專利名稱：：肽-補(bǔ)體綴合物的制作方法肽-補(bǔ)體綴合物本發(fā)明報道了抗融合肽與補(bǔ)體因子Clq球形頭衍生多肽的綴合物。
背景技術(shù)：
：HIV病毒對細(xì)胞的感染受到這樣過程的影響，其中待被感染細(xì)胞的膜與病毒的膜融合。提出了用于該過程的一般圖解病毒包膜糖蛋白復(fù)合體(gpl20/gp41)與位于待被感染細(xì)胞的膜上的細(xì)胞表面受體相互作用。gpl20結(jié)合例如CD4受體與共受體如CCR-5或CXCR-4組合引起gpl20/gp41復(fù)合體構(gòu)象的改變。該構(gòu)象改變的結(jié)果是gp41蛋白能夠插入靶細(xì)胞的膜中。該插入是膜融合過程的開始。已知因天然存在的多態(tài)性，gp41蛋白的氨基酸序列在不同的HIV毒林中不同。但是可以精確地識別相同的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)融合信號、兩個七殘基重復(fù)結(jié)構(gòu)域(HR1，HR2)和跨膜結(jié)構(gòu)域(以N末端到C末端的方向)。據(jù)提示，融合(或融合的)結(jié)構(gòu)域參與插入細(xì)胞膜及細(xì)胞膜解體。HR區(qū)由多段組成，每一段包含7個氨基酸("七殘基")(參閱例如Shu，W.，等，Biochemistry38(1999)5378-5385)。除七殘基外，還存在一個或更多個亮氨酸拉鏈樣基序。該組成解釋了gp41蛋白巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的形成，也正好解釋了來自這些結(jié)構(gòu)域的肽的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)形成。巻曲螺旋一般而言是由兩個或更多個相互作用的螺旋組成的寡聚體。具有從gp41的HR1或HR2結(jié)構(gòu)域推導(dǎo)的氨基酸序列的肽是HIV進(jìn)入細(xì)胞有效的體外及體內(nèi)抑制劑(例如，肽參閱例如US5，464，933、US5,656,480、US6,258,782、US6,348,568或US6，656，卯6)。例如，T20(也稱為DP178，F(xiàn)uzeon⑧，HR2肽)和T651(US6,479,055)是HIV感染的非常有效的抑制劑。已經(jīng)嘗試?yán)美绨被崽鎿Q或化學(xué)交來增強(qiáng)HR2衍生肽的功效(Sia，S.K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(2002)14664-14669;Otaka，A"等，Angew.Chem.Int.Ed.41(2002)2937-2940)。人的先天免疫包含補(bǔ)體途徑。該途徑通過Cl補(bǔ)體因子的識別亞基Clq結(jié)合免疫靶標(biāo)而被激活。全長Clq分子是異數(shù)分子，其包含六個拷貝的三個單體結(jié)構(gòu)單元(其命名為ClqA、ClqB和ClqC)中的每一個結(jié)構(gòu)單元。每一單體單元包含N末端區(qū)(3到9個殘基)、膠原樣結(jié)構(gòu)域(橫跨大約81個殘基)和球形結(jié)構(gòu)域(球形頭部；橫跨大約135個殘基)(Sellar，G.C.，等Biochem.J.274(1991)481-490)。Moir等報道了HIV-1通過補(bǔ)體途徑的激活感染B細(xì)胞(Moir，S.,等，J.Exp.Med.192(2000)637-646)。人補(bǔ)體途徑的激活源自gp41的免疫顯性區(qū)(gpl60的5卯-620位；根據(jù)Ratner,L.，等，Nature313(1985)277-284的編號)與補(bǔ)體因子ciq的結(jié)合(Ebenbichler,C.F.，J.Exp.Med.174(1991)1417-1424)。Thielens等報道了人Cl的Clq亞成分與HIV-1的跨膜包膜糖蛋白gp41在gpl60的590-613位氨基酸區(qū)內(nèi)相互作用。該相互作用可,皮包含gpl60笫601-613位氨基酸的肽(具有連接Cys605和Cys611的二硫鍵)抑制(Thielens,N.M.，等，J.Immunol.151(1993)6583-6592)。發(fā)明簡述本發(fā)明包含多肽綴合物，所迷多肽綴合物包含選自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的第一多肽和選自抗融合肽的第二多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明的綴合物以選自以下順序的順序包含第一和第二多肽N末端-第一多肽-第二多肽-C末端，N末端-笫二多肽-第一多肽-C末端。