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通過(guò)破壞病毒衣殼-間隔肽1蛋白的加工而抑制hiv-1復(fù)制的制作方法

文檔序號(hào):1109631閱讀:747來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):通過(guò)破壞病毒衣殼-間隔肽1蛋白的加工而抑制hiv-1復(fù)制的制作方法
關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究和發(fā)展的聲明根據(jù)NIH/NIAID給予的撥款No.2R44AI051047-02的條款,U.S.政府在本發(fā)明中具有已支付的許可并在有限的情況中可具有權(quán)力來(lái)要求專(zhuān)利持有者以合理?xiàng)l件許可其他人實(shí)施。
背景技術(shù)
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明包括抑制方法,抑制劑和發(fā)現(xiàn)HIV感染抑制劑的方法。
背景人免疫缺陷病毒(HIV)是慢病毒屬的成員,慢病毒屬是逆轉(zhuǎn)錄病毒的亞科。病毒基因組含有許多允許病毒控制其在靜息細(xì)胞和分裂細(xì)胞兩者中的復(fù)制速率的調(diào)控元件。最重要的是,HIV感染并侵襲免疫系統(tǒng)的細(xì)胞;它破壞身體的免疫系統(tǒng)并使得患者易于產(chǎn)生機(jī)會(huì)性感染和腫瘤。免疫缺陷似乎是漸進(jìn)的和不可逆的,在幾年內(nèi)具有接近100%的高死亡率。
HIV-1是親T4淋巴細(xì)胞的并對(duì)其致細(xì)胞病變,T4淋巴細(xì)胞是表達(dá)細(xì)胞表面分化抗原CD4的免疫系統(tǒng)細(xì)胞,也稱(chēng)為OKT4,T4和leu3。病毒向性是由于病毒包膜糖蛋白gp120和細(xì)胞表面CD4分子之間的相互作用而引起的(Dalgeish等,Nature 312763-767(1984))。這些相互作用不僅介導(dǎo)了HIV對(duì)易感細(xì)胞的感染,而且還引起病毒誘導(dǎo)的感染和未感染T細(xì)胞的融合。這種細(xì)胞融合導(dǎo)致HIV感染患者中巨大多核化合胞體的形成,細(xì)胞死亡和CD4細(xì)胞的漸進(jìn)性耗盡。這些事件導(dǎo)致HIV誘導(dǎo)的免疫抑制及其隨后的后遺癥,機(jī)會(huì)性感染和腫瘤。
除了CD4+T細(xì)胞,HIV的宿主范圍包括單核吞噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞(Dalgleish等,上文),包括血液?jiǎn)魏思?xì)胞,組織巨噬細(xì)胞,皮膚的朗格漢斯細(xì)胞和淋巴結(jié)內(nèi)的樹(shù)突網(wǎng)狀細(xì)胞。HIV還是親神經(jīng)性的,能夠感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,引起嚴(yán)重的神經(jīng)損傷,巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞是HIV的主要存儲(chǔ)地。它們可以與帶有CD4的T細(xì)胞相互作用并融合,導(dǎo)致T細(xì)胞耗盡并因此引起AIDS的發(fā)病。
在治療HIV-1的藥物研發(fā)中已經(jīng)獲得了相當(dāng)大的進(jìn)展。用于HIV的治療劑包括,但不限于,AZT,3TC,ddC,d4T,ddI,替諾福韋(tenofovir),阿巴卡韋(abacavir),奈韋拉平(nevirapine),地拉韋定(delavirdine),恩曲他賓(emtricitabine),依法韋倫(efavirenz),沙喹那韋(saquinavir),利托那韋(ritonavir),茚地那韋(indinavir),奈非那韋(nelfinavir),洛匹那韋(lopinavir),安普那韋(amprenavir),atazanavir和福沙那韋中的至少一種,或任何其他相互組合的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物或抗體,或與基于生物學(xué)的治療相關(guān),例如,gp41-衍生的肽enfuvirtide(Fuzeon;Timeris-Roche)和T-1249(Trimeris),或可溶性CD4,CD4的抗體,和CD4或抗CD4的綴合物,或在此另外呈現(xiàn)的。這些藥物的組合特別有效并可以將血漿中的病毒RNA水平降低至不可檢測(cè)的水平并減緩病毒抗性的發(fā)展,結(jié)果是患者健康和壽命的提高。
盡管有了這些進(jìn)展,但目前可利用的藥物方案仍然存在問(wèn)題。許多藥物呈現(xiàn)出嚴(yán)重的毒性,具有其他副作用(例如,脂肪再分配)或需要復(fù)雜的減少并發(fā)癥的給藥時(shí)間表并因此限制了功效。隨著延長(zhǎng)的時(shí)間段,甚至在聯(lián)合治療時(shí),經(jīng)常出現(xiàn)HIV的抗性株。這些藥物的高成本對(duì)于它們的廣泛使用也是一個(gè)限制,尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家以外的地方。
對(duì)于研發(fā)另外的藥物來(lái)避免這些問(wèn)題仍然存在較大的需要。理想地,這些藥物將靶向病毒生命周期的不同階段,加入醫(yī)療物質(zhì)用于聯(lián)合治療,且呈現(xiàn)最小的毒性,還具有較低的制造成本。
HIV病毒粒體的裝配發(fā)生在感染細(xì)胞的表面膜,在那里病毒Gag多蛋白質(zhì)聚集,導(dǎo)致從細(xì)胞表面出芽的未成熟病毒粒體的裝配。在病毒粒體內(nèi),Gag通過(guò)病毒蛋白酶(PR)裂解成基質(zhì)(MA),衣殼(CA),核衣殼(NC)和C-端p6結(jié)構(gòu)蛋白(Wiegers K.等,J.Virol.722846-2854(1998))。Gap加工誘導(dǎo)內(nèi)部病毒粒體結(jié)構(gòu)的重構(gòu)(稱(chēng)為“成熟”的過(guò)程)。在成熟HIV顆粒中,MA排列于膜的內(nèi)表面,而CA形成圓錐形的核,其包圍與NC復(fù)合的基因組RNA。對(duì)于顆粒形成不需要裂解和成熟,但是其對(duì)于感染性是必要的(Koh1,N等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854686-4690,(1998))。
CA和NC以及NC和p6分別通過(guò)14和10個(gè)氨基酸(p2)的短間隔肽(各自為間隔肽1(SP1)和SP2)在Gag多蛋白質(zhì)上隔開(kāi)(WiegersK.等,J.Virol.722846-2854(1998),Pettit,S.C.等,J.Virol.688017-8027(1994),Liang等,J.Virol.7611729-11737(2002))。這些間隔肽在顆粒成熟過(guò)程中通過(guò)在其N(xiāo)和C末端PR-介導(dǎo)的裂解來(lái)釋放。HIV Gag和Gag-Pol多蛋白質(zhì)上的各個(gè)切割位點(diǎn)以不同的速率得到加工,且這種順次的加工導(dǎo)致在終產(chǎn)物之前Gag中間產(chǎn)物短暫出現(xiàn)。這樣的中間產(chǎn)物對(duì)于病毒粒體形態(tài)發(fā)生或成熟可能是重要的,但對(duì)成熟病毒顆粒的結(jié)構(gòu)沒(méi)有貢獻(xiàn)(Weigers等和Pettit等,上文)。最初的Gag裂解事件發(fā)生在SP1的C末端并將N-末端MA-CA-SP1中間產(chǎn)物與C-末端NC-SP2-p6中間產(chǎn)物分開(kāi)。隨后將MA與CA-SP1以及將NC-SP2與p6分開(kāi)的裂解以低約10倍的速率發(fā)生。SP1從CA C末端的裂解是最后的事件并以比SP1-NC位點(diǎn)的裂解低400倍的速率發(fā)生(Weigers等和Pettit等,上文)。將未裂解的CA-SP1中間產(chǎn)物蛋白可供選擇地稱(chēng)為“p25”,而將裂解的CA蛋白可供選擇地稱(chēng)為“p24”,并將裂解的SP1肽可供選擇地稱(chēng)為“p2”。
SP1從CA C末端的裂解似乎是Gag加工級(jí)聯(lián)中最后的事件之一,并是最終的衣殼凝聚和成熟的感染性病毒顆粒的形成所需的。成熟病毒粒體的電子顯微相片揭示了顆粒具有電子致密圓錐性核心。另一方面,對(duì)CA-SP1裂解缺陷型病毒顆粒的電子顯微鏡研究表明顆粒具有球形電子致密核糖核蛋白核心以及恰位于病毒膜內(nèi)的新月形電子致密層(Weigers等,上文)。已經(jīng)表明CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近的突變抑制了Gag加工并破壞了正常的成熟過(guò)程,因此導(dǎo)致無(wú)感染性病毒顆粒的產(chǎn)生(Weigers等,上文)。這些顆粒在表型上呈現(xiàn)Gag加工的缺陷(其自身表現(xiàn)為蛋白質(zhì)印跡分析中p25(CA-SP1)條帶的存在)以及上述由缺陷衣殼凝聚引起的異常顆粒形態(tài)。
之前,從棒花赤楠(Syzigium claviflorum)中分離出樺木酸和platanic acid并測(cè)定其具有抗HIV活性。樺木酸和platanic acid呈現(xiàn)出對(duì)抗H9淋巴細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的抑制活性,各自具有1.4μM和6.5μM的EC50,和各自9.3和14的治療指數(shù)(T.I.)值。樺木酸的氫化產(chǎn)生了二氫樺木酸,其顯示出略微更有效的抗HIV活性,具有0.9的EC50值和14的T.I.值(Fujioka,T.,等,J.Nat.Prod.57243-247(1994))。用某些取代的酰基如3’,3’-二甲基戊二酰基和3’,3’-二甲基琥珀?;鶎?duì)樺木酸酯化產(chǎn)生了具有提高活性的衍生物(Kashiwada,Y.,等,J.Med.Chem.391016-1017(1996))。在U.S.專(zhuān)利No.5,679,828中也描述了為有效抗HIV劑的?;瘶迥舅岷投錁迥舅嵫苌铩?笻IV測(cè)試表明3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)-樺木酸(DSB)和二氫樺木酸類(lèi)似物在急性感染的H9淋巴細(xì)胞中都證明了非常有效的抗HIV活性,各自具有低于1.7×10-5μM的EC50值。這些化合物各自顯示出高于970,000和高于400,000的顯著T.I.值。
U.S.專(zhuān)利No.5,468,888公開(kāi)了被描述為具有對(duì)HIV感染細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)作用的羽扇多環(huán)烷的28-酰氨基衍生物。
R=H(樺木酸)日本專(zhuān)利申請(qǐng)No.JP01143,832公開(kāi)了白樺脂醇及其3,28-二酯用于抗癌領(lǐng)域。
