專利名稱：一種采用靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及采用靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明專利為中國專利申請(qǐng)03142114.8《濁點(diǎn)系統(tǒng)在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用》的發(fā)展。
在中國專利申請(qǐng)03142114.8中，本發(fā)明人公開了一種濁點(diǎn)系統(tǒng)在生物轉(zhuǎn)化中的新應(yīng)用，即采用一種或一種以上非離子表面活性劑形成濁點(diǎn)低于微生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)溫度的水溶液系統(tǒng)即濁點(diǎn)系統(tǒng)，作為微生物轉(zhuǎn)化的介質(zhì)。該系統(tǒng)特別適用于疏水性化合物的微生物轉(zhuǎn)化，能解除底、產(chǎn)物抑制，排除產(chǎn)物降解。該濁點(diǎn)系統(tǒng)形成了油包水和水包油的微觀乳濁液，表面活性劑液滴具有增溶能力，充當(dāng)著底物的儲(chǔ)藏庫和產(chǎn)物的萃取劑，強(qiáng)化了底物的生物利用度，排除了產(chǎn)物的抑制。連續(xù)的表面活性劑中存在水泡，相當(dāng)于一個(gè)微反應(yīng)器，能使微生物免受表面活性劑的毒害作用，從而提高了生物相容性。
但在這種濁點(diǎn)系統(tǒng)的生物轉(zhuǎn)化方法中，使用的微生物均為生長細(xì)胞，存在著整個(gè)轉(zhuǎn)化過程需在無菌狀態(tài)下進(jìn)行，且微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程受底物、產(chǎn)物的濃度影響較大(這在本發(fā)明人另一篇中國專利申請(qǐng)03142115.6中有詳細(xì)的描述)；產(chǎn)物分離純化過程難度較大，以及轉(zhuǎn)化過程的優(yōu)化不能獨(dú)立進(jìn)行等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種采用靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法，使?jié)狳c(diǎn)系統(tǒng)條件下的生物轉(zhuǎn)化更為簡(jiǎn)便。
本發(fā)明采用靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法是采用一種或一種以上非離子表面活性劑溶液在低于微生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)溫度下形成濁點(diǎn)系統(tǒng)，作為靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的介質(zhì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明所述的非離子表面活性劑選自聚氧乙烯醇類、聚氧乙烯醚類或辛基酚聚氧乙烯類表面活性劑。
其中所述的聚氧乙烯醇類包括Brij30，Brij35，Brij56或C12E7；聚氧乙烯醚類包括Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Span20、Span40、Span60或Span80；辛基酚聚氧乙烯類包括Triton X-100或Triton X-114。
其中所述的靜息細(xì)胞為將在生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)至一定時(shí)間后的微生物細(xì)胞，用適當(dāng)方法收集并用緩沖液進(jìn)行洗滌，去除了營養(yǎng)成分的微生物細(xì)胞，然后用于濁點(diǎn)系統(tǒng)中。
在本發(fā)明靜息細(xì)胞培養(yǎng)基中也可加入以非離子表面活性劑溶解的誘導(dǎo)物，以誘導(dǎo)產(chǎn)生生物轉(zhuǎn)化所需的酶。該誘導(dǎo)物一般為轉(zhuǎn)化底物，濃度為0.1～2.0％(w/v)之間。
本發(fā)明靜息細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟包括(除非特別指明，本發(fā)明所述的濃度均指w/v)(1)將斜面接種物接種在含有碳源為甘油或葡萄糖，濃度為0.5～2.0％；氮源為0.5g酵母浸出膏或蛋白胨等，濃度為0.5～2.0％；無機(jī)鹽為K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、Na2HPO4和KH2PO4等，濃度為0.05～0.5％組成的生長培養(yǎng)基中；在25～35℃下培養(yǎng)2～9天；或在上述培養(yǎng)基中加入0.1～2.0％的轉(zhuǎn)化底物，以及0.1-2.0％的非離子表面活性劑，在生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～9天；(2)微生物細(xì)胞經(jīng)離心收集，用磷酸緩沖液(100ml溶液中含0.45g Na2HPO4，0.34g KH2PO4)洗滌3次以去除轉(zhuǎn)化液中的營養(yǎng)成分，在-20℃的冰箱中保藏備用。
