專利名稱：結(jié)合補體級聯(lián)抑制劑的制作方法
相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2003年7月3日提交的美國專利臨時申請序列號60/484,854和2004年5月14日提交的美國專利臨時申請序列號60/571,374的權(quán)益，其公開內(nèi)容通過引用全文結(jié)合到本文中。
粉末領(lǐng)域本發(fā)明涉及新的化合物及其治療患者的某些病癥的用途。更具體地說，本發(fā)明涉及結(jié)合補體級聯(lián)(conjugated complement)抑制劑。
背景技術(shù)：
補體級聯(lián)具有深入研究的意義和作用，包括其在需要的免疫反應(yīng)中的作用。但是，對補體級聯(lián)不需要的刺激涉及特征為炎癥和組織損傷的某些熟知的病癥。因此，已開發(fā)出可用于治療此類病癥包括以下病癥的補體級聯(lián)抑制劑遺傳性血管性水腫、敗血性休克、心肺分流術(shù)中人工泵后綜合征(post pump syndrome in cardiopulmonarybypass)、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、器官排斥、創(chuàng)傷、腦創(chuàng)傷、哮喘、橋本甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎小球性腎炎和皮膚損害、其它腎小球性腎炎、大泡型類天皰瘡、皰疹樣皮炎(dermatitisherpetiformis)、肺出血-腎炎綜合征、格雷夫斯氏病、重癥肌無力、胰島素抵抗、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、急性感染性多神經(jīng)炎、Miller-Fisher綜合征和阿爾茨海默氏病。參見例如美國專利號6,492,403和6,515,002。
對補體級聯(lián)不需要的刺激涉及與細胞移植和移植物有關(guān)的并發(fā)癥。已知需要細胞移植和移植物治療疾病例如心力衰竭、糖尿病、中風(fēng)、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、癡呆、肝病、腎病、燒傷和創(chuàng)傷。但是，在實踐中，由于細胞移植和移植物的致免疫性導(dǎo)致激活補體級聯(lián)，最終產(chǎn)生排斥，該治療經(jīng)常無效。因此需要緩解排斥反應(yīng)的補體級聯(lián)抑制劑。
但是，始終需要給予用于治療患者的化合物賦于改善的藥物動力學(xué)性質(zhì)。已使用與聚乙二醇(PEG)共價連接的蛋白質(zhì)藥物增加這些藥物的體內(nèi)循環(huán)時間、水溶性和減少抗原性。參見例如美國專利號5,711,944。將幾個聚合物分子與大分子蛋白例如胰島素和血紅蛋白結(jié)合但不防礙與其生物靶標(biāo)相互作用的殘基是可能的。小分子蛋白和肽與聚合物結(jié)合后，保留其活性更困難，因為這些生物活性物質(zhì)通常幾乎沒有與生物活性有關(guān)的連接位點。與非肽小分子藥物結(jié)合的聚合物主要限于前藥策略。參見例如美國專利號5,614,549、美國專利號5,622,986和美國專利號6,127,355。用這些方法，通過代謝不穩(wěn)定的共價部分例如酯將小分子與非抗原聚合物連接。通過酶水解酯，該藥物必須從非抗原聚合物中釋放，以使小分子跨越細胞膜轉(zhuǎn)運入細胞。
因為補體級聯(lián)抑制劑與細胞表面上的受體結(jié)合，所以它們無須跨越細胞膜。因此，無須限制使用代謝不穩(wěn)定的共價鍵的小分子前藥方法。但是，正如蛋白藥物和小分子前藥的情形，具有調(diào)節(jié)非跨越細胞膜的小分子補體級聯(lián)抑制劑的藥物動力學(xué)性質(zhì)的技術(shù)仍然同等重要性。因此，對調(diào)節(jié)小分子補體級聯(lián)抑制劑的藥物動力學(xué)性質(zhì)的方法的需求永無止境。
本發(fā)明涉及這些和其它重要的目的。
發(fā)明概述本發(fā)明部分涉及包含結(jié)合補體級聯(lián)抑制劑的化合物。這些化合物可便利地與補體級聯(lián)成分中的受體結(jié)合，因而可抑制補體級聯(lián)或抑制由該級聯(lián)形成的蛋白質(zhì)(例如C3a和C5a)的作用。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供包含結(jié)合補體抑制劑的治療患者的藥物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供抑制補體級聯(lián)激活的治療患者的方法，該方法包括給予患者結(jié)合補體抑制劑。
通過本方面說明書和權(quán)利要求書，本發(fā)明的這些和其它方面將更清楚。
附圖簡述

圖1為由藥物形成藥物連接體(linker)結(jié)合物的可能的反應(yīng)途徑示意圖。
圖2為由藥物形成藥物連接體結(jié)合物的可能的反應(yīng)途徑示意圖。
圖3為藥物連接體結(jié)合物與聚合物連接的可能的反應(yīng)途徑示意圖。
圖4為多個藥物連接體結(jié)合物與聚合物連接的可能的反應(yīng)途徑示意圖。
圖5為由藥物形成藥物連接體結(jié)合物的可能的反應(yīng)途徑示意圖。
圖6為藥物連接體結(jié)合物與聚合物連接的可能的反應(yīng)途徑示意圖。
圖7為形成藥物-聚合物結(jié)合物的可能的反應(yīng)途徑示意圖。
圖8為形成藥物-連接體-聚合物結(jié)合物的合成路線示意圖。
圖9為圖8的備選合成路線示意圖。
圖10為形成具有高平均分子量的單價和多價藥物-聚合物結(jié)合物的合成路線示意圖。
圖11為形成三價藥物-聚合物結(jié)合物的合成路線示意圖。
說明性實施方案詳述本發(fā)明部分涉及包含結(jié)合補體級聯(lián)抑制劑的化合物。這些化合物可便利地與補體級聯(lián)成分中的受體結(jié)合，因而可抑制補體級聯(lián)或抑制由該級聯(lián)形成的蛋白質(zhì)(例如C3a和C5a)的作用。
應(yīng)理解，本發(fā)明公開中所用的“結(jié)合”表示聚合物部分與該術(shù)語緊隨其后的部分共價連接。因此，在本發(fā)明公開中，結(jié)合補體級聯(lián)抑制劑是具有共價連接的聚合物部分的補體級聯(lián)抑制劑。聚合物可選自聚醚、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物和以下定義的“活化”聚合物。
補體級聯(lián)抑制劑可以是任何抑制補體級聯(lián)的化合物。此類化合物的實例包括在美國專利號6,492,403、6,515,002、2003年5月28日提交的美國專利申請序列號60/383,130和10/445,817(委托人登記號(under client reference)1420001)中公開的那些，其公開內(nèi)容通過引用全文結(jié)合到本文中。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供式(I)化合物(D-L)n-P(I)其中每次出現(xiàn)時，D獨立選自補體級聯(lián)抑制劑化合物；L(每次出現(xiàn)時)是任選的在每次出現(xiàn)時獨立選擇的連接基團；n是1、2、3、4、5或6；和P是提高D的藥物動力學(xué)性質(zhì)的化合物。
在一個優(yōu)選的的實施方案中，D通過在生理條件下基本上不水解的鍵與P(包括通過任選的L)連接。
在一個優(yōu)選的的實施方案中，n是1。
在另一個優(yōu)選的的實施方案中，n是2。
在另一個優(yōu)選的的實施方案中，n是4。
應(yīng)理解，式(I)包括所有可能的組合，例如(D)n-P、(D-L)n-P，包括D-L-D-L-P和D-L-P-L-D，以及(D)n-P-(D-L)n。
補體級聯(lián)抑制劑本領(lǐng)域中已知有多種小分子補體級聯(lián)抑制劑，它們可用作本發(fā)明結(jié)合化合物的成分，包括但不限于與C1s亞成分、C1r亞成分、C1q亞成分、C5a受體、C3、D因子、B因子、C3a受體和MASP-2結(jié)合的化合物。適宜的補體級聯(lián)抑制劑包括與C1s亞成分結(jié)合的化合物，例如在美國專利號6,492,403、6,515,002、2003年5月28日提交的美國專利申請序列號60/383,130和10/445,817(委托人登記號1420001)中公開的化合物，其公開內(nèi)容通過引用全文結(jié)合到本文中。
適宜的補體級聯(lián)抑制劑還包括與C1r亞成分結(jié)合的化合物，例如在美國專利號5,652,237中公開的化合物，其公開內(nèi)容通過引用全文結(jié)合到本文中，和在WO 00/61608中公開的那些。
適宜的補體級聯(lián)抑制劑還包括與C5a受體結(jié)合的化合物，例如在WO 02/14265中公開的化合物，其公開內(nèi)容通過引用全文結(jié)合到本文中。
前述實例并不限制本公開內(nèi)容的范圍，如可將D理解是任何抑制補體級聯(lián)的化合物?？赏ㄟ^將特異性結(jié)合機理看成空間相互作用，產(chǎn)生各自用不同連接點連接的幾個D-L-P或D-P化合物，用已知方法例如P.Giclas，.Therapeutic Interventions in the Complement System，第225-236頁，Lambris J.D.；Holers M.V.編輯篩選這些化合物的生物活性，確定D與L或D直接與P的合適連接點。通常，D具有或可被與互補基團形成鍵的適宜基團取代，例如氨基、羧基、羥基、硫醇、鹵素、烯烴、肼、羥胺、氨基烷基、羧基烷基、鹵代烷基、羥烷基和巰基烷基。
在一個實施方案中，D是C5a受體拮抗劑。
在一個實施方案中，D是與C1r亞成分結(jié)合的化合物。
在一個實施方案中，D是與C1q亞成分結(jié)合的化合物。
在一個優(yōu)選的實施方案中，D是與MASP-2亞成分結(jié)合的化合物。
在一個優(yōu)選的實施方案中，D是與C1s亞成分結(jié)合的化合物。
在一個優(yōu)選的實施方案中，D是與C1s亞成分和MASP-2亞成分結(jié)合的化合物。
在一個優(yōu)選的實施方案中，D不是肽。
在一個優(yōu)選的實施方案中，D是分子量為約100分子量單位至約2000分子量單位(和范圍和其中的具體分子量的所有組合和次級組合)，優(yōu)選約400分子量單位至約1200分子量單位，或者約400分子量單位至約2000分子量單位的小分子。
在一個實施方案中，D是非芳族化合物。
在一個實施方案中，D是芳族化合物。
在一個實施方案中，D是芳族胍。
在一個優(yōu)選的實施方案中，D是芳族和/或雜芳族脒。
在一個優(yōu)選的實施方案中，D是式(II)化合物 其中R1、R2和R3獨立選自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羥基；U是噻吩基-R5、亞芐基、亞苯基、NH或鍵；R5是SO2、NH或鍵；Z是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基(cycloheteroene)；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或鍵；T是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基或硝基；
X是氨基、羧基、羥基、硫醇、鹵素、烯烴、肼、羥胺、氨基烷基、羧基烷基、鹵代烷基、羥烷基、巰基烷基，或與L或P連接的鍵；V是甲基、乙基或Cl；和R4是H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2、脲或胍基。
應(yīng)理解，作為(D-L)n-P化合物的部分的D、L和P具有與其原始“母核”化合物略微不同的式和個體特征。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認(rèn)為無須描述兩式之間的差異，例如可以理解D-NH-C(＝O)-L鍵(“連接”化合物)是D-NH2母核與HOOC-L母核結(jié)合的結(jié)果。同樣容易意識到，當(dāng)是該化合物的一部分時，NH2-CH2-NH2母核連接體將是HN-CH2-NH。因此，除特指外，為簡化的原故，本說明書使用母核和可互換的連接形式。
在一個實施方案中，D是 其中R4是H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2、脲或胍基，和當(dāng)D與L或P連接時，X是NH或C(＝O)。
在一個實施方案中，D是 其中當(dāng)D與L或P連接時，X是NH或C(＝O)；R6是C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵代、氨基或硝基；和V是甲基或乙基。
在一個實施方案中，D是 其中當(dāng)D與L或P連接時，X是NH或C(＝O)；R6是C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵代、氨基、苯基、吡唑基或硝基；和V是甲基或乙基。
任選的連接基團當(dāng)存在時，L可以是起連接D與P作用的化合物，同時在各部分之間提供空間。應(yīng)理解，本說明書用術(shù)語“間隔基”作為“連接體”的部分的縮寫，例如在公開連接體端基的論述中，連接體的基團可由NH2(或其它端基)-間隔基-SH(或其它端基)代表。
L任選每次出現(xiàn)，并且每次出現(xiàn)時被獨立選擇。因此，例如當(dāng)n是3時，本發(fā)明結(jié)合補體抑制劑可不具有連接基團，或具有三個不同的連接基團。
在一個優(yōu)選的實施方案中，L選自基團


其中AA是氨基酸，而m是1-12， 其中在AA是氨基酸，而m是1-12，
藥物動力學(xué)改進劑在一個實施方案中，藥物動力學(xué)改進劑(在式(I)中的P)可以是選自以下的聚合物聚醚(包括聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷和聚(環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物和“活化”聚合物。
在一個優(yōu)選的實施方案中，藥物動力學(xué)改進劑是分子量為約750分子量單位至約60,000分子量單位(和范圍和其中的具體分子量的所有組合和次級組合)的一甲基-封端的聚乙二醇，優(yōu)選約20,000分子量單位至約40,000分子量單位。
還在優(yōu)選的實施方案中，藥物動力學(xué)改進劑是活化的式(III)聚合物 其中M是CH3、HC＝CH-C(＝O)、O＝CH-CH2、H2N-CH2-CH2、Cl-H3N+-HN-C(＝O)-CH2、O＝C＝N-CH2CH2、HS-CH2CH2、H2C＝CH-S(＝O)2-CH2CH2， j為約17至約1400(和范圍和其中的具體數(shù)字的所有組合和次級組合)；和A是O-CH2-CH(＝O)、O-C(＝O)-CH2＝CH2、O-CH2-CH2-NH2、NH2、O-CH2-C(＝O)-NH-NH3+Cl-、SH、N＝C＝O、S(＝O)2-CH＝CH2，
在本發(fā)明的備選實施方案中，提供式(IV)化合物D-Ln-Pn’其中每次出現(xiàn)時，D獨立選自補體級聯(lián)抑制劑化合物；L是任選的(每次出現(xiàn)時)，在每次出現(xiàn)時獨立選擇的連接基團；n是1或2；n′是1、2、3或4；和每次出現(xiàn)時，P獨立選自提高D的藥物動力學(xué)性質(zhì)的化合物。
應(yīng)理解，式(IV)包括所有可能的組合，例如(D)n-Pn’、(D-L)n-Pn’包括例如D-L(-P)-P、P-D-P、D-L-P-L-P、D-L-P-L-D、P-D-L-D-L-P、D-L-P-P-L-D和(D)n-Pn’-(D-L)n。
在一個備選的實施方案中，D是式(V)化合物 其中R1、R2和R3獨立選自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羥基；U是噻吩基-R5、亞芐基、亞苯基、NH或鍵；R5是SO2、NH或鍵；Z是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或鍵；T是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基或硝基；X是氨基、羧基、羥基、硫醇、鹵素、烯烴、肼、羥胺、氨基烷基、羧基烷基、鹵代烷基、羥烷基、巰基烷基或與L或P連接的鍵；當(dāng)存在時，Y是氨基、羧基、羥基、硫醇、鹵素、烯烴、肼、羥胺、氨基烷基、羧基烷基、鹵代烷基、羥烷基、巰基烷基、脲、胍基或與L或P連接的鍵；和V是甲基、乙基或Cl。
在一個優(yōu)選的實施方案中，D選自基團 其中當(dāng)D與L或P連接時，X是NH或C(＝O)，
當(dāng)Y存在時，如果D與L或P連接，則Y是NH、C(＝O)、脲或胍基，V是甲基或乙基，和R6是H、C1-4烷基、OH、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基、苯基、吡唑基或硝基。
任選的連接基團當(dāng)存在時，L可以是連接D與P的化合物，同時提供各部分之間的空間，基本上同上所述。
藥物動力學(xué)改進劑在該實施方案中，藥物動力學(xué)改進劑基本上同上所述。
其中n＝1和n′＝2的式(IV)化合物的一個實例是 其中D是式(V)化合物，和J為約17至約1400(范圍和其中的具體數(shù)字的所有組合和次級組合)。
賦型劑在一個實施方案中，賦型劑選自在藥用組合物中用作活性化合物載體的已知化合物。通常根據(jù)所選的給藥途徑和例如在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA，1980)中所述的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)準(zhǔn)則選擇賦型劑，其公開內(nèi)容通過引用全文結(jié)合到本文中。
在一個備選的實施方案中，將活性化合物溶于磷酸鹽緩沖鹽水。
使用方法在另一個實施方案中，本發(fā)明提供抑制補體級聯(lián)激活的治療患者的方法，該方法包括給予患者結(jié)合補體抑制劑。
所述化合物可便利地與補體級聯(lián)成分中的受體結(jié)合，因而可抑制補體級聯(lián)，或抑制由該級聯(lián)形成的蛋白質(zhì)(例如C3a和C5a)的作用。抑制補體級聯(lián)的需要可能是其中發(fā)生補體級聯(lián)激活有害作用的某些病癥的結(jié)果，或在其中不需要激活補體級聯(lián)的結(jié)果的某些臨床方法中(移植、移植物等)需要抑制補體級聯(lián)。本說明書使用術(shù)語“病癥”包括其中本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到應(yīng)該抑制補體級聯(lián)的前述情況和任何時間。
