專利名稱：可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，特別涉及一種可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法。
背景技術(shù)：
聚蘋果酸(polymalic acid, PMLA)是一種具有優(yōu)良生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性的聚合物，最初由Siimada等于1969年研究一種圓弧青霉菌時(shí)發(fā)現(xiàn)。它作為一種水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、化學(xué)衍生性，聚蘋果酸可在水溶液中自發(fā)或酶促降解生成小分子L-蘋果酸，該L-蘋果酸單體可被人體吸收并無任何毒副作用。聚蘋果酸分解和燃燒后，最終產(chǎn)物是二氧化碳和水，可被植物吸收，對(duì)環(huán)境無毒無害。聚蘋果酸的諸多特性使其在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域的研究中得到日益廣泛的關(guān)注。理論研究表明，聚蘋果酸及其衍生物可望作為手術(shù)縫合線、組織工程支架材料、藥物控制釋放體系等在生物醫(yī)藥領(lǐng)域獲得重要應(yīng)用。目前已經(jīng)可以用化學(xué)合成或從特定的微生物中得到這種高分子。國(guó)內(nèi)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸一般采用的是一步發(fā)酵法或補(bǔ)料發(fā)酵法，生產(chǎn)周期為9天，最高產(chǎn)量為 37g/L ；日本采用靜息細(xì)胞法發(fā)酵，歷時(shí)5天，最高產(chǎn)量是80g/L。由于生產(chǎn)成本非常高，合成的聚蘋果酸和天然的聚蘋果酸還是比較難得到，因此提供一種高效的、低成本的可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，是該技術(shù)領(lǐng)域科研人員急需開發(fā)的新課題之一。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術(shù)的不足之處，提供一種高效可行并可降低聚蘋果酸生產(chǎn)成本，減小投資，降低成本，益于生產(chǎn)應(yīng)用的可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的實(shí)施方式如下一種可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，該方法是出芽短梗霉經(jīng)一級(jí)種子培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移到無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中， 發(fā)酵初期不控制PH，當(dāng)菌絲球出現(xiàn)后控制發(fā)酵液PH促進(jìn)聚蘋果酸的合成，然后放出發(fā)酵罐中的無菌體發(fā)酵液，后加入新鮮的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵，重復(fù)發(fā)酵次數(shù)為4-5批次；用無菌的磷酸緩沖液洗滌發(fā)酵罐中的菌體制成靜息細(xì)胞，加入無菌的無氮源發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行靜息細(xì)胞法發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸。具體實(shí)施步驟如下
(1)斜面菌種制備將出芽短梗霉TJZKBI0153接種到無菌斜面上，在恒溫培養(yǎng)48-60h，直至出現(xiàn)黑色孢子；斜面培養(yǎng)基組成包括，單位IL 馬鈴薯200g，葡萄糖20g， 瓊脂20g，用蒸餾水定容至1L，pH值5.6 ；其中所用菌種出芽短梗酶(Aureobasidium) TJZKBA10326；
(2)種子液制備挑取一環(huán)上述的出芽短梗霉TJZKBI0153斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，在培養(yǎng)48-60h后出現(xiàn)3-5mm菌絲球，用2_6層無菌紗布過濾除去菌絲球獲得濾液即種子液，種子液濃度為IO6-IO7個(gè)/mL ；種子培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖，碳源濃度為6%-8% ； 有機(jī)氮源為玉米漿、酵母粉、蛋白胨、玉米漿粉中的一種或其兩種以上的組合物，無機(jī)氮源為丁二酸銨，總氮源濃度為0. 35%-0. 5% ；種子培養(yǎng)基中含有鋅、鎂、鉀無機(jī)鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽，使用量分別為5mg/L-0. 