U.S.專(zhuān)利No.6,172,110公開(kāi)了具有以下通式的樺木酸和二氫白樺脂醇衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽,白樺脂醇和二氫白樺脂醇衍生物 其中R1是C2-C20取代或未取代的羧基酰基,R2是C2-C20取代或未取代的羧基?;?;和R3是氫,鹵素,氨基,可選取代的單-或二-烷基氨基,或--OR4,其中R4是氫,C1-4烷酰基,苯甲酰或C2-C20取代或未取代的羧基?;黄渲刑摼€表示C20和C29之間的可選雙鍵。
U.S.專(zhuān)利申請(qǐng)No.60/413,451公開(kāi)了3,3-二甲基琥珀?;讟逯?,在此引入作為參考。Zhu,Y-M.等,Bioorg.Chem Lett.113115-3118(2001);Kashiwada Y.等,J.Nat.Prod.611090-1095(1998);Kashiwada Y.等,J.Nat.Prod.631619-1622(2002);和Kashiwada Y.等,Chem.Pharm.Bull.481387-1390(2000)公開(kāi)了二甲基琥珀酰樺木酸和二甲基琥珀酰齊墩果醇酸。用琥珀酸酯化白樺脂醇的3’碳產(chǎn)生能夠抑制HIV-1活性的化合物(Pokrovakii,A.G.等,Gos.Nauchnyi Tsentr Virusol.Biotekhnol.“Vector,”9485-491(2001))。
公開(kāi)的國(guó)際申請(qǐng)No.WO02/26761公開(kāi)了白樺脂醇及其類(lèi)似物用于治療真菌感染的用途。
存在對(duì)有效對(duì)抗病毒耐藥株的新HIV抑制方法的需要。本發(fā)明的策略是提供以不同于已批準(zhǔn)療法的方式抑制病毒的治療方法和化合物。
本發(fā)明的化合物和方法具有新的作用機(jī)理,因此對(duì)于對(duì)目前的逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶抑制劑耐藥的HIV株是有活性的。因此,本發(fā)明提供了治療HIV/ADIS的全新方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述總的說(shuō)來(lái),本發(fā)明提供了抑制方法,抑制性化合物和鑒定靶向HIV-1 Gag蛋白的蛋白酶解加工的抑制性化合物的方法。一實(shí)施方案中,這樣的化合物可以直接或間接抑制蛋白酶與HIV-1 Gag蛋白的相互作用。另一實(shí)施方案中,這種相互作用的抑制通過(guò)化合物與Gag的結(jié)合來(lái)發(fā)生。通過(guò)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)來(lái)抑制HIV-1 Gag的CA-SP1蛋白的蛋白酶裂解是一個(gè)實(shí)例,但是可以通過(guò)相似的方法使用以與DSB與Gag相互作用所類(lèi)似的方式與底物相互作用的抑制性化合物來(lái)靶向其他蛋白酶裂解位點(diǎn)。
本發(fā)明的另一方面涉及抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但是對(duì)其他Gag加工步驟沒(méi)有影響的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及鑒定抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但是對(duì)其他Gag加工步驟沒(méi)有影響的化合物的方法。
一方面中,本發(fā)明涉及由在此所公開(kāi)的鑒定抑制HIV-1復(fù)制的化合物的方法所鑒定的化合物或藥物組合物。
另一方面中,本發(fā)明涉及多核苷酸,該多核苷酸包括編碼含有Gagp25蛋白突變的氨基酸序列的序列,所述突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工成p24的抑制降低。本發(fā)明的這個(gè)方面還涉及含有所述多核苷酸的載體,病毒和宿主細(xì)胞,和制備所述蛋白的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及含有Gag p25蛋白中的突變的氨基酸序列,所述突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工成p24的抑制降低。
本發(fā)明的另一方面涉及抗體,其選擇性地結(jié)合含有Gag p25蛋白突變的氨基酸序列,所述突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工成p24的抑制降低。還包括于本發(fā)明這個(gè)方面中的是制備所述抗體的方法,產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤和制備所述雜交瘤的方法。
進(jìn)一步的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及含有在此所公開(kāi)的多核苷酸,多肽或抗體的試劑盒。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1感染的方法,通過(guò)將所述細(xì)胞接觸阻斷從處理的受感染細(xì)胞釋放的病毒顆粒成熟的化合物。一實(shí)施方案中,所釋放的病毒顆粒呈現(xiàn)非凝聚的核心和病毒膜附近特征性的薄電子致密層并具有降低的感染性。包括將動(dòng)物細(xì)胞接觸抑制病毒Gag p25蛋白的加工并破壞病毒顆粒成熟的化合物的方法。此外,包括處理HIV感染細(xì)胞的方法,其中感染所述細(xì)胞的HIV不響應(yīng)其他HIV療法。
本發(fā)明進(jìn)一步包括鑒定抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但對(duì)其他Gag加工步驟沒(méi)有顯著影響的化合物的方法。該方法包括將HIV-1感染的細(xì)胞接觸測(cè)試化合物,且此后分析釋放的病毒顆粒來(lái)檢測(cè)p25的存在。檢測(cè)p25的方法包括病毒蛋白的蛋白質(zhì)印跡和使用p25抗體的檢測(cè),凝膠電泳和經(jīng)代謝標(biāo)記的蛋白質(zhì)的顯象。檢測(cè)p25的方法還包括使用針對(duì)p25或SP1(p2)的抗體或針對(duì)插入SP1序列中的表位標(biāo)記的抗體的免疫測(cè)定。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定化合物的方法,包括將HIV-1感染的細(xì)胞接觸化合物,此后通過(guò)薄切片和透射電子顯微鏡檢分析接觸細(xì)胞所釋放的病毒顆粒,并確定是否存在具有非凝聚的核心和病毒膜附近特征性的薄電子致密層的病毒顆粒。
本發(fā)明還涉及通過(guò)上述篩選方法鑒定的化合物。另外的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及治療患者HIV-1感染的方法,通過(guò)給藥抑制病毒Gagp25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物。相關(guān)的實(shí)施方案中,這樣的抑制可以伴隨不同的可觀察的表型。例如,抑制不必定顯著降低從處理的受感染細(xì)胞釋放的病毒粒體的數(shù)量;和/或所述抑制對(duì)引入釋放的病毒粒體中的RNA量可能具有極少或無(wú)顯著的影響;和/或所述抑制破壞了用所述化合物處理的受感染細(xì)胞釋放的病毒粒體的成熟。相關(guān)的實(shí)施方案中,病毒粒體的結(jié)構(gòu)可受到影響,且大部分從處理的受感染細(xì)胞釋放的病毒粒體呈現(xiàn)出球形的電子致密核心,其相對(duì)于病毒顆粒而言是非中心的;和/或具有就位于病毒膜內(nèi)的新月形的電子致密層;和/或具有降低的感染性或無(wú)感染性。
另外的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及治療患者HIV-1感染的方法,通過(guò)給藥抑制HIV蛋白酶與CA-SP1相互作用的化合物,其導(dǎo)致對(duì)病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的抑制,但對(duì)其他Gag加工步驟沒(méi)有顯著影響。這樣的抑制可以是直接的或間接的;和/或可以涉及所述化合物與病毒Gag蛋白的結(jié)合,使得HIV蛋白酶與CA-SP1的相互作用受到抑制。本發(fā)明還涉及治療患者HIV的方法,使用在病毒Gagp25蛋白(CA-SP1)裂解成p24(CA)的位點(diǎn)處或附近結(jié)合的化合物,因此抑制HIV蛋白酶與CA-SP1切割位點(diǎn)的相互作用并導(dǎo)致對(duì)p25加工成p24的抑制。
其他實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及治療患者HIV-1感染的方法,通過(guò)給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物,其中所述化合物結(jié)合具有與選自以下的序列具有至少約40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%或99%同一性或與其相同的氨基酸序列的多肽(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26);
(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119).
其他實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及治療患者HIV-1感染的方法,通過(guò)給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物,其中所述化合物結(jié)合由與選自以下的多核苷酸具有至少約40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%或99%同一性或與其相同的多核苷酸序列編碼的多肽(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
另一方面中,本發(fā)明涉及通過(guò)給藥化合物抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工的方法。相關(guān)實(shí)施方案中,這樣的化合物結(jié)合具有與選自以下的序列具有至少約40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%或99%同一性或與其相同的氨基酸序列的多肽(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ IDNO23);
(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26);(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119).