以上述方法獲得的靜息細(xì)胞即可用于濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明采用的靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化特別適用于1.疏水性化合物的微生物轉(zhuǎn)化；2.對(duì)微生物生長具有底物和產(chǎn)物抑制作用的微生物轉(zhuǎn)化；3.產(chǎn)物易被微生物降解的微生物轉(zhuǎn)化；4.可使用微生物細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)的生物轉(zhuǎn)化；本發(fā)明方法特別適用于膽固醇邊鏈的切除、甾體化合物轉(zhuǎn)化、有機(jī)污染沉淀物的降解等。
利用靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化除了保持濁點(diǎn)系統(tǒng)所具有的優(yōu)點(diǎn)外，還體現(xiàn)在1.可以人為地控制和調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞的濃度，實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞濃度下的生物轉(zhuǎn)化即在生長細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)的細(xì)胞濃度由于受到生長抑制不能達(dá)到高濃度轉(zhuǎn)化，而利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化由于細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)化前培養(yǎng)收集，因此，在轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的細(xì)胞濃度可以人為地控制和調(diào)節(jié)；從而在工業(yè)規(guī)模可以達(dá)到在較小的轉(zhuǎn)化體積下，獲得較高的轉(zhuǎn)化能力，以能夠大大地節(jié)約能源和其他生產(chǎn)成本。
2.微生物細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)化是獨(dú)立的過程，細(xì)胞生長和生物轉(zhuǎn)化的過程可獨(dú)立優(yōu)化即在細(xì)胞培養(yǎng)過程中進(jìn)行細(xì)胞活性和細(xì)胞生長條件的優(yōu)化，以得到大量的轉(zhuǎn)化活力高的微生物細(xì)胞，來制備用于生物轉(zhuǎn)化的靜息細(xì)胞；而一旦靜息細(xì)胞收集制備后，就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，如底物加入量和加入方式、細(xì)胞加入量和加入方式，以及轉(zhuǎn)化周期和循環(huán)轉(zhuǎn)化批次等，而無需考慮細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式等，達(dá)到最佳的生物轉(zhuǎn)化效果。
3.由于微生物細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)化是獨(dú)立的過程，因此，在生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的靜息細(xì)胞已經(jīng)合成好了用于轉(zhuǎn)化的酶，所以，底物和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長的抑制可以有效地被排除。
4.可使整個(gè)轉(zhuǎn)化過程在非無菌狀態(tài)下進(jìn)行，使操作簡(jiǎn)化，成本降低。
5.能夠比較簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)循環(huán)轉(zhuǎn)化，大大提高轉(zhuǎn)化效率，因?yàn)榻?jīng)過一次培養(yǎng)的微生物細(xì)胞可以作為生物催化劑反復(fù)使用；另外，整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)無需其他復(fù)雜的配套系統(tǒng)，即在常規(guī)的操作條件下就能夠?qū)崿F(xiàn)。
6.產(chǎn)物的分離純化，以及底物和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中表面活性劑的回收套用工藝可以簡(jiǎn)化，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)化系統(tǒng)中所用的靜息細(xì)胞不像生長細(xì)胞那樣，伴隨大量的發(fā)酵培養(yǎng)基成分，以及在細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的大量其他代謝產(chǎn)物，從而有效地提高了下游處理的效率，降低了制備成本。
本發(fā)明以膽固醇的靜息細(xì)胞邊鏈切除為模型，進(jìn)一步說明靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法。
膽固醇經(jīng)靜息細(xì)胞邊鏈切除生成甾體藥物的重要中間體ADD是生物轉(zhuǎn)化疏水性化合物的典型例子。首先，膽固醇是典型的疏水性化合物，其在水中的溶解度常在1μM以下，而一般的甾體在0.01～0.1mM之間。其次，這一轉(zhuǎn)化的底物和產(chǎn)物對(duì)微生物都有毒害作用，這種毒害作用可能是對(duì)微生物生長必需的某種酶合成的阻遏作用，也可能是對(duì)已經(jīng)合成的酶的抑制作用。利用靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行疏水性化合物的生物轉(zhuǎn)化，可以較好地解決這些問題，而使轉(zhuǎn)化效率得到較好的提高。下面通過具體的實(shí)驗(yàn)過程對(duì)本發(fā)明以膽固醇為原料生產(chǎn)ADD和4AD的方法作進(jìn)一步的描述。
