一種應(yīng)用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化1,3-丙二醇為3-羥基丙酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種應(yīng)用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化1,3-丙二醇為3-羥基丙酸的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明首先利用快速篩選法篩選出一株具有高轉(zhuǎn)化性能、高生產(chǎn)能力的微生物菌株，經(jīng)鑒定為醋桿菌（Acetobacter?sp.）JDB-71，并利用該菌靜息細(xì)胞在水相體系中高效催化1,3-丙二醇為3-羥基丙酸，所得醋桿菌培養(yǎng)工藝簡單、轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)物產(chǎn)量大、轉(zhuǎn)化液成分簡單利于產(chǎn)品分離純化、轉(zhuǎn)化過程可以人為地調(diào)節(jié)菌體濃度以縮短生產(chǎn)時(shí)間，節(jié)約大量的能源和生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種應(yīng)用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化1 ’ 3-丙二醇為3-羥基丙酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應(yīng)用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化1，3_丙二醇為3-羥基丙酸的方法，尤其是以一株醋桿菌及其靜息細(xì)胞應(yīng)用于轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇為3-羥基丙酸的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid,簡稱3-HP),又名β_羥基丙酸,與乳酸互為同分異構(gòu)體，因其碳鏈兩端分別具有一個(gè)羥基和羧基，是一種具有很高價(jià)值的化學(xué)中間體，如通過羧基還原可得到醇或醛，與醇反應(yīng)得到酯或轉(zhuǎn)化為酰胺及其衍生物，通過羥基氧化得到醛或二酸，脫水轉(zhuǎn)化為不飽和化合物，聚合得到生物可降解高分子材料等，此外，Schwarz等的研究數(shù)據(jù)顯示3-羥基丙酸能夠殺死寄生于植物內(nèi)的線蟲(M.1ncognita)且不會誘導(dǎo)其產(chǎn)生耐藥性，正因?yàn)槠渚哂羞@么多潛在的價(jià)值，美國能源部將其列為最具潛力的化工產(chǎn)品之一。
[0003]目前3-羥基丙酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和微生物轉(zhuǎn)化法。傳統(tǒng)的3-羥基丙酸化學(xué)合成法是將3-羥基丙腈(氰化鉀與鄰鹵代醇反應(yīng))水解。此外，沈長洲等在1995年報(bào)道了丙烯酸高溫水合法生產(chǎn)3-羥基丙酸。Haas等1998年提出3-HPA鉬金催化法生產(chǎn)3-羥基丙酸。2000年Ishida等提出一種丙烯酸固體酸水合法，該方法以ZSMSzeolite為催化劑?；瘜W(xué)合成法在碳末端引入功能團(tuán)有很大的難度，副反應(yīng)多、工藝要求較高、副產(chǎn)物較多不易分離提純，生產(chǎn)成本較高，操作復(fù)雜，生產(chǎn)過程存在不安全因素，產(chǎn)量較低。
[0004]微生物發(fā)酵法主要是通過基因工程的方法構(gòu)建工程菌，其主要的策略有兩種:以葡萄糖為底物的生產(chǎn)途徑和以甘油為底物的生產(chǎn)途徑，但是發(fā)酵法具有菌種不穩(wěn)定、生產(chǎn)周期長、產(chǎn)物提純過程繁瑣、轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)量低、產(chǎn)品純度低、含有相當(dāng)量的3-羥基丙酸醚鍵二聚體等不足。
[0005]在上世紀(jì)60年代，已開始了微生物轉(zhuǎn)化法制備3-羥基丙酸的研究。Harada等研究Hansenula miso菌時(shí)首次發(fā)現(xiàn)該菌株可以通過氧化1，3-丙二醇得到3-羥基丙酸；Miyoshi等在研究Fusarium merismoides菌時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌可以利用丙酸羥基化來生產(chǎn)3_羥基丙酸；Hasegawa等發(fā)現(xiàn)一株不積累丙酸的突變株Candida rugosa能以2%丙酸為底物生產(chǎn)3-羥基丙酸,產(chǎn)率達(dá)89% ；Takamizawa等利用微生物轉(zhuǎn)化丙烯酸生產(chǎn)3_羥基丙酸，在7%丙烯酸和2%葡萄糖培養(yǎng)基中，以氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH，經(jīng)過Ild的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化，得到4.8%的3-羥基丙酸。
[0006] 本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于提供了一株高轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇性能、高生產(chǎn)3-羥基丙酸能力的醋桿菌(Acetobacter sp.),并首次報(bào)道了利用利用其靜息細(xì)胞催化1，3_丙二醇轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸的方法，具有微生物培養(yǎng)工藝簡單、轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)物產(chǎn)量大、轉(zhuǎn)化液成分簡單，以3-羥基丙酸為主要成分，其他成分含量較少，利于產(chǎn)品分離純化、轉(zhuǎn)化過程可以人為地調(diào)節(jié)菌體濃度以縮短生產(chǎn)時(shí)間，節(jié)約大量的能源和生產(chǎn)成本，利于推廣。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的第一個(gè)問題是提供一株新的醋桿菌(Acetobacter sp.),于2013年9月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，保藏編號為CGMCC N0.8142。
[0008]所述醋酸桿菌是從不同地域采集到的土壤中篩選得到，能夠以1，3-丙二醇為底物高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)3-羥基丙酸。
[0009]本發(fā)明要解決的第二個(gè)問題是提供一種利用醋桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇為