相關(guān)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及通過(guò)給藥化合物來(lái)抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工的方法,其中所述化合物結(jié)合由與選自以下的多核苷酸具有至少約40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%或99%同一性或與其相同的的多核苷酸序列編碼的多肽(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
本發(fā)明可用于治療用其他HIV-1療法不能充分適當(dāng)治療的患者的HIV。因此,本發(fā)明還涉及治療需要治療的患者,其中感染所述細(xì)胞的HIV-1不響應(yīng)其他HIV-1療法。另一實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法在感染對(duì)用于治療HIV感染的藥物耐藥的HIV的對(duì)象上實(shí)施。一種應(yīng)用中,HIV對(duì)蛋白酶抑制劑,聚合酶抑制劑,核苷類(lèi)似物,疫苗,結(jié)合抑制劑,免疫調(diào)節(jié)劑或任何其他抑制劑耐藥。另一實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法在感染對(duì)用于治療HIV感染的藥物耐藥的HIV的對(duì)象上實(shí)施,這些藥物選自齊多夫定(zidovudine),拉米夫定(lamivudine),去羥肌苷(didanosine),扎西他賓(zalcitabine),司他夫定(stavudine),阿巴卡韋,奈韋拉平,地拉韋定,恩曲他賓,依法韋倫,沙喹那韋,利托那韋,茚地那韋,奈非那韋,替諾福韋,安普那韋,阿德福韋(adefovir),atazanavir,福沙那韋,羥基脲,AL-721,聚肌胞,丁基化羥基甲苯;聚甘露乙酸酯,澳栗精胺(castanospermine);contracan;creme pharmatex,CS-87,噴昔洛韋(penciclovir),泛昔洛韋(famciclovir),阿昔洛韋(acyclovir),cytofovir,更昔洛韋(ganciclovir),硫酸葡聚糖,D-青霉胺膦酰甲酸三鈉,梭鏈孢酸,HPA-23,二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(eflronithine),壬苯醇醚(nonoxynol),戊烷脒羥乙基磺酸鹽,肽T,苯妥英,異煙肼,病毒唑,利福布丁(rifabutin),安莎霉素,三甲曲沙(trimetrexate),SK-818,蘇拉明,UA001及其組合。
本發(fā)明的化合物還可以用作療法組合的一部分。因此,一方面中本發(fā)明涉及治療患者HIV的方法,其中對(duì)所述患者給藥所述化合物并聯(lián)合至少一種抗病毒劑。合適的抗病毒劑包括,但不限于齊多夫定,拉米夫定,去羥肌苷,扎西他賓,司他夫定,阿巴卡韋,奈韋拉平,地拉韋定,恩曲他賓,依法韋倫,沙喹那韋,利托那韋,茚地那韋,奈非那韋,安普那韋,替諾福韋,阿德福韋,atazanavir,福沙那韋,羥基脲,AL-721,聚肌胞,丁基化羥基甲苯;聚甘露乙酸酯,澳栗精胺;contracan;creme pharmatex,CS-87,噴昔洛韋,泛昔洛韋,阿昔洛韋,cytofovir,更昔洛韋,硫酸葡聚糖,D-青霉胺膦酰甲酸三鈉,梭鏈孢酸,HPA-23,二氟甲基鳥(niǎo)氨酸,壬苯醇醚,戊烷脒羥乙基磺酸鹽,肽T,苯妥英,異煙肼,病毒唑,利福布丁(rifabutin),安莎霉素,三甲曲沙,SK-818,蘇拉明,UA001,enfuvirtide,gp41-衍生的肽,CD4的抗體,可溶性CD-4,含有CD4的分子,CD4-IgG2及其組合。另一實(shí)施方案中,對(duì)患者給藥所述化合物并聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)劑,抗癌劑,抗細(xì)菌劑,抗真菌劑或其組合。
本發(fā)明還涉及化合物。這樣的化合物可用于以下方法中治療感染HIV患者的方法;用于抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP)加工成p24(CA)的方法,或用于處理人血液和人血液制品的方法。這樣可用于本發(fā)明中的化合物包括,但不限于,二甲基琥珀酰樺木酸或二甲基琥珀酰白樺脂醇的衍生物,或選自3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)白樺脂醇,3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)白樺脂醇,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)二氫樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)樺木酸,(3’,3’-二甲基戊二酰)二氫樺木酸,3-O-二乙醇酰-樺木酸,3-O-二乙醇酰-二氫樺木酸及其組合。
本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)使用,或和其他的化合物一起給藥,其他的化合物包括齊多夫定,拉米夫定,去羥肌苷,扎西他賓,司他夫定,阿巴卡韋,奈韋拉平,地拉韋定,恩曲他賓,依法韋倫,沙喹那韋,利托那韋,茚地那韋,奈非那韋,安普那韋,替諾福韋,阿德福韋,atazahavir,福沙那韋,羥基脲,AL-721,聚肌胞,丁基化羥基甲苯;聚甘露乙酸酯,澳栗精胺;contracan;creme pharmatex,CS-87,噴昔洛韋,泛昔洛韋,阿昔洛韋,cytofovir,更昔洛韋,硫酸葡聚糖,D-青霉胺膦酰甲酸三鈉,梭鏈孢酸,HPA-23,二氟甲基鳥(niǎo)氨酸,壬苯醇醚,戊烷脒羥乙基磺酸鹽,肽T,苯妥英,異煙肼,病毒唑,利福布丁(rifabutin),安莎霉素,三甲曲沙,SK-818,蘇拉明,UA001,enfuvirtide,gp41-衍生的肽,CD4的抗體,可溶性CD-4,含有CD4的分子,CD4-IgG2及其組合;抗病毒劑,免疫調(diào)節(jié)劑,抗癌劑,抗細(xì)菌劑,抗真菌劑或其組合。
進(jìn)一步的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及處理人血液制品的方法,包括將所述血液制品接觸抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物。一方面中,所述化合物不顯著影響其他Gag加工步驟。該方法的相關(guān)實(shí)施方案中,所述抑制不顯著減少?gòu)奶幚淼氖芨腥炯?xì)胞中釋放的病毒粒體數(shù)量;和/或?qū)σ脶尫诺牟《玖sw中的RNA量很少或沒(méi)有顯著影響;和/或抑制了從使用所述的化合物處理的受感染細(xì)胞釋放的病毒粒體的成熟;和/或影響病毒形態(tài)。這樣對(duì)于病毒形態(tài)的影響包括,但不限于從處理的受感染細(xì)胞釋放的病毒粒體呈現(xiàn)相對(duì)于病毒顆粒而言非中心的球形電子致密核心;和/或具有就位于病毒膜內(nèi)的新月形電子致密層;和/或具有降低的感染性或無(wú)感染性。相關(guān)的實(shí)施方案中,該方法包括給藥抑制HIV蛋白酶與CA-SP1相互作用的化合物,其導(dǎo)致對(duì)病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的抑制,但是對(duì)其他Gag加工步驟沒(méi)有顯著影響。這可通過(guò)直接或間接抑制HIV蛋白酶與CA-SP1的相互作用;和/或可以涉及所述化合物結(jié)合到病毒Gag蛋白使得HIV蛋白酶與CA-SP1的相互作用受到抑制;和/或所述化合物在病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)裂解成p24(CA)的切割位點(diǎn)處或附近結(jié)合,從而抑制HIV蛋白酶與CA-SP1切割位點(diǎn)的相互作用,并導(dǎo)致對(duì)p25加工成p24的抑制。
進(jìn)一步的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及處理人血液制品的方法,包括將所述血液制品接觸抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物,其中所述化合物結(jié)合具有與選自以下的序列具有至少約40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%或99%同一性或與其相同的氨基酸序列的多肽(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26);(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);
(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119).
相關(guān)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及處理人血液制品的方法,包括將所述血液制品接觸抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物,其中所述化合物結(jié)合由與選自以下的多核苷酸具有至少約40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%或99%同一性或與其相同的多核苷酸序列編碼的多肽(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
本發(fā)明還包括鑒定抑制HIV-1復(fù)制的化合物的方法。因此,本發(fā)明還包括鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的化合物的方法,包括將包括CA-SP1切割位點(diǎn)的Gag蛋白接觸測(cè)試化合物;加入在CA-SP1切割位點(diǎn)附近選擇性結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記物質(zhì);并測(cè)量測(cè)試化合物和經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)與CA-SP1切割位點(diǎn)結(jié)合之間的競(jìng)爭(zhēng)。該方法進(jìn)一步的實(shí)施方案中,化合物通過(guò)結(jié)合靶位點(diǎn)抑制HIV-1蛋白酶與所述的靶位點(diǎn)的相互作用。
這些方法還包括這樣的實(shí)施方案,其中CA-SP1切割位點(diǎn)區(qū)域包含于多肽片段或重組肽內(nèi);和/或其中經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)是標(biāo)記的對(duì)CA-SP1特異性的抗體,并測(cè)量測(cè)試化合物存在下結(jié)合蛋白的標(biāo)記抗體量與對(duì)照相比較的改變。標(biāo)記包括,但不限于,酶,熒光物質(zhì),化學(xué)發(fā)光物質(zhì),辣根過(guò)氧化物酶,堿性磷酸酶,生物素,抗生物素蛋白,電子致密物質(zhì),放射性同位素及其組合。
一實(shí)施方案中,鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的化合物的方法還包括,測(cè)量測(cè)試化合物存在下結(jié)合蛋白質(zhì)的經(jīng)標(biāo)記3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸的量與對(duì)照相比較的改變,且其中經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)是3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸。
