專利名稱：用于治療疾病的靶向補體因子h的制作方法
技術領域：
00021 本申請涉及治療牽涉補體旁路的疾病的組合物和方法。具體地，本
申請涉及治療牽涉補體旁路的疾病的CR2-FH分子及其用途。
關于聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)的聲明00031 本申請是在由美國國立衛(wèi)生研究院(the National Institutes of Health)
授予的授權(合同)號AI47469、 AI31105和EY13520的政府支持下進行的。
背景技術：
0004
補體是一系列血液蛋白質(zhì)的總稱，并且是免疫系統(tǒng)的主要效應子機
制。補體在許多自身免疫、炎癥和缺血性疾病的病理學上起著重要作用，并且也 是造成許多與生物不相容性相關的疾病狀態(tài)的原因。不適當?shù)难a體激活及其在宿 主細胞上的沉積由于產(chǎn)生強有力的炎癥介質(zhì)可導致補體介導的靶結構細胞溶解以 及組織破壞。 本文所引用的所有出版物、專利、專利申請和公布的專利申請的公
開內(nèi)容通過引用以其全部在此被并入。
發(fā)明內(nèi)容
00091 本發(fā)明一方面提供CR2-FH分子，其包括a)包含CR2或其片段的
CR2部分，和b)包含F(xiàn)H或其片段的FH部分。在一些實施方式中，提供CR2-FH 分子，其包括a)包含CR2或其片段的CR2部分，和b)包含F(xiàn)H或其片段的 FH部分，其中CR2-FH分子能結合CR2配體并且其中CR2-FH分子能抑制旁路途 徑的補體激活。在一些實施方式中，提供的是分離的CR2-FH分子。在一些實施 方式中，提供的是包括CR2-FH分子的組合物(例如藥物組合物)。在一些實施方式中，所述CR2部分和所述FH部分以融合蛋白的形式直接或間接地相互融合。 在一些實施方式中，所述CR2部分和所述FH部分通過化學交聯(lián)劑被連接。在一 些實施方式中，所述CR2部分和所述FH部分是非共價連接的。OOlOj 在一些實施方式中，提供的是CR2-FH融合蛋白，其包括a)包括
CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些實施方式 中，提供CR2-FH分子，其包括a)包含CR2或其片段的CR2部分以及b)包含 FH或其片段的FH部分，其中CR2-FH分子能結合CR2配體并且其中CR2-FH分 子能抑制旁路途徑的補體激活。在一些實施方式中，所述CR2部分和所述FH部 分直接相互融合(即連接的)。在一些實施方式中，所述CR2部分和所述FH部 分通過氨基酸連接體序列連接。在一些實施方式中，所述CR2部分的C-末端與所 述FH部分的N-末端連接(直接或間接地)。在一些實施方式中，所述CR2部分 的N-末端與所述FH部分的C-末端連接(直接或間接地)。 在另一方面，提供的是藥物組合物，其包括CR2-FH分子和藥學上
可接受的載體。在一些實施方式中，所述藥物組合物包括CR2-FH分子和適合于 給人施用的藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，所述藥物組合物包括 CR2-FH分子和適合于眼內(nèi)注射的藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，所述 藥物組合物包括CR2-FH分子和適合于局部施用于眼睛的藥學上可接受的載體。 在一些實施方式中，所述藥物組合物包括CR2-FH分子和適合于靜脈注射的藥學 上可接受的載體。在一些實施方式中，所述藥物組合物包括CR2-FH分子和適合 于注射到動脈(例如腎動脈)、肝或腎的藥學上可接受的載體。
圖8提供小鼠CR2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 15)和小鼠FH的氨
基酸序列(SEQIDNO:16)。
0036] 圖9提供示例性小鼠CR2-FH融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID
NO:17)和編碼小鼠CR2-FH加上所述信號肽的示例性多核苷酸序列(SEQ ID NO:18)。
圖15A提供如通過血清尿素氮(SUN)所測量的CR2-fH對腎功能
