專利名稱：鈉泵膜外區(qū)多肽及其在制備調(diào)節(jié)鈉泵活性藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，涉及多肽片段的應用，尤其涉及一種能夠影響鈉泵活性的鈉泵膜外區(qū)多肽及其該鈉泵膜外區(qū)多肽在制備調(diào)節(jié)鈉泵活性藥物中的應用。
背景技術(shù)：
鈉泵(Na+，K+-ATPase)是一種細胞跨膜蛋白，在維持細胞內(nèi)外Na+，K+離子轉(zhuǎn)運，保持細胞內(nèi)外鈉、鉀離子的電化學梯度，而這一離子梯度是機體基本功能活動所必需的，比如營養(yǎng)物質(zhì)由細胞外向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，細胞內(nèi)外滲透壓的平衡及細胞容量的調(diào)節(jié)，以及可興奮細胞膜靜息電位的維持等。總之，鈉泵在維持體內(nèi)電解質(zhì)平衡、穩(wěn)定細胞膜電位、保持細胞容量、信號轉(zhuǎn)導等方面均具有重要作用。
一、鈉泵的結(jié)構(gòu)鈉泵由α、β、γ三個亞單位組成。鈉泵的最小功能單位為二聚體，即αβ，常以四聚體形式存在，即2α2β。近年來的研究表明，α亞單位是其催化亞單位，其構(gòu)型決定鈉泵活性，是鈉泵的功能單位。α亞單位對促進已合成的β亞單位離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并對其糖基化起著重要作用。β亞單位是一種糖基蛋白，與α亞單位緊密連接，對維持鈉泵活性起著重要作用。它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中裝配，能促進α亞單位在膜中的固定，形成穩(wěn)定而有活性的αβ二聚體，它能影響成熟的α亞單位的轉(zhuǎn)運。近年來新發(fā)現(xiàn)的γ亞單位，其功能目前尚不明確。
鈉泵α亞單位具有與許多鈉泵調(diào)節(jié)因子(強心甙類物質(zhì)等多種配基)結(jié)合的位點，可與Na+、K+、Ca2+、ATP等結(jié)合，與磷酸化及能量傳遞系統(tǒng)相聯(lián)系，是鈉泵功能的主要調(diào)節(jié)者，在鈉泵活性的調(diào)節(jié)中具有重要作用。最早，人們只知道洋地黃是Na+，K+-ATPase的唯一拮抗劑，近來，發(fā)現(xiàn)哺乳動物體內(nèi)存在著內(nèi)源性鈉泵抑制物(SPIs、EDLS、EO等)，而且發(fā)現(xiàn)它們可能參與鈉泵活性的調(diào)節(jié)和電解質(zhì)平衡的維持。有證據(jù)表明，內(nèi)源性哇巴因(EO)與Na+，K+-ATPase催化亞單位的強心甙結(jié)合部位可逆地結(jié)合在一起(Butt AN，Tennant BP，Gillingwater SD，et al.Binding of ouabain and humanouabainlike substance to different Na+，K+-ATPase isoforms.HypertensRes，2000；23S45-S50)。
按照鈉泵催化亞單位與Na+、K+、Ca2+及強心甙類物質(zhì)等多種配基親和力的不同區(qū)分為α1、α2、α3和α4亞型(α4亞型知之甚少)。實際上，所有的細胞均表達α1亞單位，且α1-亞單位與哇巴因的親和力明顯低于α2和α3亞單位，α2和α3在所有脊椎動物中與哇巴因的親和力較高(IC50＝10-100nM)。同時鈉泵亞單位在組織中的分布及其與鈉泵抑制因子(如哇巴因)的結(jié)合能力也存在一定的種屬差異。如，嚙齒類動物的α1亞單位與哇巴因的親和力(ki＝1-5×10-5mol/L)較α2、α3亞單位(ki＝1-5×10-7mol/L)高。且不同亞型的催化亞單位具有不同的動力學特性。用Na+，K+-ATPase抑制活性法分別測得犬的α1亞單位和靈長類的α3亞單位與哇巴因的結(jié)合力相似(IC50＝10nM)。1992年Ferrandi用相似的方法分別測得犬腎臟α1亞單位的IC50為14nM，大鼠腦α3亞單位的IC50為21nM，另外，大鼠腎臟α1亞單位的IC50為105nM，提示大鼠較犬腎臟α1亞單位對哇巴因的敏感性低。近年來的研究表明，兔腎臟α1亞單位對哇巴因完全無反應，甚至于當哇巴因的濃度達到500nM時，亦未見明顯反應。1998年，Anner等人測得兔腎臟α1亞單位的IC50為600nM。當哇巴因的濃度達到500nM時，僅可觀察到5％的抑制反應。與1992年Ferrandi測得的大鼠腦α3亞單位的IC50與2000年Butt測得靈長類大腦皮質(zhì)α3亞單位的IC50相比，后者明顯增高。
盡管如此，鈉泵α催化亞單位的不同亞型基本結(jié)構(gòu)仍高度保守，Na+，K+-ATPaseα亞單位由1016個氨基酸組成，有10個穿膜區(qū)(鈉泵結(jié)構(gòu)示意參見圖7所示)。其氨基末端、H2-H3、H4-H5、H6-H7、H8-H9間序列及羧基端均位于細胞膜的胞漿面，稱為膜內(nèi)區(qū)，其序列高度保守，包含ATP結(jié)合位點和磷酸化作用位點，可與Na+、K+、ATP結(jié)合，與磷酸化及能量傳遞系統(tǒng)相聯(lián)系，在鈉泵活性的發(fā)揮中具有重要作用。H1-H2、H3-H4、H5-H6、H7-H8、H9-H10間的序列位于細胞膜外，稱為膜外區(qū)，為鈉泵配體的結(jié)合位點，如強心甙結(jié)合位點，比如地高辛和哇巴因結(jié)合位點均位于細胞膜膜外區(qū)。鈉泵活化/抑制因子通過對這些膜外區(qū)的作用影響鈉泵活性。目前研究發(fā)現(xiàn)鈉泵H1-H2、H3-H4膜外區(qū)是鈉泵調(diào)節(jié)因子等配體的主要結(jié)合位點，而H5-H6、H7-H8、H9-H10膜外區(qū)與鈉泵其他亞基之間相互作用有關(guān)。
1985年Shull等人認為哇巴因結(jié)合位點可能是位于H3-H4之間的膜外區(qū)序列。但是也有研究認為羧基端、H3-H4及H7-H8膜外區(qū)亦可能存在哇巴因的結(jié)合位點，同時證明這些區(qū)域并不僅僅是與洋地黃物質(zhì)相結(jié)合(Shull GE，Schwartz A，Lingrel JB.Amino-acid sequence of the catalytic subunit of the(Na+-K+)ATPase deduced from a complementary DNA.Nature 1985；316(22)691-695)。