5g/L，添加合成聚蘋果酸的前體物質(zhì)為丁二酸、馬來酸的一種或兩種的組合，總使用量為0. 2-0. 5%，115°C、15min滅菌；500ml規(guī)格的搖瓶裝液量是100ml，轉(zhuǎn)速為200-230rpm ；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌5L發(fā)酵罐中加入2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，115°C、15min滅菌后， PH5. 0-5.5，冷卻至觀-301后備用；發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖，碳源濃度為12%-16%; 有機(jī)氮源為玉米漿、酵母粉、蛋白胨、玉米漿粉中的一種或其兩種以上的組合物，無機(jī)氮源為丁二酸銨，總氮源濃度為0. 35%-0. 5% ；發(fā)酵培養(yǎng)基中含有鋅、鎂無機(jī)鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽，使用量分別為5mg/L-0. lg/L，添加合成聚蘋果酸的前體物質(zhì)為丁二酸、馬來酸的一種或兩種的組合，總使用量為0. 2-0. 5% ；
(4)發(fā)酵上述種子液用于接種至滅菌后的5L發(fā)酵罐中，接種量為8%-12%，發(fā)酵前期的 12-16h不控制發(fā)酵液的pH，直至有直徑為3mm-5mm的菌絲球長(zhǎng)出，后通過連續(xù)流加質(zhì)量濃度為5%-10%Na0H無菌溶液控制發(fā)酵液pH5. 0-5. 5，控制整個(gè)發(fā)酵過程中的溫度為^_30°C， 通氣量為3-3. 5L/min,發(fā)酵4 后每隔2_4h檢測(cè)發(fā)酵中葡萄糖的含量；
(5)放料、加料發(fā)酵55-60h后，取樣測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為8-10g/L時(shí)，從發(fā)酵罐中放出發(fā)酵液，然后加入3L新鮮的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵，發(fā)酵4-5批次以后， 菌體產(chǎn)酸能力下降，消耗氫氧化鈉的能力明顯減弱，停止發(fā)酵；
(6)靜息細(xì)胞制備發(fā)酵結(jié)束放出全部發(fā)酵液后用無菌的0.1-0. 2mol/L pH7. 0磷酸緩沖液洗滌菌體兩次，制成靜息細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液為鈉鹽或鉀鹽的磷酸鹽緩沖液；
(7)靜息細(xì)胞發(fā)酵將2.5L無氮源發(fā)酵培養(yǎng)液添加到5L發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度 280C -30°C，通氣量為3-3. 5L/min，待pH下降到4. 8-5. 0后通過連續(xù)流加NaOH控制發(fā)酵液的PH值至5. 0-5. 5 ；發(fā)酵4 后每隔2-4h檢測(cè)發(fā)酵中葡萄糖的含量，至發(fā)酵液中葡萄糖濃度為8-10g/L，結(jié)束發(fā)酵；靜息細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖，碳源濃度為12%-16% ；靜息細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基中含有鋅、鎂無機(jī)鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽，使用量分別為5mg/L-0. Ig/ L,溶劑為0. 1-0. 2mol/L pH7. 0的鈉鹽或鉀鹽的磷酸鹽緩沖液，此培養(yǎng)基經(jīng)115°C、15min滅菌；
(8)聚蘋果酸的提取發(fā)酵液使用截留分子量為6000Da的中空纖維膜過濾，濾液用等體積的無水乙醇沉淀，烘干稱重，得到聚蘋果酸的產(chǎn)量為50-57g/L。 本發(fā)明的有益效果是一次制種可維持5個(gè)發(fā)酵批次，有效減短了發(fā)酵過程中的制種時(shí)間，比普通發(fā)酵的時(shí)間減少了至少180小時(shí)，提高了設(shè)備的利用率；在第一次發(fā)酵后可制成靜息細(xì)胞，減省了氮源的使用，降低了產(chǎn)品的生產(chǎn)成本；本發(fā)明采用發(fā)酵一段時(shí)間后加入碳酸鈣的方法，可使菌體在合適濃度范圍中最大程度的增殖，從而達(dá)到提高發(fā)酵產(chǎn)量的目的。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，效果非常顯著；使發(fā)酵效率提高了 30%，同時(shí)降低成本35%，產(chǎn)量比采用普通發(fā)酵的產(chǎn)量提高了 46%。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
詳述如下 實(shí)施例1