在另一實施方案中，本發(fā)明的綴合物包含第一和第二多肽之間的接頭多肽。本發(fā)明還報道了多肽綴合物，其包含a)選自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的笫一多肽(1stpp),b)選自抗融合肽的笫二多肽(2ndpp)，c)選自抗原結(jié)合性抗CCR5抗體鏈、抗原結(jié)合性抗CD4抗體鏈、中和抗HIV-1抗體鏈及其片段的任選第三多肽(3rdpp)，d)連接所述第一、第二和/或第三多肽的任選接頭多肽(linkpp)。在該多肽綴合物中，組成多肽從N到C末端具有[lstppla-[linkppm一[2ndppb-[linkppn-[3rdppc一[linkpp]o-[1stppd-[linkppp_2ndppe-[linkppq-[3rdpplf-linkppr-[lstppg的順序，其中a、b、c、d、e、f、g、m、n、o、p、q、r均為整數(shù)0或l，并且a+d+g=l，b+e=l,c+f-0或1，m、n、o、p、q、r彼jt匕《蟲立地是0或1。數(shù)值O表示在相應(yīng)位置上缺少相應(yīng)多肽，數(shù)值l表示在多肽綴合物中相應(yīng)位置上存在相應(yīng)多肽。在一個實施方案中，所述任選的第三多肽選自抗原結(jié)合性抗CCR5抗體鏈及其片段。在另一實施方案中是選自抗原結(jié)合性抗CD4抗體鏈及其片段的所述任選的第三多肽。在另一抗HIV-1實施方案中是選自抗原結(jié)合性抗HIV-1抗體鏈及其片段的所述任選的第三多肽。在一個實施方案中是選自包含SEQIDNO:20到SEQIDNO:48的多肽的所述接頭多肽。在另一實施方案中是選自包含SEQIDNO:08到SEQIDNO:19的抗融合肽的所述第二多肽。本發(fā)明的另一方面是編碼本發(fā)明多肽綴合物的核酸和包含本發(fā)明核酸的真核細(xì)胞。本發(fā)明還包括用于制備本發(fā)明多肽綴合物的方法，其包括以下步驟a)在適合于表達(dá)多肽綴合物的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼本發(fā)明多肽綴合物的核酸，和b)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所述多肽綴合物。本發(fā)明還包含藥物組合物，其含有本發(fā)明的多肽綴合物或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。本發(fā)明還包括的是本發(fā)明多肽綴合物在用于制備治療病毒感染，優(yōu)選HIV感染的藥物中的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明包含多肽綴合物，所迷多肽綴合物包含選自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的第一多肽，和選自抗融合肽的第二多肽。本發(fā)明還包含多肽綴合物，所述多肽綴合物包含選自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的第一多肽(lstpp),選自抗融合肽的第二多肽(2ndpp)，選自包含抗CCR5抗體的抗原結(jié)合片段、抗HIV-l抗體的中和片段和抗CD4抗體的抗原結(jié)合片段的任選第三多肽(3rdpp)和連接所述第一、第二和/或第三多肽的任選接頭多肽(linkpp)，由此在該多肽綴合物中各多肽從N到C末端具有以下順序3GNN(SEQIDNO:24)、LSLSPGK(SEQIDNO:20)、LSPNRGEC(SEQIDNO:21)、LSLSGG(SEQIDNO:45)、LSLSPGG(SEQIDNO:46)、[G3SIS，(SEQID隱47—G3S5GGG，(SEQIDNO:48)。所有的接頭多肽均可由核酸分子編碼并因此可以進(jìn)4亍重組表達(dá)。因為所述接頭多肽本身是肽，所以連接多肽接頭的多肽通過兩個氨基酸之間形成的肽鍵進(jìn)行連接。因而，本發(fā)明的多肽綴合物可通過蛋白質(zhì)的表達(dá)重組產(chǎn)生。在另一實施方案中，本發(fā)明包含多肽綴合物，其中除了第一和第二多肽，還綴合額外的第三多肽。所述第一多肽是人補(bǔ)體因子Clq的A亞基或其片段，如上所述。所述第二多肽是選自抗融合肽的多肽，如上所述。所述第三多肽是抗CCR5抗體或抗CD4抗體或抗HIV-l抗體的抗原結(jié)合片段。如本申請中所用，術(shù)語"抗原結(jié)合"表示結(jié)合其抗原的抗體或其片段。在抗CCR5抗體的情況下，所述結(jié)合針對CCR5受體，在抗CD4抗體的情況下，所述結(jié)合針對CD4受體，在抗HIV-1抗體的情況下，所述結(jié)合針對HIVgp120。