1986年Shull等發(fā)現(xiàn)，哇巴因不僅與H3-H4間的氨基酸相結(jié)合，而且H1-H2間的氨基酸亦參與了此結(jié)合，也可能與內(nèi)酯環(huán)相結(jié)合(Shull GE，GreebJ，Lingrel JB.Molecular cloning of three distingct forms of the Na+，K+-ATPase α-subunit from rat brain.Biochemistry 1986；25(16)8125-8132)。1988年P(guān)rice和Lingral發(fā)現(xiàn)，大鼠鈉泵膜外區(qū)H1-H2的界點Arg-113和Asp-124是產(chǎn)生哇巴因抵抗的主要原因。因此1990年P(guān)rice等人用6種不同的氨基酸替換位于M1-M2膜外區(qū)邊界的氨基酸，研究鈉泵結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系(Price EM，Rice DA，Linger JB.Structure-function studies ofNa+，K+-ATPase.Site-directed mutagenesis of the border residues from theH1-H2extracellular domain of theαsubunit.J Bio Chem 1990；265(12)6638-6641)。不論替換111位或122位，或者是兩者同時被替換，其對哇巴因的親和力均發(fā)生了變化。將111位及122位氨基酸分別替換為Lys-111-Lys-122、Glu-111-Glu-122、Lys-111-Glu-122及Asp-111-Arg-122，不論被轉(zhuǎn)染任何一種突變的羊Na+，K+-ATPaseα亞單位的Hela細胞均可以在對未轉(zhuǎn)染的野生型Hela細胞產(chǎn)生毒性的哇巴因中生長，產(chǎn)生了哇巴因抵抗。經(jīng)定點突變的鈉泵，其哇巴因IC50進一步提高(4×10-3M-1×10-6M)。其中產(chǎn)生哇巴因抵抗最強的是鈉泵膜外區(qū)的雙突變(Asp-111-Arg-122)；最弱的是單側(cè)突變。因此認為哇巴因不僅與鈉泵H3-H4間的氨基酸，而且還與M1-M2間的氨基酸相結(jié)合，且近來認為后者更為重要。
可見鈉泵H1-H2、H3-H4膜外區(qū)是鈉泵調(diào)節(jié)因子作用的主要靶點。目前研究證實，鈉泵α催化亞基H1-H2、H3-H4膜外區(qū)，在鈉泵活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，血液中許多鈉泵配體(鈉泵調(diào)節(jié)因子)，正是通過與上述2個膜外區(qū)的結(jié)合在鈉泵活性的調(diào)節(jié)中起到重大作用。
鈉泵調(diào)節(jié)因子引起的鈉泵功能異常所致的病理生理變化，在多種疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用(Hamlyn J，Blaustin M，Bova S，et al.Identificationand characterization of oubain-like compound from human plasma.Proc NatlAcad Sci 1991；88625；Ferrandi M，Minotti E，Salardi S，et al.Characteristicof a ouabain-like factor from the Milan hypertensive rats.J CardiovascPharmacol 1993；22(suppl 2)S75-78)在包括高血壓在內(nèi)的多種疾病患者體內(nèi)鈉泵抑制因子水平異常，且與病患的研究程度密切相關(guān)，且正是由于這一調(diào)節(jié)因子的異常對鈉泵活性抑制在相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。例如1)心力衰竭Gottlieb等的研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者血漿EO水平增加，且增加幅度與心臟指數(shù)及平均動脈壓呈負相關(guān)，其原因可能是因為繼發(fā)于左室功能不全的血壓降低及心衰時腎上腺等組織的血流灌注減少，刺激EO的分泌增加，從而對維持心衰患者的血壓及血容量的平衡起著重要作用。其它臨床及動物實驗結(jié)果也證實心衰時EO水平的改變。對心衰患者進行血漿EO監(jiān)測具有重要意義，因為血漿EO水平的增加可能使機體對洋地黃類藥物的敏感性降低，增加了洋地黃中毒的可能性。
2)冠心病研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗塞患者發(fā)病第一天血漿EO含量升高，且并發(fā)室性心律失常者較無心律失常者高，但并發(fā)心力衰竭者較低，第二天EO即降至正常，且以后兩周內(nèi)無明顯變化。
3)心律失常Bagrov等發(fā)現(xiàn)由心肌缺血誘發(fā)的室性心律失常大鼠血漿中EO含量增高，但給予地高辛抗體后EO下降(可能是因為地高辛抗體與哇巴因存在交叉結(jié)合反應所致)，同時心律失常的發(fā)生率降低，且持續(xù)時間縮短，提示EO的改變可能參與了心律失常的發(fā)生。
4)其它妊娠時血容量擴張，刺激了EO的分泌，且并發(fā)高血壓者EO含量更高，不論血壓是否正常，分娩后EO可迅速下降。同時，母體含量較高的EO通過血液及乳汁等傳給了新生兒。研究表明，新生兒血漿EO含量明顯增高，但通常在出生后幾天內(nèi)恢復正常。
高血壓病的發(fā)生涉及一系列與血壓調(diào)節(jié)有關(guān)的內(nèi)分泌和生化代謝異常以及細胞膜離子轉(zhuǎn)運障礙，其中鈉泵活性改變、細胞膜離子轉(zhuǎn)運障礙及腎排鈉缺陷處于中心環(huán)節(jié)。特別是鈉泵主動轉(zhuǎn)運障與信號轉(zhuǎn)導異常在高血壓的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，已被公認為是高血壓病(尤其是鹽敏感性高血壓)的發(fā)病機制之一。