(1)斜面菌種制備按以下配比制備斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯200g/L， 葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L，
用10%氫氧化鈉調(diào)pH至5. 6 ； 115°CU5min滅菌制成斜面后，從平板上挑取單菌落劃線接種，即將出芽短梗霉TJZKBI0153接種到無菌斜面上，在30°C恒溫培養(yǎng)48h，出現(xiàn)黑色孢子。(2)種子液制備按以下配比制備種子培養(yǎng)基 葡萄糖60g/L，
丁二酸銨3g/L， 玉米漿0. 5g/L， 丁二酸2g/L， 磷酸二氫鉀0. lg/L, 碳酸鈉0. 4g/L， 硫酸鎂:0. lg/L, 硫酸鋅0. 005g/L,
用10%氫氧化鈉調(diào)pH至5. 0，115°C、15min滅菌，降至30°C時(shí)，挑取一環(huán)上述的出芽短梗霉TJZKBI0153斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，500mL規(guī)格三角瓶裝液量為IOOmL,培養(yǎng)溫度 300C，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)48h，出現(xiàn)3mm菌絲球。用滅菌的6層紗布過濾到無菌容器中，得到種子液待用。種子液的菌濃為IO6個(gè)/mL。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌
發(fā)酵罐容量為5L，裝液量為2. 5L，按照如下配比制備發(fā)酵培養(yǎng)基
葡萄糖120g/L，
丁二酸銨3g/L，
玉米漿0. 5g/L，
丁二酸2g/L，
硫酸鎂:0. lg/L,
硫酸鋅0. 005g/L,
用5%鹽酸調(diào)至pH至5. 0，115°C、15min滅菌，降至30°C備用。(4)發(fā)酵
按照10%接種量接入種子液開始發(fā)酵，控制整個(gè)發(fā)酵過程中的溫度為30°C，通氣量為 3L/min。發(fā)酵前的IMi不控制發(fā)酵液的pH，直至有直徑3mm的菌絲球長(zhǎng)出，后通過連續(xù)流加質(zhì)量濃度為5%Na0H無菌溶液控制發(fā)酵液pH5.0，發(fā)酵4 后每隔2h檢測(cè)發(fā)酵中葡萄糖的含量。(5)放料、加料發(fā)酵60h后，取樣測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為10g/L，停止發(fā)酵，從發(fā)酵罐中放出發(fā)酵液。然后加入2. 5L新鮮的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵，發(fā)酵4批次以后，菌體產(chǎn)酸能力下降，消耗氫氧化鈉的能力明顯減弱，停止發(fā)酵。(6)靜息細(xì)胞制備
第一次發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵罐中放出發(fā)酵液，用無菌的0. lmol/L pH7. 0磷酸鈉緩沖液洗滌菌體兩次，制成靜息細(xì)胞。(7)靜息細(xì)胞發(fā)酵
發(fā)酵罐容量為5L，裝液量為2. 5L，按照如下配比制備靜息細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基
葡萄糖120g/L，
丁二酸2g/L，
硫酸鎂:0. lg/L，
硫酸鋅0. 005g/L,
用0. lmol/L ρΗ7· 0磷酸鉀緩沖液定容至1L，115°C、15min滅菌，降至30°C時(shí)補(bǔ)加到發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制整個(gè)發(fā)酵過程中的溫度為30°C，通氣量為3. OL/min。待pH下降到 5. 0后通過連續(xù)流加NaOH控制發(fā)酵液的pH值至5. 0 ；發(fā)酵4 后每隔池檢測(cè)發(fā)酵液中葡萄糖的含量，發(fā)酵60h后發(fā)酵液中葡萄糖濃度為10g/L，結(jié)束發(fā)酵。(8)聚蘋果酸的提取
發(fā)酵液使用截留分子量為6000Da的中空纖維膜過濾，濾液用等體積的無水乙醇沉淀， 烘干稱重，平均每批次得到聚蘋果酸的產(chǎn)量為50g/L。具體制備中
從種子液到發(fā)酵罐的接種量為8%-12% v/v，菌種濃度為IO6-IO7個(gè)/mL。所述種子培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖，碳源濃度為6%_8% ；所述種子培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源為玉米漿、酵母粉、蛋白胨、玉米漿粉中的一種或其兩種以上的任意配比組合物，無機(jī)氮源為丁二酸銨，總氮源濃度為0. 35%-0. 5% ；所述種子培養(yǎng)基中含有鋅、鎂、鉀無機(jī)鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽，使用量分別為5mg/L-0. 