影響的圖示。圖15B提供CR2-fH對腎形態(tài)的影響的圖示。圖15C和15D提供用 小鼠C3的FTIC結合抗體溫育的對照小鼠(15C)和CR2-fH治療小鼠(15D)的 腎切片的免疫熒光染色結果。
0043
圖16提供在用或沒用CR2-fH治療的小鼠中a-和b-波視網(wǎng)膜應答結果。
變體包括由于誘變的緣故氨基酸序列不同的融合蛋白。此外，
CR2-FH分子(例如融合蛋白)的生物等價類似物還可以通過對CR2部分和/或FH 部分中的殘基或序列進行各種置換而構建。
10104
在一些實施方式中，CR2-FH分子，尤其是CR2-FH融合蛋白，在其
N-末端融合于信號肽。這樣的信號肽用于CR2-FH分子的分泌。合適的信號肽包 括例如CD5蛋白質(zhì)的信號(諸如人類CD5蛋白的信號肽 MPMGSLQPLATLYLLGMLVAS， SEQIDNO:ll)。在一些實施方式中，使用的 是CR2蛋白質(zhì)的信號肽。例如，在一些實施方式中，使用的是人類CR2蛋白質(zhì)的 信號肽 (MGAAGLLGVFLALVAPG ， SEQ ID NO:13 ， 或者 MGAAGLLGVFLALVAPGVLG， SEQIDNO:25)。
0 2-尸//分子游劍備 在一些實施方式中，宿主細胞是非人類宿主細胞。在一些實施方式
中，宿主細胞是CHO細胞。在一些實施方式中，宿主細胞是293細胞。0114
CR2-FH分子可通過本領域中已知的各種方法進行分離。在一些實施
方式中，當CR2-FH分子是分泌到生長培養(yǎng)基中的融合蛋白時，該分子可直接從 該培養(yǎng)基中提純。如果融合蛋白不是分泌的，它從細胞裂解物分離。細胞破碎可 以通過任何常規(guī)方法進行，包括冷凍-融循環(huán)、聲波處理、機械破碎或使用細胞裂 解劑。CR2-FH分子能夠通過各種方法獲得。這些方法包括但不限于免疫親和層析、 反相層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水作用層析、凝膠過濾層析和 HPLC。例如，CR2-FH分子可以使用識別CR2部分的抗體或者識別FH部分的抗 體或者兩者通過免疫親和層析進行提純。在一些實施方式中，識別CR2的前兩個 N-末端SCR結構域的抗體被用于提純CR2-FH分子。在一些實施方式中，CR2-FH 分子通過離子交換層析進行提純。 肽當被表達為融合蛋白時，可能或者可能沒有被正確折疊。這些因
素決定了融合蛋白是否必須被變性和重折疊，以及如果這樣的話，在切割之前或 之后這些方法是否被應用。當變性和重折疊是需要的時候，典型地肽用離液劑諸 如鹽酸胍進行處理，然后在合適的比例、pH和溫度下用氧化還原緩沖液進行處理， 所述氧化還原緩沖液含有例如還原的和氧化的二硫蘇糖醇或谷胱甘肽，這樣肽被 重折疊成其天然結構。
01161 本文所述的CR2-FH分子還可包含提純用的標記(例如可切割的標
記)。該標記可被融合于CR2部分或FH部分的C-末端或N-末端，并且可用于幫 助蛋白質(zhì)提純。 CR2-FH分子可以釆用體外或體內(nèi)試驗測定它們的期望特性。例如，
CR2-FH與CR2配體的結合可以通過表面等離子共振法測定。舉例來說，CR2-FH 與C3dg-生物素的相互作用的動力學分析可以采用在BIAcore 3000儀器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)上進行的表面等離子共振(SPR)測量方法進行。人C3dg-生物素可以結合到BIAcore鏈霉抗生物素蛋白傳感器芯片的表面上，這是通過將 C3dg-生物素注射在該芯片的一個液體池(flow cell)表面上而實現(xiàn)的。結合可以 在CR2-FH濃度范圍內(nèi)進行評價。CR2-FH分子與配體的聯(lián)合可以監(jiān)視一段時間(例 如120秒)，之后讓該復合物在緩沖液的存在下解離僅僅另外的一點時間(例如 20秒)。CR2融合蛋白片段與C3dg-固定的液體池的結合可以根據(jù)與對照液體池 的結合進行校正。結合數(shù)據(jù)可以釆用BIA評價版本3.1軟件(BIAcore)擬配(fit) 成1:1 Langmuir結合模型，并且對最佳擬配進行評價。所獲得的動力學解離曲線 可用于借助BIA評價版本3.1程序(BIAevaluation Version 3.1 program)計算結合 和解離速率(on and off rates) (ka和kd)以及親和常數(shù)(KD)。配體結合的其它試 驗方法在本領域中是已知的并且也可以使用。