1.微生物培養(yǎng)微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能實(shí)現(xiàn)膽固醇的邊鏈切除，生成產(chǎn)物ADD和4-AD，其比例大概為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏，1.2g瓊脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O或1.0g酵母浸出膏，1.5g瓊脂粉，1.0g葡萄糖，1.0g蛋白胨。
種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34g KH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g膽固醇，0.2g Triton X-100。
生長培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4，0.45gNa2HPO40.34gKH2PO4，0.2gMgSO4·7H2O，0.5g膽固醇，2.0g非離子表面活性劑。
2.分析方法取1ml樣品用4ml甲醇浸泡2hr。離心后取0.8ml上清進(jìn)行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶水(4∶1)，流速為0.7ml/min，檢測(cè)波長為254nm。ADD和AD的停留時(shí)間分別為4.8，6.2min。
3.細(xì)胞收獲和靜息細(xì)胞的制備將在生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)一定時(shí)間后的微生物細(xì)胞經(jīng)離心后收集。用磷酸緩沖液(100ml溶液中含0.45g Na2HPO4，0.34g KH2PO4)洗滌3次以去除轉(zhuǎn)化液中的營養(yǎng)成分，作為靜息細(xì)胞保藏在-20℃的冰箱中備用。
4.靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求收集靜息細(xì)胞菌體，每克菌體根據(jù)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定約含3×1013個(gè)細(xì)胞。每100ml磷酸緩沖液中，可以加入1～15克的靜息細(xì)胞菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
5.底物和表面活性劑在100ml磷酸緩沖液中，可以加入0.5～5.0克的膽固醇底物，以及可以加入4～12克左右的表面活性劑，表面活性劑為Triton X-100Triton X-114＝1∶1。
6.生物轉(zhuǎn)化條件生物轉(zhuǎn)化溫度為25～35℃；生物轉(zhuǎn)化時(shí)間為1～9天；搖床轉(zhuǎn)速為200～300rpm。
5.結(jié)果與討論采用生長細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化法進(jìn)行甾醇邊鏈切除生產(chǎn)ADD和4-AD的報(bào)道很多，本發(fā)明人在中國專利申請(qǐng)03142114.8中描述了利用生長細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中生物轉(zhuǎn)化ADD和4-AD。本發(fā)明將描述利用靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)ADD和4-AD。靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的前提條件是生物轉(zhuǎn)化和微生物生長過程具有獨(dú)立性，可以在高細(xì)胞濃度的條件下和在非無菌的條件下實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化。為了考察這些因素，進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)。
1)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)和細(xì)胞生長的獨(dú)立性，以及非無菌操作的可能性微生物生長和生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的獨(dú)立性是決定能否采用靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素?？紤]到微生物生長完全可能引起生物轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)物的積累，為了排除生物轉(zhuǎn)化過程中微生物的生長，靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化在磷酸緩沖液系統(tǒng)中進(jìn)行。圖1所示為不同條件下靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果。在這一細(xì)胞濃度下，ADD的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化時(shí)間成正比例間接地表明了細(xì)胞不生長，即生物轉(zhuǎn)化和細(xì)胞生長的獨(dú)立性。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該系統(tǒng)可以在非無菌條件下操作。