5g/L，添加合成聚蘋果酸的前體物質(zhì)為丁二酸、馬來酸的一種或兩種的組合，總使用量為0. 2-0. 5%，此培養(yǎng)基經(jīng)115°C、 15min 滅菌后，pH5. 0-5. 5，冷卻至。所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖，碳源濃度為12%_16%;所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有鋅、鎂無機(jī)鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽，使用量分別為5mg/L-0. lg/L，添加合成聚蘋果酸的前體物質(zhì)為丁二酸、馬來酸的一種或兩種的組合，總使用量為0. 2-0. 5%，此培養(yǎng)基經(jīng) 115°C、15min 滅菌后，pH5. 0-5. 5，冷卻至。所述的發(fā)酵前期的12-1 !不控制發(fā)酵液的pH，直至有直徑為3mm-5mm的菌絲球長(zhǎng)出，后通過連續(xù)流加質(zhì)量濃度為5%-10%Na0H無菌溶液控制發(fā)酵液pH5. 0-5. 5。所述的發(fā)酵時(shí)間55_60h，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度為8-10g/L時(shí)開始放料，放出全部的發(fā)酵液后重新加入新鮮無菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，所述的發(fā)酵是在發(fā)酵液PH降至 4. 8-5. 0，后通過連續(xù)流加質(zhì)量濃度為5%-10%Na0H無菌溶液控制發(fā)酵液pH5. 0-5. 5的條件下重復(fù)發(fā)酵，所述的重復(fù)發(fā)酵次數(shù)為4-5批次。所述的靜息細(xì)胞的制備是在第一次發(fā)酵結(jié)束放出全部發(fā)酵液后，用0. 1-0. 2mol/L pH7. 0的磷酸緩沖液洗滌菌體1-2次，所述的磷酸鹽緩沖液為鈉鹽或鉀鹽的磷酸鹽緩沖液。
所述的靜息細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖，碳源濃度為12%_16% ；所述的靜息細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基中含有鋅、鎂無機(jī)鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽，使用量分別為5mg/L-0. lg/L， 溶劑為0. 1-0. 2mol/L pH7. 0的鈉鹽或鉀鹽的磷酸鹽緩沖液，此培養(yǎng)基經(jīng)115°C、15min滅菌后，ρΗ7· 0，冷卻至 28-30 0C ο實(shí)施例2 (1)斜面菌種制備
按以下配比制備斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯200g/L， 葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L，
用10%氫氧化鈉調(diào)pH至5. 6 ；115°C、15min滅菌制成斜面后，從平板上挑取單菌落劃線接種，在恒溫培養(yǎng)60h，出現(xiàn)黑色孢子。(2)種子液制備按以下配比制備種子培養(yǎng)基 葡萄糖80g/L，
丁二酸銨3. 5g/L， 蛋白胨1.5g/L， 馬來酸5g/L， 磷酸二氫鉀0. lg/L, 碳酸鈉0. 4g/L， 硫酸鎂:0. lg/L, 硫酸鋅0. 005g/L,
用10%氫氧化鈉調(diào)pH至5. 5，115°C、15min滅菌，降至?xí)r，接入斜面菌種，500mL規(guī)格三角瓶裝液量為IOOmL,培養(yǎng)溫度，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為230rpm，培養(yǎng)60h，出現(xiàn)5mm菌絲球。用滅菌的6層紗布過濾到無菌容器中，得到種子液待用。種子液的菌濃為IO7個(gè)/mL。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌
發(fā)酵罐容量為5L，裝液量為2. 5L，按照如下配比制備發(fā)酵培養(yǎng)基
葡萄糖160g/L，
丁二酸銨3. 5g/L，
蛋白胨1.5g/L，
馬來酸5g/L，
硫酸鎂:0. lg/L,
硫酸鋅0. 005g/L,
用5%鹽酸調(diào)至pH至5. 5，115°C、15min滅菌，降至備用。(4)發(fā)酵
按照1 接種量接入種子液開始發(fā)酵，控制整個(gè)發(fā)酵過程中的溫度為^°c，通氣量為 3. 5L/min。發(fā)酵前的1 不控制發(fā)酵液的pH，直至有直徑5mm的菌絲球長(zhǎng)出，后通過連續(xù)流加質(zhì)量濃度為10%Na0H無菌溶液控制發(fā)酵液pH5. 5，發(fā)酵4 后每隔4h檢測(cè)發(fā)酵中葡萄糖的含量。
(5)放料、加料