目前，對于內(nèi)源性鈉泵抑制因子——哇巴因的作用機制研究的較為清楚，這也可能在一定程度上代表了其它鈉泵抑制因子的作用模式(Ming-juanZhang，Jun Yang，Zhuo-ren Lu.A New Ouabain Conjugated Peptide Was FoundFrom Phage Displayed Peptide Library.Am J Hypert.2004，17619-623；HamlynJM，Hamilton BP，Manunta P.Endogenous ouabain，sodium balance and bloodpressurea review and a hypothesis.J Hypertens 1996；14(1)151-167；Goto A，Yamnada K.Putative roles of ouabainlike compound in hypertensionRevisited.Hypertens Res 2000；23S7-S13)。
高水平的哇巴因可過度抑制細胞膜鈉泵活性，影響阻力血管功能，調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性和腎臟功能，導致機體血壓升高。其可能機制如下鈉泵被過度抑制帶來細胞內(nèi)Na+升高，通過Na/Ca交換器后，使得細胞內(nèi)Ca2+離子濃度升高，這就帶來了肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取Ca2+離子增強，導致肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)貯存Ca2+增加，增強整個細胞Ca2+離子的信號傳導，以至引起生物學效應；同時，鈉泵抑制因子對細胞膜鈉泵的抑制作用還可通過信號轉(zhuǎn)導通路途徑引起高血壓的發(fā)生①、抑制血管Na-K-ATPase，使興奮-收縮偶聯(lián)過程加強，引起血管平滑肌收縮，導致血管張力增加；②、哇巴因通過抑制顱內(nèi)鈉泵，增加神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，增加外周交感神經(jīng)系統(tǒng)活性，導致血壓上升；③、激活腦內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)，進而使交感神經(jīng)興奮；④、抑制血管鈉泵還引起血管對腎上腺素的反應性增高；⑤、近來還發(fā)現(xiàn)，哇巴因不止是Na+，K+-ATPase的抑制因子，還通過對分布于腎小管上的II型和III型H+，K+-ATPase抑制，參與高血壓的發(fā)生。
可見，眾多因素均可通過對鈉泵活性的抑制導致細胞內(nèi)Na+暫時或持續(xù)升高、細胞內(nèi)pH值及離子平衡的改變，進而引起①、外周阻力更加；②、血壓感受器重調(diào)；③、交感活性增加；④、表遺傳學的改變或交互作用加??；⑤、增加血管壁/腔比例。上述因素的單一或聯(lián)合作用最終導致血壓的持續(xù)性增高。故此認為，內(nèi)源性鈉泵抑制因子對鈉泵活性的抑制，導致細胞膜離子轉(zhuǎn)運障礙，可能是高血壓發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。
基于上述分析，通過阻斷鈉泵抑制因子對于鈉泵的抑制，使鈉泵重新恢復排鈉功能，必將會為心血管疾病的藥物防治開辟一種全新的方法和思路。已有研究證實這一思路是可行的。1999年Ferrari發(fā)現(xiàn)，給Dahl大鼠高鹽飲食后腦室內(nèi)注射一種能與哇巴因結(jié)合的新藥PST2238，18小時后血壓下降到正常水平；給妊娠高血壓患者注射PST2238，也能明顯降壓(QuadriL，Bianchi G，Cerri A，et al.17beta-(3-furyl)-5beta-androstane-3beta，14beta，17beta-triol(PST2238)A very potent antihypertensive agent with a novelmechanism of action.J Med Chem 1997；40(11)1561-1564)。此外，用地高辛抗體可以阻斷顱腦損傷患者體內(nèi)EO對血管Na-K-ATPase的抑制，并降低血壓。本研究組采用特異性抗哇巴因抗體及其F(ab)2片段同樣也可顯著降低實驗動物的血壓。
上述研究均說明選擇性降低循環(huán)血液中游離鈉泵抑制因子對鈉泵的抑制作用，或競爭性結(jié)合鈉泵，或降低高親和力哇巴因的鈉泵亞單位的數(shù)量，均可恢復鈉泵活性，達到降低高血壓患者特別是鹽敏感患者血壓的目的。因此，通過阻斷鈉泵抑制因子對于鈉泵的抑制，使鈉泵重新恢復排鈉功能，達到治療高血壓的策略是完全有效和可行的。
但是，由于機體內(nèi)存在的多種類型的內(nèi)源性因子均可抑制鈉泵的活性，而采用特異性抗體或抗體片段是通過經(jīng)典的抗原抗體反應只能阻斷單一類型鈉泵抑制因子，并不能同時阻斷或有效減輕多種不同類型內(nèi)源性鈉泵抑制因子對鈉泵的抑制作用。
因此，設(shè)計可同時阻斷多種類型的鈉泵抑制物對鈉泵的抑制作用，并盡可能少地影響細胞正常生理功能的更為合理、有效的防治策略對于心血管疾病的防治具有重要意義。
上述分析證實在鈉泵α亞單位H1～H2和H3～H4膜外區(qū)是鈉泵抑制因子的結(jié)合位點，在鈉泵活性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。鈉泵抑制因子對于鈉泵的抑制作用正是通過與鈉泵α-亞單位H1～H2和H3～H4間膜外區(qū)氨基酸殘基的結(jié)合實現(xiàn)的，且僅僅包含鈉泵α-亞單位H1～H2和H3～H4膜外區(qū)的截斷性鈉泵α-亞單位片段就具備結(jié)合鈉泵抑制因子的活性。
因此，利用人工制備的包含鈉泵α-亞單位H1～H2和H3～H4膜外區(qū)的截斷性鈉泵片段，競爭性結(jié)合游離鈉泵抑制因子，影響細胞膜鈉泵的活性，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外離子濃度，從而，可以達到同時阻斷多種類型的鈉泵抑制因子對鈉泵的抑制作用，達到治療的目的，并最大限度地降低對細胞正常生理功能的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽包含的α-亞單位H1～H2和H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段。