2)不同生長周期的細(xì)胞在靜息細(xì)胞濁點(diǎn)系統(tǒng)中生物轉(zhuǎn)化ADD的影響收集不同生長周期的50ml微生物細(xì)胞，按靜息細(xì)胞濁點(diǎn)系統(tǒng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化ADD，其結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明收集培養(yǎng)至第7天的生長細(xì)胞制備成靜息細(xì)胞，并在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化比較合適。這可能是，細(xì)胞生長周期中不同時(shí)期其有關(guān)酶的催化活性不同，一方面，可能是由于微生物的生長，使酶量增加；另一方面，可能是由于酶的比活力隨細(xì)胞的生長周期發(fā)生變化。一般地，酶活性是酶的表達(dá)和降解、抑制或阻遏與激活消長的結(jié)果。希望得到的酶可能只在某一特定的時(shí)間，如對(duì)數(shù)生長的后期、停滯期等最為有效。
3)細(xì)胞生長條件的選擇靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)之一是細(xì)胞生長和生物轉(zhuǎn)化的條件可獨(dú)立優(yōu)化。在確定了最佳細(xì)胞收集時(shí)間為對(duì)數(shù)生長的后期的基礎(chǔ)上，分別用斜面培養(yǎng)基(去掉瓊脂粉)、種子培養(yǎng)基、生長培養(yǎng)基在搖瓶裝量為50/500ml的條件下分別培養(yǎng)細(xì)胞3、5、7天后收集細(xì)胞。在表面活性劑濃度為4g/100ml，底物濃度為3g/100ml，搖瓶裝量為20/250ml的條件下靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)1天。結(jié)果如表1所示。雖然斜面培養(yǎng)基的細(xì)胞量大，但比酶活不高，微生物生長過程中生成生物轉(zhuǎn)化所需的酶系可能需要底物誘導(dǎo)。以總酶活為標(biāo)準(zhǔn)選擇轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基作為細(xì)胞生長和收集的培養(yǎng)基。
表1培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基 細(xì)胞量(g) ADD濃度(mg/L)
斜面培養(yǎng)基 1.5110種子培養(yǎng)基 0.550轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基 0.73104)溫度對(duì)細(xì)胞活性的影響溫度對(duì)酶活性的影響常常比較顯著。細(xì)胞濃度為1.4g細(xì)胞泥/100ml，不同溫度下靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的結(jié)果如圖3所示。在實(shí)驗(yàn)的溫度范圍內(nèi)，雖然溫度升高，酶催化活性有一定的提高，但溫度對(duì)酶活的影響并不敏感。
5)濁點(diǎn)系統(tǒng)中表面活性劑濃度對(duì)靜息細(xì)胞降解產(chǎn)物的影響靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中生物轉(zhuǎn)化底物時(shí)同時(shí)伴隨有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物ADD的降解，其降解能力與構(gòu)成濁點(diǎn)系統(tǒng)的表面活性劑濃度有關(guān)。圖4所示為濁點(diǎn)系統(tǒng)中表面活性劑濃度對(duì)靜息細(xì)胞降解產(chǎn)物的影響。這證實(shí)細(xì)胞不但能催化底物的生物轉(zhuǎn)化，而且能催化產(chǎn)物的降解。細(xì)胞的降解能力隨表面活性劑濃度的增加而降低。在CPS萃取轉(zhuǎn)化中，產(chǎn)物原位萃取到凝聚層相，使反應(yīng)相中的產(chǎn)物維持在較低水平而保護(hù)了產(chǎn)物的降解。產(chǎn)物在兩相中的分配由產(chǎn)物濃度和CPS的組成控制。故細(xì)胞的降解能力隨表面活性劑濃度的增加而降低。
6)底物濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響定義細(xì)胞活性為1g靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化底物1天時(shí)產(chǎn)生ADD的量。文獻(xiàn)報(bào)道甾醇的微生物轉(zhuǎn)化在底物濃度高于12mM(約0.5g/100ml)時(shí)存在底物抑制。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖5所示)，即使底物濃度為1g/100ml時(shí)，細(xì)胞活性仍沒受到影響。底物抑制作用的消除可歸因CPS中凝聚層相中表面活性劑的增溶作用。兩相分配系統(tǒng)常用于有毒底物的控制釋放。底物增溶于凝聚層相并和稀相建立動(dòng)態(tài)平衡。微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)發(fā)生在兩相界面或稀相，這樣可保證微生物反應(yīng)所在相的底物濃度維持在一定水平，但低于其抑制濃度。