以Ko-值給出的結(jié)合親合力為10-5mol/l或更低(例如l(T8mo1/1)的Kn-值，l(T7mo1/1或更低的Ko-值，或10'9mo1/1或更低的Ko-值。用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測定，如表面等離振子共振技術(shù)(BIAcore⑧)來測定結(jié)合親和力。該結(jié)合親和力值不必視為精確值；其僅僅是參考值。其用于確定和/或選擇例如抗CCR5抗體或其片段，所述抗體或其片段對CCR5受體抗原顯示免疫球蛋白典型的特異靶向結(jié)合，并因此具有治療活性。這也同樣應(yīng)用于抗CD4抗體和抗HIV-1抗體。如本申請中所用，術(shù)語"抗CCR5抗體的抗原結(jié)合片段群"表示抗CCR5抗體的任何片段，其已經(jīng)保留抗原結(jié)合能力。此類片段通常包含抗CCR5抗體輕鏈或重鏈可變結(jié)構(gòu)域的至少一部分。該片段可以是例如單條重鏈或輕鏈、Fv-、Fab-和F(ab)2-片段，以及單鏈抗體(scFv)。在表3中列出了通過雜交瘤細(xì)胞系表達(dá)的優(yōu)選抗CCR5抗體，其片段用于本發(fā)明的綴合物中，所述細(xì)胞系已經(jīng)在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)，德國)保藏。表3:表達(dá)抗CCR5抗體的雜交瘤細(xì)胞系。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>優(yōu)選抗HIV-1抗體(其片段用于本發(fā)明的綴合物)是B12和4KG5。優(yōu)選抗CD4抗體描述于US5,871,732，Reimann，K.A,，等，AidsRes.HumanRetrovir.13(1997)933-943和WO91/009966中。在包含第一、第二和第三多肽的多肽綴合物中，六種不同的N末端(N末端表示為NH2)到C末端(C末端表示為COOH)順序是可能的。該順序組包含(1)NH2—第一多肽-第二多肽一第三多肽-COOH,(2)NH2-第一多肽一第三多肽-第二多肽—COOH,(3)NH2—第二多肽-第一多肽一第三多肽—COOH,(4)NH2—第二多肽一第三多肽一第一多肽-COOH，(5)NH2—第三多肽一第一多肽-第二多肽—COOH，(6)NH2—第三多肽一第二多肽一第一多肽—COOH。在每一綴合多肽之間任選地可能包括接頭多肽。在該情況下，包括一個接頭多肽的順序(l)還包含四種不同的順序(1)NH2-第一多肽一第二多肽-第三多肽-COOH，(la)NH2-第一多肽-接頭多肽-第二多肽一第三多肽-COOH,(lb)NH2-第一多肽-第二多肽4頭多肽—第三多肽-COOH,(lc)NH2-第一多肽-接頭多肽-第二多肽-接頭多肽-第三多肽—COOH。因此，在存在所有任選接頭多肽的情況下，24種不同的順序是可能的。本發(fā)明的多肽綴合物包含每一多肽最多一次，除了包含高達(dá)三次的接頭多肽之外。因而，本發(fā)明包含多肽綴合物，其包含a)選自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的笫一多肽(lstpp)，b)選自抗融合肽的第二多肽(2ndpp)，c)選自抗CCR5抗體的抗原結(jié)合片段或抗CD4抗體的抗原結(jié)合片段的任選第三多肽(3rdpp),d)連接所述第一、第二和/或第三多肽的任選的接頭多肽(linkpp),由此所述多肽從N到C末端具有以下順序n-3rdpp〗c-[linkpp0-[1stppla-[linkppjp-[2ndppe—[linkppq-[3rdppf—[linkpp]r-[1stPPlg其中a、b、c、d、e、f、g、m、n、o、p、q、r均為整數(shù)0或l，并且a+d+g=l，b+e=l，c+f=0或1，26m、n、o、p、q、r彼此獨立地是O或l,其中O表示在所述綴合物的特定位置上缺少相應(yīng)多肽，1表示在所述綴合物的特定位置上存在相應(yīng)多肽。在優(yōu)選的實施方案中，所述多肽從N到C末端具有順序[3rdppc-[linkpp。-1stppd_[linkppp_[2ndppe-[linkppq-[1stpplg，其中c、d、e、g、o、p、q均為整數(shù)O或l,并且c二ld+g=l,e=l，o、p、q彼此獨立地為O或l，0表示在所述綴合物的相應(yīng)位置上缺少相應(yīng)多肽，1表示在所述綴合物的相應(yīng)位置上存在相應(yīng)多肽。本發(fā)明還包含編碼本發(fā)明多肽綴合物的核酸。本發(fā)明的另一方面是包含編碼本發(fā)明多肽綴合物的核酸的細(xì)胞系。