專利名稱：利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建家蠶病毒快速基因表達(dá)系統(tǒng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)，尤其涉及一種利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建家蠶病毒快速基因表達(dá)系統(tǒng)的方法。
背景技術(shù)：
昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Baculovirus Expression Vector System，簡(jiǎn)稱BEVS)是利用攜帶有外源目的基因的重組昆蟲桿狀病毒作載體在昆蟲體內(nèi)或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)的一個(gè)重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)。由于該系統(tǒng)所需要的周期遠(yuǎn)比動(dòng)物或植物系統(tǒng)短，可以利用昆蟲個(gè)體或其培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模的表達(dá)生產(chǎn)，生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)量高，蛋白翻譯后加工比細(xì)菌、酵母生產(chǎn)系統(tǒng)好，且由于昆蟲桿狀病毒具有限制性的宿主范圍，只對(duì)特定性的昆蟲及其細(xì)胞進(jìn)行感染，對(duì)人畜等脊椎動(dòng)物是非感染性的，因此具有比在哺乳動(dòng)物及其培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)更為安全等優(yōu)點(diǎn)而成為目前最有效的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。目前BEVS主要包括歐美國(guó)家正在廣泛應(yīng)用的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，簡(jiǎn)稱AcNPV)和以中國(guó)、日本為代表的家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，簡(jiǎn)稱BmNPV)表達(dá)系統(tǒng)兩大類。AcNPV表達(dá)系統(tǒng)主要使用昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，而BmNPV表達(dá)系統(tǒng)由于可以利用我國(guó)飼養(yǎng)量最大的經(jīng)濟(jì)昆蟲-家蠶作為表達(dá)載體從而具有成本低、適合產(chǎn)業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，非常具有我國(guó)特色。但目前該領(lǐng)域國(guó)外開發(fā)的相關(guān)基因工程產(chǎn)品〔包括載體質(zhì)粒等〕大都是面向AcNPV表達(dá)系統(tǒng)，雖然BmNPV與AcNPV兩者相似，均具有130Kb大小的環(huán)狀雙鏈DNA基因組，且高度同源(大于90％)，但寄主范圍有各自的專一性，兩者不能交叉感染，因此這些產(chǎn)品不能應(yīng)用于家蠶。
傳統(tǒng)的重組病毒構(gòu)建方法包含兩步首先將所需表達(dá)的基因插入到一個(gè)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中，該質(zhì)粒含有桿狀病毒啟動(dòng)子(通常為多角體啟動(dòng)子)和兩側(cè)部分同源序列。然后將這樣構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與環(huán)狀的野生病毒基因組共轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞。通過基因同源重組(多角體蛋白基因?yàn)椴《緩?fù)制非必需，可由目的基因替換)，通常產(chǎn)生約0.1-1％的含目的基因的重組病毒。隨后采用空斑分析的方法篩選出不含多角體的重組病毒。由于99％以上為野生型的病毒，分離純化重組病毒有較大難度，尤其對(duì)于沒有經(jīng)驗(yàn)的人來(lái)說這樣的篩選非常困難，一定程度上限制了它的應(yīng)用。通過對(duì)病毒基因組的線性化，重組病毒產(chǎn)生的比例可以提高到近30％。使用刪除了多角體下游部分必需基因的病毒基因組，重組病毒產(chǎn)生的比例甚至可提高到80％。但不管那種方法，在共轉(zhuǎn)染后為了除去各種可能的非重組病毒，還必須采用空斑純化的方法來(lái)得到真正的純重組病毒。這樣至少花費(fèi)4-6個(gè)星期甚至更長(zhǎng)。
近年來(lái)，美國(guó)孟山多(MONSANTO)公司成功開發(fā)了一種快速、高效產(chǎn)生重組AcNPV病毒的技術(shù)，利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子作用原理，在大腸桿菌內(nèi)就能完成重組病毒的構(gòu)建，取名為Bac-To-Bac表達(dá)系統(tǒng)，意即從細(xì)菌(bacterium)到桿狀病毒(baculovirus)，改變了傳統(tǒng)重組昆蟲桿狀病毒的構(gòu)建方法。其基本原理為將一個(gè)改造后AcNPV基因組轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，使它象普通質(zhì)粒一樣能在菌內(nèi)復(fù)制(由于太大，只限單拷貝)，將其稱之為桿狀病毒穿梭載體(baculovirusshuttle vector，又稱病毒質(zhì)粒baculovirus plasmid，將首尾合寫而成為Bacmid)，通過位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座作用，在大腸桿菌內(nèi)完成病毒基因組的重組。桿狀病毒穿梭載體Bacmid含有細(xì)菌單拷貝數(shù)mini-F復(fù)制子、卡那霉素抗性選擇標(biāo)記基因及編碼LacZα肽的部分DNA片段。