7)細(xì)胞濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響測(cè)定細(xì)胞濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響是確定生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是傳遞控制還是生物催化反應(yīng)控制的關(guān)鍵。不同細(xì)胞濃度下靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果如圖6所示。盡管文獻(xiàn)報(bào)道這一轉(zhuǎn)化過程是傳遞控制，但在實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞濃度范圍內(nèi)細(xì)胞活性不變，表明轉(zhuǎn)化反應(yīng)是由生物催化反應(yīng)控制。說明CPS提高了底物的生物利用度。
8)靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中的生物轉(zhuǎn)化活性隨轉(zhuǎn)化時(shí)間的變化如圖7所示(數(shù)據(jù)為圖6中5種細(xì)胞濃度的平均值)，細(xì)胞活性隨轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行降低。細(xì)胞活性的降低可能是細(xì)胞失活、產(chǎn)物抑制、降解等引起。由細(xì)胞的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)推測(cè)細(xì)胞失活的可能性不大。盡管文獻(xiàn)報(bào)道ADD抑制微生物呼吸過程，類似于底物在CPS中的增溶而實(shí)現(xiàn)在兩相的不均勻分配，ADD在細(xì)胞反應(yīng)相的濃度高于產(chǎn)物抑制濃度的可能性也不大。微生物進(jìn)一步降解產(chǎn)物能較好地說明細(xì)胞活度降低，隨著轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間的延長，產(chǎn)物濃度增加導(dǎo)致產(chǎn)物降解加劇，細(xì)胞活度降低。活性可能不降低，而是產(chǎn)物濃度增加而導(dǎo)致降解速率的增加。
9)表面活性劑濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響為了進(jìn)一步確證CPS保護(hù)產(chǎn)物的降解，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了表面活性劑濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響，結(jié)果如圖8所示。生物轉(zhuǎn)化過程中ADD的積累是底物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物降解兩個(gè)過程相互消長的結(jié)果。細(xì)胞活性隨表面活性劑濃度的增加而上升和CPS保護(hù)產(chǎn)物降解一致。
10)生物催化劑的循環(huán)利用為了考察靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化時(shí)酶的操作穩(wěn)定性或批式操作間酶的復(fù)活能力，在底物濃度為2.5g/100ml，細(xì)胞濃度為2g/100ml，表面活性劑濃度為8g/100ml，轉(zhuǎn)化時(shí)間為4天的條件下循環(huán)利用細(xì)胞的結(jié)果如圖9所示，雖然由于產(chǎn)物的抑制/降解，批式操作中細(xì)胞的催化活性隨時(shí)間延長而降低，但4次重復(fù)利用細(xì)胞其催化活性基本保持不變。說明在排除產(chǎn)物的抑制/降解的條件下，細(xì)胞作為催化劑在循環(huán)過程中的活力具有穩(wěn)定性。


圖1不同條件下生物轉(zhuǎn)化ADD轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的條件1.4g微生物菌體，6g表面活性劑，每100ml緩沖液含1.5g膽固醇。
圖2不同生長周期的細(xì)胞在靜息細(xì)胞濁點(diǎn)系統(tǒng)中生物轉(zhuǎn)化ADD的結(jié)果轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的條件由50ml微生物培養(yǎng)液收集的靜息細(xì)胞，6g表面活性劑，每100ml緩沖液含1.5g膽固醇。
圖3不同溫度下靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化ADD的結(jié)果轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的條件1.4g微生物菌體，6g表面活性劑，每100ml緩沖液含1.5g膽固醇。
圖4濁點(diǎn)系統(tǒng)中表面活性劑濃度對(duì)靜息細(xì)胞降解產(chǎn)物的影響轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的條件1.4g微生物菌體，每100ml緩沖液含1.5g膽固醇。
圖5底物濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的條件1.4g微生物菌體，6g表面活性劑，每100ml緩沖液含0.1～1.5g膽固醇。