01191 體外酵母聚糖補體試驗可用于測定CR2-FH分子的補體抑制活性。
兔紅細胞在Mg-EGTA中被血清裂解是可以使用的另一種活性測量法。已經(jīng)去除唾 液酸的人或羊紅細胞在Mg-EGTA中的裂解提供另外的活性測量法。 在一些實施方式中，藥物組合物包括CR2-FH分子以及適合于給人
施用的藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，藥物組合物包括CR2-FH分子 以及適合于眼內(nèi)注射的藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，藥物組合物包 括CR2-FH分子以及適合于外部施用于眼睛的藥學上可接受的載體。在一些實施 方式中，藥物組合物包括CR2-FH分子以及適合于靜脈內(nèi)注射的藥學上可接受的 載體。在一些實施方式中，藥物組合物包括CR2-FH分子以及適合于注射到動脈 (例如腎動脈)內(nèi)的藥學上可接受的載體。 在一些實施方式中，提供的是治療個體中涉及補體旁路的疾病(諸
如黃斑變性，例如AMD)的方法，其包括給所述個體施用有效量的包括CR2-FH 分子的組合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部分和b) 包括FH或其片段的FH部分。在一些實施方式中，提供的是在具有其中涉及補體 旁路的疾病(諸如黃斑變性，例如AMD)的個體中抑制補體激活的方法，其包括 給所述個體施用有效量的包括CR2-FH分子的組合物，所述CR2-FH分子包括a) 包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些實施 方式中，提供的是在具有其中涉及補體旁路的疾病(諸如黃斑變性，例如AMD) 的個體中抑制炎癥的方法，其包括給所述個體施用有效量的包括CR2-FH分子的 組合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括 FH或其片段的FH部分。 在一些實施方式中，提供的是治療(例如減少、延遲、消除或預防)
個體眼睛中玻璃疣形成的方法，其包括給所述個體施用有效量的包括CR2-FH分子的組合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包 括FH或其片段的FH部分。在一些實施方式中，提供的是治療(例如減少、延遲、 消除或預防)個體眼睛中炎癥的方法，其包括給所述個體施用有效量的包括 CR2-FH分子的組合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部 分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些實施方式中，提供的是治療(例如 減少、延遲、消除或預防)個體中感光細胞喪失的方法，其包括給所述個體施用 有效量的包括CR2-FH分子的組合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其 片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些實施方式中，提供的 是治療(例如減少、延遲、消除或預防)個體中感光細胞喪失的方法，其包括給 所述個體施用有效量的包括CR2-FH分子的組合物，所述CR2-FH分子包括a)包 括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些實施方 式中，提供的是治療(例如減少、延遲、消除或預防)與AMD相關的新血管形成 的方法，其包括給所述個體施用有效量的包括CR2-FH分子的組合物,所述CR2-FH 分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括HH或其片段的FH部分。 在一些實施方式中，提供的是治療(例如減少、延遲、消除或預防)與AMD相關 的視網(wǎng)膜脫落的方法，其包括給所述個體施用有效量的包括CR2-FH分子的組合 物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或 其片段的FH部分。在一些實施方式中，提供的是提高(包括例如減少、延遲或阻 止)個體眼睛中視力或視野丟失的方法，其包括給所述個體施用有效量的包括 CR2-FH分子的組合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部 分和b)包括FH或其片段的FH部分。 在一些實施方式中，要治療的疾病是缺血再灌注。缺血再灌注(I/R)
