專利名稱：：一種靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，是關(guān)于一種微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)l,3-丙二醇的方法。
背景技術(shù)：
：1,3-丙二醇(l，3-propanediol,簡稱l，，3-PD)是一種重要的化工原料，其本身是良好的溶劑、抗凍劑、保護(hù)劑及潤滑劑，而且可以參與多種化學(xué)合成反應(yīng)，作為有機(jī)合成原料和醫(yī)藥中間體而受到廣泛的應(yīng)用。其最有潛力的應(yīng)用是與對苯二曱酸合成的聚酯(PTT)。近幾年的研究表明，PTT較之以乙二醇與對苯二甲酸合成的聚酯(PET)具有更優(yōu)良的特性，如尼龍樣的彈性恢復(fù)，在全色范圍內(nèi)無需添加特殊化學(xué)品即能呈現(xiàn)良好的連續(xù)印染特性，抗紫外、臭氧和氮氧化合物的著色性，抗內(nèi)應(yīng)力，低水吸附，低靜電以及良好的生物降解，可循環(huán)利用等。目前，生產(chǎn)l，3-PD的方法主要包括環(huán)氧乙烷羰基化法、丙烯醛水解法和微生物轉(zhuǎn)化法。其中環(huán)氧乙烷羰基化法、丙烯醛水解法屬于化學(xué)合成法，其原料主要來自石油。微生物轉(zhuǎn)化法則是以甘油、葡萄糖等可再生資源為原料，有著傳統(tǒng)石油工業(yè)所無法比擬的優(yōu)越性，符合21世紀(jì)可持續(xù)發(fā)展的需要。目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)有天然菌抹能直接利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇，只有少數(shù)細(xì)菌能直接利用甘油生產(chǎn)1，3-PD,這些菌包括克雷伯氏肺炎桿菌(i7e6i"/e/7a/we咖ao/ae)、弗氏檸檬菌(C/"o&"er以及乳桿菌屬的多豆乳沐干菌(Zac"6ac////6reK^)、布氏乳4干菌(Zac"6ac//7/力〃c力/eW),梭菌屬的丁酸梭狀芽孢桿菌(C/o"r/V/s々"r/,/c湖)以及巴氏固氮梭狀芽孢桿菌(C/M/rA/&/wWrw's/2")。其中克雷伯氏肺炎桿菌、丁酸梭狀芽孢桿菌、弗氏檸檬菌具有較高的1,3-PD轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)強(qiáng)度，是當(dāng)前研究的熱點。微生物利用甘油合成l,3-丙二醇是一個岐化代謝途徑，包括一個氧化支路和一個還原支路。氧化途徑主要有下面幾步組成(1)甘油在甘油脫氫酶(GDH)的作用下形成二羥基丙酮(DHA);(2)二羥基丙酮在二羥基丙酮激酶的作用下，生成磷酸二羥基丙酮(DHAP);(3)磷酸二羥基丙酮轉(zhuǎn)變成3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛生成磷酸烯醇丙酮酸；(4)磷酸烯醇丙酮酸代謝生成丙酮酸，丙酮酸再進(jìn)一步代謝成乙醇，乳酸，乙酸，丁酸，琥珀酸等終產(chǎn)物。還原途徑主要有兩步酶反應(yīng)組成(1)甘油脫水酶(GDHt)將甘油轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物3-鞋基丙醛(3-HPA);(2)3-羥基丙醛在1，3-PD氧化還原酶(PD0R)的作用下生成目的產(chǎn)物1，3-PD。近幾年由于石油價格的持續(xù)攀升，生物法制備l,3-丙二醇進(jìn)一步受到國人的關(guān)注。但從國內(nèi)目前的研究現(xiàn)狀來看，利用微生物發(fā)酵甘油生產(chǎn)l,3-丙二醇還存在著一些問題(1)市場上精制甘油的價格較高，甘油轉(zhuǎn)化生產(chǎn)l,3-PD與化學(xué)法比成本上不具有優(yōu)勢。而如果大量添加葡萄糖，蔗糖等廉價^渡源，由于巴斯德效應(yīng)，菌體將無法利用甘油也不能產(chǎn)l，3-PD。(2)由于細(xì)胞的生長需要消耗底物甘油，使得產(chǎn)物對甘油的轉(zhuǎn)化率難以提高。(3)底物甘油、產(chǎn)物l，3-PD，副產(chǎn)物乳酸，乙酸，丁酸，以及3-羥基丙醛等有毒中間代謝物都會對細(xì)胞的生長產(chǎn)生不利影響，使得發(fā)酵液中菌體濃度難以提高，從而產(chǎn)物濃度也普遍不高。(4)由于細(xì)菌培養(yǎng)液成分復(fù)雜導(dǎo)致產(chǎn)物分離純化困難，這些問題的解決還需要新的轉(zhuǎn)化方法的提出和改進(jìn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對微生物發(fā)酵甘油生產(chǎn)l,3-丙二醇存在的問題，提供一種新的微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)l，3-丙二醇的方法。本發(fā)明提供一種微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述微生物細(xì)胞為靜息細(xì)胞。其中，所述樣i生物選自克雷伯氏肺炎桿菌(vT/e^/e/";7"ew/z^//se)，弗氏檸檬菌(。7rMsCer/"re〃/力7J，丁酸梭狀芽孢桿菌("o^/vV/a6"/^r/c湖)，巴氏固氮梭狀芽孢桿菌(6VoW/7c^3^i"""/s/〃)，以及它們的基因工程菌。