在LacZα基因的N氨基末端插入一小段含有細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn7(mini-attTn7)整合所需的靶位點(diǎn)(attachment site)，但它的插入不影響LacZα基因的表達(dá)閱讀框架。將桿狀病毒穿梭載體Bacmid(136kb)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10β，獲得轉(zhuǎn)化子將其命名為DH10BacTM。因此，Bacmid象一個(gè)大質(zhì)粒一樣，可以在E.Coli中增殖并使細(xì)菌細(xì)胞獲得卡那霉素抗性(kanR)，且與存在于受體菌染色體上的LacZα缺失產(chǎn)生互補(bǔ)，在IPTG誘導(dǎo)和X-gal或Bluo-gal生色底物存在下轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生藍(lán)斑(lac+)。
重組Bacmid通過pFASTBACTM供體質(zhì)粒(donor plasmid)上的mini-Tn7轉(zhuǎn)座子，在另一個(gè)輔助質(zhì)粒(helper plasmid，13.2kb)的功能作用下，將外源目的基因插入到Bacmid中來(lái)完成。helper plasmid表達(dá)轉(zhuǎn)座酶并含有四環(huán)素(tetracycline)抗性基因。pFASTBACTM系列供體質(zhì)粒具有共同的特征每個(gè)質(zhì)粒都含有桿狀病毒啟動(dòng)子(polyhedrin或p10)，在mini-Tn7左右臂間含有一個(gè)完整的表達(dá)cassette，包括慶大霉素抗性基因(Gmr)、桿狀病毒啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)及SV40 ploy(A)。外源基因插入到桿狀病毒啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)，將此重組的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含有helper plasmid和Bacmid的DH10BacTM中，由mini-Tn7轉(zhuǎn)座子將表達(dá)cassette插入到Bacmid的靶位點(diǎn)，從而破壞了LacZα基因的表達(dá)，使得LacZα+變?yōu)長(zhǎng)acZα-。在含有卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素和X-gal的培養(yǎng)板進(jìn)行篩選，重組的Bacmid(即重組病毒基因組)轉(zhuǎn)化體菌落呈現(xiàn)白色，而非重組Bacmid轉(zhuǎn)化菌落依然為藍(lán)色，因此可以根據(jù)菌落的顏色進(jìn)行重組病毒的篩選。通過單菌斑的培養(yǎng)，抽提得到重組Bacmid基因，隨后轉(zhuǎn)染入昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞獲得重組病毒，即可進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)生產(chǎn)。
利用位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座作用將外源基因插入到能在E.Coli增殖的穿梭載體Bacmid，實(shí)現(xiàn)重組病毒的構(gòu)建，此方法的優(yōu)點(diǎn)在于a.由于重組病毒的分離是通過藍(lán)白菌斑篩選，不存在野生型和非重組型病毒污染的問題，因此不需要傳統(tǒng)繁瑣的空斑分析來(lái)純化重組病毒；b.大大地縮短了重組病毒構(gòu)建所需的時(shí)間，可以由原來(lái)的4-6周或更長(zhǎng)減少到僅7-10天。因此，此技術(shù)允許快速、同時(shí)分離多種重組病毒。因此，Bac-To-Bac表達(dá)系統(tǒng)是目前最好的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。
由于家蠶BmNPV和AcNPV高度同源，將含有單拷貝數(shù)F復(fù)制子、插入有細(xì)菌轉(zhuǎn)座子整合靶位點(diǎn)、編碼LacZα肽的部分DNA片段和卡那霉素抗性選擇標(biāo)記基因的基因片段重組入家蠶BmNPV基因組，替換多角體蛋白基因，即能構(gòu)建適用于家蠶的Bac-To-Bac快速表達(dá)系統(tǒng)。
基因工程生物產(chǎn)業(yè)被稱為21世紀(jì)的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)。隨著我國(guó)“WTO”的加入，建立起適合于我國(guó)國(guó)情并具有特色的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)迫在眉捷。我國(guó)具有極為豐富的家蠶資源，家蠶個(gè)體大、極易飼養(yǎng)且便于管理，非常適合利用它作為“生物工廠”進(jìn)行重組蛋白表達(dá)生產(chǎn)，在工程疫苗和藥物生產(chǎn)、蛋白質(zhì)研究、生物殺蟲劑等領(lǐng)域具有很大潛在的應(yīng)用前景。另一方面，進(jìn)入后基因組時(shí)代后，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能分析，需要一個(gè)快速、高通量的表達(dá)系統(tǒng)。開發(fā)適用于家蠶的快速基因表達(dá)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的應(yīng)用性，期望為我國(guó)未來(lái)的基因工程生物產(chǎn)業(yè)提供一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高科技產(chǎn)品，成為促使和推動(dòng)我國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)崛起的一個(gè)重要技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容
