專利名稱：陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、溶血性貧血和涉及血管內(nèi)和血管外溶血的疾病狀態(tài)的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用補(bǔ)體旁路抑制劑和補(bǔ)體成分C3片段活性用于治療遭受涉及紅細(xì)胞異常溶解——包括血管內(nèi)和血管外溶血——的疾病的對(duì)象的方法和物質(zhì)。更具體地，本發(fā)明涉及用于治療具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、aHUS、溶血性貧血和涉及補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血的其它疾病的對(duì)象的方法和物質(zhì)，所述補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血可能涉及未被末端補(bǔ)體抑制劑，如C5活性抑制劑充分治療的血管外成分。
背景技術(shù)：
補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血性貧血是重要的健康問題，并引起許多紅細(xì)胞疾病，如陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)。PNH是一種血液疾病，其特征為由于磷脂酰肌醇多聚糖A類(phosphatidylinositol glycan class) (PIG-A)基因的獲得性體細(xì)胞突變,不能進(jìn)行糖基化磷脂酰肌醇(GPI)-錨定生物合成的一個(gè)或少數(shù)造血干細(xì)胞的克隆擴(kuò)充。受影響的后代細(xì)胞缺少所有的GPI錨定的表面蛋白——包括補(bǔ)體調(diào)節(jié)子⑶55和⑶59。因此，PNH紅細(xì)胞(RBCs)易受激活的補(bǔ)體的影響，特別是易受膜攻擊復(fù)合物(MAC)的影響，導(dǎo)致具有反復(fù)惡化的慢性血管內(nèi)溶血。影響紅細(xì)胞的其它補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥包括非典型的溶血性尿毒性綜合征(aHUS);慢性溶血性貧血；抗體介導(dǎo)的自身免疫性溶血性貧血；由血紅蛋白病如鐮狀紅細(xì)胞病引起的貧血；由感染如瘧疾引起的貧血；由于輸血反應(yīng)引起的貧血；和冷凝集素病(CAD) ο用艾庫(kù)珠單抗(eculizumab)-針對(duì)補(bǔ)體成分5(C5)的單克隆抗體(Mab)-
的治療已在PNH和其它血液疾病中部分有效。然而，具有PNH的患者的重要亞群顯示對(duì)用抗C5Mab治療的欠佳血液反應(yīng)。在該亞群中，幾乎沒有觀察到貧血的改善,一些患者仍然需要輸血，具有持續(xù)溶血的持續(xù)征兆(網(wǎng)狀細(xì)胞增多、提高的非結(jié)合膽紅素)。Risitano andRotoli，Biologies，2:205-222 (2008)。復(fù)發(fā)可被表征為“突破”，其中盡管用末端補(bǔ)體抑制劑治療，但是溶血活性可持續(xù)。Hill et al. , Blood, 106:2559-65 (2005) 對(duì)于這些對(duì)象，需要對(duì)PNH有效治療的另外的方法和物質(zhì)。補(bǔ)體抑制劑在本領(lǐng)域是已知的，并且已研發(fā)了定向補(bǔ)體抑制劑的新種類，其允許以導(dǎo)致抑制劑在補(bǔ)體被激活的組織部位高度局部的濃度，同時(shí)最小化潛在的不利全身效應(yīng)的方式治療。該類抑制劑包括，例如，TT30 (SEQ ID N0:3)、TT31和TT32。TT30是一種免疫調(diào)節(jié)化合物，其抑制補(bǔ)體旁路。TT30包括H因子蛋白的補(bǔ)體旁路抑制部分，其通過與補(bǔ)體受體2蛋白(CR2或CD21)部分的融合而靶向補(bǔ)體激活和炎癥的部位，已知該補(bǔ)體受體2蛋白(CR2或CD21)結(jié)合補(bǔ)體成分3 (C3)的固定組織/細(xì)胞的片段。TT31與TT30相似，但是含有H因子蛋白的補(bǔ)體旁路抑制部分的另外的拷貝。TT32包括補(bǔ)體受體I (CRl)的補(bǔ)體抑制部分，其通過與CR2蛋白的同一部分結(jié)合而被靶向。已知CRl是較H因子更寬的補(bǔ)體抑制齊IJ。TT32將因此不但抑制補(bǔ)體旁路，而且將局部地抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑和凝集素途徑。合適的定向抑制劑在Gilkeson et al.，美國(guó)專利公開2008/0221011中有描述，其公開在此通過引用被特別地并入本文。發(fā)明概述補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)表示與補(bǔ)體激活相關(guān)的許多病理狀態(tài)的治療形式。然而，如上面所概述的，全部或部分由于血管外溶血，具有PNH和其它形式貧血的對(duì)象的重要亞群對(duì)用末端補(bǔ)體抑制劑，如抗C5Mab、艾庫(kù)珠單抗的治療沒有最佳反應(yīng)。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)遭受補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的疾病，如PNH——不被末端補(bǔ)體抑制劑有效地或最佳地治療——的對(duì)象令人驚訝地可用抑制補(bǔ)體旁路的組合物有效地治療，并通過該活性阻斷放大性C3轉(zhuǎn)化酶在PNH紅細(xì)胞表面上的形成和活性。在某些實(shí)施方式中，抑制補(bǔ)體成分C3激活的本發(fā)明的組合物因此不僅抑制補(bǔ)體旁路的放大環(huán)路，還可通過自發(fā)的C3 ‘空轉(zhuǎn)(tickover)’部分地抑制旁路途徑激活。在某些實(shí)施方式中，除了補(bǔ)體旁路的抑制，本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步顯示對(duì)其它補(bǔ)體途徑，如經(jīng)典和凝集素激活途徑的抑制作用。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)具有對(duì)末端補(bǔ)體抑制劑，如艾庫(kù)珠單抗具有欠佳血液應(yīng)答的對(duì)象可顯示由除MAC外的補(bǔ)體效應(yīng)機(jī)理介導(dǎo)的血管外溶血?；赗BCs上補(bǔ)體部分3 (C3)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，我們提供GPI陰性紅細(xì)胞的選擇性C3調(diào)理作用的證據(jù)。該現(xiàn)象的程度趨于與對(duì)艾庫(kù)珠單抗的臨床應(yīng)答相關(guān)，并可以是PNH病理生理學(xué)中新的現(xiàn)象的表示。雖然不被任何一個(gè)理論束縛，但是在C5水平靶向末端補(bǔ)體可能不保護(hù)紅細(xì)胞抵御通過可導(dǎo)致血管外溶血的早期補(bǔ)體成分(即，C3)的損傷。據(jù)信，用末端補(bǔ)體抑制劑，如艾庫(kù)珠單抗的治療可允許低水平的血管內(nèi)溶血繼續(xù)進(jìn)行，可能通過涉及C5轉(zhuǎn)化酶積累的機(jī)制足以使LDH保持在高的正常范圍和使HgB保持低的正常范圍，該C5轉(zhuǎn)化酶在單克隆抗體的正常開關(guān)循環(huán)期間最終可勝出針對(duì)C5的末端補(bǔ)體抑制劑。這得到溶血的藥物代謝動(dòng)力學(xué)‘突破’的發(fā)生的支持，已報(bào)道這在艾庫(kù)珠單抗的血液水平降到‘低谷(trough) ’ 35ug/mL濃度以下的患者中發(fā)生。本發(fā)明人認(rèn)為突破還可由其它危險(xiǎn)情況，如病毒感染或增加的補(bǔ)體激活的其它原因——其可導(dǎo)致干擾艾庫(kù)珠單抗、C5和C5轉(zhuǎn)化酶之間的平衡——引起。本發(fā)明人認(rèn)為，PNH紅細(xì)胞上C3片段的積累通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中細(xì)胞的激活促成病毒相關(guān)的突破。此外，然而，通過在細(xì)胞表面界面結(jié)合C5，用末端補(bǔ)體抑制劑對(duì)溶血性貧血如PNH的治療可有助于C3、C3轉(zhuǎn)化酶、C3片段和C5轉(zhuǎn)化酶的積累，其可促使對(duì)象不能實(shí)現(xiàn)和穩(wěn)定地保持完全正常的血清LDH和HgB水平。因此，本發(fā)明提供用于治療具有補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血的對(duì)象如遭受PNH的那些對(duì)象的方法。這樣的方法靶向早期的補(bǔ)體激活，并能控制血管內(nèi)溶血，以及減少或避免由未控制的C3激活和調(diào)理作用產(chǎn)生的可能的血管外溶血。本發(fā)明的方法和組合物可因此更有效地治療遭受PNH或其它溶血性貧血的患者，可有效地獲得和保持正常的血清LDH和HgB水平并減少或消除已在用末端補(bǔ)體抑制劑治療的患者中觀察到的‘突破’溶血危機(jī)的發(fā)生。因此，本發(fā)明的方法和組合物還更有效地治療遭受PNH的患者，同時(shí)減少或避免這種‘突破’溶血危機(jī)的發(fā)生。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括治療具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)或其它補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病的方法，該方法包括給予有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路活性的組合物，其中所述組合物抑制補(bǔ)體成分C3(C3)的局部激活，例如通過起始C3轉(zhuǎn)化酶而抑制旁路途徑激活和/或通過抑制放大性C3轉(zhuǎn)化酶的形成和/或活性和通過C3片段的紅細(xì)胞調(diào)理作用。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明包括治療顯示血管外溶血的對(duì)象的方法，該血管外溶血可由于補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病，如PNH引起，該方法包括給予有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路活性的組合物，其中所述組合物抑制補(bǔ)體成分C3(C3)的局部激活，例如通過起始C3轉(zhuǎn)化酶而抑制旁路途徑激活和/或通過抑制放大性C3轉(zhuǎn)化酶的形成和/或活性和通過C3片段的紅細(xì)胞調(diào)理作用。
末端補(bǔ)體抑制劑選擇性地抑制補(bǔ)體蛋白C5的切割，并可以是例如，人源化抗C5抗體或其抗原結(jié)合片段，如艾庫(kù)珠單抗或培克珠單抗(pexelizumab)。因此,在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括對(duì)具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿的對(duì)象的治療，其中所述對(duì)象先前已用抗C5抗體，如艾庫(kù)珠單抗或培克珠單抗治療，但是他們的PNH疾病狀態(tài)和/或癥狀持續(xù)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括治療具有補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病，如陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)、非典型的溶血性尿毒性綜合征(aHUS);慢性溶血性貧血；和冷凝集素疾病(CAD)的對(duì)象，其中所述對(duì)象顯示以下特征中的至少一個(gè)，該特征可以是殘余貧血和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的血管外溶血和/或血管內(nèi)溶血沒有完全控制的癥狀對(duì)象顯示進(jìn)行的或間歇的血管內(nèi)溶血和/或血管外溶血引起的連續(xù)紅細(xì)胞喪失的征兆或癥狀；對(duì)象具有受C3片段調(diào)理的紅細(xì)胞；對(duì)象需要定期輸血；對(duì)象具有低的正常水平血紅蛋白或低于正常水平的血紅蛋白；對(duì)象具有低的正常水平血小板或低于正常水平的血小板；對(duì)象具有高的正常網(wǎng)狀細(xì)胞或高于正常的網(wǎng)狀細(xì)胞；對(duì)象具有高的正常膽紅素或高于正常的膽紅素；或?qū)ο缶哂需F超負(fù)荷或面臨鐵超負(fù)荷的危險(xiǎn)。以上特征還可用于監(jiān)測(cè)對(duì)象對(duì)用根據(jù)本發(fā)明的補(bǔ)體旁路抑制劑治療的應(yīng)答的進(jìn)展，和如果認(rèn)為在臨床上合適，用于修改劑量方案。在某些實(shí)施方式中，具有補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病，如PNH的對(duì)象先前已用末端補(bǔ)體抑制劑治療，但是持續(xù)顯示以上特征中的至少一個(gè)。在這種情況下，本發(fā)明提供用于避免或減少以上特征中的至少一個(gè)的發(fā)生和/或嚴(yán)重性的方法和組合物。在另一方面，本發(fā)明包括給予不依賴具有補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病，如PNH的對(duì)象的輸血的方法，其中該對(duì)象顯示對(duì)用末端補(bǔ)體抑制劑的治療欠佳的應(yīng)答。這樣的欠佳的應(yīng)答可包括顯示殘余貧血和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的血管外溶血的以上特征中的至少一個(gè)的對(duì)象。該方法包括給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物，其中所述組合物抑制補(bǔ)體成分C3 (C3)的激活，例如通過起始C3轉(zhuǎn)化酶而抑制旁路途徑激活和/或通過抑制放大性C3轉(zhuǎn)化酶的形成和/或活性和通過C3片段的紅細(xì)胞調(diào)理作用。在另一方面，本發(fā)明包括減少具有PNH的對(duì)象的溶血的方法，該方法包括給予有效量的抑制補(bǔ)體成分C3(C3)的激活的組合物，例如通過起始C3轉(zhuǎn)化酶而抑制旁路途徑激活和/或通過抑制放大性C3轉(zhuǎn)化酶的形成和/或活性和通過C3片段的PNH紅細(xì)胞調(diào)理作用。在再一方面，本發(fā)明包括減少具有PNH的對(duì)象的殘余貧血的方法，該方法包括給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物，其中所述組合物抑制補(bǔ)體成分C3(C3)的激活，例如通過起始C3轉(zhuǎn)化酶而抑制旁路途徑激活和/或通過抑制放大性C3轉(zhuǎn)化酶的形成和/或活性和通過C3片段的紅細(xì)胞調(diào)理作用。在再一方面，本發(fā)明提供增加能幸存于補(bǔ)體攻擊的PNH紅細(xì)胞比例的方法，該方法包括給予有效量的抑制補(bǔ)體成分C3 (C3)的激活的組合物，例如通過起始C3轉(zhuǎn)化酶而抑制旁路途徑激活和/或通過抑制放大性C3轉(zhuǎn)化酶的形成和/或活性和通過C3片段的PNH紅細(xì)胞調(diào)理作用。在本發(fā)明的某些方面，除了抑制補(bǔ)體旁路，該組合物還可抑制經(jīng)典補(bǔ)體途徑和凝集素補(bǔ)體途徑中的一個(gè)或多個(gè)。例如，補(bǔ)體受體I(CRl)被期望對(duì)所有三個(gè)補(bǔ)體途徑具有抑制效應(yīng)。雖然不直接是補(bǔ)體旁路抑制劑，但是MASP-I的抗體在本發(fā)明中也是有用的。這·是因?yàn)閺南到y(tǒng)中去除MASP-I可減少通過經(jīng)典途徑和凝集素途徑產(chǎn)生的C3b的量。獲得較少的C3b，補(bǔ)體旁路的放大環(huán)路可至少被部分抑制。因此，為了本發(fā)明的目的，認(rèn)為MAPI和MASP-I的抗體是可在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中有用的補(bǔ)體旁路抑制劑。參見，Skjodtet al. , Molecular Immunology, 47:2229-30(2010);and Petersen et al. , MolecularImmunology 38:133-149(2001)。在再一方面，本發(fā)明提供減少或避免用末端補(bǔ)體抑制劑治療溶血的對(duì)象中‘突破’溶血危機(jī)發(fā)生的方法。作為對(duì)實(shí)現(xiàn)以上方法有用的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明提供抑制補(bǔ)體旁路活性的藥劑和組合物。這樣的藥劑和組合物可包括有含補(bǔ)體受體2 (CR2)蛋白或其生物學(xué)活性片段的融合蛋白；和補(bǔ)體活性的調(diào)節(jié)劑，其通過調(diào)節(jié)補(bǔ)體成分C3或其切割片段，和/或C3轉(zhuǎn)化酶的存在，例如通過起始C3轉(zhuǎn)化酶而抑制旁路途徑激活和/或通過抑制放大性C3轉(zhuǎn)化酶的形成和/或活性，停止補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的進(jìn)一步進(jìn)行以形成膜攻擊復(fù)合物，和阻止或減少這樣的C3分子或其片段結(jié)合紅細(xì)胞，并特別地阻止或減少C3片段對(duì)PNH紅細(xì)胞的調(diào)理作用而起作用。在優(yōu)選實(shí)施方式中，補(bǔ)體旁路抑制劑可包括CR2蛋白的融合物，或包括CR2至少前兩個(gè)氨基末端短共有重復(fù)序列(short consensus repeat) (SCR)結(jié)構(gòu)域的片段,其與H因子(FH)蛋白或其生物學(xué)活性片段融合。FH蛋白的生物學(xué)活性片段可包括的至少前四個(gè)氨基末端SCR結(jié)構(gòu)域。一個(gè)這樣的補(bǔ)體抑制劑是TT30 (SEQ IDNO: 3)——包括融合到!7H的前五個(gè)氨基末端SCR結(jié)構(gòu)域的CR2的前四個(gè)氨基末端短共有重復(fù)序列(SCR)結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。另一個(gè)這樣的補(bǔ)體抑制劑包括融合到FH的前四個(gè)氨基末端SCR結(jié)構(gòu)域的CR2的前兩個(gè)氨基末端SCR結(jié)構(gòu)域。連接可以在結(jié)構(gòu)域的任何一端，以至于融合蛋白可被從氨基末端到羧基端描述為CR2-FH或FH-CR2。在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，補(bǔ)體旁路抑制劑可包括CR2蛋白的融合物，或其靶向片段，其包括融合到選自Crry、DAF、MCP、補(bǔ)體因子I、compstatin或CR1、或其生物學(xué)活性片段的補(bǔ)體抑制劑的CR2的至少前兩個(gè)氨基末端短共有重復(fù)序列(SCR)結(jié)構(gòu)域。在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，融合蛋白的抑制部分可包括針對(duì)選自B因子、D因子或備解素的因子的抗體；或其抗原結(jié)合片段。如上所述，雖然沒有指向補(bǔ)體旁路抑制劑，但是MASP-I的抑制劑可有效地減少存在的C3b的量，由此至少部分抑制補(bǔ)體旁路的放大環(huán)路。因此，MASPl蛋白的抑制劑，如MASPl的抗體和內(nèi)源性MASPl抑制劑MAPI在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中可以是有用的。在優(yōu)選實(shí)施方式中，補(bǔ)體旁路抑制劑包括CR2蛋白的融合物，或其靶向片段，其包括在第三SCR結(jié)構(gòu)域內(nèi)融合到因子B抗體的CR2的至少前兩個(gè)氨基末端短共有重復(fù)序列(SCR)結(jié)構(gòu)域，并阻止C3bBb復(fù)合物或其抗原結(jié)合片段的形成。合適的抗體，例如，在Holerset al.,美國(guó)專利公開2005/0260198和在Emblen et al.，美國(guó)專利公開2008/0299114中有描述。這些文件的公開在此通過引用被特別地并入本文。連接可以在結(jié)構(gòu)域的任何一端，以至于融合蛋白可從氨基末端到羧基端被描述為CR2-補(bǔ)體抑制劑或補(bǔ)體抑制劑-CR2。在另外的實(shí)施方式中，補(bǔ)體旁路抑制劑可包括融合到補(bǔ)體抑制部分的單克隆抗體部分的融合物。單克隆抗體部分包括單克隆抗體，或其結(jié)合片段，其針對(duì)補(bǔ)體成分3 (C3)或其將結(jié)合包括選自C3b、iC3b、C3dg和C3d的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C3片段。補(bǔ)體抑制部分包括補(bǔ)體抑制劑，或其生物學(xué)活性片段，其選自H因子蛋白、Crry、DAF、MCP、補(bǔ)體因子I、compstatin或CR1、或其生物學(xué)活性片段。在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，融合蛋白的抑制部分可包括針對(duì)選自B因子、D因子、MASPl或內(nèi)源性MASPl抑制劑MAPI的因子的抗體；或其抗原結(jié)合片段。連接可以在結(jié)構(gòu)域的任何一端，以至于融合蛋白可從氨基末端到羧基端被描述為抗C3-補(bǔ)體抑制劑或補(bǔ)體抑制劑-抗C3。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用于治療具有補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病，如PNH的對(duì)象的方法和物質(zhì)，其中所述方法包括給予遭受這樣的疾病痛苦的對(duì)象末端補(bǔ)體抑制劑和補(bǔ)體旁路抑制劑。在該方法中，補(bǔ)體抑制劑可以任何順序同時(shí)或相繼給予。末端補(bǔ)體抑制劑可包括抗C5單克隆抗體，如艾庫(kù)珠單抗或培克珠單抗，或另一個(gè)末端補(bǔ)體抑制劑，其抑制C5或包括C6至C9的膜攻擊復(fù)合物(MAC)的其它成分。例如，⑶59或TT33——其為定向CD59融合蛋白——可用作末端補(bǔ)體抑制劑。