本發(fā)明所述的靜息細(xì)胞為非固定化細(xì)胞或固定化細(xì)胞，所述固定化細(xì)胞的制備過程為將靜息細(xì)胞加入熔化的瓊脂溶液中混合均勻，凝固后即制得固定化細(xì)胞。本發(fā)明所述微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的制備過程為在含甘油5-120g/L的轉(zhuǎn)化液里，加入靜息細(xì)胞5-100g/L，20-42。C轉(zhuǎn)化4-60h。根據(jù)本發(fā)明，所述轉(zhuǎn)化甘油的過程中，通入空氣或氮氣。本發(fā)明的靜息細(xì)胞通過以下方法制備將微生物菌種接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時間后低溫離心收集菌體沉淀，用磷酸緩沖液洗滌，即得到靜息細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基中含有甘油和/或非甘油碳源。根據(jù)本發(fā)明，所述非甘油碳源包括葡萄糖和蔗糖。本發(fā)明用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)l，3-丙二醇與用生長細(xì)胞發(fā)酵甘油產(chǎn)l，3-丙二醇相比具有如下優(yōu)點(1)轉(zhuǎn)化體系中加入的是靜息細(xì)胞，因此轉(zhuǎn)化過程不必?fù)?dān)心底物、產(chǎn)物以及有毒副產(chǎn)物對細(xì)胞生長的影響；(2)本發(fā)明可利用葡萄糖、蔗糖等作輔助碳源培養(yǎng)菌體，從而提高培養(yǎng)液里的菌體濃度并降低生產(chǎn)成本；(3)通常細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化甘油的條件并非完全一致，而本發(fā)明中這兩個過程是分離的，因此細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化甘油的過程可以獨立優(yōu)化以求達(dá)到各自的最適條件；(4)由于細(xì)胞生長過程會產(chǎn)生大量中間代謝物，而細(xì)胞的生長和甘油轉(zhuǎn)化分離可以簡化轉(zhuǎn)化液的成分從而利于產(chǎn)品的分離純化；(5)甘油發(fā)酵產(chǎn)1，3-PD時由于甘油不是其最適碳源，且多種產(chǎn)物副產(chǎn)物都對菌體生長有抑制，因此菌體生長緩慢，菌濃度較低，故l,3-PD產(chǎn)量也難以提高，而靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化可人為地調(diào)節(jié)和控制轉(zhuǎn)化液中菌體細(xì)胞濃度以提高產(chǎn)物1,3-PD濃度，本發(fā)明中l(wèi),3-PD濃度較用生長細(xì)胞發(fā)酵甘油產(chǎn)量最大可提高1.9倍。具體實施方式.以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明中，"靜息細(xì)胞"是指將在生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)至一定時間后的微生物細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ占⒂镁彌_液進(jìn)行洗滌，去除了營養(yǎng)成分的微生物細(xì)胞。以下實施例中，1，3-PD濃度的測定采用氣相色譜(GC)分析方法，色譜儀的操作條件如下色譜型號安捷倫6820色i普柱DB-WAX(30mx0.53mmx1.Opm)色i普工作站:Sepu3000(杭州普惠科學(xué)儀器有限公司)載氣二氮氣流速1ml/min進(jìn)樣量0.5|il分流比10:1檢測器氫火焰檢測器(FID)柱溫IO(TC保持I分鐘，然后以2(TC/min梯度升溫至22(TC進(jìn)樣口溫度250°C檢測器溫度28(TC以l，4-丁二醇為內(nèi)標(biāo)，用內(nèi)標(biāo)法定量。以下實施例中，基因工程菌的構(gòu)建方法為利用PCR技術(shù)從克雷伯氏肺炎桿菌(A7e^/e7/a;/e鵬o//ae)中擴(kuò)增出1.14kb的編碼l，3-丙二醇氧化還原酶的基因dhaT，將其連接到表達(dá)載體pKM13上，得到重組質(zhì)粒pKM13-dhaT,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化克雷伯氏肺炎桿菌(//e^/e//a/ve咖o"i'ae)ATCC25955,得到重組克雷伯氏肺炎桿菌ATCC25955/pKMl3-dhaT即為實施例中使用的基因工程菌。具體構(gòu)建過程為(1)基因dhaT的克隆根據(jù)克雷伯氏肺炎桿菌dhaT基因序列設(shè)計兩引物，其序列如下引物l:5,-TGCTCTAGAATGAGCTATCGTATGTTTGAT-3，引物2:5，-CCCAAGCTTTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT-3，以克雷伯氏肺炎桿菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因PCR反應(yīng)體系(50pl):10xGCBuffer5pl，2.5mmo1/1DNTPs4jlU，才莫板DNATaqDNAPolymerasel(il,引物l和引物2各0.lnM,雙蒸水補(bǔ)足到50pl。反應(yīng)條件95。C變性5min;95°C50s,55°C90s，72°C5min,35個循環(huán)，72°C，10min。