損傷涉及低氧組織再灌注后內(nèi)皮和下面的軟組織的炎性損傷。它是造成對各種組 織急性和慢性損傷的原因的常規(guī)綜合癥，所述各種組織包括例如心肌、中樞神經(jīng) 系統(tǒng)、后(下)肢和腸。缺血再灌注可導致壞死和不可逆轉的細胞損傷。補體途 徑(包括補體旁路)是I/R損傷的主要介質(zhì)。本文提供的方法因此可用于治療發(fā)生 在任何器官或組織的缺血再灌注，其包括但不限于腸缺血-再灌注損傷、腎缺血-再灌注損傷、心臟缺血-再灌注損傷、其它內(nèi)部器官諸如肺或肝缺血-再灌注損傷、 中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血-再灌注損傷、肢或趾缺血-再灌注損傷、外傷引起的血容量不足 或者任何移植的器官或組織缺血-再灌注損傷。缺血-再灌注損傷也可與各種其它病 癥一起發(fā)生，所述其它病癥括但不限于中風、脊髓損傷、外傷引起的低血容量性 休克、以及自身免疫疾病諸如類風濕性關節(jié)炎(例如其可能由于滑膜的缺血性損傷而極大惡化)或者各種其它炎性疾病(炎癥介導的疾病或者其中炎癥是可能導 致或涉及缺血事件和再灌注的癥狀的疾病)。其中發(fā)生缺血再灌注損傷的其它病 癥和疾病將是本領域技術人員所知的。 組合物的最佳有效量可憑經(jīng)驗確定并且將取決于疾病的類型和嚴重 性、給藥途徑、疾病進展以及個體的健康、質(zhì)量和身體面積。該確定方法在本領 域技術人員的技能內(nèi)。有效量也可基于體外補體激活試驗確定。本文所述方法可 用的CR2-FH分子劑量的實例包括但不限于在下列之一的劑量范圍內(nèi)的有效量 約0.01 pg/kg至約300 mg/kg、或者約0.1 pg/kg至約40 mg/kg、或者約1 pg/kg至 約20mg/kg、或者約1 pg/kg至約10mg/kg。例如，當眼內(nèi)給藥時，組合物可以在 低微克范圍內(nèi)給藥，包括例如約0.1 pg/kg或以下、約0.05 pg/kg或以下或者約0.01 Hg/kg或以下。在一些實施方式中，CR2-FH施用于個體的量為每劑量約lOpg至 約500 mg,包括例如下列之一每劑量約10 ng至約50 pg、約50 至約100嗎、 約100 |xg至約200 pg、約200 至約300 ng、約300 (ig至約500嗎、約500 至約1 mg、約1 mg至約10 mg、約10 mg至約50 mg、約50 mg至約100 mg、約 100 mg至約200 mg、約200 mg至約300 mg、約300 mg至約400 mg或者約400 mg 至約500 mg。0157
CR2-FH組合物可以以單一日劑量給藥，或者總日劑量可以以每天兩
次、三次、或四次的分劑量給藥。組合物也可以比每天一次更少頻率地給藥，例 如一周六次、 一周五次、 一周四次、 一周三次、 一周兩次、 一周一次、每兩周一 次、每三周一次、 一月一次、每兩月一次、每三月一次或每六月一次。組合物也 可以以持續(xù)釋放的制劑給藥，諸如植入物，其在一段時間內(nèi)逐漸釋放組合物使用， 并且其允許組合物以較少的頻率給藥，諸如一月一次、每2-6個月一次、每年一次 或者甚至一次性給藥。持續(xù)釋放裝置(諸如小球、納米顆粒、微粒、納米球、微 球等)可以通過注射給予或手術移植在眼睛或與眼睛相關組織中的不同位置，諸 如眼內(nèi)、玻璃體內(nèi)、視網(wǎng)膜下、眼周、結膜下或眼球筋膜下(sub-Tenons)。
藥物組合物可以單獨或與其它分子一起給藥，所述其它分子已知對