圖6細(xì)胞活性隨細(xì)胞濃度的變化轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的條件每100ml緩沖液中含有4g表面活性劑和1.5g膽固醇。
圖7細(xì)胞活性隨轉(zhuǎn)化時(shí)間的變化轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的條件細(xì)胞濃度為圖6中5種濃度的平均值，每100ml緩沖液中含有4g表面活性劑和1.5g膽固醇。
圖8細(xì)胞活性隨表面活性劑濃度的變化轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的條件每100ml緩沖液中含有4.2g靜息細(xì)胞和1.5g膽固醇。
圖9細(xì)胞的循環(huán)利用轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的條件每100ml緩沖液中含有2g靜息細(xì)胞，2.5g膽固醇和8g表面活性劑；轉(zhuǎn)化時(shí)間為4天。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 靜息細(xì)胞的制備微生物菌種微生物菌種Mycobaterium sp.NRRL B 3683。它能實(shí)現(xiàn)膽固醇的邊鏈切除，生成產(chǎn)物ADD和4-AD，其比例大概為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏，1.2g瓊脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O或1.0g酵母浸出膏，1.5g瓊脂粉，1.0g葡萄糖，1.0g蛋白胨。培養(yǎng)溫度25～35C，培養(yǎng)時(shí)間2～9天。
種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34g KH2PO4，0.05gMgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g膽固醇，0.2g非離子表面活性劑Triton X-100。培養(yǎng)溫度25～35C，培養(yǎng)時(shí)間2～9天。
生長培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34g KH2PO4，0.2g MgSO4.7H2O，0.5g膽固醇，2.0g非離子表面活性劑Triton X-100。培養(yǎng)溫度25～35C，培養(yǎng)時(shí)間2～9天。
細(xì)胞收獲和靜息細(xì)胞的制備將接種在上述培養(yǎng)基上的微生物菌種培養(yǎng)至2～9天后，經(jīng)離心分離加以收集微生物細(xì)胞；然后用磷酸緩沖液(100ml溶液中含0.45gNa2HPO4，0.34gKH2PO4)洗滌3次，以去除粘附在微生物細(xì)胞上的營養(yǎng)成分和其他成分，減少所獲得的靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)的干擾。由此獲得的靜息細(xì)胞保藏在-20C的冰箱中備用。
實(shí)施例2 靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中的生物轉(zhuǎn)化以膽固醇作為底物，濃度為3g/100ml；以表面活性劑Triton X-100和Triton X-114，濃度為4g/100ml(Triton X-100Triton X-114＝1∶1)；取實(shí)施例1方法制得的靜息細(xì)胞細(xì)胞濃度為48g/L條件下轉(zhuǎn)化5天；ADD濃度達(dá)5000mg/L。
實(shí)施例3以膽固醇作為底物，濃度為3g/100ml；以表面活性劑Triton X-100和Triton X-114，濃度為4g/100ml(Triton X-100Triton X-114＝1∶1)；取實(shí)施例1方法制得的靜息細(xì)胞細(xì)胞濃度為225g/L條件下轉(zhuǎn)化1天；ADD濃度達(dá)3800mg/L。
實(shí)施例4以膽固醇作為底物，濃度為2.5g/100ml；以表面活性劑Triton X-100和Triton X-114，濃度為10g/100ml(Triton X-100Triton X-114＝1∶1)；取實(shí)施例1方法制得的靜息細(xì)胞濃度為200g/L條件下轉(zhuǎn)化4～5天；ADD濃度達(dá)12000mg/L。
實(shí)施例5以膽固醇作為底物，濃度為2.5g/100ml；以表面活性劑Triton X-100和Triton X-114，濃度為8g/100ml(Triton X-100Triton X-114＝1∶1)；取實(shí)施例1方法制得的靜息細(xì)胞濃度為200g/L條件下轉(zhuǎn)化時(shí)間4天；循環(huán)利用細(xì)胞4次；ADD濃度分別可以達(dá)到12000、12000、11500和11400mg/L左右。
實(shí)施例6靜息細(xì)胞系統(tǒng)與生長細(xì)胞系統(tǒng)的比較。
以膽固醇作為底物，度為2.5g/100ml；以表面活性劑Triton X-100和Triton X-114，濃度為8g/100ml(Triton X-100Triton X-114＝1∶1)組成生物轉(zhuǎn)化的濁點(diǎn)系統(tǒng)。用生長細(xì)胞轉(zhuǎn)化7天，ADD濃度可以達(dá)到9000mg/L左右，而用取實(shí)施例1方法制得的靜息細(xì)胞濃度為200g/L，轉(zhuǎn)化時(shí)間4天；循環(huán)利用細(xì)胞4次的條件；ADD濃度分別可以達(dá)到12000、12000、11500和11400mg/L左右。由此比較利用靜息細(xì)胞濁點(diǎn)生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)越性。