發(fā)酵5 后，取樣測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為8g/L，停止發(fā)酵，從發(fā)酵罐中放出發(fā)酵液。然后加入2. 5L新鮮的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵，發(fā)酵5批次以后，菌體產(chǎn)酸能力下降，消耗氫氧化鈉的能力明顯減弱，停止發(fā)酵。(6)靜息細(xì)胞制備
第一次發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵罐中放出發(fā)酵液，用無菌的0. 2mol/L pH7. 0磷酸鈉緩沖液洗滌菌體兩次，制成靜息細(xì)胞。(7)靜息細(xì)胞發(fā)酵
發(fā)酵罐容量為5L，裝液量為2. 5L，按照如下配比制備靜息細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基
葡萄糖160g/L，
丁二酸2g/L，
硫酸鎂:0. lg/L，
硫酸鋅0. 005g/L,
用0. 2mol/L ρΗ7· 0磷酸鉀緩沖液定容至1L，115°C、15min滅菌，降至30°C時(shí)補(bǔ)加到發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制整個(gè)發(fā)酵過程中的溫度為^°C，通氣量為3. OL/min。待pH下降到 5. O后通過連續(xù)流加NaOH控制發(fā)酵液的pH值至5. 5 ；發(fā)酵4 后每隔4h檢測(cè)發(fā)酵液中葡萄糖的含量，發(fā)酵5 后發(fā)酵液中葡萄糖濃度為8g/L，結(jié)束發(fā)酵。(8)聚蘋果酸的提取
發(fā)酵液使用截留分子量為6000Da的中空纖維膜過濾，濾液用等體積的無水乙醇沉淀， 烘干稱重，平均每批次得到聚蘋果酸的產(chǎn)量為57g/L。其它同實(shí)施例1。實(shí)施例3 (1)斜面菌種制備
按以下配比制備斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯200g/L， 葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L，
用10%氫氧化鈉調(diào)pH至5. 6 ；115°C、15min滅菌制成斜面后，從平板上挑取單菌落劃線接種，在30°C恒溫培養(yǎng)50h，出現(xiàn)黑色孢子。(2)種子液制備按以下配比制備種子培養(yǎng)基 葡萄糖80g/L，
丁二酸銨3. Og/L, 蛋白胨0. 5g/L， 丁二酸2g/L， 磷酸二氫鉀0. lg/L, 碳酸鈉0. 4g/L， 硫酸鎂:0. lg/L, 硫酸鋅0. 005g/L,用10%氫氧化鈉調(diào)pH至5. 3，115°C、15min滅菌，降至30°C時(shí)，接入斜面菌種，500mL規(guī)格三角瓶裝液量為IOOmL,培養(yǎng)溫度30°C，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng)50h，出現(xiàn)4mm菌絲球。用滅菌的2層紗布過濾到無菌容器中，得到種子液待用。種子液的菌濃為IO6個(gè)/mL。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌
發(fā)酵罐容量為5L，裝液量為2. 5L，按照如下配比制備發(fā)酵培養(yǎng)基
葡萄糖160g/L，
丁二酸銨3. Og/L,
蛋白胨0. 5g/L，
丁二酸2g/L，
硫酸鎂:0. lg/L，
硫酸鋅0. 005g/L,
用5%鹽酸調(diào)至pH至5. 3，115°C、15min滅菌，降至30°C備用。(4)發(fā)酵
按照10%接種量接入種子液開始發(fā)酵，控制整個(gè)發(fā)酵過程中的溫度為30°C，通氣量為 3. OL/min。發(fā)酵前的IMi不控制發(fā)酵液的pH，直至有直徑4mm的菌絲球長(zhǎng)出，后通過連續(xù)流加質(zhì)量濃度為10%Na0H無菌溶液控制發(fā)酵液pH5. 3，發(fā)酵4 后每隔4h檢測(cè)發(fā)酵中葡萄糖的含量。(5)放料、加料
發(fā)酵5 后，取樣測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為8g/L，停止發(fā)酵，從發(fā)酵罐中放出發(fā)酵液。然后加入2. 5L新鮮的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵，發(fā)酵4批次以后，菌體產(chǎn)酸能力下降，消耗氫氧化鈉的能力明顯減弱，停止發(fā)酵。(6)靜息細(xì)胞制備
第一次發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵罐中放出發(fā)酵液，用無菌的0. 2mol/L pH7. 0磷酸鈉緩沖液洗滌菌體兩次，制成靜息細(xì)胞。(7)靜息細(xì)胞法發(fā)酵
發(fā)酵罐容量為5L，裝液量為2. 5L，按照如下配比制備靜息細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基