視網(wǎng)膜連接或損壞的視網(wǎng)膜組織具有有益作用，其包括能進行組織修復和再生和/ 或抑制炎癥的分子。有用的輔因子的實例包括抗VEGF劑(如抗VEGF的抗體)、 堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、睫狀節(jié)神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子(CNTF) 、 axokine (CNTF的突變蛋白質(zhì))、白血病抑制因子(LIF)、向神經(jīng)素3 (NT-3)、向神經(jīng) 素-4(NT-4)、神經(jīng)生長因子(NGF)、胰島素樣生長因子II、前列腺素E2、 30 kD存 活因子、牛磺酸和維生素A。其它有用的輔因子包括減輕癥狀的輔因子，其包括 殺菌劑、抗生素、抗病毒和抗真菌劑以及鎮(zhèn)痛藥和麻醉劑。
纖浙 因此，本發(fā)明包括治療個體中本文所述的一種或多種疾病的方法，
其包括在允許CR2-FH分子發(fā)揮抑制補體激活作用的條件下在體外 (extracoporeally)(即在身體外部或者離體(e;c v/vo))用包括CR2-FH分子的 組合物處理個體的血液，并且將該血液返回到個體中。
單位劑量、制品及試劑盒
0171
還提供的是CR2-FH分子組合物的單位劑型，每劑包含約0.01 mg
至約50 mg的CR2-FH分子，其包括例如下列之一約0.1 mg至約50 mg、約1 mg 至約50 mg、約5 mg至約40 mg、約10 mg至約20 mg、或者約15 mg的CR2-FH 分子。在一些實施方式中，CR2-FH分子組合物的單位劑型包括大約下列任一 0.01 mg-0.1mg、 0.1 mg-0.2mg、 0.2 mg-0.25 mg、 0.25 mg-0.3 mg、 0.3 mg-0.35 mg、 0.35 mg-0.4 mg、0.4 mg-0.5 mg、0.5 mg-l.O mg、 10 mg-20 mg、20mg -50 mg、50 mg-80 mg、 80mg掘mg、 100mg-150mg、 150mg-200mg、 200mg-250mg、 250mg-300 mg、 300mg-400mg或者400mg-500mg的CR2-FH分子。在一些實施方式中，單 位劑型包括大約0.25 mg CH2-FH分子。術語"單位劑型"是指對于個體而言適合作 為單一劑量的物理上離散的單位，每一單位含有經(jīng)計算產(chǎn)生期望治療效果的預定 量的活性物質(zhì)以及合適的藥物載體、稀釋劑或賦形劑。這些單位劑型可以以單個 或多個單位劑量儲存在合適的包裝中，并且還可進一步進行滅菌和密封。 圖11提供CR2LFHFH——含有通過連接體序列連接到兩個FH部分
的CR2部分的小鼠CR2-FH融合蛋白——的DNA序列(SEQ ID NO:20)。 [0179
圖20提供人類CR2-FH融合蛋白(被稱為人類CR2-fH或CR2fH)
的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)和編碼人類CR2-ffl加上信號序列的多核苷酸(SEQ ID NO:22)。 圖13提供采用小鼠的帶有連接體的CR2-FH融合蛋白(CR2LFH)、
不帶連接體的CR2-FH融合蛋白(CR2NLFH)、帶有連接體的CR2-FH-FH (CR2LFHFH)和CR2-Crry在體外酵母聚糖補體實驗中獲得的數(shù)據(jù)的圖示。如該圖 所示，CR2-FH在抑制旁路途徑的補體激活方面比CR2-Crry更有效。CR2LFH和 CR2NLFH在抑制旁路途徑的補體激活方面同等有效。CR2LFHFH比CR2LFH和 CR2NLFH有效得更多。
實施例3.通過CR2-FH治療腸缺血和再灌注損傷
01861 該試驗顯示在小鼠模型中治療腸缺血和再灌注損傷。
0187
厲欽i^"蘑注銜傷。三只8周齡且體重20-25g的成年雄性小鼠通過
腹腔注射用10mg/kg氯胺酮和6mg/kg甲苯噻嗪進行麻醉。動物自然呼吸并且整個
試驗采用加熱墊保持體溫。進行中間剖腹術(medial laparotomy)并且將腸小心移動
以允許接近腸系膜上動脈。腸系膜上動脈用顯微手術夾鉗(Fine Instruments, USA)
夾住。缺血通過小腸的palor證實。假治療的小鼠經(jīng)歷剖腹術，而沒有夾住腸系膜
上動脈。30分鐘缺血后，去除動脈夾允許腸系膜脈管系統(tǒng)再灌注。動物采用6.0愛惜邦縫合線(ethicon suture)進行縫合并且讓其再灌注2小時。再灌注30分鐘 后經(jīng)靜脈注射施用0.1 mg或0.05 mg CR2-fH或對照(PBS)，并且在總共2小時 的再灌注之后90分鐘將動物處死。 蘊一織學。用于組織染色的組織樣品取自腸，并且在4'C下固定在10%