本發(fā)明化合物可用于治療多種病癥包括遺傳性血管性水腫、敗血性休克、心肺分流術(shù)中人工泵后綜合征、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、器官排斥、創(chuàng)傷、腦創(chuàng)傷、哮喘、橋本甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎小球性腎炎和皮膚損害、其它腎小球性腎炎、大泡型類天皰瘡、皰疹樣皮炎、肺出血-腎炎綜合征、格雷夫斯氏病、重癥肌無力、胰島素抵抗、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、急性感染性多神經(jīng)炎、Miller-Fisher綜合征和阿爾茨海默氏病。預(yù)期的其它病癥在美國專利號6,515,002和專利申請系列號60/383,130中公開，其全部公開內(nèi)容通過引用全文結(jié)合到本文中。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括緩解個體對細胞移植或移植物排斥的方法，該方法包括抑制激活補體級聯(lián)。
移植物是指在個體內(nèi)、同種個體之間或不同種個體之間(“異種移植”)的組織轉(zhuǎn)移。
細胞移植是指在個體內(nèi)、同種個體之間或不同種個體之間的細胞轉(zhuǎn)移。移植的細胞包括干細胞、一種或多種供體動物的初級細胞、源自組織培養(yǎng)物的細胞、胰島細胞、表達胰島素的細胞、表達葡萄糖調(diào)節(jié)激素的細胞或表達治療糖尿病的因子的細胞。
已知需要細胞移植和移植物治療疾病例如心力衰竭、糖尿病、中風(fēng)、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、癡呆、肝病、腎病、燒傷和創(chuàng)傷。但是，在實踐中，由于細胞移植和移植物的致免疫性導(dǎo)致激活補體級聯(lián)，最終產(chǎn)生排斥，該治療經(jīng)常無效。因此，需要抑制補體級聯(lián)減輕排斥。參見RJ Armstrong等，Porcine Neural Xenografts InThe Immunocompetent RatImmune Response Following Grafting OfExpanded Neural Precursor Cells(在免疫活性大鼠中的豬神經(jīng)異種移植物移植膨脹的神經(jīng)前體細胞后的免疫反應(yīng))，Neuroscience，2001，106(1)201-16；W Bennet等，Expression Of Complement RegulatoryProteins On Islets Of LangerhansA Comparison Between Human IsletsAnd Islets Isolated From Normal And hDAF Transgenic Pigs(在胰島上表達補體調(diào)節(jié)蛋白人胰島與正常豬和hDAF轉(zhuǎn)基因豬胰島對比)，Transplantation，2001年7月27日，72(2)312-9；RP Robertson等，IsletTransplantation As A Treatment For Diabetes-A Work In Progress(移植胰島用于治療糖尿病-正在進行中的工作)，N Engl J Med.，2004年2月12日，350(7)694-705；T Lundgren等，Soluble Complement Receptor 1(TP 10)Preserves Adult Porcine Islet Morphology After IntraportalTransplantation Into Cynomolgus Monkeys(門靜脈內(nèi)植入獼猴后，可溶性補體受體1(TP10)保存成年豬胰島形態(tài))，Transplant Proc.2001年2-3月，33(1-2)725；W Bennet等，Damage To Porcine Islets OfLangerhans After Exposure To Human Blood In Vitro，Or AfterIntraportal Transplantation To Cynomologus MonkeysProtective EffectsOf Scr 1 And Heparin(在體外暴露于人血或門靜脈內(nèi)植入獼猴后，豬胰島損傷Scr 1和肝素的保護作用)，Transplantation，2000年3月15日，69(5)711-9；R Reca等，F(xiàn)unctional Receptor For C3a AnaphylatoxinIs Expressed By Normal Hematopoietic Stem/Progenitor Cells，And C3aEnhances Their Homing-Related Responses To SDF-1(通過正常造血干/先祖細胞表達C3a過敏毒素功能受體，和C3a加強它們對SDF-1的歸巢相關(guān)反應(yīng))，Blood，2003年5月15日，101(10)3784-93(Epub 2003年1月2日)；K Teranishi等，Depletion Of Anti-Gal Antibodies By TheIntravenous Infusion Of Gal Type 2 And 6 Glycoconjugates In Baboons(通過給狒狒靜脈輸注2和6型Gal糖結(jié)合物耗竭Anti-Gal抗體)，Xenotransplantation，2003年7月，10(4)357-67；K Teranishi等，Depletion Of Anti-Gal Antibodies In Baboons By Intravenous TherapyWith Bovine Serum Albumin Conjugated To Gal Oligosaccharides(通過用與Gal低聚糖結(jié)合的牛血清白蛋白靜脈治療耗竭Anti-Gal抗體)，Transplantation，2002年1月15日，73(1)129-39；JZ Appel等，Modulation Of Platelet Aggregation In BaboonsImplications For MixedChimerism In Xenotransplantation.I.The Roles Of IndividualComponents Of A Transplantation Conditioning Regimen And Of PigPeripheral Blood Progenitor Cells(調(diào)節(jié)狒狒的血小板凝集提示在異種移植中的混和性嵌合狀態(tài)。I.移植調(diào)控方案和豬外周血始祖細胞的各個成分作用)，Transplantation，2001年10月15日，72(7)1299-305；M Basker 等，Clearance Of Mobilized Porcine Peripheral BloodProgenitor Cells Is Delayed By Depletion Of The PhagocyticReticuloendothelial System In Baboons(通過消耗狒狒的吞噬網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)延遲清除活動的豬外周血始祖細胞)，Transplantation，2001年10月15日，72(7)1278-85；L Buhler等，High-Dose Porcine HematopoieticCell Transplantation Combined With CD40 Ligand Blockade In BaboonsPrevents An Induced Anti-Pig Humoral Response(給狒狒移植與CD40配體結(jié)合的大劑量豬造血細胞形成組塞，防止誘發(fā)抗豬體液反應(yīng))，Transplantation，2000年1月15日，69(11)2296-304。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括緩解個體對細胞移植或移植物排斥的方法，該方法包括給予個體結(jié)合補體抑制劑抑制激活補體級聯(lián)。個體可以是具有至少部分補體級聯(lián)的任何動物，和在一個實施方案中，該個體是哺乳動物。
已發(fā)現(xiàn)組織損傷與器官保存有關(guān)，因為不需要的補體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可通過將補體抑制劑加入器官保存液中克服。參見Bergamaschini L等，Cl inhibitor potentiates the protective effect of organpreservation solution on endothelial cells during cold storage(Cl抑制劑在冷藏期間加強器官保存液對內(nèi)皮細胞的保護作用)，Transplant Proc.2001年2-3月，33(1-2)939-41。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括在器官保存液中防止激活器官中的補體的方法，該方法包括使器官與結(jié)合補體抑制劑結(jié)合。
移植可在個體內(nèi)、同種個體之間或不同種個體之間進行。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括防止響應(yīng)異物植入個體而發(fā)生補體激活的方法，該方法包括使該異物與結(jié)合補體抑制劑接觸。個體可以是具有至少部分補體級聯(lián)的任何動物，和在一個實施方案中，所述個體是哺乳動物。在一個實施方案中，所述物體是外科植入物、人造器官或人造關(guān)節(jié)，或不需要補體激活的類似物體。
在一個實施方案中，結(jié)合補體抑制劑是具有式(I)或式(IV)的化合物(D-L)n-P D-Ln-Pn’(I) (IV)其中每次出現(xiàn)時，D獨立選自補體級聯(lián)抑制劑化合物；(每次出現(xiàn)時)L是任選的連接基團，每次出現(xiàn)時，所述基團被獨立選擇；n是1、2、3、4、5或6；n′是1、2、3或4；和P是提高D的藥物動力學(xué)性質(zhì)的化合物。
在一個實施方案中，D是式(VI)化合物 其中R1、R2、R3和任選R3’獨立選自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羥基，其中當(dāng)虛線代表雙鍵時，R3’不存在；U是噻吩基-R5、亞芐基、亞苯基、NH或鍵；R5是SO2、NH或鍵；Z是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或鍵；T是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基或硝基；X是氨基、羧基、羥基、硫醇、鹵素、烯烴、肼、羥胺、氨基烷基、羧基烷基、鹵代烷基、羥烷基、巰基烷基或與L或P連接的鍵；當(dāng)存在時，Y′是氨基、羧基、羥基、硫醇、鹵素、烯烴、肼、羥胺、氨基烷基、羧基烷基、鹵代烷基、羥烷基、巰基烷基、脲、胍基、H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2或與L或P連接的鍵；和V是甲基、乙基或Cl。
在一個實施方案中，存在L，并選自以下基團

其中AA是氨基酸，和m是1-12， 其中AA是氨基酸，和m是1-12，和 在一個實施方案中，P是具有式(III)的活化聚合物 其中M是CH3、HC＝CH-C(＝O)、O＝CH-CH2、H2N-CH2-CH2、Cl-H3N+-HN-C(＝O)-CH2、O＝C＝N-CH2CH2、HS-CH2CH2、H2C＝CH-S(＝O)2-CH2CH2， j為17-1400；和
A是O-CH2-CH(＝O)、O-C(＝O)-CH2＝CH2、O-CH2-CH2-NH2、NH2、O-CH2-C(＝O)-NH-NH3+Cl-、SH、N＝C＝O、S(＝O)2-CH＝CH2， 待給予的有效劑量和具體的給藥模式取決于此類因素如年齡、體重、待治療的具體區(qū)域和藥物的具體組成和形式，如同本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的那樣。典型地操作是，給予低水平的劑量，增加劑量直至達到需要的治療效果?；钚猿煞趾洼d體的相對比例可通過例如該化合物的化學(xué)性質(zhì)、所選擇的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)規(guī)范確定。
最適宜預(yù)防或治療的本發(fā)明化合物的劑量取決于給藥形式、所選擇的具體化合物和接受治療的具體患者的生理特性。通常，開始時可使用小劑量，然后酌情少量增加直至在此狀況下達到需要的效果。根據(jù)用大鼠進行的生理研究，人的治療劑量通?？梢詾槊咳占s0.01mg至約600mg/kg體重以及其中范圍的所有組合和次級組合?；蛘?，人的治療劑量可以為約0.4mg至約10g或更高。并且一日可從一次到幾次給予幾個不同的劑量單位。一般而言，口服可能需要教大劑量。
可通過在患者體內(nèi)導(dǎo)致活性藥物與該藥物的作用部位接觸的任何方法給予用于本發(fā)明方法的化合物，例如口服或腸胃外給藥。
腸胃外給藥包括通過以下途徑給藥靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、直腸、眼內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、經(jīng)上皮包括透皮、眼、舌下和口含；局部給藥包括眼、皮膚、眼、直腸和通過噴射氣霧劑的鼻吸入。
作為游離堿或藥學(xué)上可接受的鹽的活性化合物溶液可用適宜與表面活性劑例如羥丙基纖維素混和的水制備。也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中和在油中制備分散液。在普通儲存和使用條件下，這些制劑可含有防腐劑，防止微生物生長。
適宜注射用的藥用形式包括例如無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。在所有情況中，優(yōu)選所述形式為無菌和流體以便于注射。優(yōu)選在制備和儲存條件下穩(wěn)定，優(yōu)選以防止微生物例如細菌和真菌污染的作用的條件保存。載體可以是含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、其適宜的混合物和植物油的溶劑或分散溶媒?？赏ㄟ^使用包衣材料例如卵磷脂，在分散液的情形中，通過保持需要的粒徑和使用表面活性劑保持適當(dāng)?shù)牧鲃有??？赏ㄟ^各種抗細菌和抗真菌劑例如尼泊金酯類、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、柳硫汞等防止微生物作用。在多種情形中，優(yōu)選包括等滲劑例如糖或氯化鈉?？赏ㄟ^使用延遲吸收劑例如單硬脂酸鋁和明膠實現(xiàn)注射組合物的延長吸收。
可通過在適當(dāng)?shù)娜軇┲校瑢⑿枰康幕钚曰衔锱c需要的以上列舉的各種其它成分混和，隨后過濾消毒制備無菌注射液。通常，可通過將無菌活性成分加入含有堿性分散介質(zhì)和以上列舉中的必需的其它成分的無菌溶媒中制備分散液。在用于制備無菌注射液的無菌粉末的情形中，優(yōu)選的制備方法可包括真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，用這些技術(shù)可得到活性成分和其先前無菌過濾溶液中的任何其它需要的成分的粉末。
可通過任何可供利用的單個治療藥物或與其它治療藥物聯(lián)合的藥物使用的常規(guī)方法給予所述化合物。其它治療成分包括但不限于抗生素、抗病毒藥、抗真菌劑、抗炎藥包括甾體和非載體抗炎藥、麻醉藥、止吐劑、免疫抑制劑及其混合物。
這樣的其它成分包括以下任何藥物a.抗菌藥-氨基糖苷類例如阿米卡星、安普霉素、阿貝卡星、班貝霉素、布替羅星、地貝卡星、雙氫鏈霉素、福提霉素、新霉素、慶大霉素、Ispamicin、卡那霉素、小諾米星、新霉素、十一烯酸新霉素、奈替米星、巴龍霉素、核糖霉素、西索米星、大觀霉素、鏈霉素、鏈異煙肼和妥布霉素；Amphenicols、例如疊氮氯霉素、氯霉素、棕櫚(Palmirate)氯霉素、氯霉素泛酸酯、氟苯尼考、甲砜霉素；安莎霉素類，例如利福米特、利福平、利福霉素和利福昔明；β-內(nèi)酰胺；卡巴培南類，例如亞胺培南；頭孢菌素，例如1-Carba(dethia)頭孢菌素、頭孢克洛(Cefactor)、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢曲嗪、頭孢西酮、頭孢唑啉、頭孢克肟、頭孢馬替林、頭孢地秦、頭孢尼西、頭孢哌酮、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢替安、頭孢咪唑、頭孢匹胺、頭孢泊肟普塞酯、頭孢沙定、頭孢磺啶、頭孢他啶、頭孢特侖、頭孢替唑、頭孢布烯、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢唑南、氰乙酰頭孢霉素鈉、頭孢氨芐、頭孢來星、頭孢噻啶、頭孢硝噻吩、頭孢噻吩、頭孢匹林鈉、頭孢拉啶和Pivcefalexin；頭孢霉素例如頭孢拉宗、頭孢美唑、頭孢克肟、Cefetan和頭孢西定；單菌霉素例如氨曲南、卡盧莫南和替吉莫南；氧頭孢烯類例如氟氧頭孢和Moxolactam；青霉素類例如Amidinocillin、氮西林、氮脒青霉素匹酯、阿莫西林、氨芐西林、阿帕西林、阿撲西林、疊氮西林、阿洛西林、巴氨西林、芐青霉素酸、芐青霉素、羧芐西林、卡非西林、卡茚西林、氨甲西林、氯唑西林、環(huán)青霉素、雙氯西林、聯(lián)苯青霉素、依匹西林、芬貝西林、氟氯西林(Floxicillin)、海他西林、侖氨西林、美坦西林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、培他西林、氫碘酸噴沙西林、苯明青霉素G、芐星青霉素G、二苯甲胺青霉素G、青霉素G鈣、青霉素G Hydragamine、青霉素G鉀、普魯卡因青霉素G.、青霉素N、青霉素O、青霉素V、芐星青霉素V、海巴明青霉素V、青哌環(huán)素、非奈西林、哌拉西林、匹氨西林(Pivapicillin)、丙匹西林、喹那西林、磺芐西林、酞氨西林、替莫西林和替卡西林；林可酰胺類(Lincosumides)例如克林霉素和林可霉素；大環(huán)內(nèi)酯類例如阿奇霉素、卡泊霉素、克拉霉素、紅霉素及衍生物、交沙霉素、白霉素、麥迪霉素、美奧卡霉素、竹桃霉素、普利霉素、洛他霉素、羅沙米星、羅紅霉素、螺旋霉素和醋竹桃霉素；多酞類例如安福霉素、桿菌肽、卷曲霉素、多粘菌素E、持久霉素、恩維霉素、夫沙芬凈、短桿菌肽、短桿菌肽S、米卡霉素、多粘霉素、β-甲磺酸多粘霉素、普那霉素、利托菌素、替考拉寧、硫鏈絲霉素、結(jié)核放線菌素、短桿菌酪酞、短桿菌素、萬古霉素、紫霉素、維吉霉素和桿菌肽鋅；四環(huán)素類例如Spicycline、金霉素、氯莫環(huán)素、地美環(huán)素、多西環(huán)素、胍甲霉素、賴甲環(huán)素、甲氯環(huán)素、美他霉素、二甲胺四環(huán)素、土霉素、青哌環(huán)素、匹哌環(huán)素、羅利環(huán)素、山環(huán)素、琥珀酸氯霉素吡甲四環(huán)素和四環(huán)素；及其它例如環(huán)絲氨酸、莫匹羅星和薯球蛋白。