在某些實(shí)施方式中，補(bǔ)體旁路抑制劑可抑制補(bǔ)體旁路活性，其中所述組合物抑制補(bǔ)體成分C3 (C3)、C3片段和/或C3轉(zhuǎn)化酶的激活，例如通過起始C3轉(zhuǎn)化酶而抑制旁路途徑激活和/或通過抑制放大性C3轉(zhuǎn)化酶的形成和/或活性和通過C3片段的PNH紅細(xì)胞調(diào)理作用。在其它實(shí)施方式中，補(bǔ)體旁路抑制劑可另外抑制其它補(bǔ)體途徑，如經(jīng)典途徑和凝集素介導(dǎo)的途徑。在另一方面，本發(fā)明提供用于PNH，或涉及補(bǔ)體介導(dǎo)的血管外溶血成分的其它疾病治療的組合物，該組合物包括以下的組合a)末端補(bǔ)體抑制劑；和b)補(bǔ)體旁路抑制劑。末端補(bǔ)體抑制劑可優(yōu)選包括抗C5抗體，如艾庫(kù)珠單抗或培克珠單抗。補(bǔ)體旁路抑制劑可優(yōu)選包括含有補(bǔ)體受體2 (CR2)蛋白或其生物學(xué)活性片段的融合蛋白；和補(bǔ)體活性的調(diào)節(jié)劑，其通過調(diào)節(jié)補(bǔ)體成分C3、其切割片段、和/或C3轉(zhuǎn)化酶的存在，和阻止或減少這樣的C3分子或其片段結(jié)合紅細(xì)胞，并特別地阻止或減少C3片段對(duì)PNH紅細(xì)胞的調(diào)理作用而起作用。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，補(bǔ)體旁路抑制劑可包括CR2蛋白的融合物、或包括CR2的至少前兩個(gè)氨基末端SCR結(jié)構(gòu)域的片段，其融合到H因子蛋白或FH的生物學(xué)活性片段。一個(gè)這樣的補(bǔ)體旁路抑制劑包括融合到H因子補(bǔ)體抑制部分一包括人H因子前四個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域——的CR2靶向結(jié)構(gòu)域部分。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，補(bǔ)體旁路抑制劑是TT30 (SEQ ID NO: 3),其包括融合到!7H的前五個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域的CR2的前四個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，補(bǔ)體旁路抑制劑是TT31，其包括融合到兩個(gè)拷貝的FH的前五個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域的CR2的前四個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域。在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，補(bǔ)體旁路抑制劑可包括CR2蛋白、或片段，其包括融合到選自抗B因子抗體、抗備解素抗體、抗D因子抗體、I因子蛋白、compstatin、Crry、DAF、MCP或CR1、或其生物學(xué)活性片段的補(bǔ)體抑制部分的CR2的至少前兩個(gè)氨基末端短共有重復(fù)序列(SCR)結(jié)構(gòu)域。一個(gè)這樣的優(yōu)選實(shí)施方式是TT32，其包括融合到CRl的前十個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域的CR2的前四個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域。由于CRl不但抑制補(bǔ)體旁路，而且抑制經(jīng)典途徑和凝集素介導(dǎo)的補(bǔ)體途徑的能力，抑制劑如TT32在涉及溶血的血管內(nèi)和血管外成分的其它疾病狀態(tài)中以及在自身免疫性疾病或相關(guān)狀態(tài)中可找到更大范圍的應(yīng)用。 在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，補(bǔ)體旁路抑制劑可包括融合到補(bǔ)體抑制部分的單克隆抗體部分的融合物。單克隆抗體部分包括單克隆抗體，或其結(jié)合片段，其針對(duì)補(bǔ)體成分3 (C3)或其將結(jié)合包括選自C3b、iC3b、C3dg和C3d的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C3片段。補(bǔ)體抑制部分包括補(bǔ)體抑制劑，或其生物學(xué)活性片段，其選自H因子蛋白、抗B因子抗體、抗備解素抗體、抗D因子抗體、I因子蛋白、compstatin、抗MASPl抗體、抗MAPI抗體、Crry、DAF、MCP或CRl或其生物學(xué)活性片段。在優(yōu)選實(shí)施方式中，補(bǔ)體抑制部分包括(a)人H因子蛋白的前四個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域；(b) Crry的前五個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域；或(c) CRl的前十個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域；或(d)包括前三個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域的MCP ;包括SCR結(jié)構(gòu)域2_4的可溶性DAF，其具有或沒有富含絲氨酸-蘇氨酸的區(qū)域，但是沒有糖基化磷脂酰錨?！矫姹景l(fā)明提供治療具有影響血細(xì)胞的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病的對(duì)象的方法，該方法包括給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述組合物抑制補(bǔ)體成分C3 (C3)的激活和通過C3片段的紅細(xì)胞調(diào)理作用。另一方面本文提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血的方法，該方法包括給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述組合物維持血清乳酸脫氫酶和血紅蛋白的正常水平。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，組合物選擇性地抑制補(bǔ)體旁路。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物包括含有補(bǔ)體受體2(CR2)蛋白或其生物學(xué)活性片段的融合蛋白jPH因子(fH)蛋白或其生物學(xué)活性片段。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，融合蛋白包括融合到fH的前五個(gè)氨基末端SCR結(jié)構(gòu)域的CR2的前四個(gè)氨基末端短共有重復(fù)序列(SCR)結(jié)構(gòu)域。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括給予對(duì)象末端補(bǔ)體抑制劑。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，末端補(bǔ)體抑制劑抑制補(bǔ)體蛋白C5(C5)的切割。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，末端補(bǔ)體抑制劑是人源化抗C5抗體或其抗原結(jié)合片段。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，末端補(bǔ)體抑制劑是艾庫(kù)珠單抗。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)，且在缺少組合物的情況下，對(duì)象的紅細(xì)胞受到C3片段的調(diào)理作用。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，對(duì)象先前已用末端補(bǔ)體抑制劑治療。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，對(duì)象對(duì)末端補(bǔ)體抑制劑的治療不起反應(yīng)、部分起反應(yīng)、或有進(jìn)展。
在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有以下特征中的一個(gè)或多個(gè)對(duì)象顯示進(jìn)行的或間歇的血管內(nèi)溶血和/或血管外溶血引起的連續(xù)紅細(xì)胞喪失的征兆或癥狀；對(duì)象具有受C3片段調(diào)理的紅細(xì)胞；對(duì)象需要定期輸血；對(duì)象具有低的正常水平的血紅蛋白或低于正常水平的血紅蛋白；對(duì)象具有低的正常水平的血小板或低于正常水平的血小板；對(duì)象具有高的正常網(wǎng)狀細(xì)胞或高于正常的網(wǎng)狀細(xì)胞； 對(duì)象具有高的正常膽紅素或高于正常的膽紅素；或?qū)ο缶哂需F超負(fù)荷或面臨鐵超負(fù)荷的危險(xiǎn)，其中所述方法包括給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，對(duì)象需要定期輸血。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，對(duì)象因此被給予獨(dú)立的輸血。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有低于正常水平的血紅蛋白。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，組合物增加對(duì)象中紅細(xì)胞的存活。在本文描述的任何方法的某些實(shí)施方式中，補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病是鐮狀細(xì)胞貧血。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明本文描述的方面和實(shí)施方式包括“由方面和實(shí)施方式組成”和/或“基本上由方面和實(shí)施方式組成”。本文提到“約”的值或參數(shù)包括(和描述)涉及值或參數(shù)自身的變化。例如，涉及“約X”的描述包括“X”的描述。如本文和所附權(quán)利要求所用，單數(shù)形式“一 (a) ”、“或”和“所述(the) ”包括復(fù)數(shù)的指示物，除非上下文另外明確指出。術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”指包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。對(duì)象包括但不限于人、牛、馬、貓、犬、嚙齒動(dòng)物或靈長(zhǎng)類。附圖簡(jiǎn)述圖I顯示測(cè)量C3在PNH對(duì)象紅細(xì)胞上的結(jié)合的單色流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果。沿著Y軸繪制紅細(xì)胞計(jì)數(shù)；沿著X軸繪制抗C3熒光異硫氰酸鹽(FITC)計(jì)數(shù)。圖Ia顯示正常對(duì)照對(duì)象的結(jié)果；圖Ib顯示具有冷凝集素疾病(CAD)的對(duì)象的結(jié)果；圖Ic顯示未用末端補(bǔ)體抑制劑治療的PNH對(duì)象的結(jié)果；圖Id顯示已用末端補(bǔ)體抑制劑艾庫(kù)珠單抗——C5的抗體——治療的兩個(gè)PNH對(duì)象的結(jié)果。圖2顯示測(cè)量C3在先前已用艾庫(kù)珠單抗治療的PNH對(duì)象RBC上的結(jié)合的雙色流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。沿著Y軸繪制⑶59+[正常]或⑶59-[PNH]紅細(xì)胞的數(shù)。沿著X軸繪制C3+[包被有C3]或C3-[未包被]細(xì)胞的數(shù)。左上象限代表⑶59+/C3-細(xì)胞，S卩，正常紅細(xì)胞。右上象限代表⑶59+/C3+細(xì)胞，S卩，由C3包被的正常紅細(xì)胞。左下象限代表⑶59-/C3-細(xì)胞，S卩，未由C3包被的PNH紅細(xì)胞。右下象限代表⑶59-/C3+細(xì)胞；即，由C3包被的PNH紅細(xì)胞。圖2a顯示正常對(duì)照對(duì)象的結(jié)果；圖2b顯示具有冷凝集素疾病(CAD)的對(duì)象的結(jié)果；圖2c顯示未用末端補(bǔ)體抑制劑治療的PNH對(duì)象的結(jié)果；圖2(1顯示顯示已用末端補(bǔ)體抑制劑艾庫(kù)珠單抗——C5的抗體——治療的四個(gè)PNH對(duì)象的結(jié)果。圖3顯示C3在PNH對(duì)象紅細(xì)胞上的結(jié)合(Y軸)與全部PNH (⑶59_) RBC百分?jǐn)?shù)(X軸)的相互關(guān)系?？勺⒁獾剑挥蠧3的RBCs的存在與PNH RBC群體大小相關(guān)。圖4顯示未用或先前已用Ecu治療的患者的PNH群體內(nèi)C3+RBCs的百分?jǐn)?shù)?？勺⒁獾剑珻3只在接受末端補(bǔ)體抑制劑艾庫(kù)珠單抗一C5的抗體一的那些對(duì)象中結(jié)合到PNHRBCs上，在這樣的對(duì)象中具有寬的異質(zhì)性。圖5顯示PNH RBCs上的C3結(jié)合的動(dòng)力學(xué)。圖5a顯示用艾庫(kù)珠單抗治療之后C3結(jié)合的出現(xiàn)。可注意到，C3結(jié)合在開始抗C5抗體治療之后幾周出現(xiàn)。圖5b顯示長(zhǎng)期(兩年)的時(shí)間里C3的結(jié)合。 可注意到，在該時(shí)期內(nèi)C3結(jié)合保持非常穩(wěn)定。圖6顯示PNH RBCs上的C3結(jié)合與先前已用末端補(bǔ)體抑制劑艾庫(kù)珠單抗——C5的抗體——治療的PNH對(duì)象的血液反應(yīng)的相互關(guān)系?？勺⒁獾?，獲得對(duì)艾庫(kù)珠單抗最好的血液反應(yīng)的對(duì)象具有較少的結(jié)合C3的RBCs。圖7顯示PNH RBCs上的C3結(jié)合(Y軸)與絕對(duì)的網(wǎng)狀細(xì)胞計(jì)數(shù)(ARC) (X軸)的相關(guān)性?？勺⒁獾?，C3結(jié)合與持續(xù)溶血的測(cè)量結(jié)果，如ARC相關(guān)，但不與LDH相關(guān)。因此，在理論上推測(cè)持續(xù)的溶血主要部分地由于補(bǔ)體介導(dǎo)的血管外溶血，因此很大程度上不受末端補(bǔ)體抑制劑的影響。圖8顯示來自兩個(gè)對(duì)象的51Cr標(biāo)記的紅細(xì)胞的體內(nèi)存活以及它們?cè)谄?實(shí)線)和肝(虛線)中的攝取。在第一個(gè)對(duì)象(圖8a)中，持續(xù)七天獲取測(cè)量結(jié)果。在第二個(gè)對(duì)象中，持續(xù)二十天獲取測(cè)量結(jié)果(圖Sb)。過度計(jì)數(shù)指超過對(duì)照的過量。還應(yīng)當(dāng)注意，脾和肝中增加的RBCs捕獲在所有研究的對(duì)象中都檢測(cè)到。圖9顯示來自先前未治療的對(duì)象的補(bǔ)體介導(dǎo)的PNH RBCs溶血，特別是用各種濃度的TT30——C3轉(zhuǎn)化酶的有效抑制劑——治療的PNH RBCs的存活。數(shù)據(jù)代表在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)存活的RBCs的百分比對(duì)給予的TT30的濃度。可注意到，TT30劑量較高時(shí)，PNH RBCs存活較大。

圖10顯示來自先前未治療的對(duì)象的PNH RBCs的存活，在五天過程里有各種治療。數(shù)據(jù)代表用酸化血清+鎂(AcS+Mg)治療的細(xì)胞中存活的PNH RBCs百分比，(a)沒有抑制劑；(b)具有 3000nM 的 TT30 (TT);和(c)具有 4500nM 的 TT30 (TT)。圖11顯示來自先前未治療的對(duì)象的PNH RBCs的存活，在5天里用各種濃度的TT30治療。數(shù)據(jù)代表用各種濃度的TT30的存活PNH RBCs百分比對(duì)治療時(shí)間。可注意到TT30劑量較高時(shí)，存活的PNH RBCs百分比增加。圖12顯示來自先前未治療的對(duì)象的補(bǔ)體介導(dǎo)的PNH RBCs溶血，特別是用TT30——C3轉(zhuǎn)化酶的有效抑制劑——治療的PNH RBCs的存活。數(shù)據(jù)代表與用酸化血清溶解的RBCs相比在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)溶解的RBCs的百分比對(duì)給予的TT30的濃度?？勺⒁獾?，TT30劑量較高時(shí)，溶解的PNH RBCs的百分比降低。圖13顯示來自先前已用艾庫(kù)珠單抗治療的對(duì)象的PNH RBCs存活，在五天過程里進(jìn)行各種治療。數(shù)據(jù)代表用酸化血清+鎂(AcS+Mg)治療的細(xì)胞中PNH RBCs存活的百分比，(a)沒有抑制劑；(b)具有 3000nM 的 TT30 (TT);和(c)具有 4500nM 的 TT30 (TT)。圖14顯示來自先前已用艾庫(kù)珠單抗治療的對(duì)象的PNH RBCs存活，在5天里用各種濃度的TT30治療。數(shù)據(jù)代表用各種TT30濃度的存活PNH RBCs的百分比對(duì)治療時(shí)間?？勺⒁獾絋T30劑量較高時(shí)，存活PNH RBCs的百分比增加。圖15顯示來自先前已用艾庫(kù)珠單抗治療的對(duì)象的補(bǔ)體介導(dǎo)的PNH RBCs溶血，特別是用TT30——C3轉(zhuǎn)化酶的有效抑制劑——治療的PNH RBCs的存活。數(shù)據(jù)代表與用酸化血清溶解的RBCs相比在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)溶解的RBCs的百分比對(duì)給予的TT30的濃度。可注意到TT30劑量較高時(shí)，溶解的PNH RBCs的百分比降低。圖16顯示在用不同濃度的TT30治療之后24小時(shí)PNH RBCs的溶血抑制百分比。將來自總共四個(gè)對(duì)象的七個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果集合。圖17顯示各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之后來自先前未治療的對(duì)象的PNH RBCs的命運(yùn)。在24小時(shí)的時(shí)期里進(jìn)行測(cè)量。治療是(圖17a):酸化血清(AcS);(圖17b) :AcS+3000nMTT30。表征細(xì)胞的溶解(紅色)和存活；進(jìn)一步表征存活細(xì)胞的C3-包被；C3-陽(yáng)性(黃色)和C3-陰性(綠色)。圖18顯示各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之后來自第二個(gè)先前未治療的對(duì)象的PNH RBCs的命運(yùn)。在24小時(shí)的時(shí)期里進(jìn)行測(cè)量。治療是(圖18a):酸化血清(AcS)；(圖18b) AcS+3000 nMTT30。表征細(xì)胞的溶解(紅色)和存活；進(jìn)一步表征存活細(xì)胞的C3-包被；C3-陽(yáng)性(黃色)和C3-陰性(綠色)?！D19顯示各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之后來自先前未用艾庫(kù)珠單抗治療的對(duì)象的PNH RBCs的命運(yùn)。在24小時(shí)的時(shí)期里進(jìn)行測(cè)量。治療是(圖19a):酸化血清(AcS)；(圖19b) AcS+3000nMTT30。表征細(xì)胞的溶解(紅色)和存活；進(jìn)一步表征存活細(xì)胞的C3-包被；C3-陽(yáng)性(黃色)和C3-陰性(綠色)。圖20顯示缺少保護(hù)的情況下紅細(xì)胞上補(bǔ)體旁路激活的順序。圖21顯示來自補(bǔ)體旁路激活的紅細(xì)胞的正常保護(hù)的順序。圖22顯示利用抗C5單克隆抗體的紅細(xì)胞的保護(hù)的順序。圖23顯示如通過本發(fā)明的定向CAP抑制劑獲得的紅細(xì)胞上的補(bǔ)體旁路激活的抑制順序。圖24顯示TT30與針對(duì)哮喘的人和食蟹猴的抗C3b單克隆抗體的結(jié)合。圖25顯示在兔紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)中TT30引起的RBC溶解的濃度依賴性抑制。圖26顯示缺少EDTA的情況下人血清有效地溶解兔RBCs。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示對(duì)于缺少EDTA的情況下兔RBCs中C3d片段的存在，大約95%的檢測(cè)細(xì)胞陽(yáng)性染色。圖27顯示隨著遞增濃度的TT30的加入，在O. 46uM的TT30濃度時(shí)，TT30結(jié)合大約70%的檢測(cè)細(xì)胞(右上象限)。圖28至30顯示在T=O時(shí)TT30存在于70%的檢測(cè)RBCs的表面上，24小時(shí)之后顯著數(shù)量的RBCs針對(duì)TT30繼續(xù)陽(yáng)性染色。圖31顯示在體外溶血試驗(yàn)中用艾庫(kù)珠單抗或TTT30溫育的CD59-PNH RBCs的C3片段積累和存活的比較。描述了當(dāng)在來自用艾庫(kù)珠單抗(左；估計(jì)的濃度lOOyg/mL)治療的患者的血清或加入TT30的血清(右；195 μ g/mL)中溫育時(shí)⑶59-PNH RBCs存活和變成包被有C3片段(C3frag+)的百分比。圖32顯示體外溶血試驗(yàn)中TT30對(duì)⑶59-PNH RBC存活或溶血的作用。描述了在O. 195至195 μ g/mL的TT30濃度溫育不同時(shí)間之后⑶59-PNH RBCs存活(左)或遭受溶血(右)的百分比。數(shù)據(jù)來自單個(gè)個(gè)體但是代表多個(gè)個(gè)體的結(jié)果。圖33顯示預(yù)測(cè)的TT30氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)。每個(gè)SCR在單獨(dú)的行。限定來自CR2和H因子的SCRs并將SCRs之間的連接序列加下劃線。共有序列糖基化位點(diǎn)是AsnlOl、Asnl07 和 Asn454。發(fā)明詳述本申請(qǐng)涉及補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病如陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)的治療。本申請(qǐng)基于這樣的發(fā)現(xiàn)在阻止PNH紅細(xì)胞(RBCs)的溶血方面，補(bǔ)體旁路(CAP)的調(diào)節(jié)，特別是用包括CR2和H因子的定向構(gòu)建物(TT30 ;SEQ ID NO:3)，較用末端補(bǔ)體抑制劑，S卩，抗C5抗體(艾庫(kù)珠單抗)的抑制更有效。不受理論的束縛，不管保護(hù)性濃度的抗體存在與否，假設(shè)關(guān)于抗C5抗體，來自PNH患者的RBCs的體外溶血可能與對(duì)C3片段包被的RBCs溶解易感性增加相關(guān)。
