專利名稱：分泌蛋白及其編碼序列和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術和醫(yī)學領域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼人分泌蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。
背景技術：
分泌蛋白在生物體具有非常重要的作用，常常與某些生理異?；蚣膊∮嘘P，因此一直是人們研究的重點，本領域迫切需要開發(fā)新的人分泌蛋白。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人分泌蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的分泌蛋白，它包括具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有相同功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性，較佳地85％，更佳地95％(a)編碼上述人分泌蛋白的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或3所示氨基酸序列的多肽。
更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49的編碼區(qū)序列或全長序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人分泌蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達人分泌蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人分泌蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人分泌蛋白特異性結合的抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了檢測樣品中是否存在分泌蛋白的方法，它包括將樣品與分泌蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在分泌蛋白。
在本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進人分泌蛋白活性的激動劑，或者篩選抑制人分泌蛋白活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人分泌蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1是對表達的NSP019的免疫印跡檢測圖。
具體實施例方式
在本發(fā)明中，術語“分泌蛋白”、可互換使用，都指具有人分泌蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的分泌蛋白。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的分泌蛋白或多肽”是指分泌蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化分泌蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。分泌蛋白的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據(jù)重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人分泌蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人分泌蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術語“人分泌蛋白”指具有人分泌蛋白活性的SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50序列的多肽。該術語還包括具有與人分泌蛋白相同功能的、SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人分泌蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人ZZ DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人分泌蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人分泌蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人分泌蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有人分泌蛋白序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人分泌蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人分泌蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人分泌蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產生。
表 1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1-50中奇數(shù)所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO1-50偶數(shù)序列所示的蛋白質，但與SEQ ID NO1-50中奇數(shù)序列所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
在本發(fā)明中，術語“人分泌蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人分泌蛋白活性的多肽的核苷酸序列。以NSP019為例，該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO1中的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO1中的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與天然的人ZZ相同功能的蛋白的、SEQ ID NO1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
編碼成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性(以NSP19為例)。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼分泌蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發(fā)明的人分泌蛋白的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或分泌蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的分泌蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人分泌蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發(fā)明中，人分泌蛋白的多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體?？