家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，簡(jiǎn)稱BmNPV)表達(dá)系統(tǒng)是目前最主要的昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，但目前在重組病毒構(gòu)建過程中采用的傳統(tǒng)的空斑篩選方法具有費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)。本發(fā)明的目的在于提供一種利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建家蠶病毒快速基因表達(dá)系統(tǒng)的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案其步驟如下(1)家蠶野生型BmNPV基因組中多角體啟動(dòng)子左右側(cè)翼各約2kb基因序列的克隆，設(shè)計(jì)的引物為左側(cè)正向引物5-GTTCTTTGCTGTTCACGCCAATTC-3；反向引物5-ACACGAAAAGTACAAACACGATAGC-3；右側(cè)正向引物為5-CAGCTTGCTGATCACGCAATTG-3；反向引物為5-GTTCGATAACTACCGACACGTCGAC-3；左側(cè)2kb基因PCR反應(yīng)的條件為反應(yīng)液含2.0ul的0.1ug的家蠶BmNPV基因組DNA作為模板，4.0ul的2.5mM的dNTP，2.0ul的20pmol的左側(cè)基因正反向引物，1單位的Taq DNA聚合酶，及5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH 8.3 PCR緩沖液，并加入超純水至50ul，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)條件為95℃變性60秒，57℃退火30秒，72℃延伸5分，最后一個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間為10分，右側(cè)2kb基因PCR反應(yīng)的條件與左側(cè)2kb基因PCR反應(yīng)條件相同，但引物采用右側(cè)2kb基因的正反向引物，PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析；(2)含有單拷貝數(shù)F復(fù)制子、插入有細(xì)菌轉(zhuǎn)座子整合靶位點(diǎn)AttTn7、編碼LacZα肽的部分DNA片段和卡那霉素抗性選擇標(biāo)記基因的8.6kb片段的克隆，引物設(shè)計(jì)如下正向引物5-GGAATTCCCCAATCGATGTC-3，含EcoRI位點(diǎn)，反向引物5-TTTCTAGACCACCGCTTACG-3，含XbaI位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的條件為反應(yīng)液含1.0ul的0.1ug的購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司AcNPV Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)病毒穿梭載體Bacmid基因組DNA作為模板，2.0ul的2.5mM的dNTP，各1.0ul的20pmol的正反向引物，0.5單位的Taq DNA聚合酶，及2.5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH 8.3 PCR緩沖液，并加入超純水至25ul，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件為95℃變性50秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分，最后一個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間為10分；(3)將上述獲得的BmNPV基因組中多角體啟動(dòng)子左右側(cè)翼各約2kb片段分別進(jìn)行末端處理加上EcoRI位點(diǎn)和XbaI位點(diǎn)，并對(duì)克隆得到的8.6kb的片段進(jìn)行EcoRI和XbaI消化處理，分別取2.ul并加上連接酶進(jìn)行體外14℃溫度下連接，使之成為一個(gè)大小為12.6kb的線性片段；(4)從AcNPV Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中分離出13.2kb輔助質(zhì)粒helper plasmid，采用常用的DNA分離方法，收集過夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化菌，先后加入0.2N的NaOH-SDS，醋酸鉀KAc和苯酚，最后用異苯醇沉淀DNA，融解于TE緩沖液；(5)將(3)連接得到的線性片段與家蠶130kb BmNPV基因組混合，在離子脂質(zhì)體Lipofectin介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，從感染的細(xì)胞中分離出病毒基因組，即BmNPV和重組的BmNPV基因組的混合物；在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染入BmN單層培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)基不含血清，24小時(shí)后更換含10％胎牛血清的培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集感染細(xì)胞并從中抽提病毒基因組DNA，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DHl0β感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素、X-gal培養(yǎng)基上利用藍(lán)白斑分析法篩選出含病毒穿梭載體的轉(zhuǎn)化子，即藍(lán)斑，并將其命名為家蠶病毒穿梭載體BmBacmid，野生型BmNPV基因組的轉(zhuǎn)化子因不含有卡那霉素抗性基因不能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