b.合成抗菌素-2，4-二氨基嘧啶類例如溴莫普林、四氧普林和甲氧芐啶；硝基呋喃類例如呋喃他酮、Furazolium、硝呋拉定、硝呋太爾、硝呋復(fù)林、硝呋吡醇、硝呋拉嗪、硝呋妥因醇和呋喃妥因；喹諾酮及其類似物類，例如氨氟沙星、西洛沙星、環(huán)丙沙星、二氟沙星、依諾沙星、氟羅沙星、氟甲喹、洛美沙星、米洛沙星、萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、奧索利酸、Perfloxacin、吡哌酸、吡咯米酸、羅索沙星、替馬沙星和托氟沙星；磺胺類例如醋磺胺甲氧嗪、醋磺胺異唑、偶氮磺酰胺、芐磺胺、氯胺-β、氯胺-T、二氯胺-T、甲醛磺胺噻唑、N.sup.2-甲酰基-磺胺索嘧啶、N.sup.4-β-D-葡糖基磺胺、磺胺米隆、4′-(甲基-氨磺酰)sulfanilanilide、對硝基磺胺噻唑、諾丙磺胺、酞磺醋胺、酞磺胺噻唑、柳氮磺嘧啶、琥珀磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺醋酰、磺胺氯達嗪、磺胺柯定、磺胺西汀、磺胺嘧啶、磺胺戊烯、磺胺地索辛、磺胺多辛、磺胺乙二唑、磺胺脒、磺胺胍諾、磺胺林、磺胺洛西酸、磺胺甲嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺托嘧啶、新諾明、磺胺甲氧嗪、磺胺美曲、磺胺米柯定、磺胺唑、磺胺、磺胺基甲磺酸三乙醇胺鹽、4-磺胺基水楊酸、N.sup.4-磺胺酰磺胺、磺胺酰脲、N-磺胺酰-3，4-xylamide、磺胺硝苯、磺胺培林、磺胺苯吡唑、磺胺普羅林、磺胺吡嗪、磺胺吡啶、磺胺異唑、磺胺均三嗪、磺胺噻唑、磺胺硫脲、磺胺托拉米、磺胺索嘧啶和磺胺異唑；砜類，例如醋氨苯砜、醋地砜、磺胺苯砜、氨苯砜、地百里砜、葡胺苯砜、苯丙砜、琥珀氨苯砜、磺胺酸、對-磺胺酰芐胺、對，對′-磺?；p苯胺-N，N′雙半乳糖苷、阿地砜和噻唑砜；及其它例如氯?？朔印⒑？宋鞫āⅠR加寧(Magainins)、烏洛托品、脫水亞甲枸櫞酸烏洛托品、馬尿酸烏洛托品、扁桃酸烏洛托品、磺基水楊酸烏洛托品、硝羥喹啉、角鯊胺和Xibomol。
c.抗真菌藥(抗生素類)-多烯例如兩性霉素-B、克念霉素、制皮霉素、非律平、制霉色基素、曲古霉素、哈霉素、魯斯霉素、美帕曲星、那他霉素、制霉菌素、培西洛星、表霉素；及其它，例如偶氮絲氨酸、灰黃霉素、寡霉素、吡咯尼群、西卡寧、殺結(jié)核菌素和綠色木霉素。
d.抗真菌藥(合成類)-烯丙胺例如萘替芬和特比萘芬；咪唑類例如聯(lián)苯芐唑、布康唑、氯登妥因、氯米達唑、氯康唑、克霉唑、益康唑、恩康唑、Finticonazole、異康唑、酮康唑、咪康唑、奧莫康唑、硝酸奧莫康唑、硫康唑和噻康唑；三唑類例如氟康唑、伊曲康唑、特康唑；及其它例如吖啶瑣辛、阿莫羅芬、珍尼柳酯、溴柳氯苯胺、丁氯柳胺、Chlophenesin、環(huán)吡酮、氯羥喹(Cloxyquin)、艾索帕爾、地馬唑、二鹽酸鹽、依沙酰胺、氟胞嘧啶、哈利他唑、?？颂驵?、氯氟卡班、硝呋太爾、碘化鉀、丙酸、吡硫翁、水楊苯胺、舒苯汀、替諾尼唑、托西拉酯、妥拉磺脲、托萘酯、3’，4’，5’，5，7-五羥黃酮(Tricetin)、芐硫噻二嗪乙酸和十一烯酸。
e.抗青光眼藥物-抗青光眼藥，例如達哌唑、雙氯非那胺、地匹福林和毛果蕓香堿。
f.消炎藥-皮質(zhì)類固醇類、氨基芳基羧酸衍生物例如依托芬那酯、甲氧芬那酸、Mefanamic acid、尼氟酸；芳基乙酸酸衍生物例如阿西美辛、氨芬酸桂美辛、氯吡酸、雙氯芬酸、芬氯酸、苯克洛酸、芬克洛酸、芬替酸、葡美辛、Isozepac、氯那唑酸、甲嗪酸、奧沙美星、丙谷美星、舒林酸、噻拉米特和托美??；芳基丁酸衍生物類例如異丁苯丁酸和芬布芬；芳酸例如環(huán)氯茚酸、酮洛酸和替諾立定；芳基丙酸衍生物例如布氯酸、卡洛芳、非諾洛芬、氟諾洛芬、布洛芬、異丁普生、丙嗪、吡酮洛芬、吡洛芬、普拉洛芬、丙替嗪酸和噻洛芬酸；吡唑類例如Mepirizole；吡唑酮類例如氯非宗、非普拉宗、莫非布宗、羥布宗、保泰松、苯基吡唑酮(Phenyl Pyrazolidininones)、琥布宗和噻唑丁炎酮；水楊酸衍生物例如溴水楊醇、芬度柳、乙二醇水楊酸酯、5-氨基水楊酸、水楊酸1-萘酯、奧沙拉嗪和柳氮磺吡啶；噻嗪酰胺例如屈昔康、伊索昔康和吡羅昔康；及其它例如e-乙酰胺基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羥基丁酸、阿米西群、芐達酸、布可隆、卡巴腙、聯(lián)苯吡胺、地他唑、愈創(chuàng)藍油烴、麥考酚酸酸和衍生物的雜環(huán)氨基烷基酯、萘丁美酮、尼美舒利、奧古蛋白、奧沙西羅、唑衍生物、瑞尼托林、哌福肟、2-取代-4，6-二叔丁基-s-羥基-1，3-嘧啶、普羅喹宗和替尼達普。
g.防腐劑-胍類例如阿來西定、安巴腙、氯己定和吡氯定；鹵素/鹵素化合物類例如保米磷鹽酸鹽(Bomyl Chloride)、碘酸鈣、碘、一氯化碘、三氯化碘、碘仿、聚維酮碘、次氯酸鈉、碘酸鈉、氯氧三嗪、麝酚碘、三氯卡班、三氯生和曲氯新鉀；硝基呋喃類例如呋喃唑酮、2-(甲氧基甲基)-5-硝基呋喃、尼曲昔腙、硝呋醛肟、硝呋肼和呋喃西林；酚類例如醋辛酚汞、氯二甲酚、六氯酚、水楊酸1-萘酯、2，4，6-三溴-間甲酚和3′，4′，5-三氯水楊苯胺；喹諾酮類例如氨喹脲、二氯羥喹、雙氯甲喹啉、氯羥喹(Cloxyquin)、乙基氫化叩卜林(Ethylhydrocupreine)、哈喹諾、白毛莨堿、8-羥基喹啉及硫酸鹽；及其它，例如硼酸、氯脒佐定、醋酸間-甲苯酯、硫酸銅和魚石脂。h.抗病毒藥-嘌呤/嘧啶酮例如2-乙酰基-吡啶5-((2-吡啶基氨基)硫代羰基)硫代羰基腙(Thiocarbonohydrazone)、阿昔洛韋、二脫氧腺苷、2，3-二脫氧胞苷、二脫氧腺苷、依度尿苷、氟尿苷、更昔洛韋、碘苷、MADU、吡啶酮、曲氟尿苷、阿糖腺苷(Videarbine)和齊多夫定；乙酰亮氨酸一乙醇胺、Acridinamine、烷基異唑、金剛烷胺、脒霉素、枯醛縮氨基硫脲、膦甲酸鈉、乙氧丁酮醛、溶菌酶、美替沙腙、嗎啉胍、鬼臼毒素、利巴韋林、金剛乙胺、司他霉素、維司托隆、胸腺素、曲金剛胺和珍那佐酸。
i.免疫抑制劑-甲潑尼龍、Atgam、即復(fù)寧、OKT3、巴利昔單抗、達珠單抗、雷帕霉素、潑尼松、環(huán)胞菌素、他克莫司、麥考酚酸莫酯和硫唑嘌呤。
制備方法在另一個實施方案中，本發(fā)明提供制備補體級聯(lián)抑制劑的方法。
圖1說明概括8種方法的示意圖，可用這些方法將雙官能化連接體(式I中的連接體L)引入關(guān)鍵支架(scaffold)1上(美國專利臨時申請60/383130)，為在中間體2-9上進行結(jié)合提供適當(dāng)處理。當(dāng)X＝NH2或OH時，在堿例如吡啶存在下，通過用氯甲酸對硝基苯基酯處理，可將支架1分別預(yù)活化為氨基甲酸對硝基苯基酯或碳酸對硝基苯基酯。在堿，優(yōu)選三乙胺或二異丙基乙胺的存在下，使原位生成的該中間體立即與適宜的連接體(NH2-間隔基-Y′)反應(yīng)，生成脲或氨基甲酸酯2(路線a)。當(dāng)X＝NH2時，可使支架1直接與含活化氨基甲酸酯或異氰酸酯的連接體反應(yīng)，得到脲4(W′＝NH)。當(dāng)X＝NH2時，也可用含碳酸酯或活化酸官能團(或酰氯)的連接體處理支架1，分別得到氨基甲酸酯4(W′＝O)或酰胺4(W′＝CH2)。在該路線的另一個變換方式中，可通過在親核取代反應(yīng)中置換連接體上的適合的離去基團生成中間體7(路線f)的親核取代反應(yīng)，使支架1上的親核基團(X＝SH或OH)烷基化?；蛘撸捎弥Ъ躭上的適合的離去基團(優(yōu)選LG＝Cl、Br、I、對硝基苯酚、磺酸甲酯或?qū)?甲苯磺酸酯)使適宜的雙官能化連接體烷基化，得到中間體3或6(如同路線b和e中分別所述的那樣)，其中Z＝NH、S或O?；蛘撸?dāng)X是酰氯或活化酸時，可路線d所示，用含連接體的胺處理，得到酰胺5。在路線d中，通過用多種標(biāo)準(zhǔn)肽偶聯(lián)試劑，優(yōu)選DIC/DMAP處理可原位生成活化酸。最后，可通過用適宜的與X結(jié)合的Michael受體共軛加成，完成支架1和連接體的結(jié)合。因此，在堿的存在下，具有適宜的親核基團(Z＝NH或S)的連接體與丙烯酰胺或乙烯砜反應(yīng)，可生成中間體8或9(如同路線g和h中分別所述的那樣)。
圖2說明概括8種方法的示意圖，可用這些方法將雙官能化連接體引入關(guān)鍵支架10上(美國專利臨時申請60/383130)，為在中間體11-18上進行結(jié)合提供適當(dāng)處理。當(dāng)X＝NH2或OH時，在堿例如吡啶存在下，通過用氯甲酸對硝基苯基酯處理，可將支架1分別預(yù)活化為氨基甲酸對硝基苯基酯或碳酸對硝基苯基酯。在堿，優(yōu)選三乙胺或二異丙基乙胺的存在下，使原位生成的該中間體立即與適宜的連接體(NH2-間隔基-Y′)反應(yīng)，生成脲或氨基甲酸酯11(路線a)。當(dāng)X＝NH2時，可使支架10直接與含活化氨基甲酸酯或異氰酸酯的連接體反應(yīng)，得到脲13(W′＝NH)。當(dāng)X＝NH2時，也可用含碳酸酯或活化酸官能團(或酰氯)的連接體處理支架10，分別得到氨基甲酸酯13(W′＝O)或酰胺13(W＝CH2)。在該路線的另一個變換方式中，可通過在親核取代反應(yīng)中置換連接體上的適合的離去基團生成中間體16(路線f)，使支架10上的親核基團(X＝SH或OH)烷基化?；蛘?，可用支架10上的適合的離去基團(優(yōu)選LG＝Cl、Br、I、對硝基苯酚、磺酸甲酯或?qū)妆交撬狨?使適宜的雙官能化連接體烷基化，得到中間體12或15(如同路線b和e中分別所述的那樣)，其中Z＝NH、S或O?；蛘?，當(dāng)X是酰氯或活化酸時，可如路線d所示，用含連接體的胺處理，得到酰胺14。在路線d中，通過用多種標(biāo)準(zhǔn)肽偶聯(lián)試劑，優(yōu)選DIC/DMAP處理可原位生成活化酸。最后，可通過用適宜的與X結(jié)合的Michael受體共軛加成，完成支架10和連接體的結(jié)合。因此，在堿的存在下，具有適宜的親核基團(Z＝NH或S)的連接體與丙烯酰胺或乙烯砜反應(yīng)，可生成所需的中間體17或18(如同路線g和h中分別所述的那樣)。
圖3說明概括使PEG與連接體-藥物復(fù)合物例如上述中間體連接的9種策略。
一種通用結(jié)合策略涉及藥物-連接體19與PEG活性功能基(-NH2或-CO2H)之間形成的酰胺鍵。例如，當(dāng)Y′＝CO2H時，在PEG-胺和化學(xué)計量的DMAP存在下，碳二亞胺偶合產(chǎn)生20(隨后用TFA的DCM溶液脫保護后)。也可使用其它偶聯(lián)試劑例如HBTU、PyBop或DPPA。當(dāng)Y′是羧酸酯時，將酯水解可得到可與前述PEG-胺偶合的羧酸?；蛘?，可通過類似的酰胺化試劑，將含胺官能團(Y′＝NH2)的連接體與PEG-羧酸偶聯(lián)，得到22(單體PEG)或21(多個PEG單位)。市售可獲得的PEG-活化酯(例如PEG-CO-N-羥基琥珀酰亞氨基酯)也可具有相同的用途。
第二個將PEG與藥物-連接烏復(fù)合物連接的通用策略涉及將硫醇親核加成或取代至合適的親電體，生成硫鍵(sulfide bond)。例如，可使含硫醇的PEG與含鹵化物(Y′＝Br)或甲磺酸酯(由Y′＝OH合成的)的連接體反應(yīng)，得到24?；蛘?，可將含硫醇的連接體加至PEG的馬來酰亞胺基團上，得到26。在其中的各個情形中，可反轉(zhuǎn)活性配偶體(連接體對PEG)上的功能基。
第三個用于結(jié)合的通用策略涉及在PEG與連接體之間形成的脲或氨基甲酸酯。例如，當(dāng)藥物-連接體復(fù)合物19含有胺官能團(Y′＝NH2)時，可用試劑例如氯甲酸對硝基苯酯和胺堿形成活化氨基甲酸酯[J.Med.Chem.38，3236-3245(1995)]?？墒乖摶罨被姿狨ヅcPEG-胺反應(yīng)，得到23。同樣，當(dāng)Y′＝OH時，可用試劑例如氯甲酸對硝基苯酯形成活化碳酸酯。該碳酸酯中間體與PEG-胺反應(yīng)得到25。再次在其中的各個情形中，可反轉(zhuǎn)活性配偶體(連接體對PEG)上的功能基。
圖4描述每PEG單位合成多個藥物-連接體部分的某些代表性策略(例如在式(I)中，當(dāng)n＝2或n＝4時)。在一個實施方案中，可在PEG的每個末端((例如H2NCH2CH2-(OCH2CH2)n-CH2CH2NH2)雙官能化PEG)簡單地將PEG部分官能化，或可含有連接PEG構(gòu)造的各種分支(例如四分支的PEG)。所涉及的鍵化學(xué)與圖3中所述的那些相似。例如，可使雙官能化胺-PEG(PEG-(NH2)2)與過量的19(Y′＝CO2H)偶合，得到雙官能化部分27。同樣，可使多功能胺-PEG(PEG-(NH2)n)與活化氨基甲酸酯(由19合成Y′＝NH2)或碳酸酯(由19合成Y′＝OH)反應(yīng)，分別得到29和30?；蛘?，可在堿性條件下，使用活性馬來酰亞胺部分官能化的PEG與19(Y′＝SH)反應(yīng)，得到28。另外，可用標(biāo)準(zhǔn)酰胺鍵形成條件，使具有多個羧酸基團的分支PEG偶合到19(Y′＝-NHR(R＝H、Me)，得到31。
對有機和肽化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員而言，圖1-4中所述策略所使用的方法為常規(guī)操作。
例如，通常用DIC/DMAP組合(其中外消旋化不是問題)或用其中氨基酸的α-中心外消旋化是潛在的問題的HBTU/HOBT組合，分別完成由胺或醇形成酰胺或酯。這也可用多種其它標(biāo)準(zhǔn)縮合劑(EDC、PyBOP、HATU、TBTU、HOBT/活化酯或DIC/HOBT)完成。(1)Bodanszky，M.；The Practice of Peptide SynthesisSpringer-VerlagNewYork，1984.(2)Bunin，B.；The Combinatorial IndexAcademic PressNew York，1998.(3)J Org Chem.1999，64(22)8063-8075。通常，通過使胺與異氰酸酯反應(yīng)或用氯甲酸對硝基苯基酯活化，然后與仲胺(1)反應(yīng)形成脲(J.Med.Chem.1995，38，3236-3245)。按前述(1)進行共軛加成和使硫醇加成到馬來酰亞胺上(J.Am.Chem.Soc.1999，121，7967-7968。(2)Bioconjugate Chemistry.2003，14(2)464-72。(3)Nat StructBiol.2000，7(4)309-11.3月(4)，J.Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms，& StructureWileyNew York，1992)。
再看圖5，按圖2中所述方法，可將苯胺32(在美國專利申請序列號60/383,130中描述的)偶合到連接體62、63或64，得到相應(yīng)的酰胺33、氨基甲酸酯34和脲35。當(dāng)化合物33、34和35中的R9是保護的胺，Y′是OH、保護的胺或羧酸時，可除去R9上的保護基團，并可進一步與雙-Boc保護的S-甲基異硫脲(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，US)反應(yīng)，得到胍36、37和38。當(dāng)R9是硝基時，可將其還原成胺，用相似方式處理，得到化合物36、37和38。
再看圖6，可通過幾種方法，使與連接體偶合形成化合物39的聯(lián)芳基噻吩脒(在美國專利申請序列號60/383,130中描述的)連接到PEG分子上。例如，當(dāng)Y′＝CO2H時，在PEG-胺(PEG-NH2)和化學(xué)計量的DMAP的存在下，使碳二亞胺偶合，得到40(隨后用TFA的DCM溶液脫保護)。也可使用其它偶聯(lián)試劑例如HBTU、PyBop或DPPA。當(dāng)Y′是羧酸酯時，如前所述將該酯水解，得到可與PEG-NH2偶合的羧酸?；蛘?，可通過類似的酰胺化試劑將含胺官能團(Y′＝NH2)的連接體與PEG-CO2H偶合，得到43。市售可獲得的PEG-活化酯(例如PEG-CO-N-羥基琥珀酰亞氨基酯)也可用于此用途。
使PEG與藥物連接體復(fù)合物39連接的第二策略涉及硫醇親核加成或取代至適當(dāng)?shù)挠H電體上，得到硫鍵。例如含硫醇的PEG可與含鹵化物(Y′＝Br)或甲磺酸酯(由Y′＝OH合成)的連接體反應(yīng)，得到42。
第三個用于結(jié)合的通用策略涉及在PEG與連接體之間形成的脲或氨基甲酸酯。例如，當(dāng)藥物-連接體復(fù)合物5含有胺官能團(Y′＝NH2)時，可用試劑例如氯甲酸對硝基苯酯和胺堿形成活化氨基甲酸酯[J.Med.Chem.38，3236-3245(1995)]?？墒乖摶罨被姿狨ヅcPEG-NH2反應(yīng)，得到41(Y″＝NH。同樣，當(dāng)Y′＝OH時，可用試劑例如氯甲酸對硝基苯酯形成活化碳酸酯。該碳酸酯中間體與PEG-NH2反應(yīng)生成41(Y″＝O)。
圖7說明將PEG部分直接與無連接體的藥物分子連接的方法。該方法用于實施例5。
用TBAF處理Teoc保護的聯(lián)苯胺44(在美國專利申請序列號60/383,130中描述)，用主要與空間位阻較小的胺反應(yīng)的二-BOC保護的S-甲基異硫脲(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，US)處理得到的聯(lián)苯胺，得到化合物45。可用氯甲酸對硝基苯酯處理化合物45，隨后用圖3中所述PEG-胺(PEG-NH2)處理，用TFA脫保護，得到化合物46。