本發(fā)明的另一個目的在于提供上述鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽包含的α-亞單位H1～H2和H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段在制備治療鈉泵功能異常相關(guān)疾病的藥物中的應用，尤其是治療心血管疾病的藥物和制備治療高血壓的藥物中的應用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽，其特征在于，包含下列6段α-亞單位H1～H2和H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段，具體氨基酸序列如下H1～H2膜外區(qū)多肽截斷性片段Gln Ala Ala Thr Glu Glu Glu Pro Gln Asn Asp AsnGln Ala Ala Met Glu Asp Glu Pro Ser Asn Asp AsnGln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp AsnH3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段Glu Tyr Thr Trp Leu GluGly Tyr Ser Trp Leu GluGly Tyr Thr Trp Leu Glu。
上述鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽的制備方法，采用體外人工合成法合成α-亞單位H1～H2和(或)H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段，經(jīng)高效液相色譜法純化合成的鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽。具體方法如下首先將一個用Fmoc基團對α-氨基進行保護的氨基酸通過一個支臂連結(jié)到一個不溶性載體樹脂上，隨后將α-氨基脫保護，用溶液洗滌氨基酸-支臂-樹脂；將第二個預先活化的α-氨基保護的氨基酸通過耦聯(lián)反應連接上去；或者用α-N端及側(cè)鏈保護的肽片斷代替單個的氨基酸進行耦聯(lián)反應，縮合反應完成后，用溶液洗滌，重復進行脫保護、耦聯(lián)，直到得到α-亞單位H1～H2和(或)H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段，最后將肽與支臂及樹脂裂解即可。
或者采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)制備包含鈉泵α3-亞單位H1～H2和H3～H4膜外區(qū)的多肽片段，具體包括下列步驟1)大鼠動脈血管組織mRNA的提取取新鮮的大鼠動脈血管組織稱重后，剪碎，直接加入勻漿液中勻漿，采用寡聚-纖維素離心柱快速分離mRNA；2)mRNA的逆轉(zhuǎn)錄在無菌的0.5ml離心管中加入5-10μgmRNA，10單位RNasin，10pmol 3’端引物，1mmol/L的各種dNTP，其pH7.0，和50單位左右M-Mulv反轉(zhuǎn)錄酶，或5單位左右Taq DNA聚合酶，反應緩沖液加水至20μl，37℃保溫1h；3)PCR擴增目的基因片段按照大鼠鈉泵α亞單位基因序列(Genbank，登錄號M14513.1)設(shè)計引物，引物序列primer 15`-c tca cta gtc gtc aag ttc tgc cgg cagctg-3`Primer25`-gac aag ctt tta gca gtt ctt gcg agc cat gcg-3；以逆轉(zhuǎn)錄之cDNA為模板，進行PCR反應，擴增鈉泵α亞單位基因序列中260～1200之間長度為760bp的核苷酸序列，作為鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的基因序列；或者直接按照大鼠鈉泵α亞單位基因序列(Genbank，登錄號M14513.1)設(shè)計包含α3-亞單位H1～H2和(或)H3～H4膜外區(qū)的基因片段的上下游引物，經(jīng)過復性后，進行PCR擴增或直接經(jīng)Xbal、HindIII限制性核酸內(nèi)切酶酶切獲得目的基因片段。
4)重組pFB-sp3轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建目的DNA片段和pFB轉(zhuǎn)移載體均經(jīng)Xbal、HindIII限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，T4-DNA連接酶作用下，體外連接，然后將重組子轉(zhuǎn)化DH5α宿主菌，堿裂解提取質(zhì)粒，并經(jīng)PCR、基因測序及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，獲得重組pFB-sp3轉(zhuǎn)移載體；5)重組Bacmid DNA的制備用重組pFB-sp3轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染DH10Bac感受態(tài)細胞，經(jīng)Luria Agar選擇性培養(yǎng)基篩選陽性菌斑，堿解法提取重組BacmidDNA，用PGR鑒定陽性重組體；6)收獲重組桿狀病毒在35mm培養(yǎng)皿中27℃ Grace`完全培養(yǎng)基培養(yǎng)Sf-9細胞至少1h；配置以下溶液A液5μl重組的Bacmid DNA加入95μl滅菌去離子水；B液6μl Cellfectin加入94μl滅菌去離子水；A液與B液輕輕混勻，室溫放置30min；用無血清、無抗生素的TNM-FH洗滌3次Sf-9細胞后，逐滴加入AB混合液，共培養(yǎng)72h收集培養(yǎng)上清，500g離心10min，將上清分成小份作為重組桿狀病毒原毒種，命名為重組Ac-sp3，4℃避光保存；7)鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽的表達和鑒定27℃培養(yǎng)Sf-9細胞至80％細胞融合時，加入重組桿狀病毒毒種400ul/瓶，繼續(xù)培養(yǎng)72h，收集病毒感染細胞，熱變性后，取10ul上清行SDS-PAGE電泳，即12％分離膠，5％積層膠，檢測截斷性鈉泵α亞單位蛋白的表達；8)非變性截斷性鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽的純化用ProBondTMColumn樹脂吸附經(jīng)反復凍融裂解的感染重組病毒的Sf-9細胞上清，非變性洗滌液洗滌，50mM、200mM、350mM、500mM非變性-咪唑洗脫液洗脫，800×g離心2min，收集上清，即獲得6段α-亞單位H1～H2和H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段。