，最后分離得到藍(lán)斑的家蠶BmBacmid轉(zhuǎn)化子；(6)將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行象普通大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)的方法，制備其感受態(tài)細(xì)胞，并將13.2kb輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入其中，在含有四環(huán)素和卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，獲得同時(shí)含家蠶病毒穿梭載體BmBacmid和輔助質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，將其命名為DH10BmBac，這樣就構(gòu)建完成了適合于家蠶的重組病毒快速基因表達(dá)系統(tǒng)，可以用于重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。
本發(fā)明與背景技術(shù)相比，具有的有益的效果是本發(fā)明較好地解決了在重組家蠶桿狀病毒構(gòu)建過程中傳統(tǒng)的需要利用昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行重組病毒的空斑篩選的過程中費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，大大縮短了重組病毒構(gòu)建所需時(shí)間，加快了基因表達(dá)系統(tǒng)的工作進(jìn)程。在未來(lái)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)利用家蠶作為“生物工廠”表達(dá)生產(chǎn)重組蛋白、基因藥物、工程疫苗及后基因組時(shí)代蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能分析方面，具有推廣的使用價(jià)值。


附圖是本發(fā)明的利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建家蠶病毒快速基因表達(dá)系統(tǒng)的方法流程圖。
具體實(shí)施例方式
1、材料家蠶BmN細(xì)胞和昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞Sf21，AcNPV和BmNPV病毒，Sf21細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100采用GibcoBRL產(chǎn)品，使用前加入體積比為10％的胎牛血清，培養(yǎng)溫度均為27℃。家蠶幼蟲1-3齡人工飼料育，29℃飼養(yǎng)，4-5齡桑葉育，23-25℃飼養(yǎng)?；虿僮魉褂玫母鞣N酶及PCR擴(kuò)增試劑盒，為日本寶酒造公司產(chǎn)品，TA克隆試劑盒、質(zhì)粒pCR2.1及AcNPV Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)中的DH10，Bacmid購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，桿狀病毒基因組DNA抽提采用Stratagene公司的試劑盒進(jìn)行，共轉(zhuǎn)染所使用的Lipofectin試劑為L(zhǎng)IFETECHNOLOGIES公司產(chǎn)品，DNA序列根據(jù)PE Applied Biosystems提供的試劑盒在DNA序列分析儀上測(cè)定。
2、工作流程(1)家蠶野生型BmNPV基因組中多角體啟動(dòng)子左右側(cè)翼各約2kb基因序列的克隆，設(shè)計(jì)的引物為左側(cè)正向引物5-GTTCTTTGCTGTTCACGCCAATTC-3；反向引物5-ACACGAAAAGT ACAAACACGATAGC-3；右側(cè)正向引物為5-CAGCTTGCTGATCACGCAATTG-3；反向引物為5-GTTCGATAACTACCGACACGTCGAC-3；左側(cè)2kb基因PCR反應(yīng)的條件為反應(yīng)液含2.0ul的0.1ug的家蠶BmNPV基因組DNA作為模板，4.0ul的2.5mM的dNTP，2.0ul的20pmol的左側(cè)基因正反向引物，1單位的Taq DNA聚合酶，及5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH8.3PCR緩沖液，并加入超純水至50ul，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)條件為95℃變性60秒，57℃退火30秒，72℃延伸5分，最后一個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間為10分，右側(cè)2kb基因PCR反應(yīng)的條件與左側(cè)2kb基因PCR反應(yīng)條件相同，但引物采用右側(cè)2kb基因的正反向引物，PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析；(2)含有單拷貝數(shù)F復(fù)制子、插入有細(xì)菌轉(zhuǎn)座子整合靶位點(diǎn)AttTn7、編碼LacZα肽的部分DNA片段和卡那霉素抗性選擇標(biāo)記基因的8.6kb片段的克隆，引物設(shè)計(jì)如下正向引物5-GGAATTCCCCAATCGATGTC-3，含EcoRI位點(diǎn)，反向引物5-TTTCTAGACCACCGCTTACG-3，含XbaI位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的條件為反應(yīng)液含1.0ul的0.1ug的購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司AcNPV Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)病毒穿梭載體Bacmid基因組DNA作為模板，2.0ul的2.5mM的dNTP.