本發(fā)明還包含用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽綴合物的方法，所述方法包括步驟a)在適合于表達(dá)多肽綴合物的條件下培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明多肽綴合物的核酸的宿主細(xì)胞，并b)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所述多肽綴合物。術(shù)語"在適合于表達(dá)多肽綴合物的條件下"表示用于培養(yǎng)表達(dá)異源多肽的細(xì)胞并為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或容易地確定的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員也常在20°C到40°C的溫度下培養(yǎng)細(xì)胞，并培養(yǎng)足夠的時間以允許有效產(chǎn)生多肽綴合物，例如4到28天。在一個實施方案中所述宿主細(xì)胞是哺乳動物本發(fā)明還包含藥物組合物，其含有本發(fā)明的多肽綴合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。如此處所用，"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和所有的生理學(xué)上相容的溶劑、M介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收/再吸收延遲劑等。優(yōu)選地，所述載體適合于注射或輸注。藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用于制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉劑。這種介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)上有活性物質(zhì)的用途為本領(lǐng)域所知。除了水，所述載體例如可以是等滲緩沖鹽溶液。不管所選的施用途徑，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法將可以合適的水合形式使用的本發(fā)明化合物，和/或本發(fā)明的藥物組合物配制成藥學(xué)上可接受的劑型。本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以獲得有效達(dá)到對特定患者、組合物和施用方式的想要治療反應(yīng)而對患者沒有毒性的活性成分的量。所選劑量水平將取決于多種藥物代謝動力學(xué)因素，其包括本發(fā)明所用的特定組合物的活性、施用途徑、施用時間、所用特定化合物的排泄速率、與所用特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料、年齡、性別、體重、狀況、一般健康和被治療患者的先前醫(yī)療史和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所熟知的其它因素。本發(fā)明還包含本發(fā)明多肽綴合物用于制備治療病毒感染的藥物的用途。優(yōu)選地，所述病毒感染是HIV感染。本發(fā)明還包含本發(fā)明多肽綴合物用于治療需要抗病毒治療的患者的用途。本發(fā)明還包含本發(fā)明綴合物用于治療患有免疫缺陷綜合征如AIDS的患者的用途。提供以下實施例、序列表和圖來幫助理解本發(fā)明，其真正范圍在所附權(quán)利要求中得以闡明。應(yīng)理解可在所述方法中進(jìn)行修改而不背離本發(fā)明的精神。附圖簡述圖1pQE80—ClqA的注釋質(zhì)粒圖。圖2pQE80—Rob1(融合蛋白T1357-ClqA)的注釋質(zhì)粒圖。圖3pQE80—Rob2(融合蛋白ClqA-T1357)的注釋質(zhì)粒圖。圖4純化蛋白質(zhì)的16%TricineSDS-PAGEal)未還原的，a2)還原的28II，泳道3洗滌RobI，泳道4洗滌RobII，泳道5BiomassRobI，泳道6BiomassRobII);b)泳道7、8和9還原的IB-制劑ClqA，泳道10和12還原的BiomassClqA，泳道13、14和15未還原的IB-制劑ClqA)。圖5包含gp41氨基酸593-621位的肽的Western印跡。圖6融合抑制測定中ROBII和T-1249的活性分析。實施例1材料與方法在Kabat，E.A.