將純化的鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽用于鈉泵活性調(diào)節(jié)藥物的制備，直接通過靜脈內(nèi)注射途徑注入哺乳類(包括人類)或非哺乳類動物，達到競爭性阻斷體內(nèi)游離鈉泵抑制因子對鈉泵的抑制作用，恢復細胞膜鈉泵活性，最大限度地降低對細胞正常生理功能的影響。從而將其用于鈉泵活性異常相關(guān)疾病，尤其是心血管疾病的藥物制備和制備治療高血壓的藥物中的應用。


圖1是本發(fā)明的6條能與鈉泵特異結(jié)合的鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽的氨基酸序列。
圖2是重組pFB-sp3轉(zhuǎn)移載體PCR鑒定。1pFB-sp3轉(zhuǎn)移載體；2陰性對照。
圖3是重組Ac-sp3桿狀病毒PCR鑒定。1陰性對照；2Ac-sp3桿狀病毒。
圖4是鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽SDS-PAGE鑒定重組桿狀病毒的表達。1Ac-sp3桿狀病毒感染的Sf-9細胞裂解液；2陰性對照。
圖5是鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽對哇巴因抑制紅細胞攝取86Rb的阻斷作用的體外生物學活性試驗結(jié)果圖。其中，橫坐標表示鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽的濃度；縱坐標表示紅細胞86Rb攝取率。
圖6是鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽降壓作用示意圖。橫坐標表示鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽的濃度；縱坐標表示血壓水平。
圖7是鈉泵由α和β亞單位結(jié)構(gòu)示意圖(Blanco，Am.J.Physiol.1998)。
為了更清楚的理解本發(fā)明，以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
1.鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽氨基酸序列的確定通過Genebank獲得鈉泵α-亞單位的基因序列和蛋白序列，按照α-亞單位的結(jié)構(gòu)和膜外區(qū)多肽序列，確定α-亞單位H1～H2和(或)H3～H4膜外區(qū)多肽。本發(fā)明經(jīng)過上述方法獲得了以下6段鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽(圖1)，其氨基酸序列為Gln Ala Ala Thr Glu Glu Glu Pro Gln Asn Asp AsnGln Ala Ala Met Glu Asp Glu Pro Ser Asn Asp AsnGln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp AsnGlu Tyr Thr Trp Leu GluGly Tyr Ser Trp Leu GluGly Tyr Thr Trp Leu Glu。
2.制備上述鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽可分別采用以下技術(shù)方案1)體外人工合成法Fmoc法合成α-亞單位H1～H2和(或)H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段，經(jīng)高效液相色譜法純化合成的截斷性鈉泵片段。具體方法如下首先將一個用Fmoc基團對α-氨基進行保護的氨基酸通過一個支臂連結(jié)到一個不溶性載體上，隨后將α-氨基脫保護，用溶液洗滌氨基酸-支臂-樹脂。將第二個預先活化的α-氨基保護的氨基酸通過耦聯(lián)反應連接上去。此外，也可以用α-N端及側(cè)鏈保護的肽片斷代替單個的氨基酸進行耦聯(lián)反應，縮合反應完成后，用溶液洗滌，重復進行脫保護、耦聯(lián)，直到得到目的肽，最后將肽-支臂-樹脂裂解。這種延長肽鏈的固相合成法既可采用間斷的方法，也可使用連續(xù)流動的方法。
2)采用原核表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)或其他真核表達系統(tǒng)或非真核表達系統(tǒng)制備鈉泵α-亞單位膜外區(qū)。具體方法如下采用RT-PCR和分子克隆技術(shù)等方法獲得包含上述鈉泵α-亞單位膜外區(qū)基因序列，通過分子克隆技術(shù)將其克隆入真核表達載體或非真核表達載體，并經(jīng)過相應的轉(zhuǎn)染相應的宿主細胞，表達鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽，非變性條件純化(方法詳見分子克隆)。
3.鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽體外生物學活性檢測采用紅細胞86Rb攝取率試驗鑒定鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽體外生物學活性。影響細胞膜鈉泵功能，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外離子平衡，從而提示其具有治療心血管疾病的潛在作用。最后，采用動物試驗證實其治療心血管疾病的作用，及其急性毒理學作用。較具體方法見具體實施方式
2。
4.體內(nèi)試驗采用高血壓動物模型實驗研究鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽在動物體內(nèi)的藥效學及毒理學。具體方法見具體實施方式
3、4。
5.鈉泵活性調(diào)節(jié)藥物的制備為了證實鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽能夠影響細胞膜鈉泵功能，并且可用于治療心血管疾病，尤其是高血壓，以下所述的實施例用于描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實驗材料1.鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽片段的獲得實施方案1
應用多肽合成儀自動合成鈉泵α亞單位膜外區(qū)多肽，并且通過HPLC純化。本實施例合成鈉泵α3-亞單位H1～H2膜外區(qū)多肽片段，其氨基酸序列如下Gln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp Asn。