或者，可用用圖3中所述PEG-酸(PEG-CO2H)處理45，用TFA脫保護，得到化合物47。
圖8說明制備實施例6中所述化合物的備選路線。在二異丙基乙胺的存在下，用乙酸基乙酰氯使苯胺48(在美國專利申請序列號60/383,130中描述)?；S后使乙?；砘玫讲?9。將49的硝基還原，隨后用1，3-二(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-假硫脲的乙酸溶液使得到的苯胺胍基化(guanidinylation)，得到醇51。用甲磺酰氯活化該伯醇。使得到的甲磺酸酯52與3-巰基丙酰胺PEG-20kDa(RappPolymere)結(jié)合。最后，用TFA/DCM(1∶1)完全脫保護，得到PEG化的-化合物53(實施例6，備選路線)。
圖9說明制備實施例6中化合物的備選路線。通過用溴乙酸叔丁基酯使3-巰基丙酸甲酯烷基化，隨后用TFA除去叔丁基，用兩步制備連接體57。然后用DIC/DMAP使連接體57與中間體58偶合(在美國專利申請序列號60/383,130中描述)。將該甲酯水解，隨后用TBAF除去Teoc保護基團，進行前述的胍基化，得到酸60。用標(biāo)準(zhǔn)條件(DIC/DMAP的DCM溶液)完成與該中間體的聚合物結(jié)合，隨后用TFA脫保護，得到需要的化合物61(實施例6)。
圖10說明合成高分子量的PEG-結(jié)合物及尤其是高分子量(＞35K)的多價PEG-結(jié)合物的方法。可使用試劑例如氯甲酸對硝基苯酯和胺堿將中間體45轉(zhuǎn)化為活化氨基甲酸酯[J.Med.Chem.38，3236-3245(1995)]。可使該活化氨基甲酸酯與雙官能化PEG例如化合物62反應(yīng)，得到具有游離羧酸端基的PEG結(jié)合物63?？稍趩喂倌躊EG例如64存在下，用二異丙基碳二亞胺活化該酸，得到具有較高分子量的65結(jié)合物，或在雙官能化PEG例如化合物66的存在下，得到二價PEG-結(jié)合物67。可用TFA處理化合物67，得到活性化合物68。
再看圖11，其為說明合成多價PEG-結(jié)合物的方法?？墒苟?Boc-保護的賴氨酸的羥基琥珀酰亞胺酯69與雙官能化PEG例如66偶合，其用TFA處理，得到四價PEG類70?？捎迷噭├缏燃姿釋ο趸锦ズ桶穳A將中間體45轉(zhuǎn)化為活性氨基甲酸酯[J.Med.Chem.38，3236-3245(1995)]。在DIEA的存在下，可使該活化氨基甲酸酯與70反應(yīng)，得到四價PEG-藥物結(jié)合物，其用TFA處理，得到活性四價PEG-藥物結(jié)合物71。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法制備本發(fā)明化合物和結(jié)合物?？赏ㄟ^例如下述方法或技術(shù)人員意識到的其改進方法合成化合物。與本發(fā)明有關(guān)的所有公開方法可在任何規(guī)模包括毫克、克、克數(shù)量級、公斤、公斤數(shù)量級或商用工業(yè)規(guī)模水平上操作。
用于本發(fā)明方法的化合物可具有一種或多種不對稱取代的碳原子，并可分離為旋光或外消旋體。因此，除具體說明的具體的立體化學(xué)或異構(gòu)體外，包括結(jié)構(gòu)的所有手性、非對映體、外消旋體和所有幾何異構(gòu)體。在本領(lǐng)域中已熟知如何制備和分離旋光體。例如，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不限于拆分外消旋體；正、反相和手性色譜；選擇性鹽形成；重結(jié)晶等或通過由手性原料或通過有方向性合成目標(biāo)手性中心分離立體異構(gòu)體混合物。
容易理解，存在的官能團在合成過程中可具有保護基團。已知保護基團是可選擇性連接到官能團(例如羥基和羧基)或從所述官能團中除去的化學(xué)官能團。這些基團存在于化合物中以提供對化合物暴露的化學(xué)反應(yīng)條件呈惰性的這種官能團。多種保護基團中的任何基團可用于本發(fā)明。優(yōu)選的保護基團包括芐氧基羰基和叔丁氧基羰基?？捎糜诒景l(fā)明的其它優(yōu)選的保護基團可在Greene，T.W.和Wuts，P.G.M.，Protective Groups in Organic Synthesis第2版，Wiley & Sons，1991中闡述。
定義當(dāng)任何變量在任何取代基或在任何式中出現(xiàn)一次以上時，其在每次出現(xiàn)時的定義獨立于其在另一次出現(xiàn)時的定義。因此，例如如果一個基團或多個基團被0-2個Q取代時，那么所述基團可任選被最高達兩個Q取代，而且在每個基團中每次出現(xiàn)的Q獨立選自可能的Q的定義目錄。如果此類組合生成穩(wěn)定的化合物，才允許取代基和/或變量的組合。當(dāng)出現(xiàn)取代基的鍵穿越環(huán)中連接兩個原子的鍵時，那么這種取代基可與環(huán)上的任何原子結(jié)合。
“在生理條件下基本上不水解”是指通常在人體內(nèi)存在的條件。此類鍵包括酰胺、脲、碳-碳、氨基甲酸酯、醚、硫醚、硫脲、硫代酰胺、胺、肟、酰肼和酮。
本文中使用的短語“藥學(xué)上可接受的”是指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適用于與人和動物組織接觸，無過多毒性、刺激、過敏反應(yīng)和其它問題或并發(fā)癥，與合理的利益/風(fēng)險比相稱的那些化合物、物質(zhì)、組合物和/或劑型。
本文中使用的“藥學(xué)上可接受的鹽”是指通過制備酸或堿鹽修飾本公開化合物的衍生物。適宜的鹽的目錄可在Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1985，第1418頁中找到，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
緩沖液包括例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、磺基水楊酸和乙酸鹽緩沖液。更完整的目錄可在United States Pharmacopoeia中找到，其公開內(nèi)容通過引用全文結(jié)合到本文中。
縮寫PEG聚乙二醇TFA三氟乙酸Et3N 三乙胺THF四氫呋喃EtOAc 乙酸乙酯rt 室溫NaOH 氫氧化鈉MgSO4硫酸鎂DCM二氯甲烷CH2Cl2二氯甲烷NaHCO3碳酸氫鈉MeOH 甲醇TLC薄層層析AcOH 乙酸H2O 水SiO2二氧化硅ESI-MS 電噴霧離子化質(zhì)譜Boc叔丁氧基羰基DIC二異丙基碳二亞胺1HNMR 質(zhì)子核磁共振CDCl3氘氯仿h 小時MW 分子量
mL 毫升MeOD氘甲醇mg 毫克g 克μL 微升min 分鐘HPLC高效液相色譜mmol毫摩爾mol 摩爾DIEA二異丙基乙胺EtOAc 乙酸乙酯NH4Cl 氯化銨EtOH乙醇Na2CO3碳酸鈉PTLC制備型薄層色譜Et2O 乙醚RP-HPLC 反相高效液相色譜DMAP4-二甲氨基吡啶HBTUO-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽HOBT1-羥基苯并三唑水合物EDC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽HATUO-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N，′-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽TBTU2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽PyBOP 苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-磷鎓六氟磷酸鹽DPPA二苯磷?；B氮化物DIPC2-二甲氨基異丙基氯鹽酸鹽Ms-Cl 甲磺酰氯
NaOH氫氧化鈉Teoc三甲基甲硅烷基乙氧基羰基DMSO二甲基亞砜H2SO4硫酸HNO3硝酸HCl 鹽酸aq 水溶液Hex 己烷CH3CN 己腈KNO3硝酸鉀Pd(PPh3)4四(三苯基膦)合鈀(O)LCMS液相色譜質(zhì)譜K2CO3碳酸鉀PEG 20K 20,000道爾頓聚乙二醇TBAF氟化四丁銨DTNB5，5′-二硫二(2-硝基苯甲酸)CD3OD 氘甲醇PG 保護基團LG、LG1、LG2離去基團再用以下實施例說明本發(fā)明。
實施例實施例1N-(mPEG20k)-11-[3’-(5-氨基甲亞氨?；?Carbamimidoyl)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鵠-十一烷酰胺二(三氟乙酸)鹽 a)8-甲基-1H-苯并[d][1，3]嗪-2，4-二酮 在30分鐘內(nèi)，向2-氨基-3-甲基苯甲酸(9.07g，60mmol)的THF(60mL)溶液中同時加入二異丙基乙胺(20.9mL)和三光氣(5.94g，20mmol)的二氯甲烷(60mL)的溶液。加入結(jié)束后，在室溫下攪拌混合物16小時。過濾固體，用乙醚(2×100mL)和H2O(3×50mL)洗滌，高真空下干燥，得到標(biāo)題化合物(10.02g，94％收率)，為白色固體。1H NMR(DMSO)δ11.02(s，1H)，7.76(d，1H，J＝7.7Hz)，7.57(d，1H，J＝7.5Hz)，7.17-7.13(m，1H)，2.32(s，3H)。
b)8-甲基-6-硝基-1H-苯并[d][1，3]嗪-2，4-二酮
在冰水浴中，在5分鐘內(nèi)，向盛有8-甲基-1H-苯并[d][1，3]嗪-2，4-二酮((實施例1步驟a)9.27g，52.4mmol)的燒瓶中加入濃H2SO4(90mL)。攪拌10分鐘后，在15分鐘內(nèi)，加入發(fā)煙HNO3(2.9mL)。在冰水浴中再攪拌反應(yīng)混合物30分鐘，在室溫下攪拌30分鐘，然后在攪拌下緩慢傾入冰中。收集固體，用H2O(3×50mL)洗滌，高真空下干燥，得到標(biāo)題化合物(10.4g，89％收率)，為黃色固體。
1H NMR(DMSO-d6)δ11.65(br s，1H)，8.46-8.43(m，2H)，2.44(s，3H)。
c)2-氨基-3-甲基-5-硝基-苯甲酸甲酯 向8-甲基-6-硝基-1H-苯并[d][1，3]嗪-2，4-二酮((實施例1步驟b)1.04g，4.68mmol)的甲醇(30mL)的懸浮液中加入甲醇鈉(0.5M，0.94mL，4.7mmol)的甲醇溶液。在室溫下攪拌混合物1小時，加入飽和NH4Cl中和該混合物。減壓除去甲醇，過濾得到的混合物。固體用H2O洗滌(兩次)，高真空下干燥，得到產(chǎn)物(0.97g，99％收率)，為黃色固體。
1H NMR(DMSO d6)δ8.48(d，1H，J＝2.7Hz)，8.02-8.01(m，1H)，7.75(br s，2H)，3.86(s，3H)，2.20(s，3H)。
d)2-溴-3-甲基-5-硝基-苯甲酸甲酯 在室溫下，向盛有溴化銅(II)(7.40g，33.1mmol)的燒瓶中加入亞硝酸叔丁酯(4.50mL，37.9mmol)的MeCN(30mL)溶液。攪拌5分鐘后，加入2-氨基-3-甲基-5-硝基-苯甲酸甲酯((實施例1步驟c)4.97g，23.7mmol)的MeCN(50mL)懸浮液。在室溫下攪拌該混合物15分鐘，在65℃下攪拌20分鐘，然后冷卻回到室溫。過濾反應(yīng)物，濃縮濾液，得到深棕色固體。該固體用己烷研磨，過濾，用己烷(4×50mL)洗滌。合并所有的己烷層，濃縮，得到標(biāo)題產(chǎn)物(5.7g，88％收率)，為淺黃色固體。
1H NMR(CDCl3)δ8.35(d，1H，J＝2.5Hz)，8.21(d，1H，J＝2.9Hz)，3.99(s，3H)，2.59(s，3H)。
e)2-溴-3-甲基-5-硝基-苯甲酸 于室溫下，向2-溴-3-甲基-5-硝基-苯甲酸甲酯((實施例1步驟d)5.04g)的乙醇(50mL)的溶液中加入NaOH水溶液(4M，10.1mL，40.5mmol)，攪拌16h。濃縮得到的紅色溶液至干，使其溶于極少量的H2O中，用1N HCl酸化至pH 3-4。過濾固體，用H2O(3×50mL)洗滌，高真空下干燥，得到標(biāo)題化合物(4.5g，94％收率)，為淺黃色固體。
1H NMR(DMSO)δ8.36-8.35(m，1H)，8.24-8.23(m，1H)，2.53(s，3H)。
f)(2-溴-3-甲基-5-硝基-苯基)-氨基甲酸叔丁基酯 在室溫下，攪拌下，將二苯磷酰基疊氮化物(453μL，2.1mmol)加入2-溴-3-甲基-5-硝基-苯甲酸((實施例1步驟e)520mg，2mmol)和三乙胺(1.4mL，2.1mmol)的叔丁醇(25mL)溶液中。15分鐘后，將反應(yīng)物加熱至80℃，保持16h。加入EtOAc(100mL)，溶液用檸檬酸(3×30mL)、NaHCO3(2×30mL)和鹽水(50mL)溶液萃取。經(jīng)柱層析純化，得到標(biāo)題化合物，為白色固體。
1H NMR(CDCl3)δ8.93(d，1H，J＝2.6Hz)，7.77(app dd，1H，J＝0.7，2.8Hz)，7.26(brs，1H)，2.51(s，3H)，1.55(s，9H)。
g)2-溴-3-甲基-5-硝基-苯胺 將2-溴-3-甲基-5-硝基-苯基)-氨基甲酸叔丁酯((實施例1步驟f)435mg，1.32mmol)溶于10mL 1∶1的三氟乙酸和DCM的混合物中(10mL總量)。攪拌1h后，真空除去溶劑，得到黃色固體殘留物(306mg)，使用時無須純化。
1H NMR(CDCl3)δ7.46(d，1H，J＝2.8Hz)，7.42(d，1H J＝2.8Hz)，6.62(br s，2H)，2.42(s，3H)。
h){[4-(6′-氨基-2′-甲基-4′-硝基-聯(lián)苯基-3-磺?；?-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯 向配備攪拌棒的燒瓶中加入{[4-(3-二羥基硼烷基-苯磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯(美國專利臨時申請60/383130(752mg，1.65mmol)、2-溴-3-甲基-5-硝基-苯胺((實施例1步驟g)306mg，1.32mmol)、Na2CO3水溶液(2M，4mL，8mmol)、乙醇(4mL)和甲苯(8mL)。向溶液中充入氬氣持續(xù)10min，加入Pd(PPh3)4(294mg，0.25mmol)。在惰性氣氛下，在80℃下，劇烈攪拌該兩相溶液16h，然后冷卻至室溫。加入EtOAc(40mL)和水(20mL)，分離各層。有機層用飽和NaHCO3(2×20mL)、鹽水(20mL)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥。真空除去溶劑，隨后殘留物通過柱層析(10-40％EtOAc/己烷)純化，得到標(biāo)題化合物(245mg，33％)，為黃色固體。
1H-NMR(CDCl3)δ8.03(ddd，1H，J＝1.2，2.1，8.1Hz)，7.91(s，1H)，7.90(t，1H，J＝1.6Hz)，7.69(t，1H，J＝7.9Hz)，7.53(app dd，1H，J＝0.7，2.3Hz)，7.50(dt，1H，J＝1.4，7.7Hz)，7.44(app dd，1H，J＝0.5，2.3Hz)，3.70(s，2H)，2.59(s，3H)，2.00(s，3H)，1.51(s，9H).
i)11-{4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲酸基}-十一烷酸甲酯 將三乙胺(139μL，1mmol)加入{[4-(6′-氨基-2′-甲基-4′-硝基-聯(lián)苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯((實施例1步驟h)118mg，0.21mmol)的DCM(10mL)溶液中。在5min內(nèi)，滴加11-氯羰基-十一烷酸甲酯(73mg，0.26mmol)。攪拌30分鐘后，反應(yīng)不完全。按同樣方法另外分次加入酰氯(3×1當(dāng)量)，直至反應(yīng)完全。加入EtOAc(40mL)，隨后用NaHCO3(2×20mL)和鹽水(30mL)進行水溶液后處理，得到粗酰胺(206mg)，為玻璃狀物。將殘留物溶于EtOH(5mL)，加入4M NH4Cl水溶液(1mL)。加入鐵粉(165mg，3mmol)，在75℃下加熱反應(yīng)物1h。通過0.22μm濾器過濾該冷卻的混合物，固體用5mL/份的MeOH和EtOAc分別洗滌。再加入EtOAc(80mL)，有機溶液用檸檬酸(2×20mL)、NaHCO3(2×30mL)、水(30mL)和鹽水(50mL)洗滌。濃縮溶液，干燥，得到標(biāo)題化合物(165mg)，其使用時無須純化。
ESI-MS(m/z)理論值C37H50N4O7S3(M+H)759.3；實測值759.4。
j)11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-4-(N，N-二-(叔丁氧基羰基氨基))胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基}-十一烷酸 將氫氧化鈉(1M，1mL)加入11-{4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-十一烷酸甲酯((實施例1步驟i)122mg，0.16mmol)的MeOH(10mL)溶液中。在室溫下攪拌溶液18h，用溶液AcOH(500μL)猝滅，真空除去溶劑。將殘留物溶于MeOH(10mL)、AcOH(500μL)中，加入N，N-二(叔丁氧基羰基)-S-甲基-異硫脲(145mg，0.5mmol)。將溶液在40℃下攪拌16h，真空除去溶劑。將殘余物在EtOAc(50mL)和水(20mL)之間分配，有機層用鹽水(20mL)洗滌。濃縮溶液，干燥，得到殘留物，使其經(jīng)SiO2(6∶4的Hex/EtOAc，然后25∶75∶5的Hex/EtOAc/MeOH)層析。殘留物進一步通過RP-HPLC(C-18柱，CH3CN/H2O)純化，得到115mg產(chǎn)物)。
1H-NMR(CD3OD)δ8.16(s，1H)，8.01(ddd，1H，J＝1.2，1.9，7.9Hz)，7.87(t，1H，J＝1.6Hz)，7.65(t，1H，J＝7.9Hz)，7.53(m，1H)，7.50(dt，1H，J＝1.4，7.7Hz)，7.39(m，1H)，2.66(s，3H)，2.29(t，2H，J＝7.4Hz)，2.05(s，3H)，1.93(m，2H)，1.61(m，2H)，1.53(s，18H)，1.49(s，9H)，1.0-1.40(m，12H)，0.94(m，2H).