因此，本申請(qǐng)一方面提供在對(duì)象中，特別是在具有溶血性貧血，或顯示以下癥狀中的一個(gè)或多個(gè)的對(duì)象中治療補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，這些癥狀是殘余貧血和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的血管外溶血和/或血管內(nèi)溶血的不完全控制的癥狀。這些特征在本文中被共同地稱作“溶血標(biāo)志”。在另一方面，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，其中所述對(duì)象先前已用末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)治療。該方法通過給予有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物來進(jìn)行。特別適合的補(bǔ)體激活途徑抑制劑是靶向構(gòu)建物(如本文描述的定向構(gòu)建物)，其包括使構(gòu)建物導(dǎo)向補(bǔ)體激活位點(diǎn)的靶向部分和具有補(bǔ)體抑制活性的活性部分。在另一方面，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象a)有效量的末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)和b)有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物?！澳┒搜a(bǔ)體抑制劑”指一個(gè)或多個(gè)補(bǔ)體途徑的抑制劑，其抑制C3轉(zhuǎn)化酶下游成分的活性。這些包括，例如，C3轉(zhuǎn)化酶的抑制劑、C5(例如抗C5抗體)的阻斷、或阻斷MAC (膜攻擊復(fù)合物)形成的抑制劑。因此，在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述對(duì)象具有溶血性貧血或顯示以下癥狀中的一個(gè)或多個(gè)殘余貧血和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的血管外溶血和/或血管內(nèi)溶血的不完全控制的癥狀。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述對(duì)象顯示進(jìn)行的或間歇的血管內(nèi)溶血和/或血管外溶血引起的連續(xù)紅細(xì)胞喪失的征兆或癥狀。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述對(duì)象具有受C3片段調(diào)理的紅細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述對(duì)象需要定期輸血。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述對(duì)象具有低的正常水平的血紅蛋白或低于正常水平的血紅蛋白。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述對(duì)象具有低的正常水平的血小板或低于正常水平的血小板。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述對(duì)象具有高的正常網(wǎng)狀細(xì)胞或高于正常的網(wǎng)狀細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述對(duì)象具有高的正常膽紅素或高于正常的膽紅素。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述對(duì)象具有鐵超負(fù)荷或面臨鐵超負(fù)荷的危險(xiǎn)。在一些實(shí)施方式中，組合物抑制補(bǔ)體成分C3(C3)的激活和由C3片段引起的紅細(xì)胞的調(diào)理作用。在一些實(shí)施方式中，組合物維持乳酸脫氫酶和血紅蛋白的正常血清水平。在一些實(shí)施方式中，補(bǔ)體激活途徑抑制劑是定向構(gòu)建物(如本文描述的定向構(gòu)建物)，其包括使構(gòu)建物導(dǎo)向補(bǔ)體激活位點(diǎn)的靶向部分和具有補(bǔ)體抑制活性的活性部分。在一些實(shí)施方式中，定向構(gòu)建物包括CR2或其片段和H因子或其片段。在一些實(shí)施方式中，定向構(gòu)建物包括CR2的前四個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域和H因子的前五個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域(如TT30)。在一些實(shí)施方式中，定向構(gòu)建物選自TT30、TT31和ΤΤ32。
在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述對(duì)象先前已用末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)治療。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象對(duì)末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)的治療沒有應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象對(duì)末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)的治療有部分應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象前對(duì)末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)開始時(shí)有應(yīng)答，但是用抗C5抗體治療一定時(shí)期(如一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月、四個(gè)月、六個(gè)月)之后變得沒有應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，用末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)治療之后，個(gè)體顯示上面描述的溶血標(biāo)志中的一個(gè)或多個(gè)。在一些實(shí)施方式中，組合物抑制補(bǔ)體成分C3(C3)的激活和C3片段引起的紅細(xì)胞的調(diào)理作用。在一些實(shí)施方式中，組合物維持乳酸脫氫酶和血紅蛋白的正常血清水平。在一些實(shí)施方式中，補(bǔ)體激活途徑抑制劑是定向構(gòu)建物(如本文描述的定向構(gòu)建物)，其包括使構(gòu)建物導(dǎo)向補(bǔ)體激活位點(diǎn)的靶向部分和具有補(bǔ)體抑制活性的活性部分。在一些實(shí)施方式中，定向構(gòu)建物包括CR2或其片段和H因子或其片段。在一些實(shí)施方式中，定向構(gòu)建物包括CR2的前四個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域和H因子的前五個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域(如TT30)。在一些實(shí)施方式中，定向構(gòu)建物選自TT30、TT31和ΤΤ32。在一些實(shí)施方式中，在用旁路補(bǔ)體途徑的抑制劑治療之前，對(duì)象用末端補(bǔ)體抑制劑治療至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 周。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象a)有效量的末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)和b)有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象a)有效量的抗C5抗體(如艾庫(kù)珠單抗)和b)有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象a)有效量的阻止MAC形成的抑制劑(如CD59)和b)有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物。在一些實(shí)施方式中，組合物抑制補(bǔ)體成分C3(C3)的激活和C3片段引起的紅細(xì)胞的調(diào)理作用。在一些實(shí)施方式中，組合物維持乳酸脫氫酶和血紅蛋白的正常血清水平。在一些實(shí)施方式中，補(bǔ)體激活途徑抑制劑是定向構(gòu)建物(如本文描述的定向構(gòu)建物)，其包括使構(gòu)建物導(dǎo)向補(bǔ)體激活位點(diǎn)的靶向部分和具有補(bǔ)體抑制活性的活性部分。在一些實(shí)施方式中，定向構(gòu)建物包括CR2或其片段和H因子或其片段。在一些實(shí)施方式中，定向構(gòu)建物包括CR2的前四個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域和H因子的前五個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域(如TT30)。在一些實(shí)施方式中，定向構(gòu)建物選自TT30、TT31和TT32。TT30包括H因子蛋白的補(bǔ)體旁路抑制部分，其通過與補(bǔ)體受體2蛋白(CR2或CD21)部分的結(jié)合而靶向補(bǔ)體激活和炎癥的部位，已知該補(bǔ)體受體2蛋白(CR2或CD21)結(jié)合補(bǔ)體成分3(C3)的固定組織/細(xì)胞的片段。TT31與TT30相似，但是含有H因子蛋白的補(bǔ)體旁路抑制部分的另外的拷貝。TT32包括補(bǔ)體受體I (CRl)的補(bǔ)體抑制部分，其通過與CR2蛋白的同一部分結(jié)合而被靶向。已知CRl是較H因子更寬的補(bǔ)體抑制劑。TT32將因此不但抑制補(bǔ)體旁路，而且將局部地抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑和凝集素途徑。其它合適的定向抑制劑在Gilkeson et al.，美國(guó)專利公開2008/0221011中有描述，其公開在此通過引用被特別地并入本文。本發(fā)明提供用于治療具有許多補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的疾病狀態(tài)中任意的對(duì)象 的方法和組合物。在這些對(duì)象之中是具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)、非典型的溶血性尿毒性綜合征(aHUS);慢性溶血性貧血；抗體介導(dǎo)的組自身免疫溶血性貧血；由血紅蛋白病如鐮狀細(xì)胞病引起的貧血；由感染如瘧疾引起的貧血；緣于輸血反應(yīng)的貧血；和冷凝集素疾病(CAD)的對(duì)象。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于治療具有溶血性貧血的對(duì)象的方法和組合物，該貧血可由以上疾病狀態(tài)引起，或該對(duì)象顯示至少一個(gè)特征，該特征可以是殘余貧血和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的血管外溶血和/或血管內(nèi)溶血不完全控制的癥狀對(duì)象顯示進(jìn)行的或間歇的血管內(nèi)溶血和/或血管外溶血引起的連續(xù)紅細(xì)胞喪失的征兆或癥狀；對(duì)象具有受C3片段調(diào)理的紅細(xì)胞；對(duì)象需要定期輸血；對(duì)象具有低的正常水平的血紅蛋白或低于正常水平的血紅蛋白；對(duì)象具有低的正常水平的血小板或低于正常水平的血小板；對(duì)象具有高的正常網(wǎng)狀細(xì)胞或高于正常的網(wǎng)狀細(xì)胞；對(duì)象具有高的正常膽紅素或高于正常的膽紅素；或?qū)ο缶哂需F超負(fù)荷或面臨鐵超負(fù)荷的危險(xiǎn)。以上討論的指征(也被稱作“溶血標(biāo)志”)還可用于評(píng)價(jià)對(duì)治療的應(yīng)答性，預(yù)測(cè)對(duì)治療的應(yīng)答性，監(jiān)測(cè)治療進(jìn)展，決定對(duì)象對(duì)治療適合與否，決定對(duì)象對(duì)治療不適合，選擇用于治療的對(duì)象，和/或選擇用于連續(xù)治療的對(duì)象。因此，例如，在一些實(shí)施方式中，提供用于評(píng)價(jià)應(yīng)答性、鑒定對(duì)象和/或選擇具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)或其它補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病的對(duì)象用于治療的方法，所述治療包括給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物。在一些實(shí)施方式中，提供評(píng)價(jià)是否具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)或其它補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病的對(duì)象將可能對(duì)包括給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物的治療有應(yīng)答的方法，該方法包括評(píng)價(jià)至少一個(gè)本文描述的溶血標(biāo)志，其中這些特征中的一個(gè)或多個(gè)的存在表示對(duì)象將可能對(duì)治療有應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括給予可能對(duì)治療有應(yīng)答的對(duì)象有效量的抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物。在一些實(shí)施方式中，提供鑒定適合治療的對(duì)象的方法，該治療包括給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物，其中所述對(duì)象具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)或其它補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病，該方法包括評(píng)價(jià)至少一個(gè)本文描述的溶血標(biāo)志，其中這些特征中的一個(gè)或多個(gè)的存在鑒定適合治療的對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括給予可適合治療的對(duì)象有效量的抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物?！翱蛇m合”的對(duì)象一包括“適合”本文描述的治療(或多個(gè))的對(duì)象一是更可能從所述治療的給予獲益而不是不從所述治療的給予獲益的對(duì)象。相反，“可不適合”的對(duì)象——包括“不適合”本文描述的治療(或多個(gè))的對(duì)象——是更可能未能從所述治療的給予獲益而不是能從所述治療的給予獲益的對(duì)象。 此外，本文提供選擇或不選擇更可能適合或更不可能適合包括給予有效量抑制補(bǔ)體旁路活性組合物的治療的對(duì)象的方法，該對(duì)象具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)或其它影響紅細(xì)胞的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病，該方法包括(A)評(píng)價(jià)至少一個(gè)本文描述的溶血標(biāo)志；和(B)選擇具有這些特征中的一個(gè)或多個(gè)的對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括給予可適合治療的對(duì)象有效量的抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物。本文還提供針對(duì)這樣的用途將本文描述的治療推向市場(chǎng)的方法，其包括告訴目標(biāo)聽眾本文描述的組合物的用途。本發(fā)明還提供監(jiān)測(cè)具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)或其它補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病的對(duì)象對(duì)包括給予有效量抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物的治療應(yīng)答性的方法，該方法包括評(píng)價(jià)至少一個(gè)本文描述的溶血標(biāo)志。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)。PNH是一種或多種具有突變體PIG的造血干細(xì)胞克隆擴(kuò)充的結(jié)果。PIG-A突變體克隆擴(kuò)充的程度在患者中變化很大。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象中超過90%的外周血細(xì)胞缺少GPI-AP (GPI-AP缺陷的)。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象中超過80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%中任一個(gè)的外周血細(xì)胞缺少GPI-AP。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象中小于10%的外周血細(xì)胞缺少GPI-AP。PNH的另一個(gè)特征是其基于PIG-基因型的表型鑲嵌現(xiàn)象，其決定GPI-AP缺乏的程度。例如，PNHIII細(xì)胞完全缺少GPI-APs，PNHII細(xì)胞部分Γ90%)缺少，而PNH I細(xì)胞——?dú)埩舻恼８杉?xì)胞的后代——以正常密度表達(dá)GPI-AP。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象只具有I型和III型細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有I型、II型和III型細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有I型和II型細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有典型的ΡΝΗ。典型的PNH被表征為大量的GPI-AP缺乏的PMNs，具有紅細(xì)胞增生和正?；蚪咏Ｐ螒B(tài)學(xué)和常見的或持續(xù)的鮮紅宏觀血紅蛋白尿的細(xì)胞骨髓。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有另一骨髓衰竭綜合征背景中的PNH。另一骨髓衰竭背景中的PNH被表征為相對(duì)小百分比(〈30%)的GPI-AP缺乏的PMNs，相伴的骨髓衰竭綜合征和間歇的或缺少的輕至中等宏觀血紅蛋白尿的證據(jù)。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有亞臨床的PNH。亞臨床或潛在的PNH被表征為少量的(〈1%)GPI-AP缺乏的PMNs，相伴的骨髓衰竭綜合征的證據(jù)和沒有血管內(nèi)溶血的臨床或生物化學(xué)證據(jù)。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有非典型的溶血性尿毒性綜合征(aHUS)。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有慢性溶血性貧血。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有冷凝集素疾病(CAD)。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象顯示進(jìn)行的或間歇的血管內(nèi)溶血和/或血管外溶血引起的連續(xù)紅細(xì)胞喪失的征兆或癥狀。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有受C3片段調(diào)理的PNH紅細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象需要定期輸血。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有以下疾病中的任何一個(gè)陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)、非典型的溶血性尿毒性綜合征(aHUS);慢性溶血性貧血；抗體介導(dǎo)的自身免疫溶血性貧血；由血紅蛋白病如鐮狀細(xì)胞病引起的貧血；由感染如瘧疾引起的貧血；緣于輸血反應(yīng)的貧血；和冷凝集素疾病(CAD)。本文描述的方法還有益于治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血、減少血管內(nèi)溶血、減少血管外溶血和增加紅細(xì)胞存活。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，對(duì)象顯示鐵超負(fù)荷。輸注和貧血的其它治療可促成或加重鐵超負(fù)荷。此外，用末端補(bǔ)體抑制劑如艾庫(kù)珠單抗或培克珠單抗或另一個(gè)末端補(bǔ)體抑制劑——抑制C5或包括C6至C9的膜攻擊復(fù)合物(MAC)的其它成分——的PNH的治療導(dǎo)致C3片段在PNH RBC表面上積累，以及以后的EVH和肝臟引起的鐵積累。因此，具有PNH