，等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991)中給出了關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈核苷酸序列的一般信息?？贵w鏈的氨基酸根據(jù)EU編號進(jìn)行編號(Edelman，G.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85;Kabat，E.A.，等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD,(1991))。重組DNA技術(shù)如在Sambrook，J.等,Molecularcloning:Alaboratorymanual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中描述，使用標(biāo)準(zhǔn)方法操作DNA。根據(jù)制造商的說明書使用分子生物學(xué)試劑?；蚝铣赏ㄟ^化學(xué)合成從寡核苷酸制備想要的基因片段。通過包括PCR擴(kuò)增在內(nèi)的寡核苷酸退火和連接來裝配100-600bp長的基因片段(其側(cè)翼是單個限制性內(nèi)切酶切割位點)并隨后經(jīng)EcoRI/Hindlll限制酶位點將其克隆至pQE80L載體(Qiagen，Hilden，德國)。通過DNA測序證實亞克隆基因片段的DNA序列。蛋白質(zhì)測定通過測定在280nm處的光密度(OD)并使用根據(jù)M酸序列計算的摩爾消光系數(shù)來測定綴合物的蛋白質(zhì)濃度。實施例2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建基于T5RNA聚合酶的細(xì)菌pQE80表達(dá)載體購自Qiagen(Hilden，德國)。EcoRI和HindIII限制性位點用于插入編碼ClqA(SEQIDNO:6)的核斷列以生成表達(dá)質(zhì)粒pQE80_ClqA(注釋質(zhì)粒圖鐠見圖1)。EcoRI和HindIII限制性位點用于插入編碼在N末端至C末端方向包含抗融合肽T-1357和ClqA(SEQIDNO:49、50)的綴合物的序列以生成表達(dá)質(zhì)粒pQE80—Rob1(注釋質(zhì)粒圖語見圖2)。EcoRI和HindIII限制性位點用于插入編碼在N末端至C末端方向包含ClqA和T-1357(SEQIDNO:51)的綴合物的序列以生成表達(dá)質(zhì)粒pQE8(^Rob2(注釋質(zhì)粒圖鐠見圖3)。實施例3多肽綴合物的產(chǎn)生和純化用實施例2中獲得的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。通過氨節(jié)青霉素抗性選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。接種OD為0.1OD/mL的起始培養(yǎng)物。培養(yǎng)物在37。C下添加有0.5pg/ml氨千青霉素的SB培養(yǎng)基(32g蛋白胨、20g酵母提取物、5gNaCl和5mL1MNaOH加1L水)中生長。OD600nm高于0.8-1.0后完成培養(yǎng)。將培養(yǎng)液離心并在含有12.11g/1TRIS羥基曱基氨基甲烷(TRIS)、1mMMgS04、用25%(w/v)HC1調(diào)整pH值至7.0的緩沖液中用高壓破碎沉淀物中的細(xì)胞。每100mg生物量使用500ml緩沖液。細(xì)胞破碎后離心懸浮液。用含200ml/130%(Wv)Brij、1.5MNaCl和60mMEDTA,pH值調(diào)整為7.0的溶液洗滌沉淀物。在第二次離心步驟之后，用100mMTRIS、20mMEDTA、pH6.5洗滌IB。經(jīng)過最后的離心步驟后，將IB離心并儲存于-20。C。用SDS-PAGE確認(rèn)樣品的同質(zhì)性。無需額外30的純化步驟。室溫下通過在pH值為11.5-12.0的30mMKOH中攪拌30分鐘來溶解IB。當(dāng)樣品完全溶解后，通過在50mMpH值為8.5的硼酸鹽緩沖液中對溶解物脈沖進(jìn)行復(fù)性，至最大濃度為0.3mg/ml。實施例4使用SDS-PAGE的表達(dá)分析根據(jù)Schagger，H.，和vonJagow，G.，AnalBiochem.166(1997)368-379通過十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)處理復(fù)性的綴合物。SDS-PAGELDS樣品緩沖液，四倍濃縮液(4x):4g甘油、0.682gTRIS-Base、0.666gTRIS鹽酸鹽、0.8gLDS(十二烷基石充酸鋰)、0.006gEDTA(乙二胺四乙酸)、按質(zhì)量(w/w)計0.75ml的1%ServaBlueG250水溶液、按質(zhì)量(w/w)計0.75ml的1%酚紅溶液，加水至總體積為10ml。