k)N-(mPEG20k)-11-[3’-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鵠-十一烷酰胺二(三氟乙酸鹽) 將二異丙基碳二亞胺(0.2M的DCM溶液，15μL)滴加到11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N-二-(叔丁氧基羰基氨基))胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基}-十一烷酸((實施例1步驟j)30mg，0.03mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(4.6mg，0.038mmol)的DCM(15mL)溶液中。在室溫下攪拌溶液15min，加入mPEG20k-NH2(327mg，0.015mmol)。在室溫下攪拌溶液18h(4h后茚三酮反應(yīng)陰性)。加入DCM(10mL)和MeOH(1mL)，隨后緩慢加入Et2O(～100mL)。冷卻溶液，使沉淀完全，過濾收集固體。將一部分固體(127mg)干燥，再溶于1∶1的TFA/DCM。攪拌2h后，真空除去溶劑，高真空下干燥。HPLC純化(C18柱，10-55％CH3CN/H2O洗脫30min)，得到104mg純PEG化的-化合物。
1H-NMR PEG在δ3.62(CDCl3)抑制峰形δ9.20(s，1H)，8.5-9.0(H2O峰)，8.37(s，1H)，8.22(s，1H)，8.07(d，1H，J＝7.7Hz)，7.77(s，1H)，7.65(t，1H，J＝7.7Hz)，7.53(d，1H，J＝7.2Hz)，7.41(s，1H)，7.05(s，1H)，7.00(s，3H)，3.82(m，PEG伴線(satellite))，3.62(m，PEG亞甲基)，3.47(m，PEG伴線)，3.39(s，3H，PEG-OMe末端)，2.65(s，3H)，2.26(t，2H，J＝7.2Hz)，2.05(s，3H)，2.04(m，1H)，1.93(m，1H)，1.62(m，2H)，1.02-1.38(m，12H)，0.95(m，2H)。
實施例2N-(mPEG20k)-6-{3-[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-己酰胺二(三氟乙酸)鹽 a)4-溴-5-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯 在室溫下，將4-溴-3-甲基苯甲酸甲酯(10.13g，44mmol)溶于H2SO4120mL和TFA(15mL)的混合物中。將該溶液在冰浴上冷卻，在30min內(nèi)，分批加入KNO3(4.65g，46mmol)，在環(huán)境溫度下攪拌混合物4小時，期間其升溫至室溫。TLC分析(少量水溶液后處理后)表明原料全部消失(30％EtOAc/Hex)。將溶液傾入冰上，水相淤漿用EtOAc(3×150mL)萃取。有機層用5％Na2CO3(3×75mL)、NaHCO3(3×50mL)、水(2×100mL)、鹽水(100mL)洗滌，然后經(jīng)硫酸鈉干燥。濃縮溶液，得到微黃色固體/凝膠物質(zhì)(11.6g)，TLC表明其為一個點。1H NMR分析表明為比例～2∶1的兩個主要產(chǎn)物，對應(yīng)于鄰-和間-硝基苯甲酸酯衍生物。該物質(zhì)無須純化即可進入下一步反應(yīng)。
b)4-溴-5-甲基-3-硝基苯甲酸 在室溫下，將4-溴-5-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯(實施例2步驟a(11.6g，42.3mmol))溶于MeOH(400mL)，在30min內(nèi)，經(jīng)加料漏斗滴加2N NaOH(43mL)。攪拌溶液12h，期間出現(xiàn)沉淀，而原料消失(TLC表明在30％EtOAc中僅有基線斑點)。用濃HCl將pH調(diào)至～2，真空除去甲醇。將EtOAc(300mL)加入水相淤漿，分離各層。水層用EtOAc(2×50mL)萃取，然后棄去。經(jīng)TLC(40％EtOAc/己烷，4％AcOH)分析表明合并的有機萃取液含有兩個產(chǎn)物。合并的有機萃取液用3∶1的0.5N NaH2PO4/0.5N NaOAc(～30×50mL分批)溶液洗滌，直至完全除去鄰-硝基苯甲酸(在TLC上的低斑點，40％EtOAc/Hex，4％AcOH)。然后用鹽水洗滌有機層，經(jīng)硫酸鈉干燥。濃縮溶液，得到5.4g(47％)白色固體。1H NMR(CD3OD)δ8.10(m，2H)，2.54(s，3H)。
c)4-溴-3-甲基-5-硝基-苯基)-氨基甲酸2-三甲基硅烷基乙基酯 在室溫下，攪拌下，將二苯磷酰基疊氮化物(4.31mL，20mmol)加入2-溴-3-甲基-5-硝基-苯甲酸(實施例2步驟b(5.2g，20mmol))和二異丙基乙胺(3.66mL，21mmol)的1，4-二烷(80mL)溶液中。在室溫下30分鐘后，加熱反應(yīng)物至90℃，保持5min。加入三甲基甲硅烷基乙醇(5.73mL，40mmol)，在95℃下，攪拌該溶液16h。真空除去溶劑，使殘留物在EtOAc(100mL)和水(30mL)之間分配。有機層進一步用檸檬酸水溶液(3×30mL)、NaHCO3(2×30mL)和鹽水(50mL)洗滌。經(jīng)柱層析(9∶1 Hex/EtOAc)純化，得到標(biāo)題化合物(4.1g)，為黃色固體。1H NMR(CDCl3)δ7.73(d，1H，J＝2.4Hz)，7.41(br d，1H，J＝1.7Hz)，7.01(s，1H)，4.24(m，2H)，2.43(s，3H)，1.02(m，2H)，0.04(s，9H)。
d)(3-氨基-4-溴-5-甲基-苯基)-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯 將鐵粉(6.1g，109mmol)加入(4-溴-3-甲基-5-硝基-苯基)-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯(實施例2步驟c(4.1g，10.9mmol))和NH4Cl(5.84g，109mmol)的EtOH(27mL)和水(54mL)懸浮液中。在85℃下加熱反應(yīng)物14h。使冷卻的混合物通過硅藻土過濾，固體用1∶1的EtOAc/MeOH(200mL)洗滌。真空濃縮濾液，使殘留物在EtOAc(100mL)和H2O(30mL)之間分配。有機溶液用水(30mL)和鹽水(50mL)洗滌。濃縮溶液，干燥，得到該苯胺(3.24g，86％)，為棕色固體，其使用時無須進一步純化。1H NMR(CDCl3)δ6.96(s，1H)，6.54(s，1H)，6.39(s，1H)，4.26(m，2H)，4.16(s，2H)，2.35(s，3H)，1.06(m，2H)，0.08(s，9H)。
e)[3-氨基-5-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧雜硼雜戊環(huán)(dioxaborolan)-2-基)-苯基]-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯 將乙酸鈀(106mg，0.47mmol)、2-(二環(huán)己基膦基)聯(lián)苯(658mg，1.88mmol)、(3-氨基-4-溴-5-甲基-苯基)-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯((實施例2步驟d)3.24g，9.38mmol)合并到燒瓶中，置于氬氣氛下。加入對-二烷(40mL)，隨后加入三乙胺(5.23mL，38mmol)和頻哪醇硼烷(pinacolborane)(4.08mL，28mmol)。在80℃下攪拌溶液1h，期間出現(xiàn)ppt。真空除去溶劑，使殘留物在EtOAc(100mL)和NH4Cl水溶液(50mL)之間分配。再用NH4Cl(2×30mL)、NaHCO3(30mL)和鹽水(50mL)洗滌有機層。干燥(MgSO4)有機層，真空濃縮，殘留物經(jīng)SiO2柱層析(8∶2的Hex/EtOAc)純化，得到產(chǎn)物(2.44g，66％)，為棕色固體。1H NMR(CDCl3)δ6.77(s，1H)，6.38(s，1H)，6.28(d，1H，J＝1.9Hz)，4.91(s，2H)，4.23(m，2H)，2.42(s，3H)，1.32(s，12H)，1.03(m，2H)，0.05(s，9H)。
f){6-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-2-甲基-聯(lián)苯-4-基}-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯
向配備攪拌棒的燒瓶中加入[3-氨基-5-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧雜硼雜戊環(huán)-2-基)-苯基]-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯(實施例2步驟e(2.34g，5.96mmol))、{[4-(3-溴-苯磺?；?-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯((美國專利臨時申請60/383130(2.93g，5.96mmol)、Na2CO3水溶液(2M，11.9mL，23.8mmol)、乙醇(12mL)和甲苯(24mL)。向溶液中充入氬氣持續(xù)10min，加入Pd(PPh3)4(689mg，0.6mmol)。在惰性氣氛下，在80℃下，劇烈攪拌該兩相溶液16h，然后冷卻至室溫。加入EtOAc(80mL)和水(20mL)，分離各層。有機層用飽和NaHCO3(2×20mL)、鹽水(20mL)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥。真空除去溶劑，隨后使殘留物通過柱層析(85∶15的DCM/EtOAc)純化，得到標(biāo)題化合物(2.24g，55％)，為淺棕色固體。
1H-NMR(CDCl3)δ7.98(ddd，1H，J＝1.3，1.9，7.8Hz)，7.89(m，2H)，7.61(t，1H，J＝7.7Hz)，7.5(dt，1H，J＝1.3，7.7Hz)，6.88(s，1H)，6.55(d，1H，J＝1.7Hz)，6.47(s，1H)，4.26(m，2H)，3.42(s，2H)，2.56(s，3H)，1.9(s，3H)，1.52(s，9H)，1.06(m，2H)，0.08(s，9H).
g)6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-己酸乙酯 在室溫下，用6-異氰酸基(isocyanato)-己酸乙酯(5.30μL，0.030mmol)處理{2-氨基-3′-[5-(亞氨基-甲氧基羰基氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-4-基}-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯((實施例2步驟f)0.020g，0.030mmol)的無水CH2Cl2(3mL)溶液，攪拌40min。反應(yīng)混合物用CH2Cl2稀釋，用水(1×15mL)洗滌。有機層經(jīng)MgSO4干燥，真空濃縮，得到產(chǎn)物6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-己酸乙酯(0.025g，98％)，為灰白色固體。
1H NMR(CD3OD)δ8.22(s，1H)，8.06(d，1H，J＝8.0Hz)，7.92(t，1H，J＝1.6Hz)，7.72(t，1H，J＝8.0Hz)，7.65(d，1H，J＝1.6Hz)，7.56(d，1H，J＝7.6Hz)，7.28(s，1H)，4.29(m，2H)，3.06-3.00(m，2H)，2.70(s，3H)，2.33(t，2H，J＝7.2Hz)，2.01(s，3H)，1.60(quint，2H，J＝7.2Hz)，1.54(s，9H)，1.40-1.36(t，2H)，1.12(m，2H)，1.28(t，3H，J＝7.2Hz)，0.09(s，9H).
ESI-MS(m/z)理論值C39H55N5O9S3Si(M+H)862.3；實測值861.9。
h)6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-己酸 在室溫下，用固體LiOH(0.097g，4.06mmol)處理6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-己酸乙酯((實施例2步驟g)0.437g，0.507mmol)的THF∶水(2∶1，15mL)溶液，攪拌18.5h。真空除去THF，用冰乙酸將殘余水溶液酸化至pH 5。溶液用CH2Cl2(3×50mL)萃取。合并的有機層經(jīng)MgSO4干燥，真空濃縮，得到產(chǎn)物6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-己酸-(0.4222g，99％)，為灰白色固體。ESI-MS(m/z)理論值C37H51N5O9S3Si(M+H)834.3；實測值834.2。
i)6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N-二-(叔丁氧基羰基氨基))胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基}-脲基)-己酸 用氟化四丁銨(1M的THF溶液，3.39mL，3.39mmol)處理6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-己酸((實施例2步驟h)0.422g，0.506mmol)的無水THF(20mL)溶液，在40℃下攪拌4h。真空蒸發(fā)溶劑。將殘留物溶于CH2Cl2中，用水(4×50mL)洗滌。有機層經(jīng)MgSO4干燥，真空濃縮。經(jīng)硅膠層析(4％MeOH/CH2Cl2)純化，得到產(chǎn)物6-(3-{4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-聯(lián)苯-2-基}-脲基)-己酸(0.200g，57％)，為灰白色固體。將該物質(zhì)與1，3-二(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-假硫脲(0.252g，0.870mmol)和乙酸(0.5mL)的MeOH(10mL)溶液合并，在40℃下攪拌2h。真空蒸發(fā)溶劑。經(jīng)硅膠層析(4％MeOH/CH2Cl2，然后～10％MeOH/CH2Cl2)純化，得到標(biāo)題化合物(0.215g，80％)，為白色固體。
1H-NMR(CD3OD)δ8.22(s，1H)，8.06(m，1H)，7.89(m，1H)，7.72(m，1H)，7.69(m，1H)，7.53(m，1H)，7.32(m，1H)，3.01(m，2H)，2.66(s，3H)，2.27(t，2H，7.4Hz)，1.97(s，3H)，1.57(m，2H)，1.54(s，18H)，1.51(s，9H)，1.37(m，2H)，1.27(m，2H).
j)N-(mPEG20k)-6-{3-[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺?；?-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-己酰胺二(三氟乙酸)鹽 在0℃下，將二異丙基碳二亞胺(0.2M的DCM溶液，1.125mL)滴加到6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基}-脲基)-己酸(實施例2步驟i(210mg，0.23mmol))和N，N-二甲氨基吡啶(32mg，0.26mmol)的DCM(23mL)溶液中。在0℃下攪拌溶液30min，加入mPEG20k-NH2(3.25g，0.15mmol)。將溶液升溫至室溫，攪拌6h(在TLC上茚三酮反應(yīng)陰性)。加入DCM(10mL)，隨后緩慢加入Et2O，誘導(dǎo)緩慢沉淀。再加入少量乙醚以確保全部沉淀，過濾收集固體，用DCM/Et2O洗滌，得到～3.3g粗PEG化的-化合物。將該固體物質(zhì)再溶于20％MeOH/DCM，緩慢加入Et2O，誘導(dǎo)沉淀。過濾收集固體，高真空下干燥固體濾餅。HPLC分析該“粗”物質(zhì)表明純度～98％，不含小分子原料雜質(zhì)(根據(jù)濾液HPLC分析)。將干PEG化的化合物再溶于DCM(8mL)，加入H2O(0.1mL)，隨后加入TFA(8mL)。攪拌1.5h后，加入MeOH(4mL)，隨后緩慢加入Et2O，誘導(dǎo)逐步沉淀。使部分該物質(zhì)經(jīng)歷HPLC(C18柱，10-55％CH3CN/H2O(0.1％TFA)洗脫30min)純化，得到120mg PEG化的-化合物。兩批PEG(HPLC純化的與僅沉淀的)相同1H-NMR分析和分析型HPLC表明兩者之間的純度差異＜0.5％。測得PEG化的-化合物沉淀的純度＞99.2％(HPLC，λ＝214，254)，其中所含的單一雜質(zhì)不超過總面積的0.3％。1H-NMR(CDCl3/CD3OD)(PEG在δ3.62抑制峰形)δ8.24(s，1H)，8.03(ddd，1H，J＝1.2，1.9，7.9Hz)，7.82(t，1H，J＝1.2Hz)，7.69(t，1H，J＝7.7Hz)，7. 58(d，1H，J＝1.9Hz)7.49(dt，1H，J＝1.3，7.9Hz)，6.88(d，1H，J＝1.9Hz)，4.22(s，DOH)，3.81(m，PEG伴線)，3.62(m，PEG亞甲基)，3.45(m，PEG伴線)，3.36(s，3H，PEG-OMe端基)，3.03(t，1H，J＝6.7Hz)2.67(s，3H)，2.15(t，2H，J＝7.4Hz)，1.97(s，3H)，1.55(m，2H)，1.37(m，2H)，1.22(m，2H)。
實施例3N-(mPEG20k)-11-[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺?；?-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鵠-十一酰胺三氟乙酸鹽 a)11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基}-十一酸乙酯 在室溫下，將11-氯羰基-十一烷酸乙酯(0.08g，0.29mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液滴加到{[4-(2′-氨基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺?；?-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯(美國專利臨時申請60/383130(0.10g，0.19mmol))和三乙胺(0.04mL，0.29mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中，攪拌1小時。然后蒸發(fā)反應(yīng)混合物，使粗混合物經(jīng)柱層析(己烷∶乙酸乙酯(2∶1))純化，得到0.060g 11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-十一烷酸乙酯。
1H NMR(CDCl3)δ7.99(d，1H，J＝8.4Hz)，7.95(s，1H)，7.86(s，1H)，7.67(d，1H，J＝7.2Hz)，7.61(t，1H，J＝7.2Hz)，7.44(d，1H，J＝8.0Hz)，7.33(t，1H，J＝7.2Hz)，7.16(d，1H，J＝7.6Hz)，6.69(s，1H)，6.60-6.40(bs，1H)，4.12(q，2H，J＝6.4Hz)，2.60(s，3H)，2.31(t，2H，J＝7.6Hz)，2.05-1.93(m，5H)，1.62(m，4H)，1.52(s，9H)，1.32-1.03(m，15H).
質(zhì)譜(LCMS，ESI)理論值C38H51N3O7S3757.29(M+1)；實測值757.92。
b)11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-十一烷酸 在室溫下，將1M氫氧化鈉溶液(0.24mL)滴加到11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-十一烷酸乙酯(實施例3步驟a(0.06g，0.08mmol))的甲醇(1mL)溶液中，保持幾小時。然后蒸發(fā)反應(yīng)混合物，滴加1N HCl直至pH為1。產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，經(jīng)硫酸鈉干燥，真空蒸發(fā)，得到0.05g 11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基}-十一烷酸。
1H NMR(CDCl3)δ7.99(d，1H，J＝8.4Hz)，7.95(s，1H)，7.89(s，1H)，7.68(d，1H，J＝8.4Hz)，7.62(t，1H，J＝7.6Hz)，7.45(d，1H，J＝8.0Hz)，7.33(t，1H，J＝6.8Hz)，7.16(d，1H，J＝6.8Hz)，6.71(s，1H)，2.60(s，3H)，2.37(t，2H，J＝6.8Hz)，2.03(s，3H)，2.05-1.94(m，2H)，1.64(m，4H)，1.53(s，9H)，1.32-1.04(m，12H).
質(zhì)譜(LCMS，ESI)C36H47N3O7S3理論值729.26(M+1)；實測值729.90。
c)N-(mPEG20k)-11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-十一酰胺 在室溫下，將二異丙基碳二亞胺(0.005g，0.0411mmol)滴加至11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-十一烷酸((實施例3步驟b)0.030g，0.0411mmol)和二甲氨基吡啶(0.008g，0.0616mmol)的二氯甲烷(4.0mL)溶液中，攪拌10分鐘。將mPEG20K-NH2(0.412g，0.0206mmol)溶于極少量的二氯甲烷，將其滴加到反應(yīng)物中，攪拌過夜。然后蒸發(fā)反應(yīng)混合物，使產(chǎn)物在異丙醇中重結(jié)晶兩次，隨后經(jīng)反相HPLC(己腈/水(0.1％TFA)純化，得到0.370g PEG-產(chǎn)物。
1H NMR(CDCl3)δ8.13(s，1H)，7.97(m，2H)，7.71(d，1H，J＝7.2Hz)，7.62(t，1H，J＝8.0Hz)，7.46(d，1H，J＝7.6Hz)，7.31(t， 1H，J＝7.6Hz)，7.13(d，1H，J＝7.2Hz)，6.98(s，1H)，6.25(s，1H)，2.59(s，3H)，2.30(m，2H)，2.02(s，3H)，2.07-1.97(m，2H)，1.64(m，4H)，1.53(s，9H)，1.36-1.06(m，12H).
d)N-(mPEG20k)-11-[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺?；?-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基]-十一酰胺三氟乙酸鹽 將三氟乙酸(3.0mL)滴加到N-(mPEG20k)-11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基}-十一酰胺(實施例3步驟c(0.370g，0.018mmol))的二氯甲烷(3.0mL)溶液中，攪拌1小時。然后蒸發(fā)反應(yīng)物，經(jīng)反相HPLC純化，得到0.200g PEG-產(chǎn)物，為三氟乙酸鹽。1H NMR(PEG在δ3.62抑制峰形)(CDCl3)δ10.1(s，2H)，8.65(s，1H)，8.20(s，1H)，7.93(d，1H，J＝8.0Hz)，7.89(s，1H)，7.55(t，1H，J＝7.6Hz)，7.47(d，1H，J＝8.0Hz)，7.42(d，1H，J＝8.0Hz)，7.25(t，1H，J＝7.6Hz)，7.10(d，1H，J＝7.6Hz)，6.36(s，1H)，2.58(s，3H)，2.12(m，2H)，1.99(s，3H)，1.98-1.92(m，2H)，1.55(m，4H)，1.26-0.95(m，12H).