或另一種補(bǔ)體介導(dǎo)的紅細(xì)胞病癥的對(duì)象顯不鐵超負(fù)荷的癥狀或正臨近鐵超負(fù)荷
進(jìn)一步的溶血治療可能不是最佳的。在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物的治療可尤其有益于減少或控制貧血，不促成或加重鐵超負(fù)荷。可選地，根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物的治療可尤其有益于治療具有補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病，如PNH的對(duì)象，同時(shí)阻止可在用末端補(bǔ)體抑制劑的治療中觀察到的鐵超負(fù)荷，或阻止鐵超負(fù)荷和因此允許末端補(bǔ)體抑制劑的連續(xù)給予。為了本發(fā)明的目的，如果對(duì)象的血清鐵水平超過約350ug/dL (輕的鐵毒性)；優(yōu)選超過約500ug/dL (嚴(yán)重的鐵毒性)，則認(rèn)為他們?cè)馐荑F超負(fù)荷。如果對(duì)象的血清鐵水平是高的正常范圍或超過正常范圍，則認(rèn)為他們面臨鐵超負(fù)荷的危險(xiǎn)。正常的鐵范圍被認(rèn)為是約40至約220ug/dL ;對(duì)于成年男性更優(yōu)選大約50至約160ug/dL。成年女性的正常鐵范圍低于成年男性大約百分之5至百分之10?！叩恼！F濃度被認(rèn)為是正常范圍的四分之一(25%)以上；優(yōu)選處于正常范圍較高的十分之一(10%)。參見,Jacobs & DeMott, LaboratoryTest Handbook,第五版，(LexiComp Inc, Hudson, OH) (2001) atp. 203-205)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，鐵和鐵結(jié)合能力的‘正常范圍’可取決于特定的實(shí)驗(yàn)室和測(cè)試而變化。在一些實(shí)施方式中，成年男性對(duì)象的血清鐵水平高于約220ug/dL。在一些實(shí)施方式中，成年男性對(duì)象的血清鐵水平高于約160ug/dL。在一些實(shí)施方式中，成年男性對(duì)象的血清鐵水平位于約175ug/dL和約220ug/dL之間。在一些實(shí)施方式中，成年男性對(duì)象的血清鐵水平位于約130ug/dL和約160ug/dL之間。在一些實(shí)施方式中，成年男性對(duì)象的血清鐵水平位于約200ug/dL和約220ug/dL之間。在一些實(shí)施方式中，成年男性對(duì)象的血清鐵水平位于約150ug/dL和約160ug/dL之間。在一些實(shí)施方式中，成年女性對(duì)象的血清鐵水平高于約200ug/dL。在一些實(shí)施方式中，成年女性對(duì)象的血清鐵水平高于約145ug/dL。在一些實(shí)施方式中，成年女性對(duì)象的血清鐵水平位于約160ug/dL和約200ug/dL之間。在一些實(shí)施方式中，成年女性對(duì)象的血清鐵水平位于約120ug/dL和約145ug/dL之間。在一些實(shí)施方式中，成年女性對(duì)象的血清鐵水平位于約185ug/dL和約200ug/dL之間。在一些實(shí)施方式中，成年女性對(duì)象的血清鐵水平位于約135ug/dL和約145ug/dL之間。此外，本發(fā)明的方法和組合物可用于涉及補(bǔ)體介導(dǎo)的血管外溶血的其它疾病和涉及以上特征中的一個(gè)或多個(gè)的補(bǔ)體相關(guān)疾病的治療。這些疾病特征在于高血清乳酸脫氫酶(LDH)水平和/或低血清血紅蛋白(HgB)水平。這樣的疾病可包括，例如，非典型的溶血性尿毒性綜合征(aHUS);慢性溶血性貧血；和冷凝集素疾病(CAD)。Jacobson et al. , AmericanJ. Medicine, 54:514—21(1973)。因?yàn)槟┒搜a(bǔ)體抑制劑如艾庫(kù)珠單抗——結(jié)合C5的單克隆抗體——必須競(jìng)爭(zhēng)地結(jié)合C5和阻止C5轉(zhuǎn)化酶對(duì)C5的酶促切割，所以如果不是不可能的話，末端補(bǔ)體抑制劑可能難以治療經(jīng)歷紅細(xì)胞溶解的對(duì)象以有效地獲得和穩(wěn)定地保持這種溶血性溶解標(biāo)記，如LDH和HgB的正常范圍，具有降低的突破溶血性溶解發(fā)生的危險(xiǎn)。這種抑制劑的作用依賴C5的抗體完全阻斷C5轉(zhuǎn)化酶對(duì)C5切割的能力。然而，因?yàn)榭贵w通常達(dá)到與它們的抗原結(jié)合的平衡水平，在這種情況下C5，血液中和紅細(xì)胞表面將周期性地或間歇地存在一些水平的未結(jié)合的C5。未結(jié)合的C5可不可逆地被存在于紅細(xì)胞表面上的C5轉(zhuǎn)化酶切割。如果(a)血清抑制劑濃度降低；或(b)血液中血清C5濃度增加，存 在的未結(jié)合的C5的量將增加。另夕卜，因?yàn)槟┒搜a(bǔ)體抑制劑與C5轉(zhuǎn)化酶——C5的天然配體，其將不可逆地切割C5——競(jìng)爭(zhēng)，所以末端補(bǔ)體抑制劑保持溶血的控制和阻止突破的有效性受血清C5轉(zhuǎn)化酶濃度的增加的影響。如先前所指出的，接受末端補(bǔ)體抑制劑的對(duì)象血清中C3片段和C3轉(zhuǎn)化酶的積累將自然地趨向于增加C5轉(zhuǎn)化酶的血清水平，限制抑制劑的效力。LDH和HgB :用本發(fā)明的定向抑制劑，以上導(dǎo)致‘突破’溶解的情形可被減少或避免，因?yàn)樵诩t細(xì)胞表面上定向抑制劑與C3d片段栓在一起，而融合蛋白的補(bǔ)體抑制劑末端能在紅細(xì)胞表面局部地起作用以抑制補(bǔ)體旁路激活。因此，可實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)定的補(bǔ)體抑制。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，預(yù)期遭受PNH、aHUS、CAD或其它溶血性貧血的對(duì)象可被有效地治療以至于乳酸脫氫酶(LDH)和血紅蛋白(HgB)的血清濃度水平可保持在正常濃度范圍內(nèi)。一般而言，血清中的LDH是紅細(xì)胞溶解的指征，高水平則指示溶血。參見，Kato et al. ,Blood, 107:2279-85(2006)。HgB是血清中血紅蛋白的測(cè)量，低水平則指不貧血。參見 Crosby and Ackroyd, Am. J. Medicine, 13:273-83 (1952) ；Dameshek, Am.J. Medicine, 18:315—25(1955)。高血清水平LDH伴隨低血清水平HgB可指示溶血性貧血的存在。對(duì)于本發(fā)明的目的，LDH血清濃度的‘正常范圍’被認(rèn)為達(dá)到大約350IU/1 ;優(yōu)選從約105至333IU/1，優(yōu)選從大約140至280IU/L ;在其它實(shí)施方式中，達(dá)到約190U/L?！叩恼！?LDH濃度將是正常范圍的較高的一半(50%)，優(yōu)選正常范圍的較高的四分之一(25%)，最優(yōu)選正常范圍的較高的十分之一(10%)。對(duì)于本發(fā)明的目的，對(duì)于成年男性血清HgB濃度的‘正常范圍’被認(rèn)為是大約13. 5至18. Ogm/dL的范圍內(nèi)；優(yōu)選從約13. 8至18. O ;對(duì)于男性更優(yōu)選從約14. O至約17. O ;對(duì)于女性大約11. O至16. 2gm/dL ;對(duì)于成年女性更優(yōu)選約12. O至16. Ogm/dL?！偷恼！?HgB濃度將是正常范圍的較低的一半(50%)，優(yōu)選正常范圍的較低的四分之一(25%)，最優(yōu)選，正常范圍的較低的十分之一(10%)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，LDH和HgB的‘正常范圍’可取決于特定的實(shí)驗(yàn)室和測(cè)試而變化。[參見，萬(wàn)維網(wǎng)nlm. nih.gov; Jacobs&DeMott, Laboratory Test Handbook,第五版，(LexiComp Inc, Hudson, OH)(2001)at p.206-208;319-422]。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有低的正常水平或低于正常水平的血紅蛋白。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平低于約13.5gm/dL。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平低于約13. 8gm/dL。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平低于約14gm/dL。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約13. 5gm/dL和約15. 75gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約13. 5gm/dL和約14. 6gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約13. 5gm/dL和約13. 9gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約13. 8gm/dL和約15. 9gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約13. 8gm/dL和約14. 9gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約13. 8gm/dL和約14. 2gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約14gm/dL和約15. 5gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約14gm/dL和約14. 75gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約14gm/dL和約14. 3gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血紅蛋白水平低于約11. Ogm/dL。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血紅蛋白水平低于約12. Ogm/dL。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約11. Ogm/dL和約13. 6gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約11. Ogm/dL和約12. 3gm/dL之間。在一些實(shí)施方式 中，在成年女性中血紅蛋白水平位于約11. Ogm/dL和約11.5gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約12. Ogm/dL和約14. Ogm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約12. Ogm/dL和約13. Ogm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血紅蛋白水平位于約12. Ogm/dL和約12. 2gm/dL之間。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象進(jìn)一步具有高于約350IU/1的LDH水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象進(jìn)一步具有高于約280IU/1的LDH水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象進(jìn)一步具有約219IU/1和333IU/1之間的LDH水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象進(jìn)一步具有約276IU/1和333IU/1之間的LDH水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象進(jìn)一步具有約310IU/1和333IU/1之間的LDH水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象進(jìn)一步具有約210IU/1和280IU/1之間的LDH水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象進(jìn)一步具有約245IU/1和280IU/1之間的LDH水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象進(jìn)一步具有約266IU/1和280IU/1之間的LDH水平。血小板可指示溶血性貧血的另一個(gè)特征是低于正常范圍的血清血小板水平。對(duì)于本發(fā)明的目的，對(duì)于成年男性血清血小板濃度的‘正常范圍’被認(rèn)為是在大約130至約410 (X109/L)的范圍內(nèi)；優(yōu)選大約150至約400(X 109/L)的范圍內(nèi)；更優(yōu)選從約210至約330 (XlOVL)0對(duì)于成年女性，血清血小板濃度的‘正常范圍’可被認(rèn)為是高于成年男性大約5至10%?！偷恼！“鍧舛葘⑹钦７秶妮^低的一半(50%)，優(yōu)選正常范圍的較低的四分之一(25%)，最優(yōu)選，正常范圍的較低的十分之一(10%)。[參見，萬(wàn)維網(wǎng)nlm.nih. gov 和 questdiagnostics. com;Jacobs&DeMott, Laboratory Test Handbook,第五版，(Lex i Comp Inc, Hudson, OH) (2001),第471-472頁(yè)]。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的,血小板的‘正常范圍’可取決于特定的實(shí)驗(yàn)室和測(cè)試而變化。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有低的正常水平或低于正常水平的血小板。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平低于約130(X 109/L)。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平低于約150(X 109/L)。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平低于約210(X109/L)。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平位于約130(X 109/L)和約270(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平位于約130(X 109/L)和約200(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平位于約130(X 109/L)和約158(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平位于約150(X 109/L)和約275(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平位于約150(X 109/L)和約112.5(X109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平位于約150 (X 109/L)和約175(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平位于約210(X109/L)和約260(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平位于約210(X109/L)和約240(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年男性對(duì)象中血清血小板水平位于約210 (X109/L)和約222(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血清血小板水平低于約140(X 109/L)。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血清血小板水平低于約165(X 109/L)。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血清血小板水平低于約230 (X 109/L)。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血清血小板水平位于約140 (X 109/L)和約295(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血清血小板水平位于約140(X 109/L)和約220(X 109/L)之間。在·一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血清血小板水平位于約140(X 109/L)和約170(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血清血小板水平位于約165(X 109/L)和約300(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血清血小板水平位于約165(X 109/L)和約235(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，血清血小板水平位于約165 (X 109/L)和約195(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血清血小板水平位于約230(X 109/L)和約295(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血清血小板水平位于約230(X 109/L)和約265(X 109/L)之間。在一些實(shí)施方式中，在成年女性對(duì)象中血清血小板水平位于約230 (X IO9ZD和約245(X 109/L)之間。網(wǎng)狀細(xì)胞可指示溶血性貧血的另一個(gè)特征是高于正常范圍的血清網(wǎng)狀細(xì)胞水平。網(wǎng)狀細(xì)胞是年輕的紅細(xì)胞，細(xì)胞核已從中被擠出，但是其保留核糖體RNA的一些殘留部分。當(dāng)存在顯著的紅細(xì)胞喪失或紅細(xì)胞被過早地破壞，例如，由于溶解的緣故時(shí)，網(wǎng)狀細(xì)胞計(jì)數(shù)升高。對(duì)于本發(fā)明的目的，血清網(wǎng)狀細(xì)胞濃度的‘正常范圍’被認(rèn)為在全部紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的約百分之O. 5至約百分之2. O的范圍內(nèi)；優(yōu)選從約O. 5至約I. 5% ;最優(yōu)選從約I. 0%至約1.5%。當(dāng)血紅蛋白水平低的時(shí)侯，作為紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的網(wǎng)狀細(xì)胞計(jì)數(shù)可較高?！叩恼！疕gB濃度將是正常范圍的較高的一半(50%)，優(yōu)選正常范圍的較高的四分之一(25%)，最優(yōu)選正常范圍的較高的十分之一(10%)。[參見,萬(wàn)維網(wǎng)nlm. nih. gov和questdiagnostics.com; Jacobs&DeMott, Laboratory Test Handbook,第五版，(LexiComp Inc, Hudson, OH)(2001)，第481-482頁(yè)]。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，網(wǎng)狀細(xì)胞的‘正常范圍’可根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)室和測(cè)試而變化。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有增加的網(wǎng)狀細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有高于全部紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的約I. 5%的血清網(wǎng)狀細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有高于全部紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的約2. 00%的血清網(wǎng)狀細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有全部紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的約I. 0%至I. 5%之間的血清網(wǎng)狀細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有全部紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的約I. 25%至I. 5%之間的血清網(wǎng)狀細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有全部紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的約I. 375%至I. 5%之間的血清網(wǎng)狀細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有全部紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的約I. 4%至I. 5%之間的血清網(wǎng)狀細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有全部紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的約I. 45%至I. 5%之間的血清網(wǎng)狀細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有全部紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的約I. 25%至2. 