3-羥基丙酸的方法，是利用所述醋桿菌，在水相體系中，以1，3-丙二醇為底物進(jìn)行生物催化反應(yīng)生產(chǎn)3-羥基丙酸，具體步驟如下:
[0010](I)菌株的培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10-100，酵母膏1-10，蛋白胨1-10，PH3-10 ;培養(yǎng)溫度20-40°C ;搖床轉(zhuǎn)速100-300rpm ;培養(yǎng)時(shí)間1_3天，將發(fā)酵液離心獲得菌體。
[0011](2)催化反應(yīng)體系的建立:菌體經(jīng)兩次洗滌后用緩沖液配制成一定pH (3-10)的菌體懸浮液，菌體濃度2-50g/L，加入終濃度為l-100g/L的1，3-丙二醇，進(jìn)行單一水相催化反應(yīng)，催化溫度20-40°C，搖床轉(zhuǎn)速100-300rpm，催化時(shí)間l_72h。所述緩沖液可以是檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液或磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；所用緩沖液體系濃度為0.05-0.5mol/L ；pH范圍在3_10。
[0012](3)轉(zhuǎn)化液的處理與分析:微生物催化后的反應(yīng)液經(jīng)離心去除菌體后，反應(yīng)液經(jīng)
0.22 um的水相濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。
[0013]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明首先通過快速篩選技術(shù)篩選到了一株具有高轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇性能、高生產(chǎn)3-羥基丙酸能力的醋桿菌(Acetobacter sp.)JDB_71。在水相體系中高效的轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇為3-羥基丙酸，在l_50g底物濃度范圍內(nèi)，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率高達(dá)85%以上，利用該菌株靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法培養(yǎng)工藝簡單、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化液成分簡單，以3-羥基丙酸為主要成分，其他成分較少，利于產(chǎn)品分離純化、產(chǎn)物產(chǎn)量大、轉(zhuǎn)化時(shí)間短、轉(zhuǎn)化過程可以人為地調(diào)節(jié)菌體濃度以縮短生產(chǎn)時(shí)間，節(jié)約大量的能源和生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1:3_羥基丙酸標(biāo)樣液相色譜圖
[0015]圖2:靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化液液相色譜圖
[0016]圖3:3_羥基丙酸標(biāo)樣質(zhì)譜圖
[0017]圖4:靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化液質(zhì)譜圖
[0018]圖5:不同1，3-丙二醇濃度下3-羥基丙酸的產(chǎn)量，▲:轉(zhuǎn)化率
[0019]圖6 ;不同pH對初始催化速率的影響
[0020]圖7:不同催化溫度對初始催化速率的影響
[0021]圖8:不同菌體濃度對初始催化速率的影響
【具體實(shí)施方式】[0022]實(shí)施例1高轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇性能、高生產(chǎn)3-羥基丙酸能力微生物菌株的篩選
[0023]富集培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨2。
[0024]平板篩選培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母膏5，瓊脂20，CaC0310 (單獨(dú)滅菌后加入),無水乙醇30 (培養(yǎng)基滅菌完成后加入)。
[0025]種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨2，ρΗ6.0。
[0026]分析方法:通過HPLC進(jìn)行3-羥基丙酸的檢測，色譜柱:B10RAD ΗΡΧ-87Η色譜柱；流動相0.005mol/L濃硫酸；流速0.6mL/min ;檢測溫度60°C ;檢測波長210nm。
[0027]將采集到的不同地域土壤加入到含有玻璃珠的無菌生理鹽水中震蕩Ih后靜置取上清液加入富集培養(yǎng)基中進(jìn)行靜置培養(yǎng)2-4天，待培養(yǎng)基表面長出菌膜后取一定量的菌膜再次接種富集培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行梯度稀釋然后涂布到平板篩選培養(yǎng)基上，20-40°C培養(yǎng)2-4天挑取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的單菌落進(jìn)行催化驗(yàn)證。
[0028]將篩選得到的單菌落接入種子培養(yǎng)基(50mL/250mL)中，30°C，220rpm培養(yǎng)16h后，以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，220rpm培養(yǎng)48h后，離心獲得菌體，將菌體用PH6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，用pH6.0的磷酸鹽緩沖液將菌體懸浮，制成菌體濃度5g/L的菌懸液，加入一定量的底物1，3-丙二醇，使其終濃度為10g/L，在30°C，220rpm下催化24h內(nèi)取樣，轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心去除菌體，0.22 μ m的水相濾膜過濾后進(jìn)行HPLC和質(zhì)譜檢測。
[0029]經(jīng)過HPLC檢測 得到3-羥基丙酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間在13.057min左右(附圖1)，轉(zhuǎn)化液經(jīng)HPLC在相同條件下檢測發(fā)現(xiàn)中存在很明顯的峰，出峰時(shí)間在13.051min左右(附圖
2)，與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間很吻合。將3-羥基丙酸的標(biāo)準(zhǔn)品與轉(zhuǎn)化液進(jìn)行HPLC-MS檢測，比較質(zhì)樸圖發(fā)現(xiàn)兩者存在相同的m/z=89特征峰(附圖3、4)由此可以判斷篩選得到的菌株具有轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇為3-羥基丙酸的能力。