獲得PCR產(chǎn)物電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(博大泰克)純化后，EcoRI酶切，回收其中l(wèi).14kb的片段，連接載體沐M13(PingZheng,KirstenWereath,e"/.,ProcessBiochemistry2006,41:2160—2169),獲得重組質(zhì)粒pKM13-dhaT。(2)基因的表達(dá)將重組質(zhì)粒pKM13-dhaT電轉(zhuǎn)化入克雷伯氏肺炎桿菌ATCC25955，涂布含卡那霉素平板，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，得到重組克雷伯氏肺炎桿菌ATCC25955/pKM13-dhaT。實施例l、種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基配方(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCi10,以2mol/LKOH調(diào)pH至7.0，115'C滅菌20min。取250ml三角瓶，種子培養(yǎng)基裝液量50ml,按表1所示，用接種環(huán)各接入一環(huán)斜面保藏的菌種，培養(yǎng)溫度30-37°C,通入空氣或氮氣進(jìn)行有氧或厭氧培養(yǎng)10-15h，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。所述菌種為克雷伯氏肺炎桿菌(vT/e^/e7"/we咖o/7/")ATCC25955,弗氏檸檬菌(。'"c^sc/Vey/2力'/VDSM30040,丁酸梭狀芽孢桿菌("/力'a6"0^ic腿)DSM5431，巴氏固氮梭狀芽孢桿菌("o""V/a/a^ri/h/j")DSM525，構(gòu)建的基因工程菌克雷伯氏肺炎桿菌(//e^/e/7a;we柳o/7"e)ATCC25955/pKM13—dhaT。表l、種子培養(yǎng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例2、菌體培養(yǎng)菌體培養(yǎng)基配方(g/L):KC10.75，NaH2P042H201.5,(NH4)2S042.35,Na2S040.28，MgSO廣7H200.26,檸檬酸0.62，玉米漿4.0，甘油2-80,葡萄糖/蔗糖0-15,微量元素各O.3ml,以hol/L的KOH調(diào)pH至7.0。其中所述微量元素溶液組成(g/L):ZnCl22,FeCl36H202.7,MnCl2.4H2010，CuCl2.2H200.85,CoCl2-6H2023,8，H萬0.31,Na2Mo04'2H200.25。取500ml三角瓶，培養(yǎng)基裝液量200ml，按表2所示條件，分別接入實施例1得到的種子液，接種量5-10%，培養(yǎng)溫度30-37。C,通入空氣或氮氣進(jìn)行有氧或厭氧培養(yǎng)10-18h，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。表2、菌體培養(yǎng)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例3、靜息細(xì)胞制備取實施例2獲得的培養(yǎng)液，于15-20°C,8000rpm離心5min，所得的菌體沉淀用pH7.OO的磷酸緩沖溶液洗滌三次，經(jīng)過洗滌后所得的微生物細(xì)胞即為轉(zhuǎn)化用靜息細(xì)胞。取3號樣品，制成瓊脂凝膠固定化細(xì)胞，具體如下稱取2.0g瓊脂于100ml小燒杯中，加水50ml,火上加熱熔化后，冷卻至5(TC左右，加入12g上述制得的靜息細(xì)胞，混合均勻，倒入平皿中，充分凝固后切成大小為3x3x3mm3的塊狀，去離子水洗滌3次，制得轉(zhuǎn)化用固定化靜息細(xì)胞。實施例4、靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)l，3-PD如表3所示，于IOOOml三角瓶裝入5-120g/L的甘油溶液200ml,加入實施例3得到的靜息細(xì)胞或固定化靜息細(xì)胞5-100g/L，200r/min振蕩,20-42。C，通入空氣或氮氣進(jìn)行有氧或厭氧轉(zhuǎn)化4-60h,12000rpm離心5min,取上清液測定l,3-PD濃度，結(jié)果見表3。表3、靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)l，3-PD<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例5、生長細(xì)胞批式發(fā)酵甘油生產(chǎn)l，3-PD(作為對照)發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):KC10.75，NaH2P04-2H201.5,(NH4)2S042.35，Na肌O.28，MgS047H200.26,檸檬酸0.62，玉米漿4.0，甘油5-120g/L,微量元素各O.3ml，以2mol/L的KOH調(diào)pH至7.0。其中所述微量元素溶液組成(g/L):ZnCl234.2,FeCl3.6H202.7,MnCl2.4H2010,CuCl2'21!200.85，CoCl2'6H2023,8,H3B030.31，Na2Mo04.2H200.25。