葡萄糖120g/L，
丁二酸2g/L，
硫酸鎂:0. lg/L,
硫酸鋅0. 005g/L,
用0. lmol/L ρΗ7· 0磷酸鉀緩沖液定容至1L，115°C、15min滅菌，降至30°C時(shí)補(bǔ)加到發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制整個(gè)發(fā)酵過程中的溫度為30°C，通氣量為3. OL/min。待pH下降到 5. 0后通過連續(xù)流加NaOH控制發(fā)酵液的pH值至5. 3 ；發(fā)酵4 后每隔4h檢測(cè)發(fā)酵液中葡萄糖的含量，發(fā)酵60h后發(fā)酵液中葡萄糖濃度為8g/L，結(jié)束發(fā)酵。(8)聚蘋果酸的提取
發(fā)酵液使用截留分子量為6000Da的中空纖維膜過濾，濾液用等體積的無水乙醇沉淀， 烘干稱重，得到聚蘋果酸的產(chǎn)量為^g/L。其它同實(shí)施例1。在上述發(fā)酵條件范圍內(nèi)，不同的發(fā)酵條件對(duì)聚蘋果酸的產(chǎn)量影響不大，平均每批次可發(fā)酵得到Mg/L的聚蘋果酸，一次制種平均可得發(fā)酵液10L，發(fā)酵效率比分批發(fā)酵效率提高30%。 上述參照實(shí)施例對(duì)用可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可根據(jù)所限定范圍例舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，其特征在于具體實(shí)施步驟如下(1)斜面菌種制備將出芽短梗霉TJZKBI0153接種到無菌斜面上，在觀-30°C恒溫培養(yǎng) 48-60h，直至出現(xiàn)黑色孢子；(2)種子液制備挑取一環(huán)出芽短梗霉TJZKBI0153斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，在培養(yǎng)48-60h后，用無菌紗布過濾菌絲體獲得濾液即種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌5L發(fā)酵罐中加入2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，115°CU5min滅菌后冷卻至 28-30 0C ；(4)發(fā)酵發(fā)酵前期不控制發(fā)酵液pH，直至有菌絲球出現(xiàn)后連續(xù)流加NaOH控制發(fā)酵液的pH值至5. 0-5. 5，控制整個(gè)發(fā)酵過程中的溫度為28-30°C，通氣量為3_3. 5L/min,發(fā)酵 48h后每隔2-4h檢測(cè)發(fā)酵中葡萄糖的含量；(5)放料、加料發(fā)酵55-60h后，取樣測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為8-10g/L時(shí)，從發(fā)酵罐中放出發(fā)酵液，然后加入2. 5L新鮮的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵；(6)靜息細(xì)胞制備發(fā)酵結(jié)束放出全部發(fā)酵液后用無菌的磷酸緩沖液洗滌菌體兩次，制成靜息細(xì)胞；(7)靜息細(xì)胞發(fā)酵將2.5L無氮源發(fā)酵培養(yǎng)液添加到5L發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度 280C -300C，通氣量為3-3. 5L/min,待pH下降到4. 8-5. 0后通過連續(xù)流加NaOH控制發(fā)酵液的pH值至5. 0-5. 5發(fā)酵4 后每隔2-4h檢測(cè)發(fā)酵中葡萄糖的含量，至發(fā)酵液中葡萄糖濃度為8-10g/L，結(jié)束發(fā)酵；(8)聚蘋果酸的提取發(fā)酵液使用截留分子量為6000Da的中空纖維膜過濾，濾液用等體積的無水乙醇沉淀，烘干稱重，得到聚蘋果酸的產(chǎn)量為50-57g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，其特征在于從種子液到發(fā)酵罐的接種量為8%-12% v/v，菌種濃度為IO6-IO7個(gè)/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖，碳源濃度為6%-8% ；所述種子培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源為玉米漿、酵母粉、蛋白胨、玉米漿粉中的一種或其兩種以上的任意配比組合物，無機(jī)氮源為丁二酸銨，總氮源濃度為0. 35%-0. 5% ；所述種子培養(yǎng)基中含有鋅、鎂、鉀無機(jī)鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽，使用量分別為5mg/L-0. 5g/L，添加合成聚蘋果酸的前體物質(zhì)為丁二酸、馬來酸的一種或兩種的組合，總使用量為0. 2-0. 5%，此培養(yǎng)基經(jīng)115°C、15min滅菌后，pH5. 0-5. 