傊灰茉谒拗黧w內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人分泌蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的人分泌蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療分泌蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或對抗分泌蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人分泌蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人分泌蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人分泌蛋白DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人分泌蛋白的基因產物或片段。較佳地，指那些能與人分泌蛋白的基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制人分泌蛋白的分子，也包括那些并不影響人分泌蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人分泌蛋白的基因產物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人分泌蛋白的基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人分泌蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6；511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人分泌蛋白功能的抗體以及不影響人分泌蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人分泌蛋白的基因產物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人分泌蛋白的基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗人分泌蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人分泌蛋白。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與人分泌蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人分泌蛋白的產生或活性。
抗體也可用于設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如人分泌蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人分泌蛋白陽性的細胞。
多克隆抗體的生產可用人分泌蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與分泌蛋白發(fā)生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明分泌蛋白或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的分泌蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。
人分泌蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術可用于治療由于分泌蛋白的無表達或異常/無活性的分泌蛋白的表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的分泌蛋白，以抑制內源性的分泌蛋白活性。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將分泌蛋白的基因轉移至細胞內。構建攜帶分泌蛋白的基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人分泌蛋白的基因可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
抑制人分泌蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與人分泌蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人分泌蛋白分子進行標記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人分泌蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人分泌蛋白水平，可以用作解釋人分泌蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷分泌蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在分泌蛋白的方法是利用分泌蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與分泌蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在分泌蛋白。
分泌蛋白的多聚核苷酸可用于分泌蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，分泌蛋白的多聚核苷酸可用于檢測分泌蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下分泌蛋白的異常表達。如分泌蛋白DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷分泌蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用分泌蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測分泌蛋白的轉錄產物。
檢測分泌蛋白的基因的突變也可用于診斷分泌蛋白相關的疾病。分泌蛋白突變的形式包括與正常野生型分泌蛋白DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明分泌蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關系。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 人分泌蛋白基因的克隆1.mRNA的分離(mRNA isolation)取人的腦垂體、肝癌組織、下丘腦等各種不同組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文庫的構建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉錄引物見SEQ ID NO1。補平末端后，加含EcoRI切點的接頭，接頭序列分別見SEQ ID NO1-50中的偶數(shù)序列和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內切酶消化1.5小時，再進行片段分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III GoldCloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)進行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF’(Stratagene，CA9203，USA)細菌。涂板并測定滴度。
4.測序及數(shù)據(jù)庫建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴增后抽提質粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3’端和5’端的通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行EST大規(guī)模測序。測序結果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450 Server上<p>