各1.0ul的20pmol的正反向引物，0.5單位的Taq DNA聚合酶，及2.5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH8.3PCR緩沖液，并加入超純水至25ul，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件為95℃變性50秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分，最后一個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間為10分；(3)將上述獲得的BmNPV基因組中多角體啟動(dòng)子左右側(cè)翼各約2kb片段分別進(jìn)行末端處理加上EcoRI位點(diǎn)和XbaI位點(diǎn)，并對(duì)克隆得到的8.6kb的片段進(jìn)行EcoRI和XbaI消化處理，分別取2.ul并加上連接酶進(jìn)行體外14℃溫度下連接，使之成為一個(gè)大小為12.6kb的線性片段；(4)從AcNPV Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中分離出13.2kb輔助質(zhì)粒helper plasmid，采用常用的DNA分離方法，收集過夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化菌，先后加入0.2N的NaOH-SDS，醋酸鉀KAc和苯酚，最后用異苯醇沉淀DNA，融解于TE緩沖液；(5)將(3)連接得到的線性片段與家蠶130kb BmNPV基因組混合，在離子脂質(zhì)體Lipofectin介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，從感染的細(xì)胞中分離出病毒基因組，即BmNPV和重組的BmNPV基因組的混合物；在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染入BmN單層培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)基不含血清，24小時(shí)后更換含10％胎牛血清的培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集感染細(xì)胞并從中抽提病毒基因組DNA，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10β感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素、X-gal培養(yǎng)基上利用藍(lán)白斑分析法篩選出含病毒穿梭載體的轉(zhuǎn)化子，即藍(lán)斑，并將其命名為家蠶病毒穿梭載體BmBacmid，野生型BmNPV基因組的轉(zhuǎn)化子因不含有卡那霉素抗性基因不能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，最后分離得到藍(lán)斑的家蠶BmBacmid轉(zhuǎn)化子；(6)將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行象普通大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)的方法，制備其感受態(tài)細(xì)胞，并將13.2kb輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入其中，在含有四環(huán)素和卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，獲得同時(shí)含家蠶病毒穿梭載體BmBacmid和輔助質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，將其命名為DH10BmBac，這樣就構(gòu)建完成了適合于家蠶的重組病毒快速基因表達(dá)系統(tǒng)，可以用于重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建家蠶病毒快速基因表達(dá)系統(tǒng)的方法，其特征在于(1)家蠶野生型BmNPV基因組中多角體啟動(dòng)子左右側(cè)翼各約2kb基因序列的克隆，設(shè)計(jì)的引物為左側(cè)正向引物5-GTTCTTTGCTGTTCACGCCAATTC-3；反向引物5-ACACGAAAAGT ACAAACACGATAGC-3；右側(cè)正向引物為5-CAGCTTGCTGATCACGCAATTG-3；反向引物為5-GTTCGATAACTACCGACACGTCGAC-3；左側(cè)2kb基因PCR反應(yīng)的條件為反應(yīng)液含2.0ul的0.1ug的家蠶BmNPV基因組DNA作為模板，4.0ul的2.5mM的dNTP，2.0ul的20pmol的左側(cè)基因正反向引物，1單位的Taq DNA聚合酶，及5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH8.3 PCR緩沖液，并加入超純水至50ul，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)條件為95℃變性60秒，57℃退火30秒，72℃延伸5分，最后一個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間為10分，右側(cè)2kb基因PCR反應(yīng)的條件與左側(cè)2kb基因PCR反應(yīng)條件相同，但引物采用右側(cè)2kb基因的正反向引物，PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析；(2)含有單拷貝數(shù)F復(fù)制子、插入有細(xì)菌轉(zhuǎn)座子整合靶位點(diǎn)AttTn7、編碼LacZα肽的部分DNA片段和卡那霉素抗性選擇標(biāo)記基因的8.6kb片段的克隆，引物設(shè)計(jì)如下正向引物5-GGAATTCCCCAATCGATGTC-3，含EcoRI位點(diǎn)，反向引物5-TTTCTAGACCACCGCTTACG-3，含XbaI位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的條件為反應(yīng)液含1.0ul的0.1ug的購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司AcNPV Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)病毒穿梭載體Bacmid基因組DNA作為模板，2.0ul的2.5mM的dNTP，各1.0ul的20pmol的正反向引物，0.5單位的Taq