福爾馬林中過夜并且隨后處理到石蠟中，或者在液氮中冷凍，進行免疫熒光分析。 來自每個動物的腸切片用蘇木精和伊紅進行染色，并且對粘膜損傷和絨毛重量進 行打分，如前所述(46)。簡單地說，0分定為正常絨毛；末端畸變的絨毛為1分； 缺乏杯狀細胞并且含有Gugenheims空間的絨毛為2分；上皮細胞鱗片狀碎裂的絨 毛為3分；固有層暴露但完整且上皮細胞脫落的絨毛為4分；固有層滲出的絨毛 為5分；并且，最后，呈現(xiàn)出血的絨毛或者脫落的絨毛為6分。所有的組織學評 價是以盲式的方式進行的。 免;^^為。對于免疫熒光來說，腎的矢狀切面在OCT化合物(Sakura
Finetek)中驟冷。4pm切片用低溫恒溫器切下并且儲存在-7(TC下。載玻片隨后用 丙酮固定，并且與小鼠C3的FITC結合抗體(Cappel)溫育。與該抗體在室溫下 雜交一小時后，載玻片用蘇木精(Vector Laboratories, Inc.)復染色。試驗結果顯 示在圖15C和15D中。如該圖所示，相對于小鼠CR2-fH治療的小鼠(15D)，更 多的C3沉積到假治療的小鼠(15C)的腎上。
實施例5.通過CR2-FH治療年齡相關性黃斑變性 用下列三個參數(shù)測量CR2-FH的作用機能活性(ERG和DC潛能，
即光感受器和RPE應答)、組織學和炎癥測定(例如通過RT-PCR的基因表達以 及通過免疫組織化學的蛋白質(zhì)表達)。 對于CNV損壞的評價，CNV大小在用同工凝集素B (其在內(nèi)皮細胞
的表面上結合于末端B-D-半乳糖殘基并且選擇性地標記小鼠血管系統(tǒng))染色的 RPE/脈絡膜的平鋪片制備物中進行測定。采用共聚焦顯微術在2 pm切片上獲取的 熒光測量被用于大小測定。簡而言之，全部試驗采用相同的激光強度設置獲得整 個CNV損壞的Z堆積圖像。對于每個切片，測定總熒光并相對于深度進行繪圖。 [0207
對于視網(wǎng)膜電描記術，動物用甲苯噻嗪(20 mg/kg體重)和氯胺酮
(80 mg/kg體重)進行麻醉。瞳孔用一滴鹽酸去氧腎上腺素(2.5%)和托吡卡胺 (1%)進行擴大。體溫通過保持在37'C的DC驅動的加熱墊進行穩(wěn)定。所用的ERG 設置先前由Rohrer等，J. Neurosci.， 1999, 19(20): 8919-30描述，并且根據(jù)Lyubarsky 和Pugh Lyubarsky等，J. Neurosci.， 1996, 16(2):563-571構建。剌激光強度釆用中性 密度過濾器進行控制。刺激范例。讓動物暗適應過夜并且將記錄ERG。分析視網(wǎng) 膜桿(Rods)對增加光強度的單閃光刺激的應答。單閃光應答是平均至少三次閃 光，其中刺激間時間間隔(ISI)為15s至2min (分別從最低強度至最高)。不同 的ISI保證第一次和最后一次閃光之間給定強度下的ERG振幅是相同的。數(shù)據(jù)分析。對于所有ERG記錄，a-波振幅是從基線至波谷測量；b-波振幅是從a-波波谷 或基線至b波的波峰測量；并且內(nèi)隱時間(implicit times)從刺激開始至a-波波谷 或b-波波峰測量。 圖16顯示在用或沒用CR2-fH治療的小鼠中a-和b-波視網(wǎng)膜應答。
如圖16所示，相對于PBS治療，視網(wǎng)膜應答的a-和b-波被CR2-fH治療行保護。 圖17A和17B顯示激光燒傷后6天損傷的同工凝集素-b染色。圖17C顯示基于同 工凝集素-b染色損傷大小的量化。如圖17A-C所示，與用PBS治療的動物相比， 用CR2-fH治療的小鼠表現(xiàn)出損傷大小的顯著降低。 小鼠CR2-fH對急性血管排斥的作用顯示在圖21中。如該圖所示，
相比11.U1.6天(單劑量組)和10.7±1.3天(多劑量組)，對照心臟移植受者存 活7.1±1天。當與對照比較時，用小鼠CR2-fH治療的小鼠的存活率有顯著提高 (p=0.02)。
02151 在收獲時任意組之間病理排斥特性或者抗供體的抗體水平方面沒有 明顯差別。令人感興趣的是，當與單劑量組比較時，與施用多劑量小鼠CR2-fH相 關的存活率似乎沒有明顯提高(p<0.05)。實施例8.通過人類CR2-FH抑制補體旁路
0216
不包括信號肽的人類CR2-FH(SEQIDNO:21,也被稱為CR2fH)和人