將復(fù)性的多肽綴合物離心以去除殘渣。澄清上清液的等分試樣與1/4體積(v/v)的4xLDS樣品緩沖液和1/10體積(v/v)的0.5M1，4-二硫蘇糖醇(DTT)混合。隨后樣品在70。C溫育10分鐘并通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)。根據(jù)制造商說明書使用NuPAGEPre-Cast凝膠系統(tǒng)(Invitrogen)。具體而言，使用10%NuPAGENovexBis畫TRISPre-Cast凝膠(pH6.4)和NuPAGEMOPS電泳緩沖液。實施例5表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建基于T5RNA聚合酶的細(xì)菌pQE80表達(dá)栽體購自Qiagen(Hilden，德國)。EcoRI和HindIII限制性位點用于插入編碼抗CCR5抗體輕鏈ClqA-T-1249綴合物的核酸序列以生成表達(dá)質(zhì)粒pQE80—Rob3。實施例6細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗描述了用于評估1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中和作用的基于細(xì)胞系的測定。該測定基于CEM.NKR細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)染來表達(dá)HIV-1共同受體CCR5以補(bǔ)充CD4和CXCR4共同受體的內(nèi)源表達(dá)。獲得的CEM.NKR-CCR5細(xì)胞有效地復(fù)制了R5和X4表型的原代HIV-1分離林。在使用來自HIV-1感染個體的血清或特異性抗HIV-1單克隆抗體的中和測定中，CEM.NKR-CCR5細(xì)胞與含有促分裂原激活的外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的比較表明HIV-1中和作用的靈敏性在兩種細(xì)胞類型中是相似的。第1天，將表達(dá)gpl60的HeLa細(xì)胞(2x104細(xì)胞/50jd/孔)接種到白色96孔微量滴定板上補(bǔ)充10%FCS和2jig/ml多西環(huán)素的DMEM培養(yǎng)基中。第2天，在透明96孔微量滴定板中每孔加入100nl上清液樣品或抗體對照。隨后加入100pl含8xl04CEM-NKr-Luc懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基并在37。C溫育30分鐘。將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基從96孔板中吸出，加入200jil抗體/CEM-NKr-Luc混合物中的100pl并在37。C溫育過夜。第3天，按100jul/孔加入Bright-Glo荄光素酶測定底物(1，4-二硫蘇糖醇和連二亞硫酸鈉；PromegaCorp.，美國)并且在室溫最少溫育15分鐘后測定發(fā)光。材料在含營養(yǎng)物和10%FCS以及400照/mlG418和200照/ml潮霉素B的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)HeLa-R5-16細(xì)胞(在多西環(huán)素誘導(dǎo)下表達(dá)HIVgpl60的細(xì)胞系)。CEM.NKR國CCR5畫Luc(目錄號5198，從NIHAIDSResearch&ReferenceReagentProgramMcKessonBioServicesCorporationGermantown，MD20874，美國可獲得的T細(xì)胞系)。細(xì)月包類型轉(zhuǎn)染(電穿孔)CEM.NKR-CCR5(Cat.#4376)以在HIV-2LTR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下表達(dá)熒光素酶基因并且在含10。/。胎牛血清、4mM谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素(100U/mL青霉素、100pg/mL鏈霉素)和0.8mg/ml遺傳霉素硫酸鹽(G418)的RPMI1640中進(jìn)行繁殖。生長特征圓形淋巴樣細(xì)胞，形態(tài)變化不大。細(xì)胞以單細(xì)胞在懸浮液中生長，其可形成小團(tuán)塊。每周兩次按1:10分傳培養(yǎng)。特殊特征HIV-2LTR轉(zhuǎn)活后表達(dá)熒光素酶活性。