Fmoc固相肽合成法首先將一個用Fmoc基團對α-氨基進行保護的氨基酸通過一個支臂連結(jié)到一個不溶性載體上，隨后將α-氨基脫保護，用溶液洗滌氨基酸-支臂-樹脂.將第二個預先活化的α-氨基保護的氨基酸通過耦聯(lián)反應連接上去.此外，也可以用α-N端及側(cè)鏈保護的肽片斷代替單個的氨基酸進行耦聯(lián)反應，縮合反應完成后，用溶液洗滌，重復進行脫保護、耦聯(lián)，直到得到目的肽.最后將肽-支臂-樹脂裂解.這種延長肽鏈的固相合成法既可采用間斷的方法，也可使用連續(xù)流動的方法。即(1)C末端氨基酸與樹脂結(jié)合；(2)Na-Fmoc的脫除、洗滌；(3)耦聯(lián)、洗滌；(4)重復步驟(2)～步驟(3)；(5)脫保護基。
同法可以獲得本發(fā)明所涉及的其他幾條α-亞單位H1～H2和(或)H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段。
實施方案2采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)制備包含鈉泵α3-亞單位H1～H2和(或)H3～H4膜外區(qū)的多肽片段，其氨基酸序列包含如下氨基酸序列Gln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp Asn。
具體制備方法如下(1)大鼠動脈血管組織mRNA的提取取新鮮的大鼠動脈血管組織稱重后，剪碎，直接加入勻漿液中勻漿，采用寡聚(dT)-纖維素離心柱快速分離mRNA。
(2)mRNA的逆轉(zhuǎn)錄在無菌的0.5ml離心管中加入5-10μgmRNA，10單位RNasin，10pmol 3’端引物，1mmol/L各種dNTP(pH7.0)和50單位左右M-Mulv反轉(zhuǎn)錄酶(或5單位左右Taq DNA聚合酶)，反應緩沖液加水至20μl，37℃保溫1h。
(3)PCR擴增目的基因片段按照大鼠鈉泵α亞單位基因序列(Genbank登錄號M14513.1)設(shè)計引物，引物序列primer 15`-c tca cta gtcgtc aag ttc tgc cgg cag ctg-3 Primer25-gac aag ctt tta gca gttctt gcg agc cat gcg-3`。以逆轉(zhuǎn)錄之cDNA為模板，進行PCR反應，擴增鈉泵α亞單位基因序列中260～1200之間長度為760bp的核苷酸序列，作為鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽(圖2)。
(4)重組pFB-sp3轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建目的DNA片段和pFB轉(zhuǎn)移載體均經(jīng)Xbal、HindIII限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，T4-DNA連接酶作用下，體外連接。然后將重組子轉(zhuǎn)化DH5α宿主菌，堿裂解提取質(zhì)粒，并經(jīng)PCR、基因測序及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，獲得重組pFB-sp3轉(zhuǎn)移載體。
(5)重組Bacmid DNA的制備用重組pFB-sp3轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染DH10Bac感受態(tài)細胞，經(jīng)Luria Agar選擇性培養(yǎng)基篩選陽性菌斑(具體方法參照GIBCO公司Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)操作手冊)。堿解法提取重組BacmidDNA，用PCR鑒定陽性重組體(圖3)。
(6)收獲重組桿狀病毒在35mm培養(yǎng)皿中27℃ Grace`完全培養(yǎng)基培養(yǎng)Sf-9細胞至少1h；配置以下溶液A液(5μl重組的Bacmid DNA加入95μl滅菌去離子水)與B液(6μl Cellfectin加入94μl滅菌去離子水)輕輕混勻，室溫放置30min；用無血清、無抗生素的TNM-FH洗滌3次Sf-9細胞后，逐滴加入AB混合液，共培養(yǎng)72h收集培養(yǎng)上清，500g離心10min，將上清分成小份作為重組桿狀病毒原毒種，命名為重組Ac-sp3，4℃避光保存。(具體方法參照GIBCO公司Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)操作手冊)。
(7)鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽的表達和鑒定27℃培養(yǎng)Sf-9細胞至80％細胞融合時，加入重組桿狀病毒毒種400ul/瓶，繼續(xù)培養(yǎng)72h，收集病毒感染細胞，熱變性后，取10ul上清行SDS-PAGE電泳(12％分離膠，5％積層膠)檢測截斷性鈉泵α亞單位蛋白的表達(圖4)。
(8)非變性截斷性鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽的純化用ProBondTMColumn樹脂(Invitrogen公司)吸附經(jīng)反復凍融裂解的感染重組病毒的Sf-9細胞上清，非變性洗滌液洗滌，50mM、200mM、350mM、500mM非變性-咪唑洗脫液洗脫，800×g離心2min，收集上清，獲得目的片段。
同法可以獲得本發(fā)明所涉及的含有其他幾條α-亞單位H1～H2和(或)H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段的表達。
實施方案3采用采用分子生物學技術(shù)，原核表達截斷性鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽片斷，包含鈉泵α3-亞單位H1～H2和(或)H3～H4膜外區(qū)的多肽片段，其氨基酸序列包含如下氨基酸序列Gln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp Asn具體的實施方案如下(1)人腎臟組織mRNA的提取取新鮮的腎臟組織樣品稱重后，剪碎成約1cm3的組織塊，直接加入勻漿液中做mRNA的提取。采用寡聚(dT)-纖維素離心柱快速分離。原理先用異硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸鈉，直接裂解勻漿、裂解腎臟組織細胞并抑制RNase活性，細胞裂解液直接上寡聚(dT)-纖維素柱，用不同鹽濃度緩沖液洗滌上柱物，最后洗脫下poly(A+)RNA，并且不需要用乙醇沉淀，而用糖原沉淀回收微量RNA。有關(guān)操作步驟參照快速mRNA提純試劑盒產(chǎn)品說明書。