0%之間的血清網(wǎng)狀細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有全部紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的約I. 625%至2.0%之間的血清網(wǎng)狀細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有全部紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的約I. 85%至2. 0%之間的血清網(wǎng)狀細(xì)胞濃度。膽紅素可指示溶血性貧血的另一個(gè)特征是高于正常范圍的血清膽紅素水平。對(duì)于本發(fā)明的目的，血清膽紅 素濃度的‘正常范圍’被認(rèn)為是在大約0.3至I. 9mg/dL的范圍內(nèi)；優(yōu)選大約O. 3至1.0mg/dL的范圍內(nèi)。‘高的正?！懠t素濃度將是正常范圍的較高的一半(50%)，優(yōu)選正常范圍的較高的四分之一(25%)，最優(yōu)選，正常范圍的較高的十分之一 (10%) ο [參見，萬(wàn)維網(wǎng) nlm. nih. gov 和 questdiagnostics. com; Jacobs& DeMott, Laboratory Test Handbook,第五版，(LexiComp Inc, Hudson, OH) (2001),第471-472頁(yè)]。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，膽紅素的‘正常范圍’可根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)室和測(cè)試而變化。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象具有增加的膽紅素。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有高于約I. 9mg/dL的血清膽紅素水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有高于約I. 0mg/dL的血清膽紅素水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有約I. lmg/dL和I. 9mg. dL之間的血清膽紅素水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有約I. 5mg/dL和I. 9mg. dL之間的血清膽紅素水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有約I. 75mg/dL和I. 9mg. dL之間的血清膽紅素水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有約0. 65mg/dL和I. Omg. dL之間的血清膽紅素水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有約0. 825mg/dL和I. Omg. dL之間的血清膽紅素水平。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象具有約0. 93mg/dL和I. Omg. dL之間的血清膽紅素水平。在某些實(shí)施方式中，具有補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病，如PNH的對(duì)象先前已用末端補(bǔ)體抑制劑治療，但是持續(xù)顯示以上殘余貧血和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的血管外溶血特征中的至少一個(gè)。在這種情況下，本發(fā)明提供用于避免或減少以上特征中至少一個(gè)的發(fā)生和/或嚴(yán)重性的方法和組合物。在某些實(shí)施方式中，具有補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病，如PNH的對(duì)象顯示對(duì)用末端補(bǔ)體抑制劑治療的欠佳的應(yīng)答。這種欠佳的應(yīng)答可包括顯示以上殘余貧血和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的血管外溶血特征中至少一個(gè)的對(duì)象。該方法包括給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物，其中所述組合物抑制補(bǔ)體成分C3 (C3)的激活，例如通過起始C3轉(zhuǎn)化酶而抑制旁路途徑激活和/或通過抑制放大性C3轉(zhuǎn)化酶的形成和/或活性和C3片段引起的紅細(xì)胞的調(diào)理作用。在一些實(shí)施方式中，具有補(bǔ)體介導(dǎo)的影響紅細(xì)胞的溶血疾病，如PNH的對(duì)象先前已用末端補(bǔ)體抑制劑治療，開始時(shí)對(duì)這種治療有應(yīng)答，然后經(jīng)歷復(fù)發(fā)。在一些實(shí)施方式中，提供治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病(如影響紅細(xì)胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括給予對(duì)象有效量的抑制(如選擇性地抑制)補(bǔ)體旁路激活的組合物，其中所述對(duì)象先前已用末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)治療。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象對(duì)末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)的治療沒有應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象對(duì)末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)的治療部分有應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象開始時(shí)對(duì)末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)的治療有應(yīng)答，但是用抗C5抗體治療一定時(shí)期(如一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月、四個(gè)月、六個(gè)月)之后變得沒有應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，用末端補(bǔ)體抑制劑(如抗C5抗體)治療之后，個(gè)體顯示上面描述的溶血標(biāo)志中的一個(gè)或多個(gè)。在一些實(shí)施方式中，補(bǔ)體激活途徑抑制劑是定向構(gòu)建物(如本文描述的定向構(gòu)建物)，其包括使構(gòu)建物導(dǎo)向補(bǔ)體激活位點(diǎn)的靶向部分和具有補(bǔ)體抑制活性的活性部分。在一些實(shí)施方式中，定向構(gòu)建物包括CR2或其片段和H因子或其片段。在一些實(shí)施方式中，定向構(gòu)建物包括CR2的前四個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域和H因子的前五個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域(如TT30)。在一些實(shí)施方式中，在用旁路補(bǔ)體途徑的抑制劑治療之前，對(duì)象用末端補(bǔ)體抑制劑治療至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周而終止。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象對(duì)先前的治療有進(jìn)展(例如在開始先前治療約3、6、9或12個(gè)月任一之后有進(jìn)展)。在另一方面，本發(fā)明提供治療具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)或涉及補(bǔ)體介導(dǎo)的血管外溶血成分的另一種疾病的對(duì)象的方法，該方法包括給予包括含有如下組合的組合物(i)有效量的補(bǔ)體旁路抑制劑和(ii)有效量的末端補(bǔ)體抑制劑。還可給予另外的補(bǔ)體 抑制劑(如補(bǔ)體芳路抑制劑)。包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物和末端補(bǔ)體抑制劑可同時(shí)給予。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“同時(shí)給予”指聯(lián)合治療中給予包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物和末端補(bǔ)體抑制劑時(shí)具有不超過約15分鐘，如不超過約10、5或I分鐘中任一個(gè)的時(shí)間間隔。當(dāng)同時(shí)給予藥物時(shí)，包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物和末端補(bǔ)體抑制劑可包含在同一個(gè)組合物中(例如，包括補(bǔ)體旁路抑制劑和末端補(bǔ)體抑制劑的組合物)或在單獨(dú)的組合物中(例如，包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物包含在一個(gè)組合物中，而末端補(bǔ)體抑制劑包含在另一個(gè)組合物中)。可選地,相繼給予補(bǔ)體旁路抑制劑和末端補(bǔ)體抑制劑，即，在給予末端補(bǔ)體抑制劑之前或之后給予包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“相繼給予”指給予包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物和末端補(bǔ)體抑制劑時(shí)具有超過約15分鐘，如超過約20、30、40、50、60或更多分鐘中任一個(gè)的時(shí)間間隔?？墒紫冉o予包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物或末端補(bǔ)體抑制劑。包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物和末端補(bǔ)體抑制劑包含在獨(dú)立的組合物中，其可包含在相同或不同的包裝或試劑盒中。在一些實(shí)施方式中，在給予末端補(bǔ)體抑制劑之前給予包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物。在一些實(shí)施方式中，在給予末端補(bǔ)體抑制劑之后給予包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物。在一些實(shí)施方式中，包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物和補(bǔ)體抑制劑的給予同時(shí)發(fā)生，即，包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物的給予時(shí)期與末端補(bǔ)體抑制劑的給予時(shí)期相互重疊。在一些實(shí)施方式中，在給予末端補(bǔ)體抑制劑之前給予包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物至少一個(gè)周期(例如，2、3或4個(gè)周期中至少任何一個(gè))。在一些實(shí)施方式中，給予末端補(bǔ)體抑制劑一、二、三或四周中至少任何一個(gè)。在一些實(shí)施方式中，包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物和末端補(bǔ)體抑制劑的給予不是同時(shí)發(fā)生的。例如，在一些實(shí)施方式中，在給予末端補(bǔ)體抑制劑之前結(jié)束包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物的給予。在一些實(shí)施方式中，在給予包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物之前結(jié)束末端補(bǔ)體抑制劑的給予。在一些實(shí)施方式中，這兩個(gè)不同時(shí)發(fā)生的給予之間的時(shí)期可以是約一天至約八周。在一些實(shí)施方式中，這兩個(gè)不同時(shí)發(fā)生的給予之間的時(shí)期是約一天。在一些實(shí)施方式中，這兩個(gè)不同時(shí)發(fā)生的給予之間的時(shí)期是約一天以上，如約二、三、四、五、六天。在一些實(shí)施方式中，這兩個(gè)不同時(shí)發(fā)生的給予之間的時(shí)期是至少約一周。在一些實(shí)施方式中，這兩個(gè)不同時(shí)發(fā)生的給予之間的時(shí)期是至少約兩周。在一些實(shí)施方式中，這兩個(gè)不同時(shí)發(fā)生的給予之間的時(shí)期是至少約四周。在一些實(shí)施方式中，這兩個(gè)不同時(shí)發(fā)生的給予之間的時(shí)期是至少約八周?；诮o藥醫(yī)師的判斷，在治療過程中可調(diào)整包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物和末端補(bǔ)體抑制劑的給藥頻率。當(dāng)分開給予時(shí)，包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物和末端補(bǔ)體抑制劑可以不同的給藥頻率或間隔給予。例如，包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物可每周給予一次，而末端補(bǔ)體抑制劑可更頻繁或更不頻繁地給予。在一些實(shí)施方式中，可利用包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物和/或末端補(bǔ)體抑制劑的持續(xù)的連續(xù)的釋放制劑。獲得持續(xù)釋放的各種制劑和裝置在本領(lǐng)域是已知的?？衫孟嗤慕o藥途徑或不同的給藥途徑給予包括補(bǔ)體旁路抑制劑的組合物和末端補(bǔ)體抑制劑。在一些實(shí)施方式(對(duì)于同時(shí)給予和相繼給予)中，以預(yù)設(shè)的比率給予包括補(bǔ)體芳路抑制劑的組合物和末端補(bǔ)體抑制劑。
靶向補(bǔ)體激活的組織本文描述的組合物優(yōu)選被靶向以增加與組織的結(jié)合，該組織已受傷、損壞或變得由物理、化學(xué)或其它損傷或傷害引起的發(fā)炎。靶向可通過將活性劑栓系、融合或另外方式結(jié)合到靶向部分來實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，靶向部分結(jié)合與補(bǔ)體激活相關(guān)的結(jié)合伴侶?！芭c補(bǔ)體結(jié)合相關(guān)的結(jié)合伴侶”指存在于補(bǔ)體激活位點(diǎn)的分子或表位。在一些實(shí)施方式中，分子或表位只是當(dāng)補(bǔ)體途徑激活時(shí)而存在。在一些實(shí)施方式中，只有當(dāng)補(bǔ)體途徑激活時(shí)，分子或表位可用于結(jié)合靶向部分。在一些實(shí)施方式中，靶向部分結(jié)合組織相關(guān)的補(bǔ)體成分3(C3)或C3的一個(gè)或多個(gè)片段，包括，但不限于C3b、iC3b、C3d和C3dg。在優(yōu)選實(shí)施方式中，靶向部分將結(jié)合補(bǔ)體成分3 (C3)或C3的一個(gè)或多個(gè)片段，包括，但不限于C3b、iC3b、C3d和C3dg。優(yōu)選的靶向部分包括，例如，補(bǔ)體受體2 (CR2)或其保持結(jié)合C3的一個(gè)或多個(gè)片段能力的片段<3、0313、^313、03(1、03(^或03其它片段的單克隆抗體。還可能利用H因子的一些非調(diào)節(jié)片段，其保持結(jié)合C3的一個(gè)或多個(gè)片段——包括C3b、iC3b和C3d或C3的其它片段——的能力。這些片段潛在地包括含有SCR結(jié)構(gòu)域5-8和SCR結(jié)構(gòu)域19-20的片段。應(yīng)當(dāng)指出，術(shù)語(yǔ)“CR2-靶向的”可用于本發(fā)明以指將以與CR2的天然結(jié)合類似的方式特異地結(jié)合〇3的一個(gè)或多個(gè)片段，如03、0315、^313、03(1和03(^的分子。因此，例如，包括(a)來自CR2的靶向部分或(b)C3d抗體的融合蛋白——融合到補(bǔ)體H因子——可被稱作“CR2-靶向的H因子”。在一些實(shí)施方式中，構(gòu)建物是包括靶向部分和活性部分的融合蛋白。在一些實(shí)施方式中，靶向部分和活性部分通過肽連接體連接。在一些實(shí)施方式中，靶向部分和活性部分通過非肽連接體連接。在一些實(shí)施方式中，靶向部分融合到活性部分的N端。在一些實(shí)施方式中，靶向部分融合到活性部分的C端。在一些實(shí)施方式中，靶向部分插入到活性部分中間。示例性的融合蛋白包括，但不限于，多肽，其中靶向部分的C端部分融合到活性部分的N端部分，靶向部分的N端部分融合到活性部分的C端部分，兩個(gè)或多個(gè)靶向部分融合到活性部分的N端和C端部分，靶向部分插入到活性部分中間，等等。在一些實(shí)施方式中，分子包括兩個(gè)或多個(gè)(如二、三、四、五或多個(gè)中任一個(gè))CR2部分(或任何其它靶向部分部分，或其組合)。這些CR2部分(或其它靶向部分的部分)可以是相同或不同的，例如在氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和/或功能方面。
在一些實(shí)施方式中，分子包括兩個(gè)或多個(gè)(如二、三、四、五或多個(gè)中任一個(gè))活性部分的部分。這些活性部分的部分可以是相同或不同的，例如在氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和/或功能方面。在一些實(shí)施方式中，分子(如融合蛋白)包括1)兩個(gè)或多個(gè)CR2部分，該CR2部分包括CR2或其片段，和2)兩個(gè)或多個(gè)活性部分。在一些實(shí)施方式中,祀向部分顯示對(duì)其結(jié)合伴侶高的親合力(avidity)。在一些實(shí)施方式中，祀向部分顯示對(duì)其結(jié)合伴侶高的親合力但是低的親和性(affinity)。結(jié)合親合力是起始過程的強(qiáng)度的量度，通過該起始過程，靶向部分，如抗體或配體，將尋找、定位和與其結(jié)合伴侶結(jié)合，并且結(jié)合親合力是涉及結(jié)合親和性的起始過程。另一方面，結(jié)合親和性是較寬的量度，其不但考慮親合力，而且還考慮結(jié)合的其它特征如相互作用的強(qiáng)度和解離系數(shù)。已經(jīng)開發(fā)了測(cè)量和修改結(jié)合屬性，如親合力和親和性的方法。例如， 參見 Lee et al. , Molecular Immunology, 47:816-24 (2010) ；Kaymakcalan etal·，Clinical Immunology, 131:308-16 (2009) ；Konstandin et al. , J Immunol.Methods, 310:67-77(2006);和 Odet al. , Molecular Immunology, 37:1111-22 (2000)。因此，本發(fā)明可包括評(píng)價(jià)靶向部分的結(jié)合親合力和親和性的方法；突變或修飾靶向部分和評(píng)價(jià)該突變或修飾的效果的方法，以獲得具有改進(jìn)的靶向特征，例如，結(jié)合親合力的靶向部分。雖然本文的某些部分討論CR2-定向構(gòu)建物，但是應(yīng)當(dāng)理解同樣適用于本文描述的其它靶向部分。本文更詳細(xì)地描述不同的靶向部分。CR2 和 CR2 片段。補(bǔ)體受體2(CR2)，或其功能片段使補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑靶向到顯示或表達(dá)C3或C3片段——CR2能與之結(jié)合，包括C3b、iC3b、C3d和C3dg——的組織的用途在US2008/0267980, Tomlinson and Holers中有描述，其在此通過引用被并入本文。這樣的CR2分子，和其功能片段可在本發(fā)明中用作靶向部分。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，包括C3dg的活性結(jié)合位點(diǎn)的前兩個(gè)N端短共有重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(SCRs)可在本發(fā)明中用作靶向部分。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)雖然紅細(xì)胞被給予特權(quán)避免補(bǔ)體攻擊，但是可由本發(fā)明治療的補(bǔ)體介導(dǎo)的血液病癥可導(dǎo)致C3和/或C3片段對(duì)RBC表面的異常包被，使受影響的RBCs易受補(bǔ)體攻擊和調(diào)理作用的影響。人補(bǔ)體受體2，也被稱作 CD21(CR2/CD21) (SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2)，是 C3 結(jié)合蛋白家族的 145kD跨膜蛋白，包括15或16個(gè)短共有重復(fù)序列(SCR)結(jié)構(gòu)域，具有這種蛋白特性的結(jié)構(gòu)單元。CR2表達(dá)在成熟B細(xì)胞和濾泡樹突細(xì)胞上，并在體液免疫中發(fā)揮重要作用。J. Hannan et al. , Biochem. Soc. Trans. (2002) 30:983-989; K. A. Young et al. , J.Biol.Chem. (2007) 282 (50) : 36614-36625。CR2蛋白不結(jié)合完整的C3蛋白，但是通過位于CR2蛋白的前兩個(gè)氨基末端短共有重復(fù)序列(“SCRs 1-2”)內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合它的分解產(chǎn)物，包括C3b、iC3b和C3d切割片段。結(jié)果，CR2的SCR1-2結(jié)構(gòu)域在C3的切割的(即，激活的)形式和完整的循環(huán)C3之間辨別。