5，冷卻至 ^-30°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖，碳源濃度為12%_16% ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有鋅、 鎂無機(jī)鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽，使用量分別為5mg/L-0. lg/L，添加合成聚蘋果酸的前體物質(zhì)為丁二酸、馬來酸的一種或兩種的組合，總使用量為0. 2-0. 5%，此培養(yǎng)基經(jīng)115°C、15min 滅菌后，ρΗ5· 0-5. 5，冷卻至 28-30 0C ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，其特征在于所述的發(fā)酵前期的12-1 不控制發(fā)酵液的pH，直至有直徑為3mm-5mm的菌絲球長(zhǎng)出， 后通過連續(xù)流加質(zhì)量濃度為5%-10%Na0H無菌溶液控制發(fā)酵液pH5. 0-5. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，其特征在于所述的發(fā)酵時(shí)間陽(yáng)-eoh，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度為8-10g/L時(shí)開始放料，放出全部的發(fā)酵液后重新加入新鮮無菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，所述的發(fā)酵是在發(fā)酵液PH降至 4. 8-5. 0，后通過連續(xù)流加質(zhì)量濃度為5%-10%Na0H無菌溶液控制發(fā)酵液pH5. 0-5. 5的條件下重復(fù)發(fā)酵，所述的重復(fù)發(fā)酵次數(shù)為4-5批次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，其特征在于所述的靜息細(xì)胞的制備是在第一次發(fā)酵結(jié)束放出全部發(fā)酵液后，用0. 1-0. 2mol/L pH7. 0的磷酸緩沖液洗滌菌體1-2次，所述的磷酸鹽緩沖液為鈉鹽或鉀鹽的磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可制成靜息細(xì)胞的重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，其特征在于所述的靜息細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖，碳源濃度為12%-16% ；所述的靜息細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基中含有鋅、鎂無機(jī)鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽，使用量分別為5mg/L-0. lg/L，溶劑為0. 1-0. 2mol/L pH7. 0的鈉鹽或鉀鹽的磷酸鹽緩沖液，此培養(yǎng)基經(jīng)115°C、15min滅菌后， pH7. 0，冷卻至 ^-30°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可制成靜息細(xì)胞的連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，實(shí)施步驟如下(1)斜面菌種制備；(2)種子液制備；(3)上述種子液用于接種至5L無菌發(fā)酵罐中發(fā)酵；(4)發(fā)酵前期不控制pH，直至有菌絲球出現(xiàn)后連續(xù)流加NaOH控制發(fā)酵液pH為5.0-5.5；(5)發(fā)酵55-60h后，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度為8-10g/L時(shí)，停止發(fā)酵，重新添加新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵；(6)靜息細(xì)胞制備；(7)采用相同的發(fā)酵方法進(jìn)行靜息細(xì)胞法發(fā)酵；(8)發(fā)酵液用截留分子量為6000Da的中空纖維膜過濾，加入等體積的無水乙醇沉淀，烘干稱重；聚蘋果酸的產(chǎn)量為50-57g/L。該方法可有效減少發(fā)酵過程中的非最優(yōu)經(jīng)濟(jì)階段，達(dá)到了縮短發(fā)酵時(shí)間，提高設(shè)備利用率，降低產(chǎn)品生產(chǎn)成本的目的。
文檔編號(hào)C12P7/62GK102286555SQ20111020611
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者劉云, 國(guó)華, 徐勇虎, 李睿穎, 王曉瓊, 王永樂, 胡婭君, 范婷 申請(qǐng)人:天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司