實施例4N-(mPEG20k)-4-(5-{3-[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺?；?-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酰胺二(三氟乙酸鹽)
a)4-[5-(1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-戊氧基]-苯甲酸甲酯 將4-羥基-苯甲酸甲酯(3.01g，19.8mmol)、2-(5-溴-戊基)-異吲哚-1，3-二酮(3.9g，13.2mmol)和K2CO3(1.82g，13.2mmol)在丙酮(150mL)中的混合物加熱至回流24h。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，真空除去溶劑。該粗產(chǎn)物用EtOAc稀釋，用1N NaOH和鹽水洗滌。有機層經(jīng)硫酸鈉干燥。真空除去溶劑。使粗產(chǎn)物在EtOAc中重結(jié)晶，得到標(biāo)題化合物，為白色固體(4g，83％)。
1H-NMR(CDCl3)δ7.95-7.98(m，2H)，7.83-7.86(m，2H)，7.70-7.73(m，2H)，6.86-6.89(m，2H)，4.00(t，2H，J＝6.22Hz)，3.88(s，3H)，3.73(t，2H，J＝7.29Hz)，1.82-1.89(m，2H)，1.73-1.81(m，2H)，1.50-1.57(m，2H).
b)4-(5-氨基-戊氧基)-苯甲酸甲酯 將4-[5-(1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-戊氧基]-苯甲酸甲酯(1g，2.72mmol，實施例4步驟a)和肼(98.4μL，3.13mmol)的MeOH∶H2O(10mL，4∶1)懸浮液加熱至65℃，保持2h。在室溫下，將另外的肼(171μL，5.44mmol)加入到反應(yīng)混合物中。將反應(yīng)混合物加熱至70℃，保持2h，然后在室溫下攪拌過夜。將碳酸鉀(30mL，1N水溶液)和二氯甲烷(200mL)加入反應(yīng)物中。有機層經(jīng)硫酸鎂干燥。真空除去溶劑，得到標(biāo)題化合物，為白色固體(500mg，77％)。
1H-NMR(CDCl3)δ7.95-8.00(m，2H)，6.88-6.92(m，2H)，4.02(t，2H，J＝6.43Hz)，3.88(s，3H)，2.71-2.76(m，2H)，1.79-1.86(m，2H)，1.49-1.56(m，4H)。
c)4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸甲酯 在室溫下，將4-硝基苯基氯甲酸酯(99.2mg，0.49mmol)加入到{2-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-4-基}-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯(303mg，0.45mmol，實施例2步驟f)和吡啶(39.8μL 0.49mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物2h。將4-(5-氨基-戊氧基)-苯甲酸甲酯(117mg，0.49mmol，實施例4步驟b)和三乙胺加入反應(yīng)混合物中，在室溫下攪拌2h。反應(yīng)混合物用EtOAc稀釋，用水和鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥。真空除去溶劑，隨后經(jīng)快速層析(50-60％EtOAc/己烷)純化，得到標(biāo)題化合物，為黃色固體(280mg，66.5％)。ESI-MS(m/z)C44H57N5O10S3Si理論值940.3(M+1)；實測值939.9。
d)4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸 在室溫下，將氫氧化鋰(45.8mg，2.08mmol)加入到4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸甲酯((實施例4步驟c)280mg，0.298mmol)的1，4-二烷/水(2∶1，10mL)溶液中，保持2天。真空除去溶劑。殘留物用水稀釋，用乙酸酸化至pH～5，用EtOAc萃取。有機層用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥。真空除去溶劑，得到標(biāo)題化合物，為黃色固體(276mg，100％)。
1H-NMR(CDCl3/CD3OD)δ7.93-7.99(m，3H)，7.83-7.86(m，2H)，7.52-7.59(m，2H)，7.15-7.20(m，2H)，6.85-6.89(m，2H)，4.21-4.26(m，2H)，3.99(t，2H，J＝6.43Hz)，3.13-3.24(m，2H)，2.61(s，3H)，2.02(s，3H)，1.75-1.83(m，2H)，1.43-1.56(m，13H)，1.02-1.08(m，2H)，0.07(s，9H).
e)4-[5-(3-{4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-聯(lián)苯-2-基}-脲基)-戊氧基]-苯甲酸 將氟化四丁銨溶液(2.38mL，1M的THF溶液)加入4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸((實施例4步驟d)276mg，0.298mmol)的THF(10mL)溶液，在35℃下保持2日。真空除去溶劑。將殘留物溶于EtOAc，用水和鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥。真空除去溶劑，得到標(biāo)題化合物，為棕色固體(300mg，100％)。ESI-MS(m/z)C37H44N5O8S3理論值782.2(M+1)；實測值781.8。
f)4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N’N″-二(叔丁氧基羰基)-胍基)-6-甲基-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸 將1，3-二(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-假硫脲(433mg，1.49mmol)加入4-[5-(3-{4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-2-基}-脲基)-戊氧基]-苯甲酸(233mg，0.298mmol，實施例4步驟e)的5％AcOH/MeOH(10mL)溶液中，在35℃下保持2天。真空除去溶劑，殘留物經(jīng)快速層析(1-6％MeOH/二氯甲烷)純化，得到標(biāo)題化合物，為黃色固體(70mg，23％)。
ESI-MS(m/z)C48H61N7O12S3理論值1024.4(M+1)；實測值1024.0。g)N-(mPEG20k)-4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N’，N″-二(丁氧基羰基)-胍基)-6-甲基-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酰胺 按照實施例2步驟j中偶合方法，使用4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-4-(N′，N″-二(叔丁氧基羰基)-胍基)-6-甲基-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸(實施例4步驟f(42.7mg，41.7μmol))、二異丙基碳二亞胺(5.26mg，41.7μmol)、4-(二甲基氨基)吡啶(9.8mg，41.7μmol)和mPEG20k-NH2(673mg，32μmol)的DCM(2mL，無水溶液)。同樣，經(jīng)Et2O沉淀純化，得到標(biāo)題化合物，為白色固體(650mg，92％)。1H-NMR PEG在δ3.62(CDCl3)抑制峰形δ3.62(CDCl3)δ8.03-7.97(m，2H)，7.84-7.76(m，3H)，7.64-7.54(m，1H)，7.46-7.39(m，1H)，7.33-7.31(m，1H)，7.10-7.02(m，2H)，6.87-6.83(m，2H)，4.02-3.96(m，2H)，3.25-3.19(m，2H)，2.63(s，3H)，2.03(s，3H)，1.82-1.75(m，2H)，1.56(s，9H)，1.52(s，9H)，1.49(s，9H)，1.48-1.45(m，4H).
h)N-(mPEG20k)-4-(5-{3-[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺?；?-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酰胺二(三氟乙酸鹽) 按實施例2步驟j，用TFA的DCM溶液處理N-(mPEG20k)-4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N′，N″-二(叔丁氧基羰基)-胍基)-6-甲基-聯(lián)苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酰胺(實施例4步驟g(650mg，29.5μmol))。同樣，用Et2O沉淀并經(jīng)RP-HPLC純化，得到標(biāo)題化合物，為白色固體(268mg，41.3％)。1H-NMR PEG在δ3.59(CDCl3/CD3OD)抑制峰形8.29-8.26(m，1H)，8.05-8.00(m，1H)，7.85-7.82(m，1H)，7.78-7.74(m，2H)，7.71-7.65(m，1H)，7.59-7.55(m，1H)，7.52-7.47(m，1H)，6.92-6.87(m，3H)，4.03-3.97(m，2H)，3.13-3.07(m，2H)，2.67(s，3H)，1.97(s，3H)，1.82-1.75(m，2H)，1.51-1.42(m，4H).
實施例54-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒的mPEG20k2′-脲二(三氟乙酸鹽)
a){[4-(2′，4′-二氨基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯 將{2-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-4-基}-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯(實施例2步驟f(1g，1.48mmol))溶于THF(25mL)。向其中加入TBAF(1M，1.62mL，1.62mmol)，使反應(yīng)物升溫至40℃，攪拌3小時。另加入TBAF(1.48mL，1.48mmol)，在室溫下攪拌反應(yīng)物過夜。真空除去溶劑，將殘留物溶于EtOAc，用水洗滌幾次(5次)。干燥(MgSO4)合并的有機層，真空除去溶劑，得到標(biāo)題化合物，為黃色固體(800mg，100％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.03(s，1H)，7.95-7.93(m，1H)，7.89-7.88(m，1H)，7.59-7.53(m，2H)，6.08(m，1H)，5.99(m，1H)，2.55(s，3H)，1.85(s，3H)，1.52(s，9H)。
b)4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯
將{[4-(2′，4′-二氨基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯((實施例5步驟a)342mg，0.64mmol)溶于MeOH(4mL)和乙酸(200μL)。向該溶液中緩慢加入1，3-二(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-假硫脲(203mg，0.70mmol)的MeOH懸浮液，于室溫下攪拌反應(yīng)物過夜。真空除去溶劑，隨后經(jīng)SiO2快速柱層析純化(40％EtOAc的己烷液)，得到標(biāo)題化合物(235mg，47％)，為白色固體。ESI-MS(m/z)C35H46N6O8S3理論值775.3(M+1)；實測值774.8。
c)4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺?；?-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯的mPEG20k2′-脲 將4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯(實施例5步驟b(67mg，0.09mmol))和吡啶(7.2μL，0.09mmol)溶于DCM(1.5mL)。將反應(yīng)冷卻至0℃，隨后加入二異丙基乙胺(16μL，0.18mmol)和氯甲酸對硝基苯酯(15.7mg，0.08mmol)，在0℃下攪拌反應(yīng)物30分鐘。向該溶液中加入mPEG20k-NH2(250mg，0.0125mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)物2小時。向該溶液中加入二異丙基乙胺(32μL，0.36mmol)和DMAP(催化量)，在室溫下攪拌反應(yīng)物過夜。真空除去溶劑，將殘留物溶于DCM/MeOH。將乙醚(4×體積)緩慢加入到DCM/MeOH溶液中，使PEG化的-化合物沉淀。1H-NMR(PEG在δ3.61抑制峰形)(CDCl3/CD3OD)δ8.11(s，1H)，8.02-8.01(m，1H)，7.85(s，1H)，7.68-7.62(m，2H)，7.45(s，1H)，2.63(s，3H)，1.96(s，1H)，1.55，(s，9H)，1.49(s，9H)，1.43(s，9H)。
d)4-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒的mPEG20k2′-脲二(三氟乙酸鹽) 在室溫下，將4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺?；?-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基的mPEG20k2′-脲(實施例5步驟c)溶于DCM(5mL)和TFA(5mL)，攪拌反應(yīng)物1小時。真空除去溶劑，然后將殘留物溶于DCM/MeOH，加入乙醚使產(chǎn)物沉淀，過濾收集產(chǎn)物。經(jīng)RP-HPLC(10-100％CH3CN/H2O，λ＝245nm，40分鐘)純化，得到標(biāo)題化合物，為白色固體(190mg，步驟c和d的總收率76％)。1H-NMR(PEG在δ3.60抑制峰形)(CDCl3/CD3OD)δ8.27(s，1H)，8.06-8.03(m，1H)，7.85(s，1H)，7.71(t，1H，J＝7.91Hz，J＝7.67Hz)，7.58(s，1H)，7.53-7.50(m，2H)，2.69(s，3H)，1.98(s，1H)。
實施例6路線aN-(mPEG20k)-3-{[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鵠-甲硫基}-丙酰胺二(三氟乙酸鹽) a)3-叔丁氧基羰基甲硫基-丙酸甲酯 將3-巰基-丙酸甲酯(3.4mL，30.7mmol)加入溴-乙酸叔丁酯(1.5mL，10.2mmol)和Et3N(3.4mL，30.7mmol)的THF溶液中。在室溫下攪拌反應(yīng)物3h，然后濃縮，使殘留物在EtOAc和1N NaOH之間分配。有機層用1N NaOH洗滌2×，除去所有過量的游離硫醇(用Ellman試劑監(jiān)測)。將有機層干燥(MgSO4)，濃縮，得到需要的產(chǎn)物，為澄清油狀物(2.1g，88％)。1H NMR(CDCl3)δ3.45(s，3H)，2.91(s，2H)，2.66(t，2H，J＝7.2Hz)，2.42(t，2H，J＝7.2Hz)，1.23(s，9H)。
b)3-羧基甲硫基-丙酸甲酯 用50％TFA的DCM處理3-叔丁氧基羰基甲硫基-丙酸甲酯(2.1g，按實施例6，路線a，步驟a制備)4h。真空濃縮混合物，得到固體產(chǎn)物，使用時無須純化。
1H NMR(CDCl3)δ3.73(s，3H)，3.31(s，2H)，2.95(t，2H，J＝7.2Hz)，2.74(t，2H，J＝7.2Hz)。
c)3-{[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酸 用N，N-二甲氨基吡啶(232mg，1.9mmol)和二異丙基碳二亞胺(172μL，1.1mmol)處理3-羧基甲硫基-丙酸甲酯(192mg，1.1mmol，按實施例6，步驟b制備)的CH2Cl2(10mL)溶液，在室溫下攪拌10min。向反應(yīng)混合物中加入{6-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-2-甲基-聯(lián)苯-4-基}-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯(248mg，0.37mmol，按實施例2，步驟f制備)，在室溫下攪拌得到的混合物6h。用DCM稀釋反應(yīng)混合物，然后用飽和NaHCO3萃取。有機層用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，濃縮，得到250mg油狀物，為粗品3-{[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酸甲酯。ESI-MS(m/z)C36H48N4O9S4Si理論值837.21(M+H)；實測值836.9、737.1。LC-MS表明該粗物質(zhì)為～90純，使用時無須進一步純化。因此，將該油溶于MeOH(10mL)，劇烈攪拌下，緩慢加入1N NaOH(10mL)。混合物變混濁，升溫至50℃。約4h后，經(jīng)TLC表明反應(yīng)完全。反應(yīng)物用AcOH酸化，然后真空濃縮。使殘留物在DCM和H2O之間分配，用鹽水洗滌有機層，干燥(MgSO4)，再次濃縮。在SiO2上層析(快速層析，洗脫液100％DCM至10％MeOH/DCM)殘留物，得到160mg標(biāo)題化合物，為棕褐色半固體。ESI-MS(m/z)C35H46N4O9S4Si理論值823.2(M+H)；實測值822.9、723.2d)3-({4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-甲硫基)-丙酸 用氟化四丁銨(1M的THF溶液，3.20mL，3.16mmol)處理3-{[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酸(0.650g，0.790mmol，按實施例6，路線a，步驟c制備)的THF(60mL)溶液，升溫至40℃，保持4.5h。真空除去溶劑，將殘留物溶于EtOAc，用水(4×75mL)洗滌。合并的有機層經(jīng)MgSO4干燥，真空濃縮，得到產(chǎn)物3-({4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-甲硫基)-丙酸(0.340g，63％)，為白色玻璃狀固體。
ESI-MS(m/z)C29H34N4O7S4理論值679.13(M+1)實測值678.80。
e)3-({3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-甲硫基)-丙酸 用1，3-二(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-假硫脲處理3-({4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-甲硫基)-丙酸(0.340g，0.501mmol，按實施例6，路線a，步驟d制備)的MeOH和5％AcOH(15mL)溶液，升溫至40℃保持4h。真空除去溶劑。經(jīng)硅膠層析(2-4％MeOH/CH2Cl2按0.5％增量增加)純化，得到標(biāo)題化合物(0.194g，42％)，為白色玻璃狀固體。
1H NMR(CDCl3)8.385(s，1H)，8.031(d，1H，J＝7.6Hz)，8.008(s，1H)，7.887(s，1H)，7.624(t，1H，J＝8.0Hz)，7.430(d，1H，J＝7.2Hz)，7.340(s，1H)，3.008(dd，2H，J＝50Hz，J＝17.2Hz)，2.599(s，3H)，2.538(d，1H，J＝8.4Hz)，2.483(s，1H)，2.548(s，2H)，2.006(s，3H)，1.549(s，9H)，1.514(s，9H)，1.492(s，9H).
f)N-(mPEG20k)-3-({3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基}-甲硫基)-丙酰胺 在室溫下，用N，N-二甲氨基吡啶(30.6mg，0.251mmol)和二異丙基碳二亞胺(DIC，20.4μL，0.130mmol)處理3-({3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-甲硫基)-丙酸(0.120g，0.130mmol，按實施例6，路線a，步驟e制備)的CH2Cl2(5mL)溶液，攪拌10min。加入mPEG20k-NH2固體(2.104g，0.100mmol，Rapp PolymereGMBH，Tübingen，Germany)，在室溫下攪拌混合物18h。用茚三酮染色檢查樣品中是否存有任何殘留的mPEG20k-NH2。真空除去溶劑。將殘留物轉(zhuǎn)移至含有極少量10％MeOH的CH2Cl2(10mL)溶液的大Erlenmeyer燒瓶中，緩慢加入無水乙醚直至溶液變混濁并有產(chǎn)物開始沉淀。攪拌懸浮液20min，然后冷卻至4℃，保持30min確保沉淀完全。將固體過濾，在真空干燥器中干燥。得到標(biāo)題化合物(2.08g，98％)，為白色固體。1H NMR(CDCl3，1滴CD3OD)δ8.203(s，1H)，8.040(d，1H，J＝7.6Hz)，8.030(s，1H)，7.816(t，1H，J＝1.6Hz)，7.660(t，1H，J＝7.6Hz)，7.540(d，1H，J＝1.6Hz)，7.458(d，1H，J＝8.0Hz)，3.080(dd，2H，J＝28Hz，J＝11Hz)，2.617(s，3H)，2.287(m，4H)，1.996(s，3H)，1.548(s，9H)，1.518(s，9H)，1.502(s，9H).
g)N-(mPEG20k)-3-{[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鵠-甲硫基}-丙酰胺二(三氟乙酸鹽) 將N-(mPEG20k)-3-({3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基}-甲硫基)-丙酰胺(2.06g，0.001mmol，按實施例6，路線a，步驟f制備)的CH2Cl2(20mL)溶液冷卻至0℃，用三氟乙酸(10.00mL)處理。使溶液升溫至室溫，攪拌4.5h。真空蒸發(fā)溶劑。將殘留物轉(zhuǎn)移至含有極少量10％MeOH的CH2Cl2(13mL)溶液的大Erlenmeyer燒瓶中。加入乙醚直至溶液變混濁并開始形成沉淀(～110mL Et2O)。將混合物在室溫下攪拌10min，然后冷卻至4℃保持30min，確保沉淀完全。過濾固體，在真空干燥器中干燥。經(jīng)制備HPLC(20-60％己腈/1％TFA/水洗脫40min)純化，得到產(chǎn)物(1.60g，77％)，為白色固體。1H NMR(CDCl3，1滴CD3OD)δ8.241(s，1H)，8.102(d，1H，J＝8.8Hz)，7.836(t，1H，J＝1.6Hz)，7.684(t，1H，J＝8.0Hz)，7.566(s，1H)，7.502(d，1H，J＝8.0Hz)，7.090(s，1H)，3.078(dd，2H，J＝28，11Hz)，2.687(s，3H)，2.244(m，4H)，2.048(s，3H).