[0030]經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，3-HP的產(chǎn)量在9.5g/L左右，轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%，篩選到一株具有高轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇性能、高生產(chǎn)3-羥基丙酸能力微生物菌株，該菌株經(jīng)鑒定為醋桿菌(Acetobacter sp.),現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為 CGMCCN0.8142。
[0031]實(shí)施例2不同底物濃度對轉(zhuǎn)化的影響
[0032]將在發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)32h的菌體離心后用pH6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體兩次后，用pH6.0的磷酸鹽緩沖液將菌體懸浮，制成菌體濃度6g/L的菌懸液，加入不同量的底物1，3-丙二醇，使其終濃度分別為 10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L，在 30°C，220rpm 下催化72h內(nèi)取樣，轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心去除菌體，0.22um的水相濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測其產(chǎn)量，其產(chǎn)量可以分別達(dá)到9.6g/L、18.9g/L、27.7g/L、35.9g/L、45.5g/L，轉(zhuǎn)化率均在90%以上(附圖5)。
[0033]實(shí)施例3不同初始pH對轉(zhuǎn)化的影響
[0034]將在發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)32h的菌體離心后分別用ρΗ4.0、ρΗ4.5、ρΗ5.0、ρΗ5.5、ρΗ6.0、ρΗ6.5、ρΗ7.0、ρΗ7.5、ρΗ8.0的緩沖液洗滌菌體兩次后，用相應(yīng)pH的緩沖液將菌體懸浮，制成菌體濃度6g/L的菌懸液，加入20g/L的1，3-丙二醇，220rpm, 30°C測定經(jīng)6h催化后3-羥基丙酸的生成量作為其初始催化速率。在pH6.0左右催化速率最大，可以達(dá)到
1.lg/L*h，pH偏酸或偏堿均造成其催化速率的下降，在pH4.0左右其催化速率大約下降了40% (附圖 6)。[0035]實(shí)施例4不同培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化的影響
[0036]將在發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)32h的菌體離心后用pH6.0的磷酸緩沖液洗滌菌體兩次后，再將其制成菌體濃度6g/L的菌懸液，加入20g/L的1，3_丙二醇，220rpm，分別于20°C、25°C、30°C、35°C、40°C下測定其初始催化速率，靜息細(xì)胞最合適的催化溫度在30V左右(附圖7)。
[0037]實(shí)施例5不同菌體濃度對轉(zhuǎn)化的影響
[0038]將在發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)32h的菌體離心后用pH6.0的磷酸緩沖液洗滌菌體兩次后，再將分別制成菌體濃度分別為4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L的菌懸液，加入20g/L的1，3-丙二醇，220rpm, 30°C測定其初始催化速率。由圖8可得，在4_12g/L菌體濃度范圍內(nèi)，隨著菌體濃度的升 高，靜息細(xì)胞的初始催化速率也伴隨著升高(附圖8)。
[0039]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一株具有高轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇生產(chǎn)3-羥基丙酸能力的醋桿菌(Acetobacter sp.)JDB-71，于2013年9月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，保藏編號為CGMCC N0.8142。
2.一種利用權(quán)利要求1所述醋桿菌轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法，其特征在于，培養(yǎng)好的微生物經(jīng)離心洗滌獲得菌體后制成菌懸液，在水相緩沖液體系中，以1，3-丙二醇為底物進(jìn)行催化反應(yīng)生產(chǎn)3-羥基丙酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)醋桿菌的培養(yǎng):將醋桿菌種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，20-40°C培養(yǎng)時(shí)間1-2天； (2)靜息細(xì)胞催化反應(yīng):將發(fā)酵培養(yǎng)24-48h的菌體離心后洗滌兩次，用緩沖液重新懸浮制成一定菌體濃度的菌懸液，加入I, 3-丙二醇,在20-4011C和100-300rpm搖床轉(zhuǎn)速下進(jìn)行催化反應(yīng)l_72h，轉(zhuǎn)化反應(yīng)完成后轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心去除菌體，取上清液經(jīng)0.22 μ m水相濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源至少為葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨糖醇、甘露醇、甘油中的一種；所述發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的濃度為10-100g/L，酵母膏 l-10g/L，蛋白胨 l-10g/L，pH3-10。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的緩沖液可以是檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；所用緩沖液體系濃度為0.05-0.5mol/L ；pH范圍在3-10。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌懸液濃度為2-50g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述底物1，3-丙二醇終濃度為1-1OOg/L0
【文檔編號】C12N1/20GK103525727SQ201310468917
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】諸葛斌, 吳金鑫, 宗紅, 陸信曜, 宋健, 方慧英, 諸葛健 申請人:江南大學(xué)