞較僅暴露于血清中的細胞其釋放的LDH顯著增加(100,140±3307(抗霉素+血清)對69,255±9754，p＜0.05；未給出數(shù)據(jù))。但是，在與細胞一起培養(yǎng)前血清與mAb1379一起孵育時，LDH的釋放下降為76,471±7720(p＜0.01對用抗霉素+血清處理的細胞，未給出數(shù)據(jù))。因此mAb1379保護了在體內或體外暴露于旁路途徑的組分中的含氧低的腎小管上皮細胞。
本文所引用的每一篇參考文獻通過援引全文納入本文。通過援引將每一篇美國臨時申請NO.60/543,594、美國臨時申請NO.60/636,239和PCT申請NO.PCT/US2004/015040的全部公開納入本文。
盡管本發(fā)明的各個實施方案已被詳細描述，但顯而易見的是本領域的技術人員可對這些實施方案進行修改和改變。但是，應該清楚了解的是這些修改和改變在所附權利要求所限定的本發(fā)明的范圍內。
序列表<110>V.M.霍勒斯J.M.瑟曼C.陶布E.W.格爾范德G.S.吉爾克森<120>B因子、補體旁路的抑制及與此相關的方法<130>2848-66<150>60/543,594<151>2004-02-10<150>60/636,239<151>2004-12-14<150>US04/015040<151>2004-05-13<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>764<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Gly Ser Asn Leu Ser Pro Gln Leu Cys Leu Met Pro Phe Ile Leu1 5 10 15Gly Leu Leu Ser Gly Gly Val Thr Thr Thr Pro Trp Ser Leu Ala Arg20 25 30Pro Gln Gly Set Cys Ser Leu Glu Gly Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser35 40 45Phe Arg Leu Leu Gln Glu Gly Gln Ala Leu Glu Tyr Val Cys Pro Ser50 55 60Gly Phe Tyr Pro Tyr Pro Val Gln Thr Arg Thr Cys Arg Ser Thr Gly65 70 75 80Ser Trp Ser Thr Leu Lys Thr Gln Asp Gln Lys Thr Val Arg Lys Ala85 90 95Glu Cys Arg Ala Ile His Cys Pro Arg Pro His Asp Phe Glu Asn Gly100 105 110Glu Tyr Trp Pro Arg Ser Pro Tyr TyrAsn Val Ser Asp Glu Ile Ser115 120125Phe His Cys Tyr Asp Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr130 135 140Cys Gln Val Asn Gly Arg Trp Ser Gly Gln Thr Ala Ile Cys Asp Asn145 150 155 160Gly Ala Gly Tyr Cys Ser Asn Pro Gly Ile Pro Ile Gly Thr Arg Lys165 170 175
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<400>2Thr Pro Trp Ser Leu Ala Arg Pro Gln Gly Ser Cys Ser Leu Glu Gly1 5 10 15Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Phe Arg Leu Leu Gln Glu Gly Gln Ala20 25 30Leu Glu Tyr Val Cys Pro Ser Gly Phe Tyr Pro Tyr Pro Val Gln Thr35 40 45Arg Thr Cys Arg Ser Thr Gly Ser Trp Ser Thr Leu Lys Thr Gln Asp50 55 60Gln Lys Thr Val Arg Lys Ala Glu Cys Arg Ala Ile His Cys Pro Arg65 70 75 80Pro His Asp Phe Glu Asn Gly Glu Tyr Trp Pro Arg Ser Pro Tyr Tyr85 90 95Asn Val Ser Asp Glu Ile Ser Phe His Cys Tyr Asp Gly Tyr Thr Leu100 105 110Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr Cys Gln Val Asn Gly Arg Trp Ser Gly115 120 125Gln Thr Ala Ile Cys Asp Asn Gly Ala Gly Tyr Cys Ser Asn Pro Gly130 135 140Ile Pro Ile Gly Thr Arg Lys Val Gly Ser Gln Tyr Arg Leu Glu Asp145 150 155 160Ser Val Thr Tyr His Cys Ser Arg Gly Leu Thr Leu Arg Gly Ser Gln165 170 175Arg Arg Thr Cys Gln Glu Gly Gly Ser Trp Ser Gly Thr Glu Pro Ser180 185 190Cys Gln Asp Ser Phe Met Tyr Asp Thr Pro Gln Glu Val Ala Glu Ala195 200 205Phe Leu Ser Ser Leu Thr Glu Thr Ile Glu Gly Val Asp Ala Glu Asp210 215 220Gly His Gly Pro Gly Glu Gln Gln Lys Arg Lys Ile Val Leu Asp Pro225 230 235 240Ser Gly Ser Met Asn Ile Tyr Leu Val Leu Asp Gly Ser Asp Ser Ile245 250 255Gly Ala Ser Asn Phe Thr Gly Ala Lys Lys Cys Leu Val Asn Leu Ile260 265 270Glu Lys Val Ala Ser Tyr Gly Val Lys Pro Arg Tyr Gly Leu Val Thr275 280 285Tyr Ala Thr Tyr Pro Lys Ile Trp Val Lys Val Ser Glu Ala Asp Ser