(2)mRNA的逆轉(zhuǎn)錄在無菌的0.5ml離心管中膠乳5-10μg細胞mRNA，10單位RNasin，10pmol 3’端引物，1mmol/L各種dNTP(pH7.0)和50單位左右M-Mulv反轉(zhuǎn)錄酶(或5單位左右Taq DNA聚合酶)，反應緩沖液加水至20μl，37℃保溫1h。
(3)PCR擴增目的基因片段設(shè)計4對引物，以mRNA為模板，在適宜的條件下擴增目的基因片段。
(4)克隆載體與目的基因片段的體外連接和轉(zhuǎn)化目的DNA片段和表達載體pGEM-Zf均經(jīng)合適的限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，經(jīng)適量的T4-DNA連接酶的作用及適宜的條件下，進行體外連接。將重組子轉(zhuǎn)化到相應的宿主菌。
(5)陽性重組子的篩選及鑒定將轉(zhuǎn)化細菌直接涂布在含100μg/ml Amp、0.5mmol/L IPTG和40μg/mlX-gal瓊脂板上，過夜培養(yǎng)后，可見到毫米大小的白色菌落。挑取白色菌落擴增、小量提取DNA，作限制性內(nèi)切酶圖譜，DNA序列測定。
(6)大量制備目的基因?qū)⒑Y選、鑒定后的陽性重組子大量擴增，大量提取DNA。
(7)體外連接和轉(zhuǎn)化目的DNA片段和表達載體pGEX-4t-1均經(jīng)合適的限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，在適宜的條件下進行體外連接。將重組子轉(zhuǎn)化到相應的宿主菌。
(8)陽性重組子的篩選將細胞轉(zhuǎn)入含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，篩選出含重組子轉(zhuǎn)化菌株，提取質(zhì)粒DNA作限制性內(nèi)切酶圖譜，DNA序列測定，確定無誤后進行表達。
(9)截斷性鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽片段的表達、鑒定和純化重組子轉(zhuǎn)化菌株在37℃培養(yǎng)數(shù)小時達到對數(shù)生長期后加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3-5小時，誘導截斷性鈉泵催化亞單位的表達。SDS-PAGE鑒定，采用Glutathione Sepharose 4B純化表達蛋白。
同法可以獲得本發(fā)明所涉及的含有其他幾條α-亞單位H1～H2和(或)H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段的表達。
以上三種實施方案所獲得的鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽片段均可用于實施方案的下述試驗檢測。為描述本發(fā)明，在本實施例的以下內(nèi)容均采用實施方案1所獲得的人工合成鈉泵α3-亞單位H1～H2膜外區(qū)的多肽片段進行。
2、鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽體外生物學活性(影響細胞膜鈉泵功能)的鑒定鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽對哇巴因與鈉泵結(jié)合的阻斷作用在新鮮配制的紅細胞懸液內(nèi)，加入固定濃度的哇巴因溶液、不同濃度的鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽溶液和Ringer氏緩沖液后，進行混合，溫育，再加入86RbCl溶液，溫育，終止反應，然后離心、吸去上清液后，置入γ計數(shù)器內(nèi)，測得紅細胞攝入的86Rb。其余的實驗操作同上，結(jié)果顯示，鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽有阻斷抑制紅細胞86Rb攝入的作用，在一定范圍內(nèi)，鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽的濃度越高，其對哇巴因抑制紅細胞86Rb攝取的阻礙作用就越大。
3、鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽在體藥理學實驗(1)實驗方法及結(jié)果高血壓模型實驗實驗分為3組，即安慰劑組、硝普鈉組、截斷性鈉泵片斷組，每組8-10只。
各組大鼠均經(jīng)25％烏拉坦麻醉，頸動脈插管監(jiān)測血壓，待血壓穩(wěn)定后舌靜脈給藥，陽性對照藥為硝普鈉(靜注劑量為0.3mg/kg體重)，陰性對照為生理鹽水(安慰劑)。
(2)動物藥理學實驗表明鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽的降壓作用有以下特點降壓效應與用藥劑量有關(guān)，降壓幅度和持續(xù)時間與用藥劑量呈正相關(guān)；降壓效果比常用降壓藥物硝普鈉降壓持續(xù)時間長；降壓起效快，用藥后2-5分鐘起效。
4、鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽急性毒性實驗選擇18-22克體重的健康小鼠20只，雌雄各半，經(jīng)尾靜脈及腹腔兩種途徑一次注入最大濃度(230mg/Kg體重)的鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽。觀察結(jié)果(1)試驗即刻動物反應情況動物活動明顯減少，但無抽搐及呼吸急促等發(fā)生。
(2)繼續(xù)觀察10天，實驗第一天動物飲食及活動明顯減少，第二天好轉(zhuǎn)，第三天恢復正常，觀察10天無動物死亡。
結(jié)論最大耐受性試驗顯示，鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽的急性毒性作用小。
從圖5中，可以看出鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽用于體外生物學活性試驗的結(jié)果鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽影響了細胞膜鈉泵的生物學活性；其溶液濃度愈高時，對哇巴因抑制紅細胞86Rb攝取的阻斷就愈強，反之愈弱。