實(shí)施例7在實(shí)施例1靜息細(xì)胞制備過程中，去除種子培養(yǎng)基和生長培養(yǎng)基中的膽固醇和表面活性劑后，進(jìn)行靜息細(xì)胞的培養(yǎng)和收集。然后同實(shí)施例2的方法進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，ADD濃度達(dá)3500mg/L。
權(quán)利要求
1.一種采用靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法，該方法是采用一種或一種以上非離子表面活性劑溶液在低于微生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)溫度下形成濁點(diǎn)系統(tǒng)，作為生物轉(zhuǎn)化的介質(zhì)，其特征在于其中所用的微生物細(xì)胞為靜息細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的靜息細(xì)胞為將在生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)至一定時(shí)間后的微生物細(xì)胞，用適當(dāng)方法收集并用緩沖液進(jìn)行洗滌，去除了營養(yǎng)成分的微生物細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于其中所述的靜息細(xì)胞生長培養(yǎng)基中加入以非離子表面活性劑溶解的誘導(dǎo)物，該誘導(dǎo)物一般為轉(zhuǎn)化底物，濃度為0.1～2.0％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于其中所述的靜息細(xì)胞的制備包括下列步驟(1)將斜面接種物接種在含有碳源為甘油或葡萄糖，濃度為0.5～2.0％；氮源為0.5g酵母浸出膏或蛋白胨，濃度為0.5～2.0％；無機(jī)鹽為K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、Na2HPO4和KH2PO4，濃度為0.05～0.5％組成的生長培養(yǎng)基中；在25～35℃下培養(yǎng)2～9天；或在上述培養(yǎng)基中加入0.1～2.0％的轉(zhuǎn)化底物，以及0.1-2.0％的非離子表面活性劑，在生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～9天；(2)微生物細(xì)胞經(jīng)離心收集，用磷酸緩沖液洗滌3次以去除轉(zhuǎn)化液中的營養(yǎng)成分，在-20℃的冰箱中保藏備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的非離子表面活性劑選自聚氧乙烯醇類、聚氧乙烯醚類或辛基酚聚氧乙烯類表面活性劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于其中所述的聚氧乙烯醇類包括Brij30，Brij35，Brij56或C12E7；聚氧乙烯醚類包括Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Span20、Span40、Span60或Span80；辛基酚聚氧乙烯類包括Triton X-100或Triton X-114。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法。該方法是采用一種或一種以上非離子表面活性劑溶液在低于微生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)溫度下形成濁點(diǎn)系統(tǒng)，作為靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的介質(zhì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。該方法較原使用生長細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化具有細(xì)胞生長和生物轉(zhuǎn)化過程相互獨(dú)立，可排除底物、產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長的抑制；可在非無菌狀態(tài)下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，使操作簡(jiǎn)單和成本降低；可人為控制細(xì)胞與底物的加量，使能夠達(dá)到最佳的生物轉(zhuǎn)化效果；可有效地實(shí)現(xiàn)循環(huán)生物轉(zhuǎn)化，大大提高轉(zhuǎn)化效率；可有效地提高了下游產(chǎn)物的處理效率，降低制備成本等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P33/00GK1544618SQ20031010896
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者陳代杰, 王志龍, 戈梅, 金一平, 葉偉東 申請(qǐng)人:上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司, 上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)