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實施例2 人分泌蛋白的制備和提純在該實施例中，將全長的人分泌蛋白編碼序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
1.將人分泌蛋白以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行原核表達。
原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌根據(jù)人分泌蛋白的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應于編碼序列5’和3’端的約20個以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據(jù)選用的pGEX-2T載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經(jīng)PGR擴增后，將人分泌蛋白基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑒定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-分泌蛋白表達載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-分泌蛋白。
表達GST-分泌蛋白重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-分泌蛋白工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時，至OD600達0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時。取培養(yǎng)時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達GST-分泌蛋白融合蛋白的工程菌。
GST-分泌蛋白融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達GST-分泌蛋白融合表達蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-分泌蛋白。誘導后的細菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細菌，超聲破碎細菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結合了GST-分泌蛋白的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。獲得人分泌蛋白(SEQ ID NO1-50中的偶數(shù)序列)。
實施例3 人分泌蛋白或多肽在人胚腎293細胞中進行真核細胞表達1.人分泌蛋白桿狀病毒表達載體的構建及轉染293細胞株根據(jù)人分泌蛋白的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將人分泌蛋白cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pcDNA3.1A載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達載體3μg，pcDNA3.1A DNA(BaCuloGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，SanDiego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無血清的DMEM培養(yǎng)基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)293細胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中，貼壁1小時后換轉染培養(yǎng)基，室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基，加入前面制備好的DNA載體轉染混合物，Parafilm密封培養(yǎng)板，于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時，而后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，收集上清備用。
2.轉入重組表達載體的293細胞株的篩選鑒定轉染3天后的293細胞進行Western鑒定。將細胞裂解后進行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的Multiphor II半干電轉移儀中將蛋白質轉印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時，而后于抗人分泌蛋白的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標記的抗人分泌蛋白一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復合物反應30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達人分泌蛋白的293細胞克隆。
3.人分泌蛋白的提取純化用高表達人分泌蛋白的Sf9細胞克隆收集細胞，PBS洗滌。每2×108細胞加入20ml細胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8)，500mMNaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mM Pefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細胞，12000×g離心20min去除細胞碎片，上清按每2×108的細胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mM N，N’-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進行SDS-PAGE電泳檢測提取的人分泌蛋白的純度。得到各人分泌蛋白(SEQ ID NO1-50中的偶數(shù)序列)。
NSP019的表達電泳圖見圖1，表明其被分泌于細胞外。對于其他蛋白獲得的結果列于表2。
實施例4 抗人分泌蛋白抗體的制備1.免疫小鼠和脾細胞的制備將實施例2和3制備的本發(fā)明SEQ ID NO1-50中的偶數(shù)序列所示的分泌蛋白用層析法進行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細胞制備見鄂征主編，《組織培養(yǎng)和分子細胞學技術》，北京出版社，第210頁。
2.按《組織培養(yǎng)和分子細胞學技術》(同上)，第371頁中的方法，制備飼養(yǎng)細胞。
3.按《組織培養(yǎng)和分子細胞學技術》(同上)，第213頁中的方法，進行細胞融合。
4.抗體的檢測在細胞融合10-15天后，需逐孔進行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細胞集落生長，就應用人分泌蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗、發(fā)射免疫試驗(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