類CR2-FH2 (SEQ ID NO:23，也被稱為CR2fH2)的蛋白質(zhì)序列分別顯示在圖20和 21中。包括信號肽的核苷酸序列的人類CR2-FH(SEQIDNO:22)和人類CR2-FH2 (SEQIDNO:24)的核酸序列分別顯示在圖20和21中。 為了進一步證實采用CR2-FH所觀察到的C3b沉積的抑制是由于補
體旁路的抑制所致，我們研究了在不存在經(jīng)典途徑(C4VC4-小鼠)下CR2-FH對 C3b沉積的作用。鈣抑制了凝集素補體途徑。圖24顯示了釆用來自C4VC4-基因 敲除小鼠的血清，小鼠CR2-FH在鈣足量緩沖液中的滴定曲線。如該圖所示，在 0.5嗎~1濃度下CR2-FH明顯抑制C3b沉積。
[02231 盡管為了清楚理解的目的，前述發(fā)明已經(jīng)通過說明和實施例的方式
被詳細地描述，進行某些微小的變化和修飾對本領域技術人員來說是明顯的。因 此，說明和實施例不應當理解為對本發(fā)明范圍的限制。
權利要求
1.CR2-FH分子，其包括a)包含CR2或其片段的CR2部分，和b)包含F(xiàn)H或其片段的FH部分，其中所述CR2-FH分子能結合CR2配體，并且其中所述CR2-FH分子能抑制旁路途徑的補體激活。
2. 權利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2部分包括CR2的至少前兩個 N-末端SCR結構域。
3. 權利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2部分包括CR2的至少前四個 N-末端SCR結構域。
4. 權利要求1的CR2-FH分子，其中所述FH部分包括FH的至少前四個SCR 結構域。
5. 權利要求1的CR2-FH分子，其中所述FH部分包括FH的至少前五個SCR 結構域。
6. 權利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2-FH分子包括兩個或更多個FH部分。
7. 權利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2部分包括CR2的前四個N-末 端SCR結構域，并且所述FH部分包括FH的前五個SCR結構域。
8. 權利要求7的CR2-FH分子，其中所述CR2部分包括SEQ ID NO:l的氨 基酸23至271,并且所述FH部分包括SEQ ID NO:2的氨基酸21至320。
9. 權利要求l的CR2-FH分子，其中所述CR2-FH分子是融合蛋白。
10. 多核苷酸，其編碼權利要求9所述的融合蛋白。
11. 載體，其編碼權利要求10所述的多核苷酸。
12. 宿主細胞，其包含權利要求11所述的多核苷酸。
13. 藥物組合物，其包括權利要求1的CR2-FH分子和藥學上可接受的載體。
14. 權利要求13的組合物，其中所述組合物適于眼內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮 下、氣管內(nèi)或吸入給藥。
15. 治療在個體中涉及補體旁路的疾病的方法，所述方法包括給所述個體施 用有效量的權利要求13所述的藥物組合物。
16. 權利要求15的方法，其中所述涉及補體旁路的疾病是下列中任一種黃 斑變性、類風濕性關節(jié)炎、缺血再灌注、器官移植排斥、MPGN II、 HUS和狼瘡 腎炎。
17. 權利要求16的方法，其中所述涉及補體旁路的疾病是年齡相關性黃斑變性。
18. 權利要求16的方法，其中所述涉及補體旁路的疾病是缺血再灌注。
19. 權利要求16的方法，其中所述涉及補體旁路的疾病是器官移植排斥。
全文摘要
本發(fā)明提供CR2-FH分子，其包括包含CR2蛋白質(zhì)或其片段的CR2部分以及包含因子H蛋白質(zhì)或其片段的FH部分，以及包括CR2-FH分子的藥物組合物。還提供的是使用該組合物治療疾病的方法，其中涉及補體旁路，例如年齡相關性黃斑變性、類風濕關節(jié)炎和缺血再灌注。
文檔編號C07K14/435GK101563363SQ200780029458
公開日2009年10月21日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權日2006年6月21日
發(fā)明者B·羅雷爾, G·吉爾克森, S·湯姆林森, V·M·霍爾勒斯 申請人:南卡羅來納醫(yī)療大學研究發(fā)展基金會;科羅拉多大學校董事會