適合用原代HIV分離林感染、中和作用和藥物敏感性測定(Spenlehauer，C.，等，Virology280(2001)292-300;Trkola，A.，等，J.Virol.73(1999)8966—8974)。通過NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram,NIAID，NIHfromDrs.JohnMooreandCatherineSpenlehauer獲得細(xì)胞系。Bright-GloTM螢光素酶測定緩沖液(PromegaCorp.USA,PartNoE2264B)、Bright-GIoTM、螢光素酶測定底物(PromegaCorp.USA,partNoEE26B)。實施例7多肽結(jié)合親和力的測定在25。C使用BIAcore3000儀器(Pharmacia,Uppsala,瑞典)通過表面等離振子共振(SPR)測定基于HIV-1gp41蛋白質(zhì)的HR1-HR2相互作用(HR,七殘基重復(fù)1和2區(qū))的多肽的結(jié)合親和力。很好地建立了用于研究分子相互作用的BIAcore⑧體系。其允許連續(xù)實時監(jiān)測配體/分析物結(jié)合并因此測定結(jié)合速率常數(shù)(ka)、解離速率常數(shù)(kj和平衡常數(shù)(KD)。SPR技術(shù)基于測定金包被的生物傳感器芯片表面附近的折射指數(shù)。折射指數(shù)的改變表明由固定化的配體與溶液中注入的分析物間的相互作用引起的表面上質(zhì)量的改變。如果分子結(jié)合表面上固定化的配體，則質(zhì)量增加，在解離的情況下則質(zhì)量減少。結(jié)合測定通過用50mMNaOH中的1MNaCl三次連續(xù)1分鐘注射來預(yù)洗滌SensorChipSA(SA,Streptavidin)。隨后將生物素化的HR1肽Biotin-T-2324(SEQIDNO:52)固定在SA包被的傳感器芯片上。為了避免質(zhì)量轉(zhuǎn)移限制，將溶于HBS-P緩沖液(10mMHEPES、pH7.4、150mMNaCl、0.005%(v/v)SurfactantP20)中的最小可能值(約200RU,ResonanceUnits)的HR1肽裝載到SA芯片上。測定開始之前，笫一次用0.5%(w/v)十二烷基石克酸鈉(SDS)以50pL/分鐘的流速進(jìn)^f亍一分鐘脈沖使芯片再生。待分析的多肽綴合物首先以約1mg/mL的濃度溶解于pH值為9的50mMNaHC03中，并隨后在HPS-P緩沖液中稀釋至25到1.95nM的多個濃度。樣品接觸時間為5分鐘(結(jié)合相)。此后用HBS-P洗滌芯片表面5分鐘(分離相)。在精確的25。C下(標(biāo)準(zhǔn)溫度)進(jìn)行所有相互作用。在測定周期內(nèi)，樣品儲存于12。C。以每秒一個信號的檢測速率檢測信號。將樣品以逐漸增加的濃度，50nL/分鐘的流速注入偶聯(lián)HRl的生物傳感器元件。用0.5%(w/v)SDS溶液以50nL/分鐘的流速將表面再生1分鐘。通過使用BIAevaluation4.1軟件包分析由幾種不同濃度獲得的sensorgram曲線來測定定義為ka/kd的平衡常數(shù)(KD)。通過從HR2-HR1相互作用的值中減去包含HR2的多肽與游離鏈霉抗生素蛋白表面相互作用的反應(yīng)值來校正非特異性結(jié)合。數(shù)據(jù)的擬合按照1:1Langmuir結(jié)合模型。表5:與HR1區(qū)結(jié)合的BIAcore⑧分析樣品名ka[1/mslkdl/slKA[固lKDMlT-12496.4x1058.45xl(T47.56x1081.32x10-9Robl8.8x1044.76xl(T41.85x1085.41x109Rob23.5x1043.11xl(T51.13xlO98.88x1010實施例8Western印跡分析以下樣品(每份15pi=1-5照)在還原條件下轉(zhuǎn)移至10%Bis-TRISNuPAGE陽Gel:泳道1-多個分子量標(biāo)準(zhǔn)泳道2-硼酸鹽緩沖液泳道3-T-1249(約5kDa)泳道4-RobI(26kDa)泳道5-RobII(25kDa)泳道6-ClqA(28kDa)泳道7-空泳道8-奇異標(biāo)記(magicmark)轉(zhuǎn)移緩沖液192mM甘氨酸、25mMTRIS、20%甲醇(v/v)。在SDS-PAGE后根據(jù)Burnette(Burnette，W.N"Anal.Biochem.112(1981)195-203)的"Semidry-Blotting-Method"將分離的綴合物電泳轉(zhuǎn)移(25V、1小時)至PVDF濾膜(孔徑0.45pm、InvitrogenCorp.)。