動物藥理學實驗表明(圖6所示)鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽的降壓效應與用藥劑量有關(guān)，降壓幅度和持續(xù)時間與用藥劑量呈正相關(guān)；降壓起效快，用藥后2～5分鐘起效。
總之，以上內(nèi)容充分說明了鈉泵α-亞單位膜外區(qū)多肽影響了細胞膜鈉泵的生物學活性，并且可以應用于心血管疾病的治療，尤其是治療高血壓病。
2.技術(shù)效果本發(fā)明采用上述方案獲得的鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽，具有體內(nèi)外競爭性阻斷鈉泵抑制因子對鈉泵活性的抑制作用，達到調(diào)節(jié)鈉泵活性的目的，可以與細胞膜鈉泵競爭結(jié)合鈉泵調(diào)節(jié)因子，降低試驗動物的血壓。可直接以注射方式將其作為藥物用于鈉泵活性相關(guān)疾病患者或試驗動物的藥物治療，達到競爭性阻斷體內(nèi)游離鈉泵抑制因子對鈉泵的抑制作用，恢復細胞膜鈉泵活性，最大限度地降低對細胞正常生理功能的影響的目的，因而，可將其用于鈉泵活性異常相關(guān)疾病，尤其是心血管疾病和降壓藥物的制備。
3.最佳實施方式3.1鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽的獲得3.1.1直接應用多肽合成儀合成鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽，并且通過HPLC純化(參見實施方案1)。
3.1.2采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)制備包含鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽片段(參見實施方案2)。
3.1.3采用原核表達系統(tǒng)制備包含鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽片段(參見實施方案3)。
3.2具有體內(nèi)外競爭性阻斷鈉泵抑制因子對鈉泵活性的抑制作用，達到調(diào)節(jié)鈉泵活性的目的，可直接將本發(fā)明獲得的鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽以注射方式將其作為藥物用于鈉泵活性相關(guān)疾病患者或試驗動物的藥物治療，達到競爭性阻斷體內(nèi)游離鈉泵抑制因子對鈉泵的抑制作用，恢復細胞膜鈉泵活性，最大限度地降低對細胞正常生理功能的影響的目的，因而，可將其用于鈉泵活性異常相關(guān)疾病，尤其是心血管疾病藥物的制備。
鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽含有α-亞單位H1～H2和/或H3～H4膜外區(qū)多肽氨基酸序列Gln Ala Ala Thr Glu Glu Glu Pro Gln Asn Asp AsnGln Ala Ala Met Glu Asp Glu Pro Ser Asn Asp AsnGln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp AsnGlu Tyr Thr Trp Leu GluGly Tyr Ser Trp Leu GluGly Tyr Thr Trp Leu Glu
權(quán)利要求
1.鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽，其特征在于，包含以下6段α-亞單位H1～H2和/或H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段，具體氨基酸序列如下H1～H2膜外區(qū)多肽截斷性片段Gln Ala Ala Thr Glu Glu Glu Pro Gln Asn Asp AsnGln Ala Ala Met Glu Asp Glu Pro Ser Asn Asp AsnGln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp AsnH3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段Glu Tyr Thr Trp Leu GluGly Tyr Ser Trp Leu GluGly Tyr Thr Trp Leu Glu。
2.如權(quán)利要求1所述的鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽，其特征在于包含上述H1～H2和H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段的單一或兩個以上肽段的重復多肽序列片段，且長度小于300個氨基酸的短肽或蛋白。
3.鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽包含的α-亞單位H1～H2和/或H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段用于制備治療心血管疾病的藥物應用。
4.鈉泵α-亞單位膜外區(qū)的多肽包含的α-亞單位H1～H2和/或H3～H4膜外區(qū)多肽截斷性片段用于制備治療高血壓的藥物應用。
5.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述的心血管疾病的藥物為注射方式的藥物。
6.如權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述的高血壓的藥物為注射方式的藥物。
全文摘要
該發(fā)明公開了鈉泵α－亞單位膜外區(qū)的多肽及其在制備調(diào)節(jié)鈉泵活性藥物中的應用，鈉泵α－亞單位膜外區(qū)的多肽是一種包含鈉泵alpha亞單位膜外區(qū)氨基酸序列的多肽，屬于多肽或蛋白質(zhì)的應用。該發(fā)明的鈉泵α－亞單位膜外區(qū)多肽可以影響細胞膜鈉泵的生物學活性，具有治療心血管疾病的潛能，并且在體外實驗中證實其具有阻斷或拮抗哇巴因抑制鈉泵的作用，以及動物藥理學實驗表明其可以降低高血壓動物模型的血壓。因此，該發(fā)明可用于心血管疾病的治療，尤其是應用于高血壓病的治療，同時具有療效顯著、副作用小等特點。
文檔編號A61P9/12GK1837236SQ20061004274
公開日2006年9月27日 申請日期2006年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月27日
發(fā)明者張明娟 申請人:西安交通大學