獲得的抗體的特異反應活性用它在體外沉淀對應分泌蛋白的能力加以評估。結果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結合。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>人分泌蛋白及其編碼序列<130>035910<160>50<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5716<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1cgagcgagcg ggcgctgcca ggagcccgca gccctggcgc ccgccgccgc ccggagcccc 60gcaatatgcc gccgcggccc tctggctcta ggccatggcg aggctctgcc ggcgtgtccc120ctgcaccctg cttctcggcc tggccgtggt gctgctgaaa gcgcggctgg tccccgcggc180cgccagagcg gaactcagcc gctccgacct cagcctcatc caacagcagc agcagcagca240gcagcagcaa caacaacaac aacagcaaaa gcagctggag gaggctgagg aggagaggac300agaggtgcct ggggcaacct ccaccttgac ggttccagtg tctgtattta tgttgaaagt360ccaggtgaat gacatcatca gtcgtcagta cctgagccaa gcagttgtag aagtgtttgt420aaactacacg aagacaaatt ccacagtaac taaaagcaat ggagcagtgc tgataaaagt480accctacaaa ttaggactta gtttaactat tattgcttac aaagatggct acgtgttgac540ccctctgcct tggaaaacca gaagaatgcc aatatattca tcagttacac tttcactgtt600cccgcaaagc caagcaaata tatggctatt tgaagacact gttttaatta ctggaaaatt660agctgatgcc aagtctcaac caagtgttca gttttcaaaa gccttaatta aacttcctga720caaccatcat attagcaacg ttactggcta tcttacagtt ctacaacagt ttttgaaagt780ggacaatttt ctgcatacaa ctggaattac tctcaataaa ccaggttttg aaaacattga840attgactcct cttgctgcaa tatgtgtgaa aatatattct ggaggaaaag aactaaaggt900caatggctct attcaagttt ctcttcctct tctacgtctg aatgatataa gtgcagggga960tcgcatacct gcttggacat ttgatatgaa cacaggtgct tgggtaaatc atggtcgggg 1020aatggtcaag gaacataaca atcatttaat ctggacatat gatgcaccac atttggggta 1080ctggatagca gctccacttc caggaactag aggttcaggt ataaatgaag attccaagga 1140cataactgcc taccacacag tgtttcttac agccatatta ggaggaacaa tagtcattgt 1200cattggattt tttgctgtac tactttgtta ttgcagggac aagtgtggta ctccacagaa 1260aagagaaaga aatatcacta aacttgaggt cctcaagaga gaccagacaa cttcaacaac 1320acacataaat catatcagta cagttaaagt tgcattaaaa gctgaggaca agtcgcagtt 1380attcaatgcc aaaaactcct catatagtcc tcagaaaaag gaaccatcaa aggcagaaac 1440agaagaaaga gtttccatgg taaaaactcg ggacgatttt aaaatctaca atgaagatgt 1500ttcatttcta tcagtcaatc aaaataatta ctcaagaaac ccaacacagt ctttggagcc 1560caatgtaggg tccaaacaac ctaaacatat taacaacaat ctatcttcat ctctaggtga 1620tgctcaagat gaaaagaggt atctcacagg taatgaggag gcgtatgggc gttcccatat 1680tcctgaacag cttatgcata tttacagcca acccattgcc atccttcaaa catctgacct 1740tttctccaca ccggaacaat tacatactgc taagtcagct actttgccaa gaaagggaca 1800gttagtctat ggccaattga tggaaccagt aaatcgagag aactttacgc agaccttgcc 1860caaaatgcca attcattctc atgcacagcc cccagatgcc agggaagagg atatcatact 1920tgaaggtcaa cagagcctgc catcccaggc ttcagattgg agccgatact caagcagctt 1980actggaatcc gtctctgttc ctggaacact aaatgaggct gttgtaatga ctccattttc 2040atcggaactt caaggaattt cagaacagac cctcctggag ctgtccaaag gaaagccctc 2100cccgcatccc agagcctggt ttgtgtctct tgatggaaag ccagttgcac aagtgaggca 2160ctcctttata gacctgaaaa agggcaagag aacccagagc aatgacacca gtctggactc 2220tggggtggac atgaatgagc ttcactcaag tagaaagctc gagagggaga aaacattcat 2280caaaagcatg catcagccca agatccttta cttagaagat ttagacctaa gcagcagtga 2340gagtggaacc accgtctgtt cccctgagga cccagcttta aggcacatcc tagatggagg 2400gagtggagtg atcatggagc accctggaga agagtcgcca ggaaggaaaa gcactgttga 2460agattttgaa gctaatacat cccccactaa aagaaggggc agaccaccac tagccaaaag 2520agatagcaag actaacatct ggaagaagcg agaggaacgc ccactgattc ccataaatta 2580actccaatgg ggattgtgtg tctgctgtct cgtgctgttt attcttgctt cttgttgtaa 2640attgcagtac gaacttaaga aaatgagact gagcaatctc atggttcttg gacatgtctc 2700aagcagagta aatggtaatt cagtaatcag agagaaagat accaaggaat gctttttctg 2760gcctattcat ttatttttgg gtgatgaatt tacagtatct aagttttcaa aatgtaaaat 2820agcttcaaga tgttagttat ctgaaaatgt tgctcagcca gccagtttgg ccttgactct 2880cttaagaata acagtgaaat atatactcct caagttgcct ccaaaaatgt tgcctctacc 2940atggtgacta ccccatggaa catttagaaa caaaactgac ttcaggcatc atattatttt 3000