作為靶向基團(tuán)，CR2的SCRs 1-2因此能在循環(huán)C3和補(bǔ)體激活期間產(chǎn)生的C3片段之間辨別。雖然CR2對(duì)C3d的親和性只有620_658nM(JHannan et al. , Biochem. Soc. Trans. (2002) 30:983-989 ；J. M. Guthridge et al. , Biochem.(2001) 40:5931-5941)，但是CR2對(duì)聚集的C3d的親合力使它成為使分子靶向補(bǔ)體激活位點(diǎn)的有效方法。CR2含有細(xì)胞外部分，其具有15或16個(gè)被稱作短共有重復(fù)序列(SCR結(jié)構(gòu)域)的重復(fù)單位。SCR結(jié)構(gòu)域通常具有高度保守的殘基的框架，包括四個(gè)半胱氨酸、兩個(gè)脯氨酸、一個(gè)色氨酸和幾個(gè)其它部分保守的甘氨酸和疏水殘基。SEQ ID顯:1代表具有1530 結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)人CR2蛋白序列。SEQ ID NO: I的氨基酸1_20包括前導(dǎo)肽，SEQ ID NO: I的氨基酸23-82 包括 SCRl，SEQ ID NO: I 的氨基酸 91-146 包括 SCR2，SEQ ID NO: I 的氨基酸 154-210包括SCR3，SEQ ID NO: I的氨基酸215-271包括SCR4?；钚圆课?C3d結(jié)合部位)位于SCRl-2(前兩個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域)(SEQ IDNO: 2)中。這些SCR結(jié)構(gòu)域由充當(dāng)間隔區(qū)的可變長(zhǎng)度的短序列分開。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于公開的肽、多肽和蛋白質(zhì)，存在物種和品系變化，本文描述的CR2或其片段包括所有的物種和品系變化。在某些實(shí)施方式中，CR2部分包括含有CR2蛋白的一些或所有配體結(jié)合部位的多 肽，包括，但不限于，如下面詳細(xì)描述的全長(zhǎng)CR2蛋白(如SEQ ID N0:1所示的人CR2)、可溶的CR2蛋白(如包括CR2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的CR2片段)、CR2的其它生物學(xué)活性片段、包括SCR1-2 (SEQ ID NO: 2)的CR2片段、或天然存在的CR2或其片段的任何同系物。在一些實(shí)施方式中，CR2部分具有以下CR2性質(zhì)中的至少一個(gè)(I)結(jié)合C3d的能力，(2)結(jié)合iC3b的能力，(3)結(jié)合C3dg的能力，(4)結(jié)合C3d的能力，和(5)結(jié)合一個(gè)或多個(gè)C3b的細(xì)胞結(jié)合片段的能力，該C3b的細(xì)胞結(jié)合片段結(jié)合CR2的兩個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方式中，CR2部分包括CR2的前兩個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO: 2) 0在某些實(shí)施方式中，CR2部分包括CR2的前三個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方式中，CR2部分包括CR2的前四個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方式中，CR2部分包括CR2的至少前兩個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域(在一些實(shí)施方式，由或基本上由CR2的至少前兩個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域組成)，包括例如CR2的前3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域中的至少任何一個(gè)。C3的切割首先導(dǎo)致C3b在激活的細(xì)胞表面上產(chǎn)生和沉積。C3b片段涉及放大補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的酶促?gòu)?fù)合物的產(chǎn)生。在細(xì)胞表面上，C3b被快速地轉(zhuǎn)變成無活性的iC3b，特別是當(dāng)沉積在含有補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)劑的宿主表面上(即，大部分宿主組織)時(shí)。即使在缺少膜結(jié)合的補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑的情況下，由于血清H因子和血清I因子的作用，形成大量水平的iC3b。iC3b隨后被I因子和其它蛋白酶和輔因子消化成膜結(jié)合的片段C3dg，然后消化成C3d，但是該過程相對(duì)緩慢。因此，一但CR2的C3配體產(chǎn)生，它們相對(duì)長(zhǎng)時(shí)間地存活并以高濃度存在于補(bǔ)體激活的部位。C3和C3片段的抗體。C3和C3片段的抗體。代替來自CR2的靶向部分，靶向部分可包括結(jié)合C3或C3片段如C3b、iC3b、C3d和C3dg的抗體或其抗原結(jié)合片段。結(jié)合C3的抗體和結(jié)合C3b和C3d的切割片段的抗體是已知的。例如，參見美國(guó)專利6，572，856，Taylor ；Tosic et al.,J. Immunological Methods, 120:241-249 (1989) ；Sokoloff etal. , Cancer Immunology and Immunotherapy, 49:551-562 (2000) ；MastelIos etal. , Molecular Immunology, 40:1213-1221 (2004) ；DiIiIIo et al. , MolecularImmunology, 43:1010-1019(2006) ；Campagne, US 2009/0081211 ；Etemad-Gilbertson etal. ,US 2009/0175875 ；Aguado et al.，J. Clin. Invest.，76:1418-1426 (1985)。這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此通過引用被并入本文。這樣的抗體和其功能片段可在本發(fā)明中用作靶向部分，該靶向部分將治療片段引導(dǎo)到經(jīng)歷激活的補(bǔ)體活性并因此表達(dá)C3或其片段的組織?？贵w的功能片段可包括，例如，單鏈可變區(qū)片段(scFvs)，其優(yōu)選包括Vh和\結(jié)構(gòu)域，任選地由柔性肽連接體連接。這樣的scFvs通常保留親本抗體的特異性和以單價(jià)方式結(jié)合靶抗原?？贵w轉(zhuǎn)變成scFvs是眾所周知的方法(參見Nat. Biotechnol. 23:1126 (2005) ；BiomolEng. 24:201 (2007);JImmunol Methods.，168:149(1994) ；Arch Virol.148:497(2003)。ScFvs可由新基因合成、重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或單個(gè)重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(')基因區(qū)段的相繼連接而構(gòu)建。還可進(jìn)行單個(gè)V1^P'基因相繼克隆進(jìn)含有合成連接體序列(例如，(Gly4Ser) 3)的載體。序列可以是Vh-連接體-Vlj或連接體-Vh。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶向部分可包括結(jié)合C3d的抗體，如由以下產(chǎn)生的那些抗體(I)雜交瘤細(xì)胞系3d-9a/25，其于2010年5月26日保藏并被命名為ATCC專利保藏PTA-10998 ; (2)雜交瘤細(xì)胞系3d_8b/2，其于2010年5月26日保藏并被命名為ATCC專
利保藏PTA-10999 ； (3)雜交瘤細(xì)胞系3d_29/5/2，其于2010年5月26日保藏并被命名為ATCC專利保藏PTA-11000 ; (4)雜交瘤細(xì)胞系3d_10/14/l，其于2010年6月3日保藏并被命名為ATCC專利保藏PTA-11010 ; (5)雜交瘤細(xì)胞系3d_l 1/14，其于2010年6月3日保藏并被命名為ATCC專利保藏PTA-11011 ； (6)雜交瘤細(xì)胞系3d_15A9，其于2010年6月2日保藏并被命名為ATCC專利保藏PTA-11012 ; (7)雜交瘤細(xì)胞系3d_3/28/4，其于2010年6月9日保藏并被命名為ATCC專利保藏PTA-11025 ; (8)雜交瘤細(xì)胞系3d_16/3/3，其于2010年6月9日保藏并被命名為ATCC專利保藏PTA-11026 ;和(9)雜交瘤細(xì)胞系3d_31/A6/9，其于2010年6月9日保藏并被命名為ATCC專利保藏PTA-11027。那些抗體在2010年6月22日提交的名稱為“補(bǔ)體成分3的C3d片段的抗體”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/357，499中被更詳細(xì)地描述，該申請(qǐng)?jiān)诖艘云淙客ㄟ^引用被并入本文。那些雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體的完整的核苷酸和氨基酸序列可容易地用標(biāo)準(zhǔn)方法如，例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和自動(dòng)化測(cè)序來確定?？笴3d單克隆抗體向單鏈可變區(qū)片段的轉(zhuǎn)變(scFvs) ο抗體轉(zhuǎn)變成scFvs是眾所周知的方法(參見Nat.Biotechnol. 23:1126 (2005) ； B i omoI Eng. 24:201 (2007) ； J Immuno IMethods.，168:149(1994) ；Arch Virol. 148:497 (2003)。ScFvs 可由新基因合成、重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或單個(gè)重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的相繼連接而構(gòu)建。還可進(jìn)行單個(gè)Vh和'基因相繼克隆進(jìn)含有合成連接體序列(例如，(Gly4Ser)3)的載體。序列可以是Vh-連接體-V1j或V1j-連接體_Vh?？蓪⒐こ袒笴3d-scFvs連接到補(bǔ)體抑制劑如CFI。本發(fā)明的單鏈Fvs優(yōu)選包括通過阻止分解的柔性肽連接體連接的Vh和\結(jié)構(gòu)域。如上面所描述的，抗C3d單克隆抗體可以相等的方式轉(zhuǎn)變成單鏈可變區(qū)片段。scFvs通常保留親本抗體的特異性和以單價(jià)方式結(jié)合靶抗原。一系列連接體可用于鑒定抗C3d-scFV和CFI相關(guān)的靶向部分之間的最佳距離，從沒有連接體到40個(gè)氨基酸的連接體,選擇的連接體序列可以是例如(GlyGlyGlyGlySer)η,其中η=0-8。連接到CFI相關(guān)部分的抗C3d-scFv的構(gòu)建可通過新基因合成、重疊PCR、連續(xù)的克隆或連接而進(jìn)行。最終構(gòu)建物的N端部分可以是CFI相關(guān)的部分或抗C3d-scFV。
H因子和ra片段H因子具有至少三個(gè)不同的C3b結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于SCRs 1-4 ；SCRs5-8和SCRs 19-20內(nèi)。H因子的每個(gè)位點(diǎn)結(jié)合C3b蛋白內(nèi)的不同區(qū)域N末端位點(diǎn)結(jié)合天然的C3b ;位于H因子中間區(qū)域的第二位點(diǎn)結(jié)合C3c片段；位于SCR19-20內(nèi)的位點(diǎn)結(jié)合C3d區(qū)域。H因子還含有肝素的結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于H因子的SCR 7、SCRs 5_12和SCRs19-20內(nèi)并與C3b結(jié)合位點(diǎn)的那些位點(diǎn)重疊。在一些實(shí)施方式中，靶向部分包括H因子的非補(bǔ)體調(diào)節(jié)片段，其保留結(jié)合C3片段——包括C3b、iC3b和C3d或C3的其它組織相關(guān)片段——中的一個(gè)或多個(gè)的能力。在一 些實(shí)施方式中，靶向部分包括H因子的SCR結(jié)構(gòu)域5-8和SCR結(jié)構(gòu)域19-20。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)體H因子”、“H因子”或“ΠΓ指補(bǔ)體H因子、單個(gè)多肽鏈血漿糖蛋白，包括其同系物。該蛋白由20個(gè)保守的大約60個(gè)氨基酸的短共有重復(fù)序列(SCR)結(jié)構(gòu)域組成，其以象串珠一樣的連續(xù)方式排列，每個(gè)由2-6個(gè)氨基酸的短連接體序列分開。H因子結(jié)合C3b，加速旁路途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)的衰變，并充當(dāng)C3b的蛋白水解失活的輔因子。在存在H因子的情況下，I因子進(jìn)行的蛋白水解導(dǎo)致C3b的切割和失活。H因子具有至少三個(gè)不同的C3b結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于SCRs 1-4 ；SCRs 5-8和SCRs 19-20內(nèi)。H因子的每個(gè)位點(diǎn)結(jié)合C3b蛋白內(nèi)的不同區(qū)域N末端位點(diǎn)結(jié)合天然的C3b;位于H因子中間區(qū)域的第二位點(diǎn)結(jié)合C3c片段和位于SCR19和20內(nèi)的位點(diǎn)結(jié)合C3d區(qū)域。此外，H因子還含有肝素的結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于H因子的SCR 7,SCRs 5-12和SCRs 19-20內(nèi)并與C3b結(jié)合位點(diǎn)的那些位點(diǎn)重疊。結(jié)構(gòu)和功能分析已顯示，H因子的補(bǔ)體抑制活性的結(jié)構(gòu)域位于前四個(gè)N端SCR結(jié)構(gòu)域內(nèi)。炎癥新表位(Neoepitopes)的抗體。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶向部分可包括抗體，該抗體結(jié)合炎癥新表位(inflammatory neoepitope),如I丐磷脂結(jié)合蛋白IV、隹丐磷脂結(jié)合蛋白A2、磷脂，如心磷脂，和瓜氨酸修飾的蛋白。適合的抗體可包括，例如，結(jié)合鈣磷脂結(jié)合蛋白IV的抗體B4 ;結(jié)合心磷脂的抗體C2 ;和結(jié)合瓜氨酸修飾的蛋白的抗體D5(參見Holers etal. ,WO 2007/112403 ； Thurman and Holers, WO 2010/034015);還參見，Allison,美國(guó)專利 6，962，903 ;7，407，475 (鈣磷脂結(jié)合蛋白 V) ;7，635，676 ;7，635，678 ;7，635，679 ；7,635,680 ;和 7，645，739 ;近端小管靶向部分，參見 Quigg et al. , US 2005/0265995。如上所述，抗體的功能片段如ScFvs可用作靶向部分。那些雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體的完整核苷酸和氨基酸序列可容易地用標(biāo)準(zhǔn)方法如，例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和自動(dòng)化測(cè)序來確定。其它靶向部分。本發(fā)明還考慮可利用其它靶向部分。靶向部分應(yīng)理想地在補(bǔ)體激活區(qū)域中結(jié)合一個(gè)或多個(gè)結(jié)合細(xì)胞的C3片段。這還包括在補(bǔ)體激活區(qū)域中結(jié)合表達(dá)在細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)新表位的祀向部分。補(bǔ)體旁路的抑制在一些實(shí)施方式中，本文描述的組合物包括顯著或選擇性地抑制補(bǔ)體旁路的活性劑部分?！帮@著地抑制補(bǔ)體旁路”指活性劑具有能力或百分比抑制——測(cè)量到在缺少所述活性劑部分的情況下旁路補(bǔ)體活性的至少10%，優(yōu)選20%、30%或40%、更優(yōu)選至少約50%、60%、80%或90%——抑制補(bǔ)體旁路?！斑x擇性地抑制補(bǔ)體旁路”指活性劑具有能力或百分比抑制一測(cè)量到比經(jīng)典或凝集素補(bǔ)體途徑大至少二、三、四、五或十倍一地抑制補(bǔ)體旁路。更優(yōu)選，活性劑將以比經(jīng)典或凝集素補(bǔ)體途徑大至少一、二或三個(gè)數(shù)量級(jí)的能力或百分比抑制來選擇性地抑制補(bǔ)體芳路。在優(yōu)選實(shí)施方式中，活性劑部分包括補(bǔ)體旁路抑制劑，或其生物學(xué)活性片段，其選自H因子蛋白、Crry、衰變加速因子(DAF)、MCP、CR1或其生物學(xué)活性片段。在一些實(shí)施方式中，活性部分是旁路補(bǔ)體途徑的放大環(huán)路的抑制劑并將阻止放大C3轉(zhuǎn)化酶以及下游C5轉(zhuǎn)化酶的形成和活性。在一些實(shí)施方式中，一旦起始C3轉(zhuǎn)化酶在紅細(xì)胞表面上形成，活性部分將能滅活起始C3轉(zhuǎn)化酶，并可部分地阻止流體相中起始C3轉(zhuǎn)化酶的形成。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，活性劑部分包括H因子蛋白或其生物學(xué)活性片段，其保留抑制補(bǔ)體旁路的能力。適合的H因子蛋白和其生物學(xué)活性片段包括前四個(gè)N端短共有序列(H因子的SCRs，并在US 2008/0221011, Gilkeson et al中有描述，其公開在此特別通過引用被并入本文)。在，例如，Tomlinsonand Holers, US 2008/0267980 中描述了在本發(fā)明中可用作活性劑部分的其它補(bǔ)體抑制劑和其片段。適合的補(bǔ)體抑制劑，例如，可包括補(bǔ)體受體I (CRl) ;MCP ;Crry ;或DAF。Tomlinson and Holers的公開在此特別通過引用被并入本文?？捎米骰钚詣┎糠值钠渌a(bǔ)體抑制劑包括compstatin,參見Janssen et al.，J. Biol.Chem. 282:29241-7(2007)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，補(bǔ)體抑制劑是旁路補(bǔ)體途徑的放大環(huán)路的 抑制劑。在某些實(shí)施方式中，活性部分包括兩個(gè)或多個(gè)補(bǔ)體抑制劑，例如，TT31中H因子的兩個(gè)或多個(gè)生物學(xué)活性片段；或H因子的活性片段聯(lián)合補(bǔ)體受體I的活性片段，MCP ；Crry ；補(bǔ)體I因子；CD59或DAF。在這樣的實(shí)施方式中，可以以多種形式提供活性部分，例如，當(dāng)活性部分包括H因子和⑶59的組合時(shí)，該組合物可包括下面的兩個(gè)或多個(gè)CR2-FH-⑶59 ；CR2-CD59-FH ;抗 C3d-FH_CD59 和抗 C3d-CD59_ra。如本文所用，術(shù)語(yǔ)補(bǔ)體抑制劑的“生物學(xué)活性”片段指補(bǔ)體抑制劑的片段，其保留全長(zhǎng)補(bǔ)體抑制蛋白的一些或所有的抑制活性。例如，H因子的“生物學(xué)上有活性的”片段包括，但不限于，如下面詳細(xì)描述的，包括SCRs 1-4、SCRs 1-5、SCRs 1-8、SCRsl-18、SCRs19-20的H因子片段，或天然存在的H因子的任何同系物或其片段。在某些實(shí)施方式中，H因子的生物學(xué)活性片段具有以下性質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)(I)結(jié)合C-re活性蛋白(CRP)、(2)結(jié)合C3b、(3)結(jié)合肝素、(4)結(jié)合唾液酸、(5)結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面、(6)結(jié)合細(xì)胞整合素受體、(7)結(jié)合病原體、(8)C3b輔因子活性、(9)C3b衰變加速活性和(10)抑制旁路補(bǔ)體途徑。應(yīng)當(dāng)考慮以上描述的補(bǔ)體抑制劑的變體和修飾在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中可用作活性劑部分。例如，通過缺失分析，可能鑒定上述一些補(bǔ)體抑制劑的較小片段，其包括補(bǔ)體抑制需要的最小序列元件。在其它實(shí)施方式中，補(bǔ)體抑制劑，或補(bǔ)體抑制需要的其最小序列元件，可被修飾以增加作為抑制劑的活性劑部分的半衰期、穩(wěn)定性或潛能。例如，活性劑部分可包括補(bǔ)體抑制劑，或其活性片段，其栓系到蛋白或非蛋白支架——預(yù)期保持以能進(jìn)行補(bǔ)體抑制的構(gòu)象的活性劑部分，同時(shí)減少對(duì)蛋白酶的易感性或另外延長(zhǎng)活性劑部分的半衰期、穩(wěn)定性或潛能。以下描述涉及方法和組合物，其中定向治療劑是包括來自CR2的靶向部分和來自FH的活性劑的融合蛋白(CR2-H1融合蛋白)。該描述是非限制的，而且就本發(fā)明的其它實(shí)施方式一包括本文提到的可選的靶向部分和可選的活性部分一而論，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能實(shí)施本發(fā)明。還考慮間接抑制補(bǔ)體旁路的抑制劑。例如，在一些實(shí)施方式中，抑制劑抑制兩個(gè)或多個(gè)補(bǔ)體途徑。在一些實(shí)施方式中，抑制劑抑制凝集素補(bǔ)體途徑(例如，在一些實(shí)施方式中，抑制劑是抗MASP抗體)。在一些實(shí)施方式中，抑制劑抑制經(jīng)典途徑(例如，在一些實(shí)施方式中，抑制劑是CRl)。還考慮其它補(bǔ)體抑制劑。在一些實(shí)施方式中，本文描述的定向構(gòu)建物包括兩個(gè)或多個(gè)補(bǔ)體抑制劑或其片段。每個(gè)構(gòu)建物中這些兩個(gè)或多個(gè)補(bǔ)體抑制劑或其片段可以相同或不同。每個(gè)構(gòu)建物中的兩個(gè)或多個(gè)補(bǔ)體抑制劑或其片段可抑制相同或不同的補(bǔ)體途徑。組合物本文描述的組合物可以任何途徑給予個(gè)體，該途徑包括，但不限于，靜脈內(nèi)(例·如，通過輸注泵)、腹膜內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肺內(nèi)、口腔、吸入、膀胱內(nèi)、肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)胸膜、動(dòng)脈內(nèi)、局部、吸入(例如，作為噴霧劑的霧)、粘膜(如通過鼻粘膜)、皮下、經(jīng)皮、胃腸道、關(guān)節(jié)內(nèi)、腦池內(nèi)、心室內(nèi)、直腸(即，通過栓劑)、陰道(即，通過陰道環(huán))、顱內(nèi)、尿道內(nèi)、肝內(nèi)和瘤內(nèi)途徑。在一些實(shí)施方式中，全身給予組合物(例如通過靜脈內(nèi)注射)。在一些實(shí)施方式中，局部給予組合物(例如通過動(dòng)脈內(nèi)或眼內(nèi)注射)。在一些實(shí)施方式中，血管內(nèi)，如靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)給予組合物。在一些實(shí)施方式(例如對(duì)于腎臟病的治療)中，將組合物直接給予到動(dòng)脈(如腎動(dòng)脈)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，皮下給予組合物。最佳有效量的組合物可以以經(jīng)驗(yàn)確定并將取決于疾病的類型和嚴(yán)重性、給藥途徑、疾病進(jìn)展和健康狀態(tài)、個(gè)體的質(zhì)量和身體面積。這樣的確定處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)內(nèi)。有效量還可基于體外補(bǔ)體激活測(cè)定來確定。可用于本文描述的方法的CR2-FH分子的劑量的例子包括，但不限于，約O. 01ug/kg至約300mg/kg、或約O. lug/kg至約40mg/kg內(nèi)、或具有約 lug/kg 至約 20mg/kg、或約 lug/kg 至約 10mg/kg 內(nèi)、或約 O. lmg/kg 至約 100mg/kg內(nèi)、或約 O. lmg/kg 至 50mg/kg 內(nèi)或約 O. lmg/kg 至約 25mg/kg 內(nèi)、或約 O. lmg/kg 至約 IOmg/kg內(nèi)中任一個(gè)的劑量范圍內(nèi)的有效量。在一些實(shí)施方式中，有效量是約O. lmg/kg至約10mg/kg。在一些實(shí)施方式中，有效量是約0. lmg/kg至約20mg/kg。在一些實(shí)施方式中，有效量是約0. 1、0· 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20mg/kg 中任一個(gè)。例如，當(dāng)皮下給予時(shí)，組合