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Arg Ser Pro Tyr Tyr Asn Val Ser Asp Glu Ile Ser Phe His Cys Tyr20 25 30Asp Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr Cys Gln Val Asn35 40 45Gly Arg Trp Ser Gly Gln Thr Ala Ile Cys Asp Asn50 55 60<210>5<211>48<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Gly Tyr Cys Ser Asn Pro Gly Ile Pro Ile Gly Thr Arg Lys Val Gly1 5 10 15Ser Gln Tyr Arg Leu Glu Asp Ser Val Thr Tyr His Cys Ser Arg Gly20 25 30Leu Thr Leu Arg Gly Ser Gln Arg Arg Thr Cys Gln Glu Gly Gly Ser35 40 45<210>6<211>761<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>6Met Glu Ser Pro Gln Leu Cys Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Phe Ser1 5 10 15Ser Gly Gly Val Ser Ala Thr Pro Val Leu Glu Ala Arg Pro Gln Val20 25 30Ser Cys Ser Leu Glu Gly Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu35 40 45Leu Gln Gly Gly Gln Ala Leu Glu Tyr Leu Cys Pro Ser Gly Phe Tyr50 55 60Pro Tyr Pro Val Gln Thr Arg Thr Cys Arg Ser Thr Gly Ser Trp Ser65 70 75 80Asp Leu Gln Thr Arg Asp Gln Lys Ile Val Gln Lys Ala Glu Cys Arg85 90 95Ala Ile Arg Cys Pro Arg Pro Gln Asp Phe Glu Asn Gly Glu Phe Trp100 105 110Pro Arg Ser pro Phe Tyr Asn Leu Ser Asp Gln Ile Ser Phe Gln Cys115 120 125Tyr Asp Gly Tyr Val Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr Cys Gln Glu130 135 140Asn Gly Arg Trp Asp Gly Gln Thr Ala Ile Cys Asp Asp Gly Ala Gly
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755 760
權利要求
1.一種分離抗體或其抗原結合片段，它選擇性結合B因子的第三短同源重復序列(SCR)結構域，其中該抗體阻止C3bBb復合物的形成。
2.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合B因子并預防或抑制D因子剪切B因子。
3.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段結合人B因子的第三短同源重復序列(SCR)結構域。
4.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選擇性結合選自下列的B因子的第三SCR結構域中的表位(a)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括從約Tyr139位到約Ser185位，或其在非人類B因子序列中的等效位置；(b)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括從約Try139位到約Ser141位，或其在非人類B因子序列中的等效位置；(c)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括從約Glu182位到約Ser185位，或其在非人類B因子序列中的等效位置；(d)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括任何一個或多個下列位置或其在非人類B因子序列中的等效位置Tyr139，Cys140，Ser141，Glu182，Gly184或Ser185。
5.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選擇性結合多種哺乳動物物種的B因子。
6.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選擇性結合人和選自下列動物的B因子除人類外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔。
7.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為非補體激活的同種型或亞類。
8.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單克隆抗體。
9.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab片段。
10.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體。
11.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為雙特異性抗體。
12.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單價抗體。
13.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單克隆抗體1379(由ATCC保藏號PTA-6230產生)。