aaatgttact attacgtctt cttctgccta tacttaaaaa taacttgata aatgacttgg 3060actgatgtta ctctggagtt atcacaaaga aaatgttgtt tggtctttaa agagcatgtg 3120tattgtatca tcccaaacgt aaatcctaca tttatataag atgggcaaga agctacttgg 3180tcattagaga gggagacacc agctctttgg ttgtttttgg atataacttt acaaaataag 3240taagatgtta atttagaaat ttgagaaatt aatgctctaa tactgagttt ttatttaaaa 3300attatttttt cttcccctca acaatgaagc aagcttagct gtcaagggaa actttttaca 3360aatctgaaaa aaacaatcta tgactttggt ttaaggctca ctgatacttt taggctaaat 3420tggttttaat atatttcttc tattctaaaa acctgaactc agtcacttaa aggctatgaa 3480atttaaaaaa aaagtcgatg tgaaagtttc ttttgaacac taaaataaaa tatgtgcaga 3540taaaatatac attgatttgt ttttcttaaa tgttgatgag aagaaaaaga gatgccattt 3600tcctgaggct caaaaatacc ttcaggatag ttgtatatcc agttattgat tttcttaaaa 3660gatgtgtaag gaaaacagtt tcaatttcag gggaaaagta aaagtttttc cctaagtcac 3720ttaaagcctt tgcaacttct tttttcagtt ttgtaagtaa tatatctatg ttcttttcat 3780tatagcaagc attcaatgtg aacaactttt taattaactc tgaattacca ttcatacatc 3840ctaaaaataa aagctcgtta ttcattaaaa tcaactgatc ccatttttct taaaatttcc 3900ctgaaggcaa atgtctgaag cacctttccc ttgtgggggt aaaaatccta aattgcttta 3960tttttcattc cctcctattc aacatgggag cagcatagag acccaaacca tgtaaacaag 4020ttcagtgaac caaaacagcc acattagctt cagtaaaatt atagctagat gtgcaatttt 4080ttcctccaac ttctaacgtg tcaaataacc ttcctactgt tctgtgttaa ctgaaagaac 4140ataaagaccc taggcaaata tttgctatat attaccccaa tccatagaag aaataatgtt 4200ttgggtaata cctaggcttc cttttttttt tttttttttt ttttttagtg ataaggctca 4260taacaattaa ttagagaagg cttcttattg gtcttacaca gaaagataca tcaaaagcag 4320catgactcaa aatgatttgg aaaaggttaa agttagtgct ctgctgaagt gcctttgata 4380tagacttgca ttattagaag gatataacat cttttttaag tgtgcatttt ctttcagtta 4440accaaattaa acagatgtgc agttttatta aaaatataga cctagtgttt catgttggaa 4500caataaatat tgcatgtgag tagtatttct tgttttttga atacagtata tattgataaa 4560ttgtttatgt tggaatgaag ttagaaacta tatagcaaaa cattatattt taagtgttta 4620tttttcccac ctttaaataa aaatgtttca tctcagcttg gtaatgaaat acacatattg 4680gtataagggt ataccattca ggtatgccac ttattttatt catttttgtg taagggaaat 4740gagatgatgt atcccaaggg cttttctaga actacttgtt tgctttcaga ataaaacctt 4800attatttttt acactgcaca tgctgttctc aattggtaat tataggcaat ttatcttttc 4860taatgatcaa aagagtgtga cttctcattt gtgagtagtt cacaaatttc ctgttaaaaa 4920gctgaaacca tctacttttt cttaacccaa gtgataataa acaatattca caactttctt 4980aaatttttaa attgaaaacc aaggtttttt caaatataaa cctagatgat tttggtcaca 5040aattgttaac atttgtcgat cctttgtata tactttggat atatattaaa ggcaaaacta 5100tctcttgact aactgatgga ttcatttact aaagcacagc tgtatgtatt tttgaataca 5160tattatgatc ttgagacttt ataaatcaat ttttatgact ttatgcagtt gtatagggat 5220tatgcccttt cagttctata gggattatgc ccttttataa tacataatat accacagaga 5280ttacaaatgt tgaggaatga aagcacttct ttgctttggc aatcattttc agaccactat 5340gtgtttgaat cctctggtat caatacgtat tatagggttt tagagatctg tgggtcaaat 5400gatgtccctc aaaacttcct aaaaaggtga agctcaaagt cacacattct tataaggcgc 5460atgagtttct cattttccca tgtacgagca ttgtaaagga attcagctgt attaatttct 5520atttcagatc tagaattgac attttgcctt cttgtttcca ggtgtttcta ttttttgtat 5580tctttcagag aaatctcata tttcggtgta tttattgctg ttactactat atttactgct 5640gaaaactgta acaacctgaa gatttgtaaa atgttaaaca tagttcatta aaaataataa 5700aataaatcta aaatgt 5716<210>2<211>241<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Ala Arg Leu Cys Arg Arg Val Pro Cys Thr Leu Leu Leu Gly Leu1 5 10 15Ala Val Val Leu Leu Lys Ala Arg Leu Val Pro Ala Ala Ala Arg Ala20 25 30Glu Leu Ser Arg Ser Asp Leu Ser Leu Ile Gln Gln Gln Gln Gln Gln35 40 45Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Gln Leu Glu Glu Ala50 55 60Glu Glu Glu Arg Thr Glu Val Pro Gly Ala Thr Ser Thr Leu Thr Val65 70 75 80Pro Val Ser Val Phe Met Leu Lys Val Gln Val Asn Asp Ile Ile Ser85 90 95Arg Gln Tyr Leu Ser Gln Ala Val Val Glu Val Phe Val Asn Tyr Thr100 105 110Lys Thr Asn Ser Thr Val Thr Lys Ser Asn Gly Ala Val Leu Ile Lys