物可以以低微克范圍-包括例如約0. lug/kg或更少、約0. 05ug/kg或更少、或0. Olug/
kg或更少——給予。在一些實(shí)施方式中，給予個(gè)體的CR2-FH的量是每個(gè)劑量約IOug至約500mg per dose,包括例如每個(gè)劑量約IOug至約50ug、約50ug至約100ug、約IOOug至約200ug、約 200ug 至約 300ug、約 300ug 至約 500ug、約 500ug 至約 lmg、約 Img 至約 10mg、約IOmg 至約 50mg、約 50mg 至約 100mg、約 IOOmg 至約 200mg、約 200mg 至約 300mg、約 300mg至約 400mg、約 400mg 至約 500mg、約 500mg 至約 600mg、約 600mg 至約 700mg、約 700mg 至約800mg、約800mg至約900mg或約900mg至約IOOOmg中任一個(gè)。CR2-H1組合物可以以單個(gè)日劑量給予，或總?cè)談┝靠梢砸悦刻於?、三或四次的分開的劑量給予。組合物還可以以比每天一次更小的頻率給予，例如，每周六次、每周五次、每周四次、每周三次、每周二次、每周一次、每?jī)芍芤淮?、每三周一次、每月一次、每?jī)蓚€(gè)月一次、每三個(gè)月一次或每六個(gè)月一次。組合物還可以以持續(xù)釋放制劑給予，如以逐漸釋放組合物用于一段時(shí)期的植入劑，其允許組合物較不頻繁地給予，如一個(gè)月一次、每2-6個(gè)月一次、每年一次或甚至單次給予。持續(xù)釋放裝置(如片劑、納米顆粒、微粒、納米球、微球和類似物等)可通過注射給予或手術(shù)植入身體的各種位置。在一些實(shí)施方式中，組合物(如TT30)以約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/ml的濃度在水或生理鹽水中被提供。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，滴定CR2-FH融合蛋白的配量以至于劑量足以減少或阻止紅細(xì)胞溶解，可完全或部分地抑制或阻斷放大C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)在紅細(xì)胞表面上的形成和活性；但以足夠低的濃度以至于異常細(xì)胞的C3包被仍然在全身被觀察到，以至于C3能形成流體相的起始C3轉(zhuǎn)化酶(C3iBb)?；蛑委烠R2-FH分子還可通過體內(nèi)CR2-FH融合蛋白的表達(dá)來輸送，這常常被稱作“基因治療”。例如，可將細(xì)胞用編碼融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)進(jìn)行離體工程改造，然后將工程改造的紅細(xì)胞提供給將用融合蛋白治療的個(gè)體。這樣的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。例如，可通過本領(lǐng)域已知的操作，通過利用含有為本發(fā)明的編碼融合蛋白的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒使細(xì)胞工程改造。利用基因治療局部輸送本發(fā)明的融合蛋白可向局部的靶區(qū)提供治療劑。基因輸送的方法在本領(lǐng)域是已知的。這些方法包括，但不限于，直接的DNA轉(zhuǎn)移，參見,例如，Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468 ;2)脂質(zhì)體介導(dǎo)的 DNA 轉(zhuǎn)移，參見，例如，Caplen et al. (1995)Nature Med. 3:39-46 ；Crystal (1995)Nature Med. 1:15-17 ；Gao and Huang(1991)Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285 ；3)反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA 轉(zhuǎn)移，參見，例如，Kay et al. (1993) Science 262:117-119 ;Anderson (1992) Science256:808-813 ；4)DNA病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。這樣的DNA病毒包括腺病毒(優(yōu)選基于Ad2或Ad5的載體)、皰疹病毒(優(yōu)選基于單純皰疹病毒的載體)和細(xì)小病毒(優(yōu)選基于“缺陷的”或非自治的細(xì)小病毒的載體，更優(yōu)選基于腺相關(guān)病毒的載體，最優(yōu)選基于AAV-2的載體)。參見，例如，Ali et al. (1994)基因治療1:367-384 ;通過引用并入本文的美國(guó)專利號(hào)4，797，368，和美國(guó)專利號(hào)5，139，941。反轉(zhuǎn)錄病毒——可從其獲得上文提到的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體——包括，但不限于，莫洛尼小鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒如Rotis肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽白血病病毒、長(zhǎng)臂猿類人猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺瘤病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體來自莫洛尼小鼠白血病病毒。腺病毒具有以下優(yōu)點(diǎn)具有廣泛宿主范圍，可感染靜止的或末期分化的細(xì)胞，如神經(jīng)元或肝細(xì)胞，并且基本上呈現(xiàn)非致瘤的。參見，例如，Ali et al. (1994)，supra,第367頁(yè)。腺病毒似乎不整合進(jìn)宿主基因組。因?yàn)樗鼈兇嬖谟谌旧w外，所以插入誘變的危險(xiǎn)大大降低。Ali et al. (1994), supra,第 373 頁(yè)。腺相關(guān)病毒顯示與基于腺病毒的載體相似的優(yōu)點(diǎn)。然而，AAVs顯示在人19號(hào)染 色體上的位點(diǎn)特異性整合(Ali et al. (1994)，supra,第377頁(yè))?；蛑委熭d體可包括一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，載體具有在多個(gè)細(xì)胞類型中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，載體具有在特定細(xì)胞類型(如視網(wǎng)膜細(xì)胞或腎臟中的細(xì)胞)中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子。可利用的適合的啟動(dòng)子包括，但不限于，反轉(zhuǎn)錄病毒LTR ;SV40 啟動(dòng)子；和Miller et al. (1989) Biotechniques 7 (9) : 980-990 中描述的人巨細(xì)胞病毒(CVM)啟動(dòng)子,或任何其它啟動(dòng)子(例如，細(xì)胞啟動(dòng)子如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，包括，但不限于，組蛋白、pol III和β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)?？衫玫钠渌牟《締?dòng)子包括，但不限于，腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和Β19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。從本文包含的教導(dǎo)選擇適合的啟動(dòng)子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是明顯的。編碼CR2-FH融合蛋白的核酸序列優(yōu)選在適合的啟動(dòng)子的控制下。可利用的適合的啟動(dòng)子包括，但不限于，腺病毒啟動(dòng)子，如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；或異源啟動(dòng)子，如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動(dòng)子；可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如MMT啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子；熱休克啟動(dòng)子；白蛋白啟動(dòng)子；ΑροΑ1啟動(dòng)子；人球蛋白啟動(dòng)子；病毒的胸昔激酶啟動(dòng)子，如單純皰疹胸腺激酶啟動(dòng)子；反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs (包括上文描述的修飾的反轉(zhuǎn) 錄病毒LTRs) ； β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；和人生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？杀晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子被描述在Miller(1990)Human Gene Therapy 1:5-14中。載體可通過本領(lǐng)域已知的任何方法轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。這樣的方法包括，但不限于，電穿孔、脂質(zhì)體的利用、和CaPO4沉淀。在一個(gè)可選方案中，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可被包入脂質(zhì)體，或與脂質(zhì)結(jié)合，然后給予宿主。生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生感染的反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，其包括編碼多肽的核酸序列(或多個(gè))。這樣的反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆?？捎糜隗w外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼多肽的核酸序列(或多個(gè))?？杀晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括，但不限于，胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞、以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，在允許CR2-FH分子起作用以抑制補(bǔ)體激活的條件下，通過離體使體液與包括CR2-H1分子的組合物接觸而抑制補(bǔ)體激活。適合的體液包括可返回到個(gè)體的那些體液，如血液、血漿或淋巴。親和吸附血漿分離置換法(apheresis)在 Nilsson et al. (1988)Blood 58(I) :38-44 ;Christie et al. (1993)Transfusion33:234-242 ；Richter et al. (1997)ASAI0 J. 43(1):53-59 ；Suzuki et al. (1994)Autoimmunity 19:105-112 ;美國(guó)專利號(hào)5，733，254 ;Richter et al. (1993)Metabol. Clin.Exp. 42:888-894 和 Wallukat et al. (1996) Int’I J. Card. 54:1910195 中被一般性描述。因此，本發(fā)明包括在個(gè)體中治療本文描述的一個(gè)或多個(gè)疾病的方法，包括在允許CR2-FH分子起作用以抑制補(bǔ)體激活的條件下，用包括CR2-FH分子的組合物體外地(extracoporeally)(即，身體外或離體)治療個(gè)體的血液，并將血液返回到個(gè)體。單似劑量、制品和試劑盒還提供CR2-FH分子組合物的單位劑型，每個(gè)劑量含有約O. Olmg至約50mg，包括例如約O. Img至約50mg、約Img至約50mg、約5mg至約40mg、約IOmg至約20mg、或約15mg中任一個(gè)的CR2-H1分子。在一些實(shí)施方式中，CR2-H1分子組合物的單位劑型包括約O. Olmg-O. lmg、0. lmg-0. 2mg、0. 2mg-0. 25mg、0. 25mg-0. 3mg、0. 3mg-0. 35mg、0. 35mg-0. 4mg、
0.4mg-0. 5mg、0. 5mg-l. 0mg、5. 0mg_15mg、10mg-20mg、20mg-50mg、50mg-80mg、80mg-100mg、100mg_150mg、150mg-200mg、200mg-250mg、250mg-300mg、300mg-400mg、或 400mg_500mg 中任一個(gè)的CR2-ra分子。在一些實(shí)施方式中，單位劑型包括約O. 25mg CH2-H1分子。在其它實(shí)施方式中，單位劑型包括約IOmg CH2-H1分子。術(shù)語(yǔ)“單位劑型”指適合用作個(gè)體的單一
劑量(unitatry dosages)的物理上分離的單位,每個(gè)單位含有預(yù)設(shè)量的活性物質(zhì)-其被
計(jì)算以產(chǎn)生期望的療效——結(jié)合適合的制藥載體、稀釋劑或賦形劑。這些單位劑型可以以單個(gè)或多個(gè)單位劑量?jī)?chǔ)存于適合的包裝中，并還可被進(jìn)一步滅菌和密封。在一些實(shí)施方式中，組合物(如TT30)以約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/ml的濃度在水或生理鹽水中被提供。還提供在適合的包裝中的制品，其包括本文描述的組合物。用于本文描述的組合物(如眼組合物)的適合的包裝在本領(lǐng)域已知，并包括，例如，小瓶(如密封的小瓶)、管、安 瓿、瓶子、罐、軟包裝(例如，密封的聚脂薄膜或塑料袋)和類似的包裝等。這些制品可進(jìn)一步被滅菌和/或密封。本發(fā)明還提供試劑盒，其包括本文描述的組合物(或單位劑型和/或制品)，并可另外包括關(guān)于使用該組合物——如本文描述的用途——的方法的說明書(一個(gè)或多個(gè))。本文描述的該試劑盒可另外包括商業(yè)和使用者立場(chǎng)期望的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、過濾器、針、注射器和具有進(jìn)行本文描述的任何方法的指示的包裝插件。本發(fā)明的組合物和制劑可用于與補(bǔ)體激活相關(guān)的狀況的治療，優(yōu)選涉及補(bǔ)體旁路的那些狀況，該治療主要不受末端補(bǔ)體抑制劑[例如，C 3激活以后的補(bǔ)體途徑的步驟的抑制劑]的影響。在前述的說明和在下面的實(shí)施例中，本發(fā)明已用其具體地實(shí)施方式進(jìn)行描述。然而，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的是，可對(duì)其進(jìn)行各種修改和變化，而不背離本發(fā)明較寬的范圍。本文引用的所有出版物在此通過參考它們被引用的教導(dǎo)的公開被特別地并入本文。
實(shí)施例實(shí)施例I.證明保護(hù)紅細(xì)胞抵御陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)中溶血性溶解的可能機(jī)制。該實(shí)施例使用TT30 (SEQ ID NO: 3)和PNH作為實(shí)例來證明TT30可保護(hù)紅細(xì)胞抵御溶血性溶解的可能機(jī)制。PNH RBCs缺乏通過CD55控制C3轉(zhuǎn)化酶和通過CD59控制C5轉(zhuǎn)化酶介導(dǎo)的膜攻擊復(fù)合物(MAC)形成的能力。在缺少局部補(bǔ)體旁路(CAP)控制的情況下(參見圖20)，自發(fā)的空轉(zhuǎn)(tichover)產(chǎn)生液相C3 (H2O),其在存在因子D(fD)的情況下與因子B(fB)和備解素(P)結(jié)合以形成液相起始C3轉(zhuǎn)化酶，該起始C3轉(zhuǎn)化酶切割C3以釋放C3和在RBC表面上沉積共價(jià)結(jié)合的C3b。在存在fD的情況下C3b與fB和P的結(jié)合產(chǎn)生表面結(jié)合的放大性(amplifying) C3轉(zhuǎn)化酶。CAP放大環(huán)路產(chǎn)生另外的C3b和C3轉(zhuǎn)化酶，并通過將C3b加入到C3轉(zhuǎn)化酶，形成表面結(jié)合的C5轉(zhuǎn)化酶。C5轉(zhuǎn)化酶切割C5以釋放C5并沉積C5b，導(dǎo)致迅速加入C6、C7、C8和聚C9以形成MAC，導(dǎo)致血紅蛋白(Hgb)和乳酸脫氫酶(LDH)的溶解和釋放。自發(fā)的CAP啟動(dòng)的主要負(fù)調(diào)節(jié)劑是fH。在液相中，fH阻斷C3(H2O)與fB的結(jié)合。在細(xì)胞表面上，fH還破裂放大性C3轉(zhuǎn)化酶，聯(lián)合蛋白酶I因子(fl)，在細(xì)胞表面上將C3b轉(zhuǎn)化成滅活的iC3b，iC3b隨后被Π和補(bǔ)體受體I(CRl)轉(zhuǎn)化成C3dg，然后被具有差的特征性的血清蛋白酶轉(zhuǎn)化成C3d。fH還破裂C5轉(zhuǎn)化酶。這些fH活性存在于正常的RBCs和PNH RBCs上，但只部分促成RBCs上必需的補(bǔ)體激活的完全控制。最重要的是，在正常RBCs上(參見圖21)，由于CD55 (DAF)，C3轉(zhuǎn)化酶經(jīng)歷加速的衰變，而MAC形成在C9結(jié)合步驟被⑶59破壞。因此，在存在正常的保護(hù)機(jī)制的情況下，自發(fā)的CAP激活被控制。雖然fH活性在PNH未被損害，但是在缺少⑶55和⑶59作用的情況下，fH不能充分地控制RBC表面上CAP激活(參見圖20)，和溶血后果。保護(hù)PNH RBCs抵御血管內(nèi)溶血(IVH)的一 個(gè)方法是阻止MAC的形成，這可通過用抗C5單克隆抗體,如艾庫(kù)珠單抗阻斷C5參與來實(shí)現(xiàn)(參見圖22)。在該方案(setting)中，不改變fH功能。然而，fH單獨(dú)不能阻止所有放大性C3轉(zhuǎn)化酶功能，以使PNH RBCs逐漸地變得“包被”有 C3 片段。Risitano et al.，Blood, 113:4094-100 (2009)。這導(dǎo)致這些包被 C3片段的PNH RBCs在肝和脾內(nèi)的去除一這是稱作血管外溶血(EVH)的過程。除了積累C3片段，放大性C3轉(zhuǎn)化酶的連續(xù)活性將可能導(dǎo)致PNH RBC表面上C3和C5轉(zhuǎn)化酶的增加的形成。如果未阻斷的C5將變的可獲得，那么該狀況將使PNH RBCs易于溶解，并可解釋為什么艾庫(kù)珠單抗不能體外阻止 PNHRBCs 溶血。Risitano et al. , Blood, 114:71 (2009; AbstractNo. 158;Accessed at: http://ash, confex. com/ash/2009/webprogram/Paper19102.