14.一種分離抗體或其抗原結合片段，它選擇性結合來自多種哺乳動物物種的B因子，其中該抗體阻止了C3bBb復合物的形成。
15.權利要求14的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選擇性結合人和選自下列動物的B因子除人類外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔。
16.權利要求14的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為非補體激活的同種型或亞類。
17.權利要求14的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單克隆抗體。
18.權利要求14的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab片段。
19.一種分離抗體或其抗原結合片段，它選擇性結合B因子，其中該抗體或其片段競爭性抑制單克隆抗體1379(由ATCC保藏號PTA-6230產生)與人B因子的特異性結合，并且其中，當該抗體或其抗原結合片段結合人B因子時，單克隆抗體1379抑制補體旁路的能力被抑制。
20.權利要求19的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段競爭性抑制單克隆抗體1379與人B因子的結合，通過抗體-抗體競爭性分析在人B因子存在時檢測比較結合特異性。
21.一種分離抗體或其片段，它選擇性結合人B因子，其中該分離抗體或其片段競爭性抑制二抗或其抗原結合片段與人B因子的特異性結合，并且其中該二抗或其抗原結合片段結合人B因子的第三SCR結構域。
22.一種組合物，包含權利要求1-21中任一項的分離抗體或其抗原結合片段。
23.一種抗原結合多肽，它選擇性結合B因子的第三短同源重復序列(SCR)結構域，其中該抗原結合多肽阻止了C3bBb復合物的形成。
24.一種抗原結合多肽，它選擇性結合多種哺乳動物物種的B因子，其中該抗原結合多肽阻止了C3bBb復合物的形成。
25.一種組合物，包含權利要求23或權利要求24的抗原結合多肽。
26.一種降低或預防動物的氣道高反應性(AHR)或氣道炎癥的方法，包括將根據(jù)權利要求1到18中的任一項的抗體或其抗原結合片段給予患有炎癥相關氣道高反應性或氣道炎癥或有患該病風險的動物。
27.權利要求26的方法，其中該抗體或抗原結合片段以一定的量給予動物，與給予該抗體或抗原結合片段前相比，該量可有效顯著降低動物的氣道高反應性。
28.權利要求26的方法，其中該抗體或抗原結合片段以一定的量給予動物，與患有炎癥并未給予該抗體或抗原結合片段的動物群體的氣道高反應性的水平相比，該量可有效顯著降低動物的氣道高反應性。
29.權利要求26的方法，其中該抗體或抗原結合片段的給予降低了動物對乙酰甲基膽堿或對組胺的反應性。
30.權利要求26的方法，其中該抗體或抗原結合片段與選自下列的可藥用載體一起給予可分散干粉、無水乙醇、小膠囊、脂質體、霧化噴霧劑和可注射賦形劑。
31.權利要求26的方法，其中該抗體或抗原結合片段在選自下列的載體或裝置中給予無水乙醇、干粉吸入系統(tǒng)、超聲吸入系統(tǒng)、壓力計量吸入器和計量溶液裝置。
32.權利要求26的方法，其中所述抗體或抗原結合片段與選自下列的試劑一起給予所述哺乳動物皮質類固醇、β-激動劑(長效或短效)、白三烯調節(jié)物、抗組胺、磷酸二酯酶抑制劑、色甘酸鈉、奈多羅米、茶堿、細胞因子拮抗劑、細胞因子受體拮抗劑、抗IgE和T細胞功能的抑制劑。
33.權利要求26的方法，其中所述氣道高反應性或氣道炎癥與選自下列的疾病相關哮喘、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、過敏性支氣管肺曲菌病、過敏性肺炎、嗜酸粒細胞性肺炎、肺氣腫、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管擴張、囊性纖維化病、結核病、過敏性肺炎、職業(yè)性哮喘、結節(jié)病、反應性氣道病綜合征、間質性肺病、嗜酸細胞增多綜合征、鼻炎、鼻竇炎、運動誘發(fā)哮喘、污染誘發(fā)哮喘、咳嗽變異性哮喘、肺寄生蟲病、呼吸道合胞體病毒(RSV)感染、副流感病毒(PIV)感染、鼻病毒(RV)感染和腺病毒感染。
34.權利要求26的方法，其中該氣道高反應性與過敏性炎癥相關。
35.權利要求26的方法，其中該(AHR)或氣道炎癥與哮喘相關。
36.權利要求26的方法，其中該(AHR)或氣道炎癥與COPD相關。
37.一種降低或預防動物的氣道高反應性(AHR)或氣道炎癥的方法，包括將選擇性抑制補體旁路的試劑給予患炎癥相關氣道高反應性或氣道炎癥或有患該病風險的動物。
38.一種降低或預防動物的缺血-再灌注損傷的方法，包括將根據(jù)權利要求1到18中任一項的抗體或其抗原結合片段給予患缺血-再灌注損傷或有患該病風險的動物。
39.權利要求38的方法，其中該缺血-再灌注損傷為腎臟缺血-再灌注損傷。
40.權利要求38的方法，其中該抗體或抗原結合片段以一定的量給予動物，與不給予該抗體或抗原結合片段相比，該量可有效顯著抑制動物的血清尿素氮的升高。
41.權利要求38的方法，其中該抗體或抗原結合片段以一定的量給予動物，與不給予抗體或抗原結合片段相比，該量可有效顯著降低對動物的腎臟組織的組織學損傷。
42.權利要求26或38的方法，其中該抗體或抗原結合片段通過選自下列的途徑給予口服、鼻部、局部、吸入、氣管內、經皮、直腸和腸胃外途徑。
43.一種降低或預防動物的氣道高反應性(AHR)或氣道炎癥的方法，包括將根據(jù)權利要求23或權利要求24的抗原結合多肽給予患有炎癥相關氣道高反應性或氣道炎癥或有患該病風險的動物。
44.一種降低或預防動物的缺血-再灌注損傷的方法，包括將權利要求23或權利要求24的抗原結合多肽給予患有缺血-再灌注損傷或有患該病風險的動物。
45.權利要求26-44中任一項的方法，其中該動物為哺乳動物。
46.權利要求26-44中任一項的方法，其中該動物為人。
全文摘要
公開了補體旁路的新型抑制劑，特別公開了新型抗B因子抗體。還公開了該抑制劑通過選擇性抑制補體旁路降低或預防氣道高反應性和/或氣道炎癥，由此治療該病癥起作用的疾病的用途。還公開了該抑制劑通過補體旁路的抑制降低或預防包括缺血－再灌注損傷在內的其它疾病和病癥的用途。
文檔編號C12P21/08GK101022828SQ200580011963
公開日2007年8月22日 申請日期2005年2月10日 優(yōu)先權日2004年2月10日
發(fā)明者V·M·霍勒斯, J·M·瑟曼, C·陶布, E·W·格爾范德, G·S·吉爾克森 申請人:科羅拉多大學評議會, 國家猶太醫(yī)療及研究中心, 南卡羅來納醫(yī)科大學研究發(fā)展基金會