路線bN-(mPEG20k)-3-{[3′-(5-氨基甲亞氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；?-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酰胺二(三氟乙酸鹽) a)({4-[6′-(2-羥基-乙?；被?-2′-甲基-4′-硝基-聯(lián)苯基-3-磺酰基]-5-甲硫基-噻吩-2-基}-亞氨基-甲基)-氨基甲酸叔丁酯 向{[4-(6′-氨基-2′-甲基-4’-硝基-聯(lián)苯基-3-磺?；?-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯(216mg，0.384mmol，按實施例1，步驟h制備)的DCM(2mL)溶液中加入DIEA(212μL，1.15mmol)和乙酸基乙酰氯(54mL，0.5mmol)。將溶液在室溫下攪拌3h。反應(yīng)混合物用EtOAc稀釋，用飽和NaHCO3、水和鹽水洗滌。有機層經(jīng)MgSO4干燥，過濾，真空濃縮，得到256mg粗油狀物，其使用時無須純化。
ESI-MS(m/z)C28H30N4O9S3理論值663.1(M+H)；實測值662.7、563.0(M-Boc)。向以上得到的粗中間體的MeOH(2.5mL)溶液中加入1N NaOH(2.5mL)，在室溫下攪拌混合物45min，此時，TLC表明乙酰基完全水解。反應(yīng)混合物用乙酸中和，真空濃縮，將殘留物在EtOAc和飽和NaHCO3之間分配。有機層用水和鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾，真空濃縮，得到220mg(92％，兩步的毛收率)標(biāo)題化合物，其使用時無須進一步純化。ESI-MS(m/z)C26H28N4O8S3理論值621.1(M+H)；實測值620.7、521.0(M-Boc)。
b)({4-[4′-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6′-(2-羥基-乙?；被?-2′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺酰基]-5-甲硫基-噻吩-2-基}-亞氨基-甲基)-氨基甲酸叔丁酯 向({4-[6′-(2-羥基-乙?；被?-2′-甲基-4′-硝基-聯(lián)苯基-3-磺?；鵠-5-甲硫基-噻吩-2-基}-亞氨基-甲基)-氨基甲酸叔丁酯(220mg，0.354mmol，按實施例6，路線b，步驟a制備)的EtOH(2.2mL)溶液中加入NH4Cl(1.1mL，3.2M，3.54mmol)。將混合物在50℃下劇烈攪拌30min。加入鐵粉(100mg，1.77mmol)，加熱混合物至80℃，保持3.5h。過濾(0.2μ，Wheaton針筒過濾器)反應(yīng)混合物，濃縮濾液至固體，使其在EtOAc和1N Na2CO3之間分配。有機層用另一份Na2CO3洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到需要的粗產(chǎn)物。用PTLC(4×1500μ板，5％MeOH的DCM溶液)純化，得到58mg需要的苯胺。ESI-MS(m/z)C26H30N4O6S3理論值591.1(M+H)；實測值591.0、491.0(M-Boc)。向該苯胺(55mg，0.09mmol)的MeOH/AcOH(10∶1，5mL)溶液中加入N，N′-二(叔丁氧基羰基)-S-甲基異硫脲(78mg，0.27mmol，Aldrich Chemical Company)。使反應(yīng)混合物升溫至40℃，攪拌3h。真空濃縮混合物至固體，使其在PTLC(2×1000μ板，1∶1的EtOAc/己烷)上純化，得到45mg(60％)標(biāo)題化合物，為澄清油狀物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ11.60(s，1H，10.27(s，1H)，8.20(m，2H)，8.04(d，1H，J＝6.7Hz)，7.90(br s，1H)，7.64(t，1H，J＝7.8Hz)，7.40-7.45(m，2H)，4.42(br s，1H)，3.84和3.99(AB四重峰，2H，J＝15.4Hz)，2.55(s，3H)，1.93(s，3H)，1.57(s，9H)，1.53(s，9H)，1.48(s，9H)。ESI-MS(m/z)C37H48N6O10S3理論值833.2(M+H)；實測值832.8、732.8、632.9、533.1。
c)甲磺酸{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-甲酯 在0℃下，向({4-[4′-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6′-(2-羥基-乙酰基氨基)-2′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺?；鵠-5-甲硫基-噻吩-2-基}-亞氨基-甲基)-氨基甲酸叔丁酯(40mg，48μmmol，按實施例6，路線b，步驟b制備)和二異丙基乙胺(100μL，192μmol)的DCM(1mL)溶液中加入甲磺酰氯(10μL，130μmol)。在0℃下攪拌溶液30min，然后升溫，在室溫下攪拌5h。真空濃縮反應(yīng)混合物，殘留物經(jīng)層析(PTLC，1∶1EtOAc/己烷，1000μSiO2板)純化，得到40mg(97％)需要的標(biāo)題化合物，為玻璃狀固體。ESI-MS(m/z)C38H50N6O12S4理論值911.2(M+H)；實測值910.7、810.8、710.8、611.1。
d)N-(mPEG20k)-3-{[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺?；?-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鵠-甲硫基}-丙酰胺二(三氟乙酸) 向甲磺酸{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鶀-甲酯(21mg，0.023mmol，按實施例6，路線b，步驟c制備)和二異丙基乙胺(100μL 192μmol)的DCM(1.5mL)溶液中加入mPEG20k-NHC(O)(CH2)2-SH(350mg，16.7μmol，Rapp Polymere GMBH，Tübingen，Germany)。在室溫下攪拌得到的溶液，在TLC上，用Ellman′s試劑(DTNB)監(jiān)測反應(yīng)進程。所有的游離硫醇耗盡后(～2h)，反應(yīng)混合物用MeOH(3mL)稀釋，然后緩慢加入乙醚使沉淀。一旦反應(yīng)混合物變混濁，使其在4℃靜置，誘導(dǎo)沉淀完全。在Buchner漏斗上收集固體，經(jīng)抽真空干燥。將該固體移入反應(yīng)容器中，用1∶1的TFA/DCM處理2h。真空濃縮反應(yīng)混合物，使粗產(chǎn)物再溶于水，用C-18 RP-HPLC(λ＝214、254；梯度20-60％CH3CN/H2O(0.1％TFA)純化30分鐘，得到標(biāo)題化合物(220mg，63％)，為白色固體。1H NMR(CDCl3PEG在δ3.62抑制峰形)δ8.24(s，1H)，8.10(d，1H，J＝8.8Hz)，7.84(t，1H，J＝1.6Hz)，7.68(t，1H，J＝8.0Hz)，7.57(s，1H)，7.50(d，1H，J＝8.0Hz)，7.09(s，1H)，3.62(m，PEG CH2)，3.36(s，3H，PEG-OCH3)3.08(dd，2H，J＝28，11Hz)，2.69(s，3H)，2.24(m，4H)，2.05(s，3H).
實施例7N-(mPEG30k)-6-[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鵠-己酰胺二(三氟乙酸鹽) 用描述實施例2，步驟j的類似方法合成標(biāo)題化合物。因此，將二異丙基碳二亞胺(6.2μl，0.0399mmol)加入6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基}-脲基)-己酸(40mg，0.0426mmol，按實施例2，步驟i制備)和N，N-二甲氨基吡啶(9.1mg，0.074mmol)的DCM(2.5mL)溶液中。攪拌溶液10min，然后加入mPEG30k-NH2(800mg，0.0266mmol，NOF Corporation，Japan)。在室溫下攪拌反應(yīng)物6h(在TLC上茚三酮反應(yīng)陰性)。加入DCM(10mL)，隨后緩慢加入Et2O，誘導(dǎo)緩慢沉淀。再加入少量乙醚，確保沉淀完全，過濾收集固體，用DCM/Et2O洗滌，得到～700mg粗PEG化的-化合物。重復(fù)沉淀過程。HPLC分析該粗物質(zhì)表明純度為～98％。用TFA(50％的DCM溶液，6mL)處理干燥的PEG化的-化合物。攪拌2h后，加入MeOH(4mL)，隨后緩慢加入Et2O誘導(dǎo)逐步沉淀。收集固體，按上述方法重復(fù)沉淀。過濾收集并真空干燥固體，得到純標(biāo)題化合物，為白色固體(640mg)。分析型RP-HPLC(C18柱，10-80％CH3CN/H2O(0.1％TFA，λ＝214、254)洗脫10min)表明純度＞99％。1H-NMR(CD3OD)(PEG在δ3.62抑制峰形)δ8.45(s，1H)，8.11(m，1H)，7.93(t，1H，J＝1.5Hz)，7.83(t，1H，J＝7.8Hz)，7.73(m，1H)7.61(dt，1H，J＝1.2，7.6Hz)，7.04(m，1H)，3.62(m，PEG亞甲基)，3.28(t，2H，J＝6.9Hz，PEG-CH2N)，3.10(t，2H，J＝7.7Hz)，2.76(s，3H)，2.19(t，2H，J＝7.4Hz)，2.03(s，3H)，1.62(m，2H)，1.45(m，2H)，1.32(m，2H)。
實施例8與6-[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺?；?-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲酰基]-己酸的二取代的-PEG20k-(NH2)2四(三氟乙酸鹽)結(jié)合
用實施例7中使用的方法合成標(biāo)題化合物。因此，使二異丙基碳二亞胺(5.6μL，0.036mmol)、6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基}-脲基)-己酸(34mg，0.0365mmol，按實施例2，步驟i制備)與N，N-二甲氨基吡啶(8mg，0.066mmol)和PEG20k-(NH2)2(255mg，0.0122mmol，Rapp Polymere GMBH，Tübingen，Germany)的DCM(1mL)溶液反應(yīng)，隨后用TFA處理，按實施例7方法進行相同后處理和純化，得到～200mg標(biāo)題化合物，為白色固體。1H-NMR(CD3OD)(PEG在δ3.6抑制峰形)δ8.45(s，1H)，8.12(m，1H)，7.92(t，1H，J＝1.5Hz)，7.83(t，1H，J＝7.8Hz)，7.73(m，1H)7.61(dt，1H，J＝1.2，7.6Hz)，7.035(m，1H)，3.62(m，PEG亞甲基)，3.36(t，2H，J＝5.5Hz，PEG-CH2N)，3.10(t，1H，J＝6.7Hz)，2.76(s，3H)，2.22(t，2H，J＝7.3Hz)，2.02(s，3H)，1.62(m，2H)，1.45(m，2H)，1.32(m，2H)。
實施例9N-(mPEG20k)-3-{[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺?；?-2-甲基-聯(lián)苯-4-基氨基甲?；鵠-甲硫基}-丙酰胺三氟乙酸鹽
向({4-[4′-(2-溴-乙?；被?-2′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺?；鵠-5-甲硫基-噻吩-12-基}-亞氨基-甲基)-氨基甲酸叔丁酯(45mg，0.07mmol，按實施例234，步驟a，WO-03099805制備)和Et3N(15μL)的DCM(5mL)溶液中加入mPEG20k-NHCO(CH2)2SH(1.13g，0.056mmol，Rapp Polymere，GMBH，Tübingen，Germany)。在Ar下，在室溫下，攪拌反應(yīng)物1h。用Ellman試劑監(jiān)測反應(yīng)的完成。真空濃縮反應(yīng)混合物，用Et2O研磨剩余殘留物，然后用TFA(25％的DCM溶液)處理40min。除去TFA/DCM，殘留物在RP-HPLC(C18柱，20-60％CH3CN/H2O(0.1％TFA，λ＝214、254)上純化殘留物30min，得到純標(biāo)題化合物的TFA鹽。分析型RP-HPLC(C18柱，10-80％CH3CN/H2O(0.1％TFA，λ＝214、254)洗脫10min)顯示單一峰。1H-NMR(CD3OD)(PEG在δ3.62抑制峰形)δ8.38(s，1H)，8.03-8.06(m，1H)，7.97(m，1H)，7.71(m，2H)，7.56-7.61(m，2H)，7.21(d，1H，J＝9.1Hz)，3.62(m，PEG亞甲基)，3.37-3.4(m，5H)，3.36(s，3H，PEG-OMe)，2.97(t，2H，J＝7.2Hz)，2.75(s，3H)，2.60(t，2H，J＝7.2Hz)，2.26(s，3H)。
實施例104-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒八(三氟乙酸鹽)的四價(4-Arm)PEG 2′-脲結(jié)合物(五赤蘚醇母核)
用實施例5，步驟c和d中所述類似方法合成標(biāo)題化合物。將4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺?；?-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯(實施例5步驟b(155mg，0.2mmol))和吡啶(19μL，0.02mmol)溶于DCM(1.5mL)。將反應(yīng)物冷卻至0℃，隨后加入二異丙基乙胺(16μL，0.18mmol)和氯甲酸對硝基苯酯(35mg，0.17mmol)，在0℃下攪拌反應(yīng)物，然后在室溫下攪拌30分鐘。向該混合物中加入四價4-arm PEG20k-NH2(500mg，0.025mmol)和二異丙基乙胺(300μL)。在室溫下攪拌反應(yīng)物14h。真空除去溶劑，將殘留物溶于DCM。將乙醚(4×體積)緩慢加入DCM/MeOH溶液中，使PEG化的-化合物沉淀。收集固體，再重復(fù)沉淀2次。在室溫下，用TFA(50％的DCM溶液，5mL)處理該固體1h。真空除去溶劑，將殘留物溶于MeOH/DCM，用Et2O沉淀3次。在RP-HPLC HPLC(C18柱，20-60％CH3CN/H2O(0.1％TFA，λ＝214、254)上純化收集的固體30min，得到400mg標(biāo)題化合物，為棕褐色固體。1H-NMR(PEG在δ3.62抑制峰形)(CD3OD)δ8.44(s，1H)，8.12(d，1H，J＝7.2Hz)，7.92(br s，1H)，7.82(t，1H，J＝7.8Hz)，7.71(s，1H)，7.61(d，1H，J＝7.7Hz)，7.04(s，1H)，3.62(m，PEG亞甲基)，3.27(t，2H，J＝4.7Hz)，2.76(s，3H)，2.02(s，1H)。
實施例114-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒二(三氟乙酸鹽)的HOOC-PEG5k2′-脲 按實施例10中所述，用以下量合成標(biāo)題化合物4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺?；?-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亞氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯(實施例5步驟b(30mg，0.039mmol))、吡啶(24μL，0.3mmol)、氯甲酸對硝基苯酯(7.3mg，0.036mmol)、二異丙基乙胺(200μL)和H2N-PEG5k-COOH(100mg，0.02mmol，NOF，Japan)的DCM(1mL)溶液。進行同樣的后處理和純化(沉淀和RP-HPLC)，得到35mg純Boc-保護的中間體。用TFA處理，隨后通過前述MeOH/DCM/Et2O沉淀，得到標(biāo)題化合物，為白色固體。1H-NMR(PEG在δ3.62抑制峰形)(CD3OD)δ8.43(s，1H)，8.09-8.14(m，1H)，7.92(t，1H，J＝1.6Hz)，7.82(t，1H，J＝7.8Hz)，7.60-7.66(m，2H)，7.06(d，1H，J＝1.6Hz)，3.62(m，PEG亞甲基)，3.18(t，2H，J＝6.8Hz)，2.76(s，3H)，2.31(t，2H，J＝7.4Hz)，2.04(s，1H)，1.56-1.68(m，6H)，1.37-1.46(m，2H)。
實施例124-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒四(三氟乙酸鹽)的二價45k PEG結(jié)合物 向4-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺?；?-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒的三-Boc-保護的HOOC-PEG5k2′-脲(33mg，0.0065mmol，按實施例11制備)和DMAP(3mg，0.018mmol)的DCM(1mL)溶液中加入二異丙基碳二亞胺(10μL 10％的DCM溶液，0.0064mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)物10min，然后一次性加入PEG35k-(NH2)2(81mg，0.0023mmol，NOF，Japan)。在室溫下攪拌反應(yīng)物過夜。真空除去溶劑，按實施例7中所述，在DCM/Et2O中沉淀殘留物。在RP-HPLC上純化收集的固體，用恒溶劑梯度(35％CH3CN/H2O(0.1％TFA)洗脫30min)除去產(chǎn)物(后流分)中的過量HOOC-PEG5k-小分子結(jié)合物(前流分)。用TFA(50％的DCM溶液，2mL)處理后流分4h，真空濃縮反應(yīng)混合物。再次在RP-HPLC上層析純化殘留物，得到標(biāo)題化合物，經(jīng)分析型RP-HPLC和1H-NMR證實為純化合物。1H-NMR(PEG在δ3.62抑制峰形)(CD3OD)δ8.42(s，1H)，8.09-8.11(m，1H)，7.91(t，1H，J＝1.7Hz)，7.81(t，1H，J＝7.8Hz)，7.71(s，1H)，7.60-7.62(m，1H)，7.04(d，1H，J＝1.6Hz)，3.62(m，PEG亞甲基)，3.25(t，2H，J＝6.8Hz)，3.17(t，4H，J＝6.0Hz)，2.75(s，3H)，2.18(t，2H，J＝7.5Hz)，2.02(s，1H)，1.90-1.98(m，2H)，1.72-1.79(m，2H)，1.56-1.67(m，6H)。
實施例134-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-聯(lián)苯基-3-磺?；?-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒(八)-三氟鹽酸鹽的四價PEG 2′-脲結(jié)合物(末端分支為賴氨酸) 在室溫下，向PEG35k-(NH2)2(1g，28.6mmol，NOF，Japan)和DMAP(0.035mg，0.286mmol)的DCM(3.5mL)溶液中加入Boc-N-Lys(Boc)-N-羥基琥珀酰亞胺酯(102mg，0.229mmol，Novabiochem)。劇烈攪拌該粘性反應(yīng)混合物24h，然后用DCM稀釋，緩慢加入Et2O至混濁。使混合物在4℃下靜置直至沉淀完全。過濾收集固體，再重復(fù)該過程3次。收集白色固體，在室溫下用TFA(50％的DCM溶液)處理4h。濃縮反應(yīng)混合物至干，加入過量DIEA中和殘留物，真空蒸發(fā)，得到需要的固體中間體。按實施例7中所述類似的方法，使部分回收的固體(300mg，0.0086mmol)與6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基}-脲基)-己酸(64mg，0.0686mmol，按實施例2，步驟i制備)、二異丙基碳二亞胺(10.6μL，0.068mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(16mg，0.129mmol)的DCM(2mL)溶液反應(yīng)。濃縮反應(yīng)混合物，將殘留物溶于DCM/MeOH混合物中，用Et2O沉淀(3×)。在室溫下，用TFA(50％的DCM溶液)處理過濾的固體6h。真空除去揮發(fā)性物質(zhì)，在MeOH/DCM/Et2O中沉淀殘留物兩次，得到白色固體，經(jīng)分析型RP-HPLC和1H-NMR確證為純標(biāo)題化合物。1H-NMR(PEG在δ3.62抑制峰形)(CD3OD)δ8.44(s，1H)，8.09-8.11(m，1H)，7.92(s，1H)，7.82(t，1H，J＝7.8Hz)，7.73(m，1H)，7.60(d，1H，J＝8.0Hz)，7.03(s，1H)，3.62(m，PEG亞甲基)，3.05-3.12(t，2H，J＝6.8Hz)，2.75(s，3H)，2.19(t，2H，J＝7.7Hz)，2.01(s，1H)，1.70-1.90(m，2H)，1.24-164(m，10H)。
實施例14N-(PEG40k)-6-[3′-(5-氨基甲亞氨?；?2-甲硫基-噻吩-3-磺?；?-4-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基氨基甲?；鵠-己酰胺二(三氟鹽酸鹽) 用實施例7中所述方法，通過使6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亞氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺?；鵠-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-聯(lián)苯-2-基}-脲基)-己酸(25mg，0.027mmol，按實施例2，步驟i制備)、二異丙基碳二亞胺(4.3μL，0.027mmol)、N，N-二甲氨基吡啶(6.4mg，0.05mmol)和Y-PEG40k-NH2(700mg，0.0175mmol，Sunbio，South Korea)在DCM(3mL)溶液中反應(yīng)合成標(biāo)題化合物。經(jīng)同樣后處理，TFA處理和最后沉淀得到標(biāo)題化合物，為白色固體。1H-NMR(CD3OD)(PEG在δ3.62抑制峰形)δ8.45(s，1H)，8.11(m，1H)，7.91(s，1H)，7.66-7.84(m，2H)，7.61(d，1H，J＝7.7Hz)，7.04(s，1H)，3.62(m，PEG亞甲基)，2.77(s，3H)，2.60(m，2H)，2.25(t，2H，J＝6.7Hz)，2.01(s，3H)，1.60(m，2H)，1.42(m，2H)，1.25-1.35(m，2H)。
實施例15體外抑制C1s試劑所有緩沖液得自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，且具有現(xiàn)有的最高純度。DTNB購自Pierce(Rockford，IL)。Z-Gly-Arg-S-Bzl購自Enzyme Systems Products(Livermore，CA)。激活的人C1s購自Calbiochem(La Jolla，CA)。