DNA聚合酶，及2.5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH8.3 PCR緩沖液，并加入超純水至25ul，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件為95℃變性50秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分，最后一個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間為10分；(3)將上述獲得的BmNPV基因組中多角體啟動(dòng)子左右側(cè)翼各約2kb片段分別進(jìn)行末端處理加上EcoRI位點(diǎn)和XbaI位點(diǎn)，并對(duì)克隆得到的8.6kb的片段進(jìn)行EcoRI和XbaI消化處理，分別取2ul并加上連接酶進(jìn)行體外14℃溫度下連接，使之成為一個(gè)大小為12.6kb的線性片段；(4)從AcNPV Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中分離出13.2kb輔助質(zhì)粒helper plasmid，采用常用的DNA分離方法，收集過夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化菌，先后加入0.2N的NaOH-SDS，醋酸鉀KAc和苯酚，最后用異苯醇沉淀DNA，融解于TE緩沖液；(5)將(3)連接得到的線性片段與家蠶130kb BmNPV基因組混合，在離子脂質(zhì)體Lipofectin介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，從感染的細(xì)胞中分離出病毒基因組，即BmNPV和重組的BmNPV基因組的混合物；在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染入BmN單層培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)基不含血清，24小時(shí)后更換含10％胎牛血清的培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集感染細(xì)胞并從中抽提病毒基因組DNA，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10β感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素、X-gal培養(yǎng)基上利用藍(lán)白斑分析法篩選出含病毒穿梭載體的轉(zhuǎn)化子，即藍(lán)斑，并將其命名為家蠶病毒穿梭載體BmBacmid，野生型BmNPV基因組的轉(zhuǎn)化子因不含有卡那霉素抗性基因不能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，最后分離得到藍(lán)斑的家蠶BmBacmid轉(zhuǎn)化子；(6)將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行象普通大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)的方法，制備其感受態(tài)細(xì)胞，并將13.2kb輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入其中，在含有四環(huán)素和卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，獲得同時(shí)含家蠶病毒穿梭載體BmBacmid和輔助質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，將其命名為DH10BmBac，這樣就構(gòu)建完成了適合于家蠶的重組病毒快速基因表達(dá)系統(tǒng)，可以用于重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建家蠶病毒快速基因表達(dá)系統(tǒng)的方法。利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子作用原理，在大腸桿菌內(nèi)即能完成家蠶重組桿狀病毒的構(gòu)建。利用家蠶桿狀病毒BmNPV和AcNPV基因組高度同源，借鑒AcNPV Bac－to－Bac表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，利用基因重組原理，構(gòu)建適用于可利用我國(guó)特色資源—家蠶的新型快速表達(dá)系統(tǒng)。解決了在重組病毒構(gòu)建過程中傳統(tǒng)的需要利用昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行重組病毒的空斑篩選的過程中費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，縮短了重組病毒構(gòu)建所需時(shí)間，加快了基因表達(dá)系統(tǒng)的工作進(jìn)程。在未來(lái)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)利用家蠶作為“生物工廠”表達(dá)生產(chǎn)重組蛋白、基因藥物、工程疫苗及后基因組時(shí)代蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能分析方面，具有推廣的使用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N7/01GK1544625SQ20031010878
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月18日
發(fā)明者吳小鋒 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)