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275 280 285Thr Arg Glu Asp Asp Arg His Leu Cys Leu Ala Lys Leu Asp Pro Gln290 295 300Thr Leu Asp Thr Glu Gln Gln Trp Asp Thr Pro Cys Pro Arg Glu Asn305 310 315 320Ala Glu Ala Ala Phe Val Ile Cys Gly Thr Leu Tyr Val Val Tyr Asn325 330 335Thr Arg Pro Ala Ser Arg Ala Arg Ile Gln Cys Ser Phe Asp Ala Ser340 345 350Gly Thr Leu Thr Pro Glu Arg Ala Ala Leu Pro Tyr Phe Pro Arg Arg355 360 365Tyr Gly Ala His Ala Ser Leu Arg Tyr Asn Pro Arg Glu Arg Gln Leu370 375 380Tyr Ala Trp Asp Asp Gly Tyr Gln Ile Val Tyr Lys Leu Glu Met Arg385 390 395 400Lys Lys Glu Glu Glu Val405<210>47<211>1010<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>47ggtctgggct cggggcgcgg cggcagtcag ctctatgttc gcggtcttaa cctctcctct 60ggccgagtcc ttgcaagaag tgaattaccc gaccctgcaa aacacttact attttggagt120ttaaagtatg tcatcatggc aaagtttcgg agaaggactt gcatcatttt ggcacttttt180attctattta ttttctctct gatgatgggt ttaaaaatgc tgagaccaaa tacagctact240tttggagctc cttttggact tgaccttctt ccagaacttc atcaacgaac tattcatttg300gggaaaaatt ttgatttcca aaagagtgac agaatcaaca gtgaaacaaa taccaagaat360ttaaaaagtg ttgaaatcac tatgaaacct tccaaagcct ctgaacttaa cttggatgaa420ctaccacctc tgaacaatta tctacatgta ttttattaca gttggtatgg aaatccacaa480tttgatggta aatatataca ttggaatcat ccagtgttag agcattggga ccctagaata540gccaagaatt atccacaagg gagacacaac cctccagatg acattggctc cagcttttat600cctgaattgg gaagttacag ttctcgggat ccttctgtca tagaaactca catgagacaa660atgcgctcag cttcaattgg taattattgt atatatatat atatatgtgt gtttgtgtct720gtatatatgc atataaatga ttttttgtgt aactttacta gttaattttc tcattattat780taattatatt gttaagctca tacctccaaa ttaaactgta tgtatgatct taaacatcca840ggcaaccaca ttttaacact gcccttagtg tatattgttt aatttttaca ttttggagca900tttctggata tattgttgat ttctaattta attcactttc tcaattttat taaattatga960tttacataaa atacaatgaa tttcccactt taagtttaca gctcattgat 1010<210>48<211>209<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>48Met Ala Lys Phe Arg Arg Arg Thr Cys Ile Ile Leu Ala Leu Phe Ile1 5 10 15Leu Phe Ile Phe Ser Leu Met Met Gly Leu Lys Met Leu Arg Pro Asn20 25 30Thr Ala Thr Phe Gly Ala Pro Phe Gly Leu Asp Leu Leu Pro Glu Leu35 40 45His Gln Arg Thr Ile His Leu Gly Lys Asn Phe Asp Phe Gln Lys Ser50 55 60Asp Arg Ile Asn Ser Glu Thr Asn Thr Lys Asn Leu Lys Ser Val Glu65 70 75 80Ile Thr Met Lys Pro Ser Lys Ala Ser Glu Leu Asn Leu Asp Glu Leu85 90 95Pro Pro Leu Asn Asn Tyr Leu His Val Phe Tyr Tyr Ser Trp Tyr Gly100 105 1l0Asn Pro Gln Phe Asp Gly Lys Tyr Ile His Trp Asn His Pro Val Leu115 120 125Glu His Trp Asp Pro Arg Ile Ala Lys Asn Tyr Pro Gln Gly Arg His130 135 140Asn Pro Pro Asp Asp Ile Gly Ser Ser Phe Tyr Pro Glu Leu Gly Ser145 150 155 160
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權利要求
1.一種分離的人分泌蛋白，其特征在于，該多肽含有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50的氨基酸序列。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、或50所示。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49的編碼區(qū)序列或全長序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種分泌蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出分泌蛋白。
9.一種能與權利要求1所述的人分泌蛋白特異性結合的抗體。
10.一種檢測樣品中是否存在分泌蛋白的方法，其特征在于，包括將樣品與權利要求9所述的抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在分泌蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類新的分泌蛋白，編碼分泌蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術產生這種分泌蛋白的方法。本發(fā)明還公開了編碼這類分泌蛋白的多核苷酸的用途。
文檔編號C12N15/12GK1618807SQ20031010876
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月21日 優(yōu)先權日2003年11月21日
發(fā)明者劉鋒, 曾令春, 祁小飛, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心