Ki測定根據(jù)測試化合物抑制C1s-催化水解Z-Gly-Arg-S-Bzl底物的能力建立所有測定方法，通過與5，5′-二硫代-二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的次級反應(yīng)，觀察該能力。在典型的Ki測定中，用DMSO制備底物，稀釋到由50mM HEPES、200mM NaCl、pH 7.5，0.05％正辛基-β-D-吡喃葡糖苷組成的測定緩沖液中。用200μM DTNB的測定緩沖液配制45μM(Km＝78μM)底物溶液。在測定緩沖液中，將測試化合物終濃度配制為10μM。在測定緩沖液中，配制測試化合物的稀釋系列濃度，得到濃度范圍為700倍的至少7個終濃度。將純激活的C1s稀釋到測定緩沖液中，測定用濃度為50nM。
在典型的Ki測定中，向96孔板的各孔中加入280μL底物溶液和10μL測試化合物溶液，在37℃下，將板熱平衡10分鐘。加入10μL等份酶試樣起動反應(yīng)，在Molecular Devices板讀出器中，在405nm處連續(xù)記錄吸收度的增加15分鐘。終試劑濃度為[C1s]＝1.7nM，[Z-Gly-Arg-S-Bzl]＝45μM，[DTNB]＝200μM。不含測試化合物樣品的速率(吸收度變化的速率作為時間的函數(shù))除以含測試化合物樣品的速率的比率，作為測試化合物濃度的函數(shù)作圖。將數(shù)據(jù)擬合到線性回歸中，計算該直線的斜率值。該斜率的倒數(shù)是實驗測得的表觀Ki值(Kiapp)。通過底物濃度[S]與底物Km之間的關(guān)系，將Kiapp校正為準(zhǔn)確的Ki，其中Ki＝Kiapp×(1/(1+[S]/Km))。
實施例16體外抑制MASP-2試劑所有緩沖鹽水得自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，且具有現(xiàn)有的最高純度。DTNB購自Pierce(Rockford，IL)。Z-Gly-Arg-S-Bzl購自Enzyme Systems Products(Livermore，CA)。由昆蟲細胞中的桿狀病毒表達系統(tǒng)內(nèi)部制備自動激活的2-鏈人MASP-2(His-tag，Cys300-Phe686)。
Ki測定根據(jù)測試化合物抑制MASP-2-催化水解Z-Gly-Arg-S-Bzl底物的能力建立所有測定方法，通過與5，5′-二硫代-二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的次級反應(yīng)，觀察該能力。在典型的Ki測定中，用DMSO制備底物，稀釋到由50mM HEPES、200mM NaCl、pH 7.5，0.05％正辛基-β-D-吡喃葡糖苷組成的測定緩沖液中。用200μMDTNB的測定緩沖液配制45μM(Km＝8.6μM)底物溶液。在測定緩沖液中，將測試化合物終濃度配制為10μM。在測定緩沖液中，配制測試化合物的稀釋系列濃度，得到濃度范圍為700倍的至少7個終濃度。將純激活的MASP-2稀釋到測定緩沖液中，測定用濃度為30nM。
在典型的Ki測定中，向96孔板的各孔中加入280μL底物溶液和10μL測試化合物溶液，在37℃下，將板熱平衡10分鐘。加入10μL等份酶試樣起動反應(yīng)，在Molecular Devices板讀出器中，在405nm處連續(xù)記錄吸收度的增加15分鐘。終試劑濃度為[MASP-2]＝1.0nM，[Z-Gly-Arg-S-Bzl]＝45μM，[DTNB]＝200μM。不含測試化合物樣品的速率(吸收度變化的速率作為時間的函數(shù))除以含測試化合物樣品的速率的比率，作為測試化合物濃度的函數(shù)作圖。將數(shù)據(jù)擬合到線性回歸中，計算該直線的斜率值。該斜率的倒數(shù)是實驗測得的表觀Ki值(Kiapp)。通過底物濃度[S]與底物Km之間的關(guān)系，將Kiapp校正為準(zhǔn)確的Ki，其中Ki＝Kiapp×(1/(1+[S]/Km))。
實施例17抑制補體數(shù)據(jù)按實施例15和16中所述方法測得的由列在表1中的各個實施例制備的下列化合物的Ki值。
表1
對于C1s亞成分，實施例的Ki值在0.018-0.4微摩爾(μM)范圍。表1列出代表性實施例組抑制C1s和MASP-2的Ki值。結(jié)果表明本發(fā)明化合物為補體抑制劑。
引用的每件專利、專利申請和出版物或文獻所述通過引用全文結(jié)合到本文中。
據(jù)信，本文中使用的化學(xué)式和化學(xué)名正確和準(zhǔn)確反映所代表的化合物。但是，無論完全或部分，本發(fā)明的特性和價值不取決于這些式的理論正確性。因此，應(yīng)理解本文中使用的式和化學(xué)名歸屬于相應(yīng)表示化合物，但它們絕不限制本發(fā)明，除這種立體化學(xué)明確定義之外，包括不能將其限制在任何具體的互變異構(gòu)體或任何具體的旋光體；或幾何異構(gòu)體。
除本文中所述的那些外，本領(lǐng)域技術(shù)人員由前述會明了本發(fā)明的各種改進。此類改進也包括在附屬的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種含有結(jié)合補體抑制劑的組合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，所述組合物具有式(I)或式(IV)(D-L)n-PD-Ln-Pn’，(I)(IV)其中D在每次出現(xiàn)時獨立選自為補體級聯(lián)抑制劑的化合物；L在每次出現(xiàn)時是任選的(每次出現(xiàn)時)獨立選擇的連接基團；n是1、2、3、4、5或6；n’是1、2、3或4；和P在每次出現(xiàn)時獨立選自提高D的藥物動力學(xué)性質(zhì)的化合物。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述組合物具有式(I)，而n是1、2、4或6。
4.權(quán)利要求2的組合物，其中連接D與P的鍵在生理條件下是基本上不水解的。
5.權(quán)利要求2的組合物，其中D與C1s亞成分、C1r亞成分、MASP-2亞成分結(jié)合，或是C5a受體拮抗劑。
6.權(quán)利要求2的組合物，其中D與至少一個C1s亞成分或MASP-2亞成分結(jié)合。
7.權(quán)利要求2的組合物，其中D是芳族化合物。
8.權(quán)利要求2的組合物，其中D不是肽。
9.權(quán)利要求2的組合物，其中D是分子量在約100分子量單位至約2000分子量單位范圍的小分子。
10.權(quán)利要求2的組合物，其中D是分子量在約400分子量單位至約1200分子量單位范圍的小分子。
11.權(quán)利要求2的組合物，其中D是分子量在約400分子量單位至約2000分子量單位范圍的小分子。
12.權(quán)利要求2的組合物，其中D是非芳族化合物。
13.權(quán)利要求2的組合物，其中D是芳族胍。
14.權(quán)利要求2的組合物，其中D是芳族化合物或雜芳族脒。
15.權(quán)利要求2的組合物，其中D是式(II)化合物 其中R1、R2和R3獨立選自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羥基；U是噻吩基-R5、亞芐基、亞苯基、NH或鍵；R5是SO2、NH或鍵；Z是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或鍵；T是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基或硝基；X是氨基、羧基、羥基、硫醇、鹵素、烯烴、肼、羥胺、氨基烷基、羧基烷基、鹵代烷基、羥烷基、巰基烷基或與L或P連接的鍵；V是甲基、乙基或Cl，和R4是H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2、脲或胍基。
16.權(quán)利要求2的組合物，其中D是 其中當(dāng)D與L或P連接時，X是NH或C(＝O)，和R4是H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2、脲或胍基。
17.權(quán)利要求2的組合物，其中D是 其中當(dāng)D與L或P連接時，X是NH或C(＝O)；R6是C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基、苯基、吡唑基或硝基；和V是甲基或乙基。
18.權(quán)利要求2的組合物，其中D是 其中當(dāng)D與L或P連接時，X是NH或C(＝O)；R6是C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基、苯基、吡唑基或硝基；和V是甲基或乙基。
19.權(quán)利要求2的組合物，其中D是式(V)化合物 其中R1、R2和R3獨立選自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羥基；U是噻吩基-R5、亞芐基、亞苯基、NH或鍵；R5是SO2、NH或鍵；Z是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或鍵；T是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基或硝基；X是氨基、羧基、羥基、硫醇、鹵素、烯烴、肼、羥胺、氨基烷基、羧基烷基、鹵代烷基、羥烷基、巰基烷基或與L或P連接的鍵；當(dāng)存在時，Y是氨基、羧基、羥基、硫醇、鹵素、烯烴、肼、羥胺、氨基烷基、羧基烷基、鹵代烷基、羥烷基、巰基烷基、脲、胍基或與L或P連接的鍵；和V是甲基、乙基或Cl。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中D選自 其中當(dāng)D與L或P連接時，X是NH或C(＝O)，當(dāng)Y存在時，如果D與L或P連接，則Y是NH、C(＝O)、胍基或脲，V是甲基、乙基或Cl，和R6是H、C1-4烷基、OH、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基、苯基、吡唑基或硝基。
21.權(quán)利要求19的組合物，其中D是 其中當(dāng)D與L或P連接時，X是NH或C(＝O)，當(dāng)Y存在時，如果D與L或P連接，則Y是NH、C(＝O)、脲或胍基，和V是甲基或乙基。
22.權(quán)利要求19的組合物，其中D是 其中當(dāng)D與L或P連接時，X是NH或C(＝O)，當(dāng)Y存在時，如果D與L或P連接，則Y是NH、C(＝O)、脲或胍基，V是甲基或乙基，和R6是H、C1-4烷基、OH、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基或硝基。
23.權(quán)利要求19的組合物，其中D是 其中當(dāng)D與L或P連接時，X是NH或C(＝O)，當(dāng)Y存在時，如果D與L或P連接，則Y是NH、C(＝O)、脲或胍基，V是甲基或乙基，和R6是H、C1-4烷基、OH、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基、苯基、吡唑基或硝基。
24.權(quán)利要求2的組合物，其中L選自以下基團 其中AA是氨基酸，而m是1-12， 其中AA是氨基酸，而m是1-12，和
25.權(quán)利要求2的組合物，其中P是選自以下的聚合物聚醚、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物和活化聚合物。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中P是分子量為約750分子量單位至約60,000分子量單位的一甲基端基聚乙二醇。
27.權(quán)利要求25的組合物，其中P是分子量為約750分子量單位的一甲基端基聚乙二醇。
28.權(quán)利要求25的組合物，其中P是分子量為約10,000分子量單位的一甲基端基聚乙二醇。
29.權(quán)利要求25的組合物，其中P是分子量為約20,000分子量單位的一甲基端基聚乙二醇。
30.權(quán)利要求25的組合物，其中P是分子量為約40,000分子量單位的一甲基端基聚乙二醇。
31.權(quán)利要求25的組合物，其中P是分子量為約60,000分子量單位的一甲基端基聚乙二醇。
32.權(quán)利要求25的組合物，其中P是具有式(III)的活化聚合物 其中M是CH3、HC＝CH-C(＝O)、O＝CH-CH2、H2N-CH2-CH2、Cl-H3N+-HN-C(＝O)-CH2、O＝C＝N-CH2CH2、HS-CH2CH2、H2C＝CH-S(＝O)2-CH2CH2， J是17-1400；和A是O-CH2-CH(＝O)、O-C(＝O)-CH2＝CH2、O-CH2-CH2-NH2、NH2、O-CH2-C(＝O)-NH-NH3+Cl-、SH、N＝C＝O、S(＝O)2-CH＝CH2，
33.權(quán)利要求2的組合物，其中D是式(II)或式(V)化合物 其中R1、R2和R3獨立選自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羥基；U是噻吩基-R5、亞芐基、亞苯基、NH或鍵；R5是SO2、NH或鍵；Z是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或鍵；T是亞芳基、亞雜芳基、亞芳烷基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)雜烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4鏈烯氧基、苯氧基、芐氧基、鹵素、氨基或硝基；X是氨基、羧基、羥基、硫醇、鹵素、烯烴、肼、羥胺、氨基烷基、羧基烷基、鹵代烷基、羥烷基、巰基烷基，或與L或P連接的鍵；當(dāng)存在時，Y是氨基、羧基、羥基、硫醇、鹵素、烯烴、肼、羥胺、氨基烷基、羧基烷基、鹵代烷基、羥烷基、巰基烷基、脲、胍基或與L或P連接的鍵；和V是甲基、乙基或Cl；和R4是H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2、脲或胍基；L在每次出現(xiàn)時是任選的獨立選自以下的連接基團； 其中AA是氨基酸，而m是1-12， 其中AA是氨基酸，m是1-12，和 P是具有式(III)的活化聚合物 其中M是CH3、HC＝CH-C(＝O)、O＝CH-CH2、H2N-CH2-CH2、Cl-H3N+-HN-C(＝O)-CH2、O＝C＝N-CH2CH2、HS-CH2CH2、H2C＝CH-S(＝O)2-CH2CH2， J是17-1400；和A是O-CH2-CH(＝O)、O-C(＝O)-CH2＝CH2、O-CH2-CH2-NH2、NH2、O-CH2-C(＝O)-NH-NH3+Cl-、SH、N＝C＝O、S(＝O)2-CH＝CH2，
34.一種抑制激活補體級聯(lián)治療患者的方法，所述方法包括給予所述患者權(quán)利要求2的結(jié)合補體抑制劑。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述患者的病癥選自遺傳性血管性水腫、敗血性休克、心肺分流術(shù)中人工泵后綜合征、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、器官排斥、創(chuàng)傷、腦創(chuàng)傷、哮喘、橋本甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎小球性腎炎和皮膚損害、其它腎小球性腎炎、大泡型類天皰瘡、皰疹樣皮炎、肺出血-腎炎綜合征、格雷夫斯氏病、重癥肌無力、胰島素抵抗、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、急性感染性多神經(jīng)炎、Miller-Fisher綜合征和阿爾茨海默氏病。
36.一種治療由傳統(tǒng)途徑或補體級聯(lián)的MBL途徑介導(dǎo)的急性或慢性疾病的癥狀的方法，所述方法包括給予有這種治療需要的哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求2的結(jié)合補體抑制劑。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述急性或慢性疾病是炎癥、組織損傷或自身免疫性疾病。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物給予需要治療補體介導(dǎo)的疾病的哺乳動物，所述疾病選自炎癥、組織損傷及其組合。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述炎癥或組織損傷發(fā)生在中風(fēng)、心肌梗死、出血性休克或手術(shù)或其組合之后。
40.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物給予需要治療Crohn’s病的腸炎、再狹窄或銀屑病。
41.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物在器官或移植物移植之前、期間或之后給予哺乳動物，以緩解哺乳動物對這種器官或移植物的排斥。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述移植在個體內(nèi)、同種個體之間或不同種個體之間進行。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述器官選自腎、心、肺和肝。
44.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物按有效減少IL-2治療、骨髓移植或胰腺炎的毒性和副作用的量給予在(1)接受IL-2治療之前、期間和之后的所述哺乳動物；接受骨髓移植的所述哺乳動物或(3)胰腺炎發(fā)生的所述哺乳動物。
45.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物給予已診斷為患有自身免疫性疾病的哺乳動物。
46.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物給予已診斷為患有阿狄森氏病、I型糖尿病、橋本甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎小球性腎炎和皮膚損害、其它腎小球性腎炎、大泡型類天皰瘡、皰疹樣皮炎、肺出血-腎炎綜合征、格雷夫斯氏病、重癥肌無力、胰島素抵抗、自身免疫性出血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、免疫復(fù)合物引起的脈管炎腎小球性腎炎、膠原-引起的II型關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或過敏性神經(jīng)炎。
47.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物被給予已診斷為患有重癥肌無力(MG)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或系統(tǒng)性紅斑狼瘡的哺乳動物。
48.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物被給予已診斷為患有神經(jīng)變性疾病的哺乳動物。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是多發(fā)性硬化(MS)、急性感染性多神經(jīng)炎(GBS)、Miller-Fisher綜合征(MFS)、阿爾茨海默氏病(AD)或變型克羅伊茨費爾特-雅各布綜合征(vCJD)。
50.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物被給予患有成年呼吸窘迫綜合征的癥狀的哺乳動物。
51.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物被給予患有敗血性休克的哺乳動物。
52.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物被給予需要治療患有以下疾病的哺乳動物遺傳性血管性水腫、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、創(chuàng)傷愈合、腦創(chuàng)傷、哮喘、血液透析、感染、皮膚病、炎性腸道疾病、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、灼傷(燒傷和凍傷)、出血性貧血或心肺分流術(shù)中人工泵后綜合征。
53.一種緩解個體排斥細胞移植或移植物的方法，所述方法包括通過給予所述個體權(quán)利要求2的結(jié)合補體抑制劑抑制補體級聯(lián)激活。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述個體的病癥選自心力衰竭、糖尿病、中風(fēng)、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、癡呆、肝病、腎病、燒傷和創(chuàng)傷。
55.權(quán)利要求53的方法，其中所述移植物是個體內(nèi)、同種個體之間或不同種個體之間的組織轉(zhuǎn)移。
56.權(quán)利要求53的方法，其中所述細胞移植在個體內(nèi)、同種個體之間或不同種個體之間進行。
57.權(quán)利要求53的方法，其中所述細胞移植的細胞是干細胞、原代細胞、來自組織培養(yǎng)的細胞、胰島細胞、表達胰島素的細胞、表達調(diào)節(jié)葡萄糖激素的細胞或表達用于治療糖尿病的因子的細胞。
58.權(quán)利要求53的方法，其中所述個體是哺乳動物。
59.一種在器官保存溶液中預(yù)防器官中的補體激活的方法，所述方法包括使器官與權(quán)利要求2的結(jié)合補體抑制劑接觸。
60.一種預(yù)防異物進入個體內(nèi)引起補體激活的方法，所述方法包括使所述異物與權(quán)利要求2的結(jié)合補體抑制劑接觸。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述異物是外科移植物、人造器官或人造關(guān)節(jié)。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合補體級聯(lián)抑制劑和用結(jié)合補體級聯(lián)抑制劑治療患者的方法。本發(fā)明部分涉及含結(jié)合補體級聯(lián)抑制劑的化合物。所述化合物可便利地與補體級聯(lián)組合物中的受體結(jié)合，因此，可抑制補體級聯(lián)，或抑制由級聯(lián)形成的蛋白質(zhì)(例如C3a和C5a)的作用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供治療患者的包含結(jié)合補體抑制劑的藥物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供通過抑制補體級聯(lián)激活治療患者的方法，所述方法包括給予患者結(jié)合補體抑制劑。通過本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中的闡述，本發(fā)明的這些和其它方面會更為清楚。
文檔編號A61P7/00GK101065148SQ200480024455
公開日2007年10月31日 申請日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月3日
發(fā)明者N·蘇巴辛赫, E·哈利爾, F·阿利, H·R·哈夫納格爾, S·K·巴倫蒂恩, J·M·特拉文斯, K·A·萊昂納, R·F·博恩 申請人:奧索-麥克尼爾藥品公司