html)o不被理論束縛，假設(shè)TT30 (定向fH)將通過自發(fā)的空轉(zhuǎn)來結(jié)合沉積在RBC表面上的C3片段，并將阻止C3和C5轉(zhuǎn)化酶和MAC的形成，因此阻止IVH。阻止溶血將導(dǎo)致血清LDH濃度的降低和血細(xì)胞比容的增加。此外，TT30可阻止與EVH相關(guān)的C3片段的積累(圖23)。實(shí)施例2. PNH RBCs的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血的體外模型；不同補(bǔ)體抑制劑的作用PNH是一種血液病癥，其特征在于由于受影響的紅細(xì)胞(RBCs)上缺少C抑制劑⑶55和⑶59而引起的補(bǔ)體(C)介導(dǎo)的血管內(nèi)溶血(IVH)。當(dāng)不受⑶55控制時(shí)，正常的、自發(fā)的補(bǔ)體旁路激活可導(dǎo)致C3沉積到PNH RBCs上——這在未治療的PNH中未檢測(cè)到，C3和C5轉(zhuǎn)化酶的產(chǎn)生和由于缺少CD59而形成膜攻擊復(fù)合物(MAC)和溶解。TT30是本發(fā)明的65kD重組嵌合人融合蛋白。TT30包括C2受體的iC3b/C3d_結(jié)合區(qū)和CAP調(diào)節(jié)劑H因子(fH)的功能結(jié)構(gòu)域，其象CD55 —樣起作用以阻斷CAPC3轉(zhuǎn)化酶在RBCs表面上的形成和活性。從5個(gè)PNH對(duì)象(2個(gè)是未治療的，3個(gè)是用Ecu治療的)獲得RBCs。從相同的對(duì)象和從ABO匹配的健康對(duì)象獲得血清。Ecu輸注之后在估計(jì)的 200 μ g/mL峰濃度立即收集用Ecu治療的PNH對(duì)象的血清。漢姆酸溶血試驗(yàn)是體外評(píng)價(jià)在酸化血清中短暫溫育之后補(bǔ)體激活后PNH RBCs對(duì)IVH 增加的易感性的診斷方法。Ham and Dingle, J. Clin. Invest. , 18:657 (1939)。漢姆試驗(yàn)的主要原理是在酸化作用引起的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的體外激活之后攻擊在新鮮正常人血清中的PNH RBCs (通過定義，由于缺少⑶55和⑶59，其對(duì)補(bǔ)體激活敏感)。作為本發(fā)明的部分，本發(fā)明人發(fā)展了漢姆試驗(yàn)，將其改良以延遲溶血和允許連續(xù)的評(píng)價(jià)以評(píng)價(jià)PNH RBCs對(duì)隨后溶血(由末端補(bǔ)體激活產(chǎn)生的)的易感性和對(duì)溶血前補(bǔ)體激活的易感性(如通過在雙色[C3-FITC對(duì)⑶59-PE]流式細(xì)胞術(shù)中由初始C3沉積所評(píng)價(jià)的)。溶血通過上清液的經(jīng)典光譜測(cè)定法來測(cè)量，還通過RBCs的流式細(xì)胞術(shù)來定量(Ferreirand Pangburn, Blood 2007)。因此，改良的漢姆試驗(yàn)允許評(píng)價(jià)各種C調(diào)節(jié)劑對(duì)PNH RBCs溶血的作用，以及對(duì)初始C3激活和通過CAP的沉積的作用。C3結(jié)合的RBCs已顯示在PNH中在用末端補(bǔ)體抑制劑艾庫(kù)珠單抗(Ecu)治療期間形成，并是這些對(duì)象中血管外溶血(EVH)的可能的原因(Risitano et al, Blood2009);在該改良的漢姆試驗(yàn)中，C3沉積通過雙色流式細(xì)胞術(shù)來定量。評(píng)價(jià)補(bǔ)體抑制劑TT30 (TaligenTherapeutics, Cambridge, MA)。TT30是定向C3轉(zhuǎn)化酶抑制劑,包括從CR2分離的祀向部分和從H因子分離的補(bǔ)體抑制部分。從未治療的和用艾庫(kù)珠單抗治療的PNH對(duì)象獲得RBCs。從ABO匹配的健康個(gè)體獲 得血清。簡(jiǎn)言之，給新鮮的正常血清添加MgCl，并與補(bǔ)體抑制劑(TT30) —起溫育。15分鐘之后，加入HCl以酸化血清和激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)。將PNH加入(50%懸浮液的1:20)到血清中，并于37°C溫育。在不同的時(shí)間間隔測(cè)量溶血和C3沉積，以評(píng)價(jià)補(bǔ)體抑制劑的作用。下面描述了材料和實(shí)驗(yàn)方法的詳細(xì)內(nèi)容。在該改良的漢姆試驗(yàn)中，觀察到RBCs的延遲溶解，其來自未治療的PNH對(duì)象；lh之后溶解是部分的(50-70%)，并在72h變得幾乎完全溶解。將結(jié)果表達(dá)為初始PNHRBCs :在
I、6、24和72h之后的存活，存活分別是 65、40、20和〈10%。當(dāng)與ABO匹配的血清溫育時(shí)，在來自接受Ecu的對(duì)象的PNH RBCs中觀察到相同比率的溶血。TT30能顯著地抑制未治療的PNH對(duì)象的RBCs溶血。TT30顯示濃度和時(shí)間依賴的溶血抑制。3_100ηΜ (1000ηΜ=65 μ g/ml)的TT30濃度在甚至Ih時(shí)不改善PNH RBC存活。相比之下，300nM TT30導(dǎo)致在Ih時(shí)的暫時(shí)抑制(存活的PNH RBCs 70%)，這沒有持續(xù)(在6和24h時(shí)存活的PNH RBCs是 50和20%)。TT30的較高濃度(3000nM，等于195 μ g/mL)只在24h導(dǎo)致溶血的完全抑制，雖然具有較長(zhǎng)的溫育時(shí)溶血是明顯的(存活的PNH RBCs在1、6、24和72h分別是 90、90、90和50%)。當(dāng)利用用Ecu治療的PNH對(duì)象的洗過的RBCs時(shí)，TT30導(dǎo)致未治療的PNH RBCs的溶血抑制。最后，改良的漢姆試驗(yàn)研究補(bǔ)體抑制劑對(duì)PNH RBCs上C3激活和沉積的作用。與C3轉(zhuǎn)化酶活性的局部RBC表面抑制的機(jī)制一致，在120h溫育自始至終，TT30暴露沒有導(dǎo)致PNH RBCs上任何C3沉積。此外，當(dāng)利用用Ecu治療的PNH對(duì)象的PNH RBCs時(shí)，TT30不允許PNH RBCs上進(jìn)一步的C3結(jié)合，即使預(yù)存在的C3+RBCs保持不變。在該模型中，TT30證明濃度和時(shí)間依賴性的溶血抑制。3-100ηΜ(1000ηΜ=65μ g/ml)的TT30濃度在甚至Ih時(shí)不改善PNH RBC存活。相比之下，300nM TT30導(dǎo)致在Ih時(shí)大量的抑制(存活的PNH RBCs 70%)，這沒有持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間(在6和24h時(shí)存活的PNH RBCs是 50和20%)。TT30的較高濃度(3000nM，等于195 μ g/mL)只在24h導(dǎo)致溶血的完全抑制，雖然具有較長(zhǎng)的溫育時(shí)溶血是明顯的(存活的PNH RBCs在1、6、24和72h分別是 90、90,90和50%)。進(jìn)行改良的漢姆試驗(yàn)以研究C抑制劑對(duì)PNH RBCs上C3激活和沉積的作用。與C3轉(zhuǎn)化酶活性的局部RBC表面抑制的機(jī)制一致，在120h溫育自始至終，暴露于TT30沒有導(dǎo)致PNH RBCs上任何C3沉積。我們的數(shù)據(jù)顯示，利用TT30的CAP調(diào)節(jié)體外抑制PNHRBCs溶血。TT30還抑制存活的PNH RBCs上的C3激活和沉積，這最近已被描述為接受末端補(bǔ)體抑制劑艾庫(kù)珠單抗的PNH對(duì)象中殘留溶血和貧血的主要原因。這些發(fā)現(xiàn)為通過靶向和抑制CAP而治療與PNH相關(guān)的IVH和EVH的潛在新機(jī)制提供理論。
總之，發(fā)展了本文描述的“改良的漢姆試驗(yàn)”以體外評(píng)價(jià)C抑制劑對(duì)PNH RBCs的有效性。來自該試驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，利用TT30的CAP調(diào)節(jié)體外抑制PNH RBCs溶血。然而，與Ecu不同，TT30還抑制存活的PNH RBCs上的C3激活和沉積。這些發(fā)現(xiàn)為通過靶向和抑制CAP而治療與PNH相關(guān)的IVH和EVH的潛在新機(jī)制提供有效性的證據(jù)。材料和實(shí)驗(yàn)方法從ABO匹配的供體獲得新鮮血清。通過用NaCl O. 9%洗滌三次從PNH對(duì)象獲制備的新鮮紅細(xì)胞；利用50%或25%重懸浮液用于實(shí)驗(yàn)(分別為與血清比1:20和1:10)。50%RBC重懸浮液應(yīng)是約5 X IO6RBCs/ μ L0制備以下溶液和試劑MgCl2 (六水合物(hexahydratate), MW 203)制備 IOOmM 忙存液(IOmL 蒸懼水中 2.03g);制備30mM工作溶液(由貯存液，1:3. 3)，在最后的實(shí)驗(yàn)中與血清以1:20比使用。HCl從可利用的37%溶液(=12M)開始；制備IM=IN溶液(IOOmL蒸餾水中8. ImL)；制備O. 4或O. 2工作溶液(分別與血清以1:20和1:10比使用)。TT30 (MW 65kDa)-從118 μ M溶液(7. 71mg/mL)開始；制備兩個(gè)工作溶液；6 μ M (由貯存液，1:20) ;0. 6 μ M(由工作溶液A，1:10)。根據(jù)稀釋曲線使用合適的量(最終的范圍3-3000ηΜ)。根據(jù)表I進(jìn)行制備。將500 μ L(10份；I份等于50 μ L)血清(或適當(dāng)?shù)乃?加入到所有的管中。將25yL(0. 5份)30mM MgCl溶液加入到適當(dāng)?shù)墓苤?。加入適當(dāng)濃度的抑制劑，如表I中所示，并溫育15分鐘。加入HCl以酸化血清。表I管和內(nèi)含物
蘇抑制劑
1S.....pnh'rbcs......
2NaCl 0.9% PNH RBCs
"3ISPNH RBCsMgCl
IKIfciLttPNHRBCs.........MgCl
5酸化血淸PNH RBCsMgCl TT30 3000 nM (120 μΜ 的 15 μ )
___PNHRBCsMgCl^ ^TT30 1000 ηΜ(120 μΜ fl<J 5 μ )
~7酸化血清PNH RBCsMgClTT30 300 nM (6 μΜ 的 30 μ )
:8........................酸化血淸PNH RBCsMgCl^ ^TT30 100 nM (6 μΜ 的 10 μ )
"9酸化血淸PNH RBCsMgClΤΤ30 30 nM (0.6 μΜ 的 30 μ )
10酸化血淸PNH RBCsMgCl ΤΤ30 10 nM (0.6 μΜ 的 10 μ )
11酸化血清PNH RBCsMgCl ΤΤ30 3 nM (0.6 μΜ 的 3 μ )將50yL(l份)0. 2Μ HCl加入到每個(gè)管中。將RBC重懸浮夜加入到所有的管中，作為25 μ L (O. 5份)50%RBC懸浮液，約5 X 106/uL ;每管使用25uL 50%RBC懸浮液。將管于37°C溫育(持續(xù)至少72h)。(于lh、6h、24h和72h)檢查溶血和C3包被通過CD59/C3流式細(xì)胞術(shù)染色對(duì)RBC沉淀(pellet)進(jìn)行。將I μ L RBC 沉淀(約 IO7RBCs)以 1:1000 稀釋；將 NaCl 中 50uL 104/uL*RBC 重懸浮液與IuL抗C3多克隆抗體和5uL抗⑶59單克隆抗體一起溫育。將樣品于室溫溫育Ih ；加入250-500uLNaCl之后，無需另外沖洗,通過流式細(xì)胞術(shù)分析(Risitano et al, Blood113:4094-4100(2009))。如下計(jì)算PNH RBCs 的存活(Ferreirand Pangburn, Blood, 110:2190-2192 (2007)):存活％=(之后的PNH%/之后的N%) X (之前的N%/之前的PNH%)
如下計(jì)算PNH RBCs的溶解％溶解=100- (%存活)。實(shí)施例2A :補(bǔ)體介導(dǎo)的PNH RBCs溶血的體外模型；不同補(bǔ)體抑制劑的作用發(fā)展了體外模型以允許評(píng)價(jià)TT30和艾庫(kù)珠單抗的比較有效性。該體外模型是改良的漢姆試驗(yàn)，其中將PNH RBCs暴露于ABO匹配的酸化的正常血清(ANS)，這導(dǎo)致自發(fā)的CAP激活(Pascariello et al. , European Hematologic Association (EHA), Barcelona, June10-13，(2010)) o當(dāng)將來自未治療的患者的PNH RBCs與ANS溫育24小時(shí)時(shí)，74± 16%的PNHRBCs溶解，具有針對(duì)C3片段(C3frag)存在的RBC鬼影染色。相比之下，與I或3 μ M(65或195 μ g/ml)TT30溫育導(dǎo)致只有14±26%或5±7%的PNH RBCs溶血，存活的PNH RBCs是在它們表面上C3片段陰性的。人fH的等摩爾濃度產(chǎn)生少得多的溶血抑制(約50%溶解)，支持TT30是細(xì)胞靶向的觀點(diǎn)。利用抗fH mAb通過流式細(xì)胞術(shù)，TT30的靶向的fH補(bǔ)充被PNHRBC表面上顯示結(jié)合的TT30所證實(shí)。因此，TT30阻止溶血，代表艾庫(kù)珠單抗治療的PNH患者中IVH以及C3frag積累發(fā)生時(shí)EVH觀察到的溶血。已將TT30的有效性直接與該模型中艾庫(kù)珠單抗的有效性進(jìn)行了比較(Risitanoet al. ,Biologies:Targets & Therapy, 2:205-22 (2008), Risitano et al. , Blood,113:4094-100(2009)) o PNH RBCs從5個(gè)PNH患者(2個(gè)未治療，3個(gè)用艾庫(kù)珠單抗治療)獲得；血清從相同的患者和從ABO匹配的健康對(duì)象獲得。艾庫(kù)珠單抗輸注之后，在估計(jì)的"200 μ g/mL峰濃度立即收集用艾庫(kù)珠單抗治療的PNH患者的血清。將TT30加入到血清中至終濃度范圍從0. 195至195μ g/mL(0. 003至3μΜ)。將PNH RBCs在血清中與或不與艾庫(kù)珠單抗或ΤΤ30溫育，并在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)。I小時(shí)之后，直到 70%的PNH RBCs被ABO匹配的血清溶解。艾庫(kù)珠單抗顯著地減少溶血(在I小時(shí)時(shí)至只有 25%)，但不能提供完全的保護(hù)，并與遞增的C3frag+PNH RBCs積累相關(guān)(圖31)。在PNH患者中，推薦的將保持的用于阻止溶血的最小血漿艾庫(kù)珠單抗?jié)舛仁?35 μ g/mL (Risitano et al. , Biologies: Targets & Therapy, 2:205-22 (2008))。因此，該體外溶血試驗(yàn)可能過高評(píng)價(jià)在PNH中阻止溶血的有效濃度。TT30以濃度依賴的方式阻止PNH RBCs溶血。在65 μ g/mL達(dá)到溶血的完全Γ 00%)抑制。在195 μ g/mL,TT30在24小時(shí)里完全阻止C3片段積累和溶血(圖31)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)在整個(gè)濃度范圍TT30對(duì)PNH RBC存活的作用(圖32)，并計(jì)算ICltl和IC9tl值(表1A)。溫育I小時(shí)之后，抑制CAP介導(dǎo)的PNH RBCs溶血的ICltl和IC9tl值分別為4. 3和87. 9 μ g/mL。表IA體外溶血試驗(yàn)中TT30抑制CAP介導(dǎo)的CD59-PNH RBCs溶血的ICltl和IC9tl值
權(quán)利要求
1.治療具有補(bǔ)體介導(dǎo)的影響血細(xì)胞的溶血疾病的對(duì)象的方法，所述方法包括給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路激活的組合物， 其中所述組合物抑制補(bǔ)體成分C3(C3)的激活和C3的片段引起的紅細(xì)胞的調(diào)理作用。
2.治療對(duì)象中補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血的方法，所述方法包括 給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路激活的組合物， 其中所述組合物維持乳酸脫氫酶和血紅蛋白的正常血清水平。
3.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述組合物選擇性地抑制補(bǔ)體旁路。
4.權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括給予所述對(duì)象末端補(bǔ)體抑制劑。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對(duì)象具有陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)，并且在缺少所述組合物的情況下所述對(duì)象的紅細(xì)胞受C3片段的調(diào)理。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抑制所述補(bǔ)體旁路活性的組合物包括融合蛋白，所述融合蛋白包括 補(bǔ)體受體2(CR2)蛋白或其生物學(xué)活性片段；和 H因子(fH)蛋白或其生物學(xué)活性片段。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述融合蛋白包括融合到fH的前五個(gè)氨基末端SCR結(jié)構(gòu)域的CR2的前四個(gè)氨基末端短共有重復(fù)序列(SCR)結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述個(gè)體先前已用末端補(bǔ)體抑制劑治療。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述個(gè)體對(duì)所述末端補(bǔ)體抑制劑的治療無應(yīng)答、部分應(yīng)答或有進(jìn)展。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述末端補(bǔ)體抑制劑抑制補(bǔ)體蛋白C5 (C5)的切割。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述末端補(bǔ)體抑制劑是人源化抗C5抗體或其抗原結(jié)合片段。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述末端補(bǔ)體抑制劑是艾庫(kù)珠單抗。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對(duì)象具有以下特征中的一個(gè)或多個(gè) i.所述對(duì)象顯示進(jìn)行的或間歇的血管內(nèi)溶血和/或血管外溶血引起的連續(xù)紅細(xì)胞喪失的征兆或癥狀； j.所述對(duì)象具有受C3片段調(diào)理的紅細(xì)胞； k.所述對(duì)象需要定期輸血； I.所述對(duì)象具有低的正常水平血紅蛋白或低于正常水平的血紅蛋白； m.所述對(duì)象具有低的正常水平血小板或低于正常水平的血小板； η.所述對(duì)象具有高的正常網(wǎng)狀細(xì)胞或高于正常的網(wǎng)狀細(xì)胞； ο.所述對(duì)象具有高的正常膽紅素或高于正常的膽紅素；或 P.所述對(duì)象具有鐵超負(fù)荷或面臨鐵超負(fù)荷的危險(xiǎn)。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述對(duì)象需要定期輸血。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述對(duì)象因此被給予獨(dú)立的輸血。
16.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述對(duì)象具有低于正常水平的血紅蛋白。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物增加所述對(duì)象中紅細(xì)胞的存活。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病是鐮狀細(xì)胞貧血。
全文摘要
治療具有補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血疾病，如陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)和其它溶血性貧血的對(duì)象的方法，該方法包括給予有效量的抑制補(bǔ)體旁路活性的組合物。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102958535SQ201080060629
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者V·M·郝勒斯, A·M·里西塔諾 申請(qǐng)人:亞力史劍橋公司