取1000ml三角瓶，培養(yǎng)基裝液量200m1,按表4所示，接入按實施例l的方法得到的種子液，接種量10%,培養(yǎng)溫度20-42'C,通入空氣或氮氣進(jìn)行有氧或厭氧發(fā)酵，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。表4、生長細(xì)胞批式發(fā)酵甘油生產(chǎn)l，3-PD<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表3、表4的結(jié)果可以看出，在含有相同量甘油的情況下，利用靜息細(xì)胞或由靜息細(xì)胞制得的固定化細(xì)胞生產(chǎn)的l，3-丙二醇濃度均比用生長細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)得到l，3-丙二醇的終濃度高，平均為l.5倍，最高可達(dá)L9倍，大大提高了l,3-丙二醇的得率，這是因為(1)轉(zhuǎn)化體系中加入的是靜息細(xì)胞，因此轉(zhuǎn)化過程不必考慮底物、產(chǎn)物以及有毒副產(chǎn)物對細(xì)胞生長的影響；(2)本發(fā)明中生長和轉(zhuǎn)化兩個過程是分離的，因此細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化甘油的過程可以獨立優(yōu)化以求達(dá)到各自的最適條件；(3)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化可人為地調(diào)節(jié)和控制轉(zhuǎn)化液中菌體細(xì)胞濃度以提高產(chǎn)物1，3-PD濃度；(4)本發(fā)明可利用葡萄糖、蔗糖等作輔助碳源培養(yǎng)菌體(其中需加入適量甘油誘導(dǎo)甘油代謝酶系的生成)，從而提高培養(yǎng)液里的菌體濃度并降低生產(chǎn)成本。權(quán)利要求1、一種微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，其特征在于，所述微生物細(xì)胞為靜息細(xì)胞。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述微生物選自克雷伯氏肺炎桿菌(jOoe咖o//ae)，弗氏檸檬菌(d7r幽"ei"/rei/油7入丁酸梭狀芽孢桿菌(67oWr/V/sZw///7c〃/z)，巴氏固氮梭狀芽孢桿菌("w"/cf/a/7aWr〃/a/7〃)，以及它們的基因工程菌。3、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述靜息細(xì)胞為非固定化細(xì)胞。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述靜息細(xì)胞為固定化細(xì)胞。5、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述固定化細(xì)胞的制備過程為將靜息細(xì)胞加入熔化的瓊脂溶液中混合均勻，凝固后即制得固定化細(xì)胞。6、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的過程為在含甘油5-120g/L的轉(zhuǎn)化液里，加入靜息細(xì)胞5-100g/L,20-42。C轉(zhuǎn)化4-60小時。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述制備過程中通入空氣或氮氣8、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述靜息細(xì)胞通過以下方法制備將微生物菌種接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時間后低溫離心收集菌體沉淀，用緩沖液洗滌，即得到靜息細(xì)胞。9、如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基中含有甘油和/或.非甘油碳源。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述非甘油碳源包括葡萄糖和蔗糖。全文摘要本發(fā)明公開了一種微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述微生物細(xì)胞為靜息細(xì)胞。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于轉(zhuǎn)化體系中加入的是靜息細(xì)胞，因此轉(zhuǎn)化過程不必?fù)?dān)心底物、產(chǎn)物以及有毒副產(chǎn)物對細(xì)胞生長的影響；細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化甘油的過程可以獨立優(yōu)化以求達(dá)到各自的最適條件，還可以簡化轉(zhuǎn)化液的成分從而利于產(chǎn)品的分離純化；靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化可人為地調(diào)節(jié)和控制轉(zhuǎn)化液中菌體細(xì)胞濃度以提高產(chǎn)物1，3-丙二醇的濃度。文檔編號C12P7/18GK101157939SQ200710046420公開日2008年4月9日申請日期2007年9月26日優(yōu)先權(quán)日2007年9月26日發(fā)明者張海毅,莉趙,宇鄭,馬興元,魏東芝申請人:華東理工大學(xué)