可供選擇的實(shí)施方案中,本發(fā)明包括鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的化合物的方法,其包括在測(cè)試化合物存在下將包括CA-SP1切割位點(diǎn)的多肽接觸蛋白酶。優(yōu)選,蛋白酶與HIV-1蛋白酶有關(guān),或是HIV蛋白酶。一實(shí)施方案中,該方法包括在測(cè)試化合物的存在下將包括野生型CA-SP1切割位點(diǎn)的多肽接觸蛋白酶,還在測(cè)試化合物存在下將包括突變CA-SP1切割位點(diǎn)的多肽或包括另一可供選擇的蛋白酶切割位點(diǎn)的蛋白質(zhì)接觸HIV-1蛋白酶,檢測(cè)裂解,并將天然野生型多肽的裂解量與突變多肽的裂解量或包括可供選擇的蛋白酶切割位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的裂解量相比較。該方法的相關(guān)方面中,野生型CA-SP1或突變CA-SP1或可供選擇的蛋白酶切割位點(diǎn)區(qū)域包含于多肽片段或重組肽內(nèi)。進(jìn)一步相關(guān)的方面中,用熒光部分和熒光淬滅部分來(lái)標(biāo)記多肽,這兩個(gè)部分各自結(jié)合CA-SP1切割位點(diǎn)的相對(duì)側(cè),且其中所述檢測(cè)包括測(cè)量熒光部分發(fā)出的信號(hào)。另一相關(guān)的實(shí)施方案中,用兩個(gè)熒光部分來(lái)標(biāo)記多肽,其各自結(jié)合CA-SP1切割位點(diǎn)的相對(duì)側(cè),且其中所述檢測(cè)包括測(cè)量測(cè)試化合物存在下熒光能量從一個(gè)部分至另一部分的轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步的實(shí)施方案中,通過(guò)測(cè)量結(jié)合SP1或p24(CA)的標(biāo)記抗體的量來(lái)檢測(cè)測(cè)試化合物對(duì)多肽裂解的作用。相關(guān)方面中,用選自酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、辣根過(guò)氧化物酶,堿性磷酸酶,生物素,抗生物素蛋白,電子致密物質(zhì),放射性同位素及其組合的分子來(lái)標(biāo)記結(jié)合CA的標(biāo)記抗體或結(jié)合SP1的抗體。
本發(fā)明還涉及鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的化合物的方法。一實(shí)施方案中,該方法包括將測(cè)試化合物接觸野生型病毒分離株感染的細(xì)胞,和接觸對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸具有顯著降低的敏感性的病毒分離株感染的細(xì)胞;并選擇與對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸具有顯著降低敏感性的病毒分離株相比較更有效對(duì)抗野生型病毒分離株的測(cè)試化合物。另一實(shí)施方案中,該方法包括將HIV-1感染的細(xì)胞接觸測(cè)試化合物;將感染的細(xì)胞或釋放的病毒顆粒裂解來(lái)形成裂解物,并分析裂解物來(lái)確定是否已經(jīng)發(fā)生了CA-SP1蛋白的裂解。該后一實(shí)施方案中,所述分析可包括測(cè)量p25的存在與否,和或進(jìn)行病毒蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡并使用p25的抗體來(lái)檢測(cè)p25;和/或進(jìn)行病毒蛋白的凝膠電泳和代謝標(biāo)記蛋白質(zhì)的顯像;和/或進(jìn)行免疫測(cè)定??梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)進(jìn)行這樣的免疫測(cè)定,包括,但不限于(a)使用選擇性結(jié)合p24的抗體在基質(zhì)上捕獲p25和p24;和(b)使用選擇性結(jié)合p25的抗體來(lái)檢測(cè)基質(zhì)上p25的存在與否。本發(fā)明還包括本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的對(duì)上述測(cè)定的改進(jìn)。
進(jìn)一步的實(shí)施方案中,根據(jù)本發(fā)明鑒定化合物的方法包括使用插入SP1中的表位標(biāo)記序列并使用表位標(biāo)記的抗體來(lái)進(jìn)行p25的選擇性檢測(cè)。
本發(fā)明還涉及鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的化合物的方法,包括將HIV-1感染的細(xì)胞接觸測(cè)試化合物,此后使用透射電子顯微鏡來(lái)分析病毒顆粒。這樣的分析包括,例如,尋找相對(duì)于病毒顆粒而言非中心的球形核心的存在;和/或具有恰位于病毒膜內(nèi)的新月形的電子致密層。
其他方面中,本發(fā)明涉及分離的多核苷酸,包括編碼含有HIV Gagp25蛋白(CA SP1)中的突變的氨基酸序列的序列,所述突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)對(duì)p25(CA-SP1)加工成p24(CA)的抑制降低。這種對(duì)p25加工的抑制可能是由于對(duì)HIV蛋白酶和Gag相互作用抑制的降低;和/或3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸和Gag結(jié)合的降低;和/或DSB在Gag的CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近的結(jié)合降低。合適的多核苷酸還包括那些編碼在CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近的突變或在CA-SP1的SP1結(jié)構(gòu)域中的突變;和/或那些編碼在氨基酸序列G/SHKARV/ILAEAMSQV(SEQ ID NO1)處或附近的突變;和/或那些編碼氨基酸序列GHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO2)或SHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO3);和/或分離的多核苷酸,其選自SEQID NO4,SEQ ID NO6,SEQ ID NO8和SEQ ID NO9;和/或與選自SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的多核苷酸具有至少約95%同一性;和/或與選自SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的多核苷酸具有至少約80%同一性;和/或與選自SEQ ID NO5和SEQ ID NO7的多核苷酸具有至少約95%同一性;和/或與SEQ ID NO10的多核苷酸具有至少約80%同一性。其他實(shí)施方案中,多核苷酸與以上所列的多核苷酸序列具有至少約40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,99%同一性或與之相同。
本發(fā)明還涉及含有如上所述的這類(lèi)多核苷酸的載體;含有這樣載體的宿主細(xì)胞;和生產(chǎn)多肽的方法,包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有這樣載體的宿主細(xì)胞并從所述培養(yǎng)基中回收多肽。
一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抗體。這樣的抗體可以結(jié)合具有與選自以下的序列具有至少約40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%或99%同一性或與之相同的氨基酸序列的多肽(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26);(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119).
進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抗體,其結(jié)合由與具有選自以下的序列的多核苷酸具有至少約40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%或99%同一性或與之相同的多核苷酸序列編碼的多肽(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
一實(shí)施方案中,抗體結(jié)合HIV-1 Gag多肽的CA-SP1區(qū)域的氨基酸,其中所述氨基酸包括SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25)或GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)。
一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抑制3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸與Gag多肽的CA-SP1區(qū)域結(jié)合的抗體。
本發(fā)明還涉及突變的HIV-1病毒。一個(gè)這樣的實(shí)施方案中,本發(fā)明是分離的突變重組HIV-1病毒,其中所述病毒中的病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)不受到3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸的顯著抑制。相關(guān)實(shí)施方案中,該病毒不受3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸的抑制。另一實(shí)施方案中,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸不抑制該病毒中蛋白酶與Gag多肽的相互作用。另一實(shí)施方案中,該病毒不結(jié)合3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸。進(jìn)一步的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及病毒,其中CA-SP1區(qū)域的氨基酸由可供選擇的氨基酸替代,或?qū)被崽砑又罜A-SP1區(qū)域,或其中刪除了氨基酸。一實(shí)施方案中,從CA-SP1區(qū)域中的AEAMSQV(SEQ ID NO26的氨基酸no.8-14)氨基酸序列刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
突變病毒可用于本文別處所述的本發(fā)明的方法中。例如,這樣的病毒可用于鑒定抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物的方法中,該方法包括與以上概述的突變病毒的復(fù)制相比較,比較所述化合物抑制HIV-1復(fù)制的能力。可以在細(xì)胞中,或在動(dòng)物中,或在體外檢測(cè)這樣的抑制。
本發(fā)明還涉及對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸敏感的非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒。一些實(shí)施方案中,所述逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼CA-SP1多肽,該多肽具有在CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近包括序列AEAMSQV(SEQ IDNO26的氨基酸no.8-14)的氨基酸序列。另一實(shí)施方案中,逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼CA-SP1多肽,該多肽具有在CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近包括序列VLAEAMSQV(SEQ ID NO26的氨基酸no.6-14)的氨基酸序列。另一實(shí)施方案中,逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼CA-SP1多肽,該多肽具有在CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近包括序列GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)的氨基酸序列;另一實(shí)施方案中,逆轉(zhuǎn)錄病毒包括與由SEQ ID NO26,SEQ IDNO90;SEQ ID NO92;SEQ ID NO94;SEQ ID NO96或SEQ ID NO98的多核苷酸編碼的序列具有至少60%,70%,80%,90%同一性或與之相同的氨基酸序列;另一實(shí)施方案中,逆轉(zhuǎn)錄病毒包括與SEQ ID NO91;SEQ ID NO93;SEQ ID NO95;SEQ ID NO97或SEQ ID NO99的序列具有至少60%,70%,80%,90%同一性或與之相同的氨基酸序列。另一實(shí)施方案中,逆轉(zhuǎn)錄病毒包括與SEQ ID NO90;SEQ ID NO92;SEQID NO94;SEQ ID NO96或SEQ ID NO98的序列具有至少70%,80%,90%同一性或與之相同的核酸序列。