印跡后將膜浸入TBST(1110mMTRIS緩沖液，補(bǔ)充有150mMNaCl、lmlTween20，調(diào)節(jié)pH值為7.5)中的5%的膜封閉劑(AmershamBiosciences)中，在室溫振蕩約30分鐘并隨后在4。C過夜。封閉步驟完成后用TBST將膜洗滌三次。為了檢測，將封閉后的膜與生物素標(biāo)記的肽HIV-gp41P2(593-621)-Bi以及5pg/mlTBST、0.15mMCaCl2和12mMMgCl2振蕩下溫育3小時。顯色步驟結(jié)束后用TBST洗滌膜并與Lumi-LightPLUSWestern-Blotting底物溫育，并隨后顯影(SDS凝膠見圖4且Western印跡見圖5)。權(quán)利要求1.多肽綴合物，其特征在于所述綴合物包含a)選自包含SEQIDNO01的多肽及其片段的第一多肽，b)選自抗融合肽的第二多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求l的綴合物，其特征在于所述第一多肽和所述第二多肽具有選自以下順序的順序N-末端—第一多肽—第二多肽-C-末端，或N-末端—第二多肽—第一多肽-C-末端。3.根據(jù)前述^5L利要求任何一項的綴合物，其特征在于所述綴合物在所述第一多肽和所述笫二多肽之間包含接頭多肽。4.多肽綴合物，其特征在于所述綴合物包含a)選自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的第一多肽(lstpp),b)選自抗融合肽的第二多肽(2ndpp)，c)選自抗CCR5抗體的抗原結(jié)合片段，或抗HIV-1抗體的抗原結(jié)合片段，或抗CD4抗體的抗原結(jié)合片段的任選的第三多肽(3rdpp)，d)連接所述第一、第二和/或第三多肽的任選的接頭多肽(linkpp)，其中所述多肽綴合物的多肽從N到C末端具有順序[1stppa-[linkpp]m-2ndppb-[linkppn-[3rdppjc—[linkpp0-1stppd_[linkppp-[2ndppe-[linkppq-[3rdppf一[linkppr一[1stPPg其中a、b、c、d、e、f、g、m、n、o、p、q、r均為整數(shù)0或l，并且a+d+g=1,b+e=1，c+f-0或1,m、n、o、p、q、r彼此獨立地是O或l,其中O表示在所述綴合物的相應(yīng)位置上缺少相應(yīng)多肽，1表示在所述綴合物的相應(yīng)位置上存在相應(yīng)多肽。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的綴合物，其特征在于所述接頭多肽選自包含SEQIDNO:20到SEQIDNO:48的多肽。6.根據(jù)前迷權(quán)利要求任何一項的綴合物，其特征在于所述第二多肽選自包含SEQIDNO:08到SEQIDNO:19的抗融合肽。7.用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1或4的多肽綴合物的方法，其特征在于所述方法包才舌a)在適合表達(dá)所述多肽綴合物的條件下培養(yǎng)包含編碼權(quán)利要求1或4的多肽綴合物的核酸的宿主細(xì)胞，并b)從所述細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所述多肽綴合物。8.藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1到6中任何一項的多肽綴合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。9.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任何一項的多肽綴合物用于制備治療病毒感染的藥物的用途。10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其特征在于所述病毒感染是HIV感染。11.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任何一項的多肽綴合物用于治療需要抗病毒治療的患者的用途。全文摘要本發(fā)明報道了多肽綴合物，其中所述多肽綴合物包含選自包含SEQIDNO01的多肽及其片段的第一多肽和選自抗融合肽的第二多肽。文檔編號C07K14/16GK101616929SQ200880005253公開日2009年12月30日申請日期2008年3月11日優(yōu)先權(quán)日2007年3月13日發(fā)明者H·迪費爾,I·萊恩,R·施穆克,R·法爾肯施泰因,W·蒂舍爾申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司