本發(fā)明該實(shí)施方案的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括,但不限于,HIV-2,HTLV-I,HTLV-II,SIV,禽類(lèi)白血病病毒(ALV),內(nèi)源性禽類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒(EAV),小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV),貓免疫缺陷病毒(FIV),牛免疫缺陷病毒(BIV),山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV),Visna-maedi病毒或貓白血病病毒(FeLV)。
相關(guān)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及制造對(duì)DSB敏感的重組非HIV-1慢病毒的方法。該方法包括從所述慢病毒的基因組中刪除對(duì)應(yīng)于HIV-1中SEQ ID NO18的核苷酸1370-1413的核苷酸;并將SEQ ID NO18的核苷酸1370-1413或SEQ ID NO19的核苷酸1857-1899插入所述非HIV-1慢病毒的所述區(qū)域中。


圖10中描繪了以前或現(xiàn)在是或可通過(guò)這種方法構(gòu)建的嵌合慢病毒的實(shí)例。
這樣的病毒可以用于本文別處所述的本發(fā)明的方法中。例如,這樣的重組非HIV-1慢病毒可以用于鑒定抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物的方法中,該方法包括比較所述化合物抑制野生型非HIV-1慢病毒與其DSB-敏感性重組變體的復(fù)制的能力。所述抑制可發(fā)生于細(xì)胞中;在動(dòng)物中;或體外。
本發(fā)明還涉及慢病毒感染的動(dòng)物模型,包括用對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸敏感的慢病毒感染的合適的非人動(dòng)物宿主。這樣的實(shí)施方案中,慢病毒可包括,但不限于SIV;FIV;EIAV;BIV;CAEV和Visna-Maedi病毒。
本發(fā)明還涉及分離的多肽。一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及含有HIVCA-SP1蛋白突變的多肽,所述突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工的抑制降低。相關(guān)實(shí)施方案中,該多肽由含有位于或接近CA-SP1切割位點(diǎn)的突變或SEQ ID NO5,SEQ ID NO7或SEQ IDNO10編碼的SP1結(jié)構(gòu)域中的突變的多核苷酸編碼和/或由選自SEQ IDNO4,SEQ ID NO6,SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的多核苷酸編碼;和/或包括選自GHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO2)或SHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO3)的序列;和/或由嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自SEQ ID NO5,SEQ ID NO7和10的多核苷酸雜交的分離的多核苷酸編碼;和/或是嵌合或融合蛋白的一部分。
本發(fā)明還涉及選擇性結(jié)合含有HIV CA-SP1蛋白突變的氨基酸序列的抗體,該突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25(CA-SP1)加工成p24(CA)的抑制降低。一個(gè)這樣的實(shí)施方案中,抗體選擇性地結(jié)合位于或接近CA-SP1切割位點(diǎn)的突變或CA-SP1的SP1結(jié)構(gòu)域中的突變;另一實(shí)施方案中,抗體選擇性地結(jié)合包括選自GHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO2)或SHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO3)的序列的突變;另一實(shí)施方案中,抗體選擇性地結(jié)合選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的氨基酸序列。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及選擇結(jié)合SP1但不結(jié)合CA-SP1的抗體;另一選擇性地結(jié)合CA-SP1但不結(jié)合CA的抗體;另一選擇性地結(jié)合CA但不結(jié)合CA-SP1的抗體;和進(jìn)一步的在CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近選擇性地結(jié)合的抗體。
本發(fā)明還涉及通過(guò)在此說(shuō)明的任何一種方法鑒定的化合物。一實(shí)施方案中,化合物不是選自3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)白樺脂醇,3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)白樺脂醇,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)二氫樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)樺木酸,(3’,3’-二甲基戊二酰)二氫樺木酸,3-O-二乙醇酰-樺木酸,3-O-二乙醇酰-二氫樺木酸及其組合的化合物。
本發(fā)明還涉及藥物組合物。一實(shí)施方案中,藥物組合物包括二甲基琥珀酰樺木酸或二甲基琥珀酰白樺脂醇的衍生物;另一實(shí)施方案中,藥物組合物包括選自3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)白樺脂醇,3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)白樺脂醇,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)二氫樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)樺木酸,(3’,3’-二甲基戊二酰)二氫樺木酸,3-O-二乙醇酰-樺木酸,3-O-二乙醇酰-二氫樺木酸及其組合的化合物。另一實(shí)施方案中,藥物組合物包括一種或多種根據(jù)不是另外列出的本發(fā)明的方法鑒定的化合物;或其任何藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或前體藥物,和藥物學(xué)上可接受的載體。另一實(shí)施方案中,藥物組合物進(jìn)一步包括抗病毒劑,其可包括以下的任何一種齊多夫定,拉米夫定,去羥肌苷,扎西他賓,司他夫定,阿巴卡韋,奈韋拉平,地拉韋定,恩曲他賓,依法韋倫,沙喹那韋,利托那韋,茚地那韋,奈非那韋,替諾福韋,安普那韋,阿德福韋,atazanavir,福沙那韋,羥基脲,AL-721,聚肌胞,丁基化羥基甲苯;聚甘露乙酸酯,澳栗精胺;contracan;creme pharmatex,CS-87,噴昔洛韋,泛昔洛韋,阿昔洛韋,cytofovir,更昔洛韋,硫酸葡聚糖,D-青霉胺膦酰甲酸三鈉,梭鏈孢酸,HPA-23,二氟甲基鳥(niǎo)氨酸,壬苯醇醚,戊烷脒羥乙基磺酸鹽,肽T,苯妥英,異煙肼,病毒唑,利福布丁(rifabutin),安莎霉素,三甲曲沙,SK-818,蘇拉明,UA001,其組合,任何其他的抗病毒劑,免疫調(diào)節(jié)劑,抗癌劑,抗真菌劑,抗細(xì)菌劑或其組合。
本發(fā)明還涉及確定個(gè)體是否受到對(duì)通過(guò)抑制p25加工的化合物治療敏感的HIV-1感染的方法。一實(shí)施方案中,該方法包括從患者取血,將病毒RNA進(jìn)行基因分型,并測(cè)定病毒RNA在編碼CA-SP1切割位點(diǎn)區(qū)域的序列中是否含有突變。
本發(fā)明還涉及治療有此需要的患者的疾病的方法,包括鑒定抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但對(duì)其他Gag加工步驟沒(méi)有顯著影響的化合物;獲得銷(xiāo)售和使用所述化合物的法規(guī)許可;將化合物包裝用于銷(xiāo)售和治療有此需要的患者的疾病。
附圖簡(jiǎn)述圖1.50μg/mL濃度的DSB沒(méi)有破壞HIV-1蛋白酶的活性。在含有DSB的樣品中,重組Gag得到了正確加工。相反,5μg/mL的茚地那韋阻斷了蛋白酶活性,如通過(guò)不存在對(duì)應(yīng)于p24和MA-CA前體的條帶來(lái)證明。
圖2.在DSB(1μg/mL),茚地那韋(1μg/mL)或?qū)φ?DMSO)存在下,源自慢性感染的H9/HIV-1IIIB,H9/HIV-2ROD和H9/SIVmac251的病毒粒體相關(guān)Gag的蛋白質(zhì)印跡。使用HIV-Ig(HIV-1)或猴子抗SIVmac251血清(HIV-2和SIV;NIH AIDS Research and ReferenceReagent)來(lái)顯現(xiàn)Gag蛋白。
圖3.DSB處理的HIV-1感染細(xì)胞的EM分析。EM數(shù)據(jù)顯示出DSB處理的和未處理樣品之間的兩個(gè)主要差異。在DSB存在下產(chǎn)生的病毒粒體的特征在于不存在圓錐形的成熟核心。這些樣品中,核心一律為球形的并通常是非中心的(acentric)。其次,許多病毒粒體在脂質(zhì)雙層內(nèi)但在核心外呈現(xiàn)了電子致密層(DSB處理樣品圖中用箭頭來(lái)指示)。DSB處理樣品中,沒(méi)有觀察到成熟病毒顆粒。
圖4描述了DSB敏感HIV-1分離株NL4-3和RF(#1;SEQ ID NO1)和DSB-抗性HIV-1分離株(#2;SEQ ID NO2(NL4-3),和#3;SEQID NO3(RF))的CA-SP1切割位點(diǎn)區(qū)域中的氨基酸序列。天然和DSB-抗性序列之間的差別涉及距CA-SP1切割位點(diǎn)(-|-)第一個(gè)下游殘基處丙氨酸至纈氨酸改變(#2)和第三個(gè)下游殘基中丙氨酸至纈氨酸的改變(#3)。為了易于識(shí)別,將這些殘基標(biāo)下劃線并加粗。
圖5描繪了A364V DSB抗性NL4-3突變體的+有義共有序列(SEQID NO4),始于gag開(kāi)始并持續(xù)至pol,包括完整的蛋白酶編碼區(qū)域。將野生型NL4-3 GENBANK M19921序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變加粗和灰色陰影。將共有CA-SP1切割位點(diǎn)區(qū)域的編碼序列標(biāo)下劃線。包括切割位點(diǎn)的陰影區(qū)域表示SP1序列。第一個(gè)突變是A364V突變。
在親本克隆中還發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)氨基酸改變(蛋白酶中)并證實(shí)對(duì)應(yīng)于原始GENBANK登錄中的測(cè)序錯(cuò)誤。因此,在蛋白酶中實(shí)際上沒(méi)有發(fā)生突變。
圖6描繪了DSB-敏感NL4-3親本分離株的+有義共有序列(SEQID NO5),該分離株在藥物不存在下與A364V突變體分離株平行傳代。
圖7描述了A366V DSB-抗性HIV-1 RF突變體的+有義共有序列(SEQ ID NO6),始于gag開(kāi)始并持續(xù)至pol,包括完整的蛋白酶編碼區(qū)域。以灰色陰影顯示野生型HIV-1RF GRNBANK M17451序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變。將CA-SP1切割位點(diǎn)的區(qū)域標(biāo)下劃線。在同樣傳代的DSB-敏感分離株中沒(méi)有也發(fā)現(xiàn)的唯一錯(cuò)義突變是CA-SP1切割位點(diǎn)中的A366V突變。
圖8描繪了DSB-敏感HIV-1 RF親本分離株的+有義共有序列(SEQID NO7),該分離株在藥物不存在下與A366V突變體分離株平行傳代。
圖9描繪了多核苷酸序列,SEQ ID NO8和SEQ ID NO9,其編碼在此各自指定為SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的多肽。SEQ UD NO10和12描繪了編碼指定為SEQ ID NO1的親本多肽序列的核苷酸序列。SEQ ID NO1是基于NL4-3和RF的區(qū)域序列的共有序列。
圖1010A.慢病毒的CA-SP1區(qū)域中的氨基酸序列。(各自為SEQ IDNO13;SEQ ID NO11;SEQ ID NO14;SEQ ID NO15;SEQ ID NO20;SEQ ID NO27;SEQ ID NO28;SEQ ID NO29;SEQ ID NO30;SEQ IDNO30)。
10BHIV-1株RF(SEQ ID NO11)和NL4-3(SEQ ID NO13)中CA-SP1區(qū)域的氨基酸序列。
10C-10D嵌合SIV的gag基因的核苷酸序列。將編碼CA-SP1切割位點(diǎn)的七個(gè)上游氨基酸和七個(gè)下游氨基酸的42個(gè)核苷酸序列標(biāo)下劃線并加粗。
10E-H根據(jù)本發(fā)明制備的嵌合FIV,EIAV和BIV的gag基因的核苷酸序列。將編碼CA-SP1切割位點(diǎn)的七個(gè)上游氨基酸和七個(gè)下游氨基酸的42個(gè)核苷酸序列標(biāo)下劃線并加粗(核苷酸序列SEQ ID NO16;氨基酸序列SEQ ID NO17)。
10F.含有HIV CA-SP1區(qū)域的嵌合貓免疫缺陷病毒(FIV)的GAG基因的核苷酸序列嵌合FIV-GAG基因核苷酸1-1353對(duì)應(yīng)于嵌合FIV基因組中的核苷酸628-1980。核苷酸序列SEQ ID NO94編碼氨基酸SEQ ID NO95。
10G.含有HIV1 CA-SP1區(qū)域的嵌合馬傳染性貧血病病毒(EIAV)的GAG基因的核苷酸序列嵌合EIAV-GAG基因核苷酸1-1587對(duì)應(yīng)于嵌合EIAV基因組中的核苷酸450-1910。核苷酸SEQ ID NO96編碼氨基酸SEQ ID NO97。
10H.含有HIV1 CA-SP1區(qū)域的嵌合牛免疫缺陷病毒(BIV)的GAG基因的核苷酸序列嵌合BIV-GAG基因核苷酸1-1471對(duì)應(yīng)于嵌合BIV基因組中的核苷酸316-1746。核苷酸SEQ ID NO98編碼氨基酸SEQ IDNO99。
圖11PA-457(DSB)抗性突變體的復(fù)制動(dòng)力學(xué)。
圖12用于鑒定DSB活性必需殘基的NL4-3范圍內(nèi)的連續(xù)SP1點(diǎn)缺失。顯示了NL4-3中SP1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列?!唉ぁ北硎救笔Ф?”意思是點(diǎn)缺失突變體和NL4-3之間相同的殘基(各自為SEQ IDNO13;SEQ ID NO33;SEQ ID NO34;SEQ ID NO35;SEQ ID NO36;SEQ ID NO85;SEQ ID NO86;SEQ ID NO87;SEQ ID NO88;SEQ IDNO89;SEQ ID NO100;SEQ ID NO101;SEQ ID NO102;SEQ ID NO103)。
圖13.點(diǎn)缺失突變體的顆粒生產(chǎn)和感染性的概述。
圖14.在DSB的存在(+)和不存在(-)下,含有SP1點(diǎn)缺失的病毒的蛋白質(zhì)印跡。
圖15.SIVmac 239主鏈中的HIV-1 CA-SP1殘基VL-AEAMSQV(SEQID NO32)置換使得SIVmac239對(duì)DSB敏感(各自為SEQ ID NO14;SEQ ID NO15;SEQ ID NO20;SEQ ID NO27;SEQ ID NO28;SEQ IDNO13)。
(上圖)顯示了SIVmac 239,HIV-1 NL4-3和一系列其中插入各種NL4-3殘基(下劃線)的SIV突變體的CA-SP1切割位點(diǎn)附近的氨基酸序列(包括完整的SP1區(qū)域)。虛線(“-”)表示殘基與SIVmac239中的那些相同。
(下圖)顯示了該系列病毒在DSB存在(+)或不存在(-)下CA和CA-SP1蛋白的蛋白質(zhì)印跡。
圖16慢病毒CA-SP1區(qū)域中的序列保守??寺〔呗詫IV-1特異性CA-SP1殘基置換至FIV、EIAV或BIV相應(yīng)的Gag區(qū)域中。
圖17.用表位標(biāo)記的HIV-1 NL4-3 SP1。顯示了含有插入的肽標(biāo)記的SP1肽的序列?!唉ぁ北硎救笔У臍埢汀?”表示與NL4-3 SP1中相同的殘基。(圖17(1);各自為SEQ ID NO15;SEQ ID NO104;SEQ ID NO105;SEQ ID NO106;SEQ ID NO107);(圖17(2);各自為SEQ ID NO15;SEQ ID NO108;SEQ ID NO109);(圖17(3);各自為SEQ ID NO15;SEQ ID NO110;SEQ ID NO111);(圖17(4);各自為SEQ ID NO15;SEQ ID NO112;SEQ ID NO113;SEQ ID NO114);(圖17(5);各自為SEQ ID NO15;SEQ ID NO115)。
圖18A-CHIV-1株RF多核苷酸序列。將Gag多蛋白的核苷酸序列標(biāo)下劃線并加粗。將編碼CA-SP1切割位點(diǎn)的七個(gè)上游氨基酸和七個(gè)下游氨基酸的42個(gè)核苷酸序列用綠色突出。將CA中切割位點(diǎn)上游的另外129個(gè)核苷酸(43個(gè)氨基酸殘基)和SP1中剩余的21個(gè)核苷酸(七個(gè)氨基酸殘基)突出。
圖19A-EHIV-1株NL4-3多核苷酸序列。將Gag多蛋白的核苷酸序列標(biāo)下劃線并加粗。將編碼CA-SP1切割位點(diǎn)的七個(gè)上游氨基酸和七個(gè)下游氨基酸的42個(gè)核苷酸序列用綠色突出。將CA中切割位點(diǎn)上游的另外129個(gè)核苷酸(43個(gè)氨基酸殘基)和SP1中剩余的21個(gè)核苷酸(七個(gè)氨基酸殘基)突出。
圖20該研究中所用的SHIV的Gag蛋白和CA-SP1序列的圖示。在序列列表的頂端和底部各自顯示了SIV Mac239和HIV-1 NL4-3的CA-SP1切割位點(diǎn)兩側(cè)的序列。虛線(-)表示與親本SIV MAC239相同的殘基,(Δ)表示SHIV中缺失的SIV殘基。
圖21小組1-3SHIV的Gag加工特征的蛋白質(zhì)印跡分析。圖21A顯示了細(xì)胞相關(guān)病毒的Gag加工,而圖21B顯示了無(wú)細(xì)胞的病毒粒體的Gag加工特征。通過(guò)加號(hào)(+)來(lái)表示正常的Gag加工,而用減號(hào)(-)來(lái)表示缺陷的加工特征。
圖221μg/ml的DSB對(duì)衣殼前體CA-SP1轉(zhuǎn)化成成熟衣殼蛋白的作用的蛋白質(zhì)印跡分析。圖A中,使用恒定體積的細(xì)胞培養(yǎng)上清液獲得用于蛋白質(zhì)印跡的病毒。由于SHIV間病毒產(chǎn)生水平的差異,這導(dǎo)致病毒蛋白條帶強(qiáng)度的可變性。圖B顯示了當(dāng)提高用于蛋白質(zhì)印跡分析的病毒蛋白量時(shí)所獲得的Gag加工特征。在此只包括呈現(xiàn)正常Gag加工的SHIV。圖A中的星號(hào)(*)表示不能看到在放射自顯影中觀察到的SHIV GI的微弱CA-SP1條帶,然而,基于使用提高量的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析時(shí)所觀察到的結(jié)果,將該病毒的DSB敏感性評(píng)價(jià)為+/-(圖B)。
圖23A-H。HIV-1臨床分離株中CA-SP1區(qū)域的比對(duì),從“HIVSequence Compendium 2002”(HIV序列一覽表2002)獲得,Kuiken等編輯,Los Alamos National Laboratory,Los Alomos,NM。(www.hiv.lanl.gov)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的方法。更具體地,本發(fā)明涉及通過(guò)將感染的細(xì)胞接觸抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24蛋白(CA)的化合物來(lái)抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的方法。更具體地,這樣的化合物抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24蛋白(CA)而不顯著影響其他Gag加工步驟。
“不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物”意思是目標(biāo)化合物主要抑制p25加工成p24,但不必定排除對(duì)其他Gag加工步驟具有附加較小影響的可能性。
“顯著的”或“顯著地“,在沒(méi)有另外定義時(shí)意思是與不存在化合物的過(guò)程相比較可觀察的或可測(cè)量的改變。然而,不是所有可觀察的或可測(cè)量的改變必定是顯著的。
在本發(fā)明方法的實(shí)踐中,還可觀察到多種病毒表型。感染細(xì)胞與本發(fā)明化合物接觸的一種結(jié)果是形成非感染性的病毒顆粒??晒┻x擇地或另外地,感染細(xì)胞與抑制p25加工成p24的化合物的接觸,導(dǎo)致非感染性病毒顆粒的形成,但其中不存在對(duì)其他Gag加工步驟的顯著影響。這可能不顯著降低從處理細(xì)胞釋放的病毒量和/或?qū)σ脶尫挪《玖sw中的RNA量具有極小或沒(méi)有顯著影響。
因此,本發(fā)明還涉及抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1感染的方法,包括將所述細(xì)胞接觸上述抑制p25加工且還影響其他病毒表型的化合物。
已經(jīng)表明CA-SP1裂解缺陷的突變病毒是非感染性的(Wiegers K.等,J.Virol.722846-2854(1998))。3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)是破壞p25加工成p24且有效抑制HIV-1復(fù)制的化合物實(shí)例。該化合物的活性對(duì)p25加工成p24的步驟是特異性的,而不是Gag加工中的其他步驟。此外,DSB處理導(dǎo)致如圖3中所示的異常HIV顆粒形態(tài)。
1.鑒定與對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸敏感性相關(guān)的HIV-1決定因子(a)DSB抗性HIV-1病毒的產(chǎn)生和選擇已經(jīng)產(chǎn)生了HIV-1的突變形式,其中改變了CA-SP1切割位點(diǎn)區(qū)域中的氨基酸序列,降低了這些株對(duì)破壞CA-SP1加工的化合物的敏感性。關(guān)于這些突變病毒的數(shù)據(jù)已經(jīng)用于鑒定野生型Gag中涉及這些化合物抗病毒活性的氨基酸殘基。一實(shí)施方案中,破壞CA-SP1加工的化合物直接或間接抑制HIV-1蛋白酶與含有這些氨基酸殘基的Gag蛋白區(qū)域的相互作用。另一實(shí)施方案中,破壞CA-SP1加工的化合物結(jié)合含有這些氨基酸殘基的區(qū)域。如在此所用的,術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”或“結(jié)合的”指的是結(jié)合或連接,包括,例如,離子相互作用,靜電疏水相互作用,氫鍵等;還包括可能是共價(jià)的連接,例如,通過(guò)化學(xué)耦合。共價(jià)鍵可以是,例如,酯,醚,磷酸酯,硫酯,硫醚,尿烷,酰胺,胺,肽,亞酰胺,腙,酰肼,碳-硫鍵,碳-磷鍵等,術(shù)語(yǔ)“結(jié)合的”更寬泛并包括術(shù)語(yǔ)如“耦合的”,“綴合的”和“連接的”。
另一實(shí)施方案中,破壞CA-SP1加工的化合物結(jié)合Gag的另一個(gè)區(qū)域并因此抑制HIV-1蛋白酶與CA-SP1切割位點(diǎn)的區(qū)域的相互作用。另一實(shí)施方案中,含有CA-SP1切割位點(diǎn)區(qū)域突變的病毒或重組蛋白可以用于篩選試驗(yàn)中來(lái)鑒定破壞CA-SP1加工的化合物。
在一套實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)將已經(jīng)就對(duì)DSB抗性而選擇的病毒分離株的gag-pol基因測(cè)序來(lái)鑒定HIV-1Gag中涉及3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)破壞CA-SP1加工的氨基酸殘基。將這些抗性病毒的氨基酸序列與DSB-敏感HIV-1分離株的gag-pol基因序列相比較。在DSB-抗性病毒中鑒定出兩個(gè)單個(gè)氨基酸改變,殘基364處(SEQ IDNO4)丙氨酸(Ala)至纈氨酸(Val)的置換,和第二個(gè)分離株中,Gag多蛋白中的殘基366處(SEQ ID NO6)丙氨酸(Ala)至纈氨酸(Val)的置換(參見(jiàn)圖4)。這些殘基就位于CA-SP1切割位點(diǎn)的下游(在SP1的N-末端)。在Los Alamos National Laboratory數(shù)據(jù)庫(kù)中所列的所有HIV-1亞型中,在這些位置丙氨酸是高度保守的。在各種亞型中CA-SP1切割位點(diǎn)上游和下游的五個(gè)氨基酸殘基也是高度保守的。然而,在多個(gè)分化體中切割位點(diǎn)上游兩個(gè)殘基的位置異亮氨酸置換了纈氨酸(參考圖4,SEQ ID NO1)(“HIV Sequence Compendium2002”(HIV序列一覽表2002),Kuiken等編輯,Los Alamos NationalLaboratory,Los Alamos,NM)。
為了更大范圍地將DSB抗性病毒基因決定因子作圖,進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)來(lái)體外選擇藥物抗性的病毒。在10-50ng/ml DSB存在或不存在下,用原病毒DNA克隆pNL4-3轉(zhuǎn)染Jurkat T細(xì)胞(各5×105)的多個(gè)平行培養(yǎng)物。將細(xì)胞每?jī)商靷鞔?,每次傳代加入新鮮藥物。通過(guò)測(cè)量培養(yǎng)物上清液中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性來(lái)監(jiān)測(cè)病毒復(fù)制。從選定時(shí)間點(diǎn)收集的培養(yǎng)物上清液中分離病毒,并通過(guò)RT-PCR來(lái)擴(kuò)增基因組DNA,使用跨越CA N-端和RT N-端之間的編碼區(qū)域的引物。然后使用相同組的引物將所擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
一實(shí)驗(yàn)中,在DSB存在下培養(yǎng)的NL4-3病毒的SP1區(qū)域中鑒定出A366V突變(注釋編號(hào)相對(duì)于Gag多蛋白)。在進(jìn)一步傳代時(shí),鑒定出含有CA中G357S突變以及SP1中A366V突變的雙重突變體。之前在選擇RF分離株的抗性變體的實(shí)驗(yàn)中鑒定出A366V突變。令人感興趣的,野生型RF序列在CA的位置357還含有絲氨酸殘基(圖4)。因?yàn)镈SB敏感分離株(如RF)中的這個(gè)位置存在絲氨酸,單獨(dú)的CA G357S不足以賦予對(duì)DSB的抗性。為了測(cè)定這些突變中每個(gè)對(duì)藥物抗性的貢獻(xiàn),通過(guò)定點(diǎn)誘變將A366V突變和A366V/G357S雙突變重新工程化至野生型NL4-3主鏈中。將所得到的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至Jurkat T細(xì)胞中并在上述用于抗性選擇的病毒復(fù)制試驗(yàn)中來(lái)表征。對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物和釋放至培養(yǎng)基中的病毒的SDFS-PAGE分析證明了A366V突變體Gag無(wú)效地加工和從細(xì)胞中釋放(數(shù)據(jù)未顯示),因此即使在藥物不存在下復(fù)制也非常差(圖11)。然而,在DSB缺乏或存在下,A366V/G357S雙突變體有效復(fù)制。這些數(shù)據(jù)表明抗性突變體A366V需要Gag CA區(qū)域中357位置的絲氨酸來(lái)補(bǔ)償對(duì)病毒復(fù)制的不利影響(圖11)。
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中,產(chǎn)生了十個(gè)不同的抗性分離株。對(duì)這些分離株的測(cè)序鑒定出之前在抗性選擇實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有看到的四個(gè)另外的突變,這些是CA中的H358Y,L363F和L363M,和Gag NC區(qū)域中的A402T。這些突變中沒(méi)有一個(gè)存在于HIV-1分化體A-O的共有序列中,反映出DSB對(duì)抗HIV-1遺傳不同分化體的活性寬度。在HIV-2的共有序列中發(fā)現(xiàn)CA中的L363M置換,其可以部分解釋DSB對(duì)于HIV-1的特異性。
這些結(jié)果證明HIV-1中對(duì)DSB活性的特異性基因決定因子的存在,且這些決定因子集中圍繞CA-SP1切割位點(diǎn)。
(a)用于鑒定DSB敏感性的病毒基因決定因子的HIV-1 NL4-3缺失和SIV插入研究體外抗性選擇實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明DSB HIV-1抑制活性的決定因子作圖到CA-SP1切割位點(diǎn)兩側(cè)的Gag區(qū)域。為了更好地定義對(duì)DSB的病毒基因決定因子,采用HIV-1點(diǎn)缺失誘變和SIV插入研究來(lái)鑒定與化合物活性相關(guān)的特定氨基酸殘基。如下進(jìn)行研究。將開(kāi)始于殘基E365并持續(xù)至殘基M377的單個(gè)殘基缺失工程化至感染性HIV-1分子克隆NL4-3的SP1結(jié)構(gòu)域中(圖12)。測(cè)定這些點(diǎn)缺失對(duì)病毒顆粒產(chǎn)生、感染性、Gag加工和對(duì)DSB敏感性的作用。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用于鑒定CA-SP1切割位點(diǎn)區(qū)域中與DSB活性相關(guān)的Gag殘基。將與活性相關(guān)的殘基插入DSB-抗性病毒SIV(Mac 239分離株)的CA-SP1切割位點(diǎn)區(qū)域中來(lái)產(chǎn)生HIV-1,SIV嵌合病毒(SHIV)。將CA蛋白N-端的HIV-1殘基的點(diǎn)置換引入該嵌合病毒直至鑒定出挽救DSB活性所必需的最小序列。認(rèn)為獲得DSB活性所需要的該最小序列是DSB活性的主要病毒基因決定因子。其可以表明DSB活性的分子決定因子。
1.方法(a)NL4-3單個(gè)點(diǎn)缺失突變體的構(gòu)建使用之前所述的PCR-連接-PCR(PLP)策略來(lái)產(chǎn)生單個(gè)點(diǎn)缺失構(gòu)建體。將HIV-1 NL4-3質(zhì)粒DNA用作模板來(lái)進(jìn)行所有PCR反應(yīng),用于產(chǎn)生跨越完整Gag SP1結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)缺失,除了SP1的第一個(gè)殘基。
將NL4-3用作模板使用Vent DNA聚合酶(NEB)來(lái)產(chǎn)生ΔE365,使用缺失-特異性下游引物(引物1)和通用上游引物(引物2)(表1)。源于此的片段稱(chēng)為第一個(gè)側(cè)翼PCR片段。使用缺失-特異性上游引物(引物3)和通用下游引物(引物4)(表1)來(lái)擴(kuò)增第二個(gè)側(cè)翼片段。為了產(chǎn)生其他缺失構(gòu)建體(ΔA366,ΔM367,ΔS368,ΔQ369,ΔV370,ΔT371,ΔN372,ΔP373,ΔA374,ΔT375,ΔI376和ΔM377),通過(guò)改變對(duì)應(yīng)于每個(gè)特定點(diǎn)缺失的缺失-特異性下游和上游引物(表1)來(lái)相似進(jìn)行PCR程序。
這些平行的兩個(gè)鄰近的PCR片段各自凝膠純化,使用T4多核苷酸激酶(NEB)來(lái)磷酸化,并使用T4 DNA連接酶(NEB)連接。在65℃滅活15分鐘后,將連接反應(yīng)用于隨后的擴(kuò)增,使用通用上游引物(引物2)和下游引物(引物4)。將該產(chǎn)物凝膠純化,用SpeI和ApaI消化,然后連接至NL4-3原病毒DNA克隆的SpeI和ApaI位點(diǎn)。
將標(biāo)準(zhǔn)PCR條件用于上述反應(yīng)中。這些包括,95℃變性1分30秒的一個(gè)循環(huán),接著95℃變性30秒、60℃30秒和72℃30秒的30個(gè)循環(huán)。使用以下成分來(lái)建立PCR反應(yīng)5μL 10×NEB耐熱緩沖液2μL 10mM dNTPs1μL 100nM MgSO21μL 50pmol上游引物1μL 50pmol下游引物1μL 50ng/μL模板DNA0.5μL Vent DNA聚合酶38.5μL ddH2O將10μL等分試樣在1.0%的瓊脂糖凝膠上跑膠來(lái)確保正確大小的產(chǎn)物得到擴(kuò)增。然后用Qiaex II凝膠提取試劑盒(Qiagen)將PCR產(chǎn)物凝膠分離并純化。在連接之前將凝膠純化的兩個(gè)鄰近的PCR片段在以下反應(yīng)中使用T4多核苷酸激酶(NEB)來(lái)各自磷酸化。如下建立磷酸化反應(yīng)2μL 10×T4多核苷酸激酶緩沖液2μL 10mM ATP1μL T4多核苷酸激酶15μL這兩個(gè)鄰近PCR片段中每個(gè)的凝膠純化DNA將反應(yīng)在37℃溫育1小時(shí)。在65℃滅活10分鐘后,使用T4 DNA連接酶(NEB)在以下條件下將鄰近的磷酸化PCR片段連接在一起3L 10×T4 DNA連接酶緩沖液13μL兩個(gè)鄰近PCR片段中的每個(gè)1μL T4 DNA連接酶在16℃溫育過(guò)夜后,將連接反應(yīng)產(chǎn)物用于第二輪的PCR反應(yīng)中來(lái)擴(kuò)增跨越這兩個(gè)鄰近PCR產(chǎn)物的全長(zhǎng)PCR片段。如上所述進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng),除了只使用通用上游引物(引物2)和下游引物(引物4),再次,將10μL等份試樣在瓊脂糖凝膠上跑膠來(lái)確保正確的產(chǎn)物得到擴(kuò)增。然后使用Qiaex II試劑盒將全長(zhǎng)PCR片段凝膠分離并純化。然后用SpeI和ApaI在以下條件下切割經(jīng)純化的全長(zhǎng)PCR片段以及NL4-32μL 10×NE緩沖液4(NEB)1μL ApaI(NEB)1μL SpeI(NEB)16μL全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物(1μg)或NL4-3(500ng)將上述限制酶消化混合物在37℃溫育2小時(shí)。使用Qiaex II試劑盒將全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物和NL4-3質(zhì)粒的消化DNA片段單獨(dú)凝膠分離并純化。使用T4 DNA連接酶在以下條件下連接消化的載體NL4-3和全長(zhǎng)PCR片段1μL 10×T4 DNA連接酶緩沖液1μL(25-50ng)經(jīng)消化的NL4-3載體7μL經(jīng)消化的(200ng-400ng)消化的PCR片段(700bp)1μL T4 DNA連接酶將連接反應(yīng)在16℃溫育過(guò)夜,根據(jù)說(shuō)明(Invitrogen)通過(guò)熱休克將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(Escherila coli)Max EfficiencyStb12(Invitrogen)中。然后各自使用Taq染料脫氧終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Biosystems)通過(guò)自動(dòng)化測(cè)序來(lái)篩選原病毒DNA克隆,使用內(nèi)在引物(引物29和30)。驗(yàn)證突變后,將原病毒DNA克隆用于各種將來(lái)的研究中。
1.SIV嵌合突變體的構(gòu)建通過(guò)使用上述的PCR和克隆程序,使用SIVmac 239分子克隆產(chǎn)生一組帶有NL4-3 CA-SP1邊界區(qū)域的各種殘基的SIV嵌合構(gòu)建體。這些構(gòu)建體及其CA-SP1邊界區(qū)域中的氨基酸序列顯示于圖15中。SIVmac 239用于產(chǎn)生SIV DD和DE構(gòu)建體。SIV DD構(gòu)建體用于產(chǎn)生SIV DM。在PCR中通過(guò)改變各自對(duì)應(yīng)于每種嵌合體的誘變上游和下游引物(表1)來(lái)產(chǎn)生不同的SIV嵌合構(gòu)建體。將這些平行的兩個(gè)鄰近PCR片段中的每個(gè)凝膠純化且不經(jīng)磷酸化處理直接用于隨后的擴(kuò)增,使用通用上游引物(引物31)和下游引物(引物32)。將該產(chǎn)物凝膠純化,用BamHI和SbfI純化,然后連接入SIVmac 239原病毒DNA克隆的BamHI和SbfI位點(diǎn)。然后各自使用Taq染料脫氧終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Biosystems)通過(guò)自動(dòng)化測(cè)序來(lái)篩選原病毒DNA克隆,使用內(nèi)在引物(引物39)。驗(yàn)證突變后,將原病毒DNA克隆用于各種將來(lái)的研究中。
2.細(xì)胞培養(yǎng)和DNA轉(zhuǎn)染將HeLa細(xì)胞維持于DMEM(Invitrogen)中(10%FBS,100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)并在匯合時(shí)傳代。將Jurkat細(xì)胞在RPMI1640(Invitrogen)(10%FBS,100U/ml青霉素和100g/ml鏈霉素)中培養(yǎng)且每?jī)商旎蛉靷鞔?br> 為了表征缺失或置換對(duì)病毒顆粒產(chǎn)生和Gag多蛋白加工的作用,使用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)將野生型HIV-1 NL4-3或SIVmac239和各自的突變?cè)《綝NA轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中。簡(jiǎn)而言之,在轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞以0.5×105每孔的濃度接種于6-孔平板(Corning)中以在轉(zhuǎn)染那天達(dá)到60至80%匯合。對(duì)于每次轉(zhuǎn)染,將3μl FuGENE 6稀釋至100μl無(wú)血清DMEM中,接著加入1μg DNA。輕微混合后,將DNA-脂質(zhì)復(fù)合物的混合物溫和地逐滴加入含有2ml完全DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí),除去含有DNA-FuGENE 6復(fù)合物的培養(yǎng)基,將2ml新鮮DMEM加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)時(shí),收集含有病毒顆粒的培養(yǎng)基并通過(guò)在Sorvall RT 6000B離心機(jī)中2,000rpm4℃離心20分鐘來(lái)澄清。然后將含有病毒顆粒的上清液通過(guò)微離心機(jī)中的20%蔗糖墊13,000rpm4℃20分鐘來(lái)濃縮,并將沉淀物重懸浮于裂解緩沖液中(150mM Tris-HCl,5%曲通X-100,1%去氧膽酸鹽,pH8.0)。通過(guò)p24抗原捕獲ELISA(ZeptoMetrix,Buffalo,NY)來(lái)測(cè)定野生型NL4-3和點(diǎn)缺失突變體的病毒顆粒的產(chǎn)生水平。
為了檢測(cè)缺失或置換對(duì)Gag多蛋白加工的作用(在DSB不存在下),進(jìn)行了sDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡。簡(jiǎn)而言之,將病毒蛋白在12%NuPAGEBis-Tris凝膠(Invitrogen)上分離并轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜(Invitrogen),接著在含有0.5%吐溫和5%奶粉的PBS緩沖液中封閉。用HIV-1-感染患者的免疫球蛋白(HIV-Ig)(NIH AIDS research andreference reagent program)來(lái)溫育膜并用山羊抗人辣根過(guò)氧化物酶(Sigma)來(lái)雜交。對(duì)于含有SIV蛋白的膜。用SIV-感染猴子的參照多克隆免疫血清(NIH AIDS Research and Reference ReagentProgram)來(lái)溫育膜并用山羊抗猴辣根過(guò)氧化物酶(Sigma)來(lái)雜交。根據(jù)制造商提供的說(shuō)明使用ECL系統(tǒng)(Amersham Pharmacis Biotech)來(lái)觀察免疫復(fù)合物。
為了確定缺失或置換對(duì)DSB抑制CA-SP1加工的能力的作用,使用上述的程序用野生型HIV-1 NL4-3或SIVmac239及其各自的突變?cè)《綝NA來(lái)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。在整個(gè)培養(yǎng)中維持1μg/ml濃度的DSB和DMSO對(duì)照,如之前段落中所述的進(jìn)行SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡,用于分析這些轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的病毒蛋白。
將每ml 50%-組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)用作每個(gè)缺失突變體的感染性的衡量指標(biāo)。將HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的突變病毒用于感染U87CD4.CXCR4細(xì)胞。將每種病毒原種以1∶10的起始稀釋度重復(fù)測(cè)試三次,接著四倍連續(xù)稀釋。在感染前一天將細(xì)胞以3×103細(xì)胞/孔的密度平板接種。在感染那天,從細(xì)胞平板中除去培養(yǎng)基并加入90μl稀釋的病毒。在感染后第1,3和6天,從平板中取出病毒并加入200μl培養(yǎng)基。在感染后第6和8天,收集上清液用于p24 ELISA分析。根據(jù)Reed和Muench的方法(Aldovini A.和B.Walker 1990;DulbeccoR.1988)測(cè)定導(dǎo)致50%培養(yǎng)物受到感染的病毒稀釋度(TCID50)。
3.結(jié)果表征在Gag SP1結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有連續(xù)點(diǎn)缺失的病毒(圖12)的顆粒生產(chǎn),感染性,Gag加工和對(duì)DSB的敏感性。將這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用于鑒定與DSB活性相關(guān)的SP1殘基。
如所預(yù)期的,點(diǎn)缺失對(duì)病毒顆粒產(chǎn)生的作用隨著該改變距蛋白酶解切割位點(diǎn)的接近性而改變。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)于圖13中。在殘基E366,A367和M368缺失的病毒受到最大影響,產(chǎn)生<25%通常在野生型病毒感染中觀察到的顆粒數(shù)目。體外感染性試驗(yàn)用于表征缺失突變體支持病毒復(fù)制的能力。這些實(shí)驗(yàn)表明E365至Q369五個(gè)位置中任一個(gè)的單個(gè)殘基缺失導(dǎo)致產(chǎn)生非感染性或復(fù)制顯著削弱的病毒(圖13)。相反,開(kāi)始于殘基V370并遠(yuǎn)離CA-SP1切割位點(diǎn)延伸,沒(méi)有一個(gè)表征的點(diǎn)缺失導(dǎo)致病毒感染性的降低(圖13)。除了在位置I376和M377缺失的病毒,所有突變病毒呈現(xiàn)出正?;蚪咏5腉ag加工表型(圖13)。這三套實(shí)驗(yàn)的結(jié)果允許設(shè)計(jì)并解釋鑒定DSB活性的基因決定因子的實(shí)驗(yàn)。
在表征DSB對(duì)Gag加工晚期步驟即CA-SP1裂解的作用的實(shí)驗(yàn)中測(cè)定對(duì)DSB的敏感性。具體地,這些試驗(yàn)測(cè)量了DSB破壞CA-SP1加工的能力。如所看到的,例如,實(shí)施例8,DSB誘導(dǎo)的Gag加工中的缺陷與化合物抑制病毒復(fù)制的能力相關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明E365至V370六個(gè)位置中任一個(gè)的單個(gè)殘基缺失顯著降低DSB對(duì)CA-SP1加工的影響(圖14)。相反,開(kāi)始于殘基T372并遠(yuǎn)離CA-SP1切割位點(diǎn)延伸,所有表征的點(diǎn)缺失對(duì)DSB誘導(dǎo)的CA-SP1加工破壞完全敏感(圖14)。
與DSB活性相關(guān)的SP1殘基由E365至V370的連續(xù)殘基組成。
將殘基A364至V370插入DSB-抗性逆轉(zhuǎn)錄病毒SIV(Mac 239分離株)中Gag SP1結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似位置。另外,通過(guò)用HIV-1特異性殘基累積置換SIV中發(fā)現(xiàn)的殘基來(lái)改變?cè)撉逗喜《镜腃A蛋白的N-端。該方法概述于圖5中。接著,測(cè)定DSB對(duì)每個(gè)嵌合病毒Gag加工表型的作用。如圖15中所示的,SIV.DM病毒展示出表明對(duì)DSB敏感性的Gag加工表型。因此,SHIV中恢復(fù)DSB活性需要插入的HIV-1 CA-SP1特異性殘基的最小序列從V362延伸至V370。
表1.PCR誘變引物
以上呈現(xiàn)的抗性和誘變數(shù)據(jù)表明HIV-1 Gag CA-SP1切割位點(diǎn)區(qū)域中的GHKARVL-AEAMSQV氨基酸序列作為病毒對(duì)DSB敏感性的基因決定因子。
將Dsb敏感性的決定因子擴(kuò)展至其他慢病毒Ca-Sp1嵌合體作為動(dòng)物功效模型用于研發(fā)突變抑制劑抗HIV治療的發(fā)展受到缺乏動(dòng)物功效模型的阻礙。這種動(dòng)物模型的缺乏主要是由于大部分HIV-1株在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中不能復(fù)制并導(dǎo)致疾病。一些情況中,通過(guò)使用將HIV-1病毒靶標(biāo)的感興趣區(qū)域引入支持在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中復(fù)制的SIV病毒主鏈中的嵌合病毒克服了該問(wèn)題。該方法最值得注意的實(shí)例涉及HIV-1/SIV(SHIV)嵌合病毒,其中構(gòu)成感染性病毒的蛋白全部是SIV來(lái)源,除了Env(gp120/gp41),其源自HIV-1。這些SHIV包膜嵌合體已經(jīng)廣泛用于HIV-1疫苗研發(fā)中。
HIV-1成熟抑制劑破壞Gag CA-SP1加工,其導(dǎo)致呈現(xiàn)異常核心形態(tài)的非感染性病毒顆粒的形成和釋放。參見(jiàn),例如,Li等,Proc NatlAcad Sci U S A.10013555-60(2003)。樺木酸衍生物DSB是這類(lèi)抑制劑的一個(gè)實(shí)例。將與成熟抑制劑活性相關(guān)的關(guān)鍵病毒基因決定因子作圖到HIV-1 CA-SP1切割位點(diǎn)兩側(cè)的氨基酸殘基。將該決定因子引入DSB抗性非HIV-1病毒的CA-SP1切割位點(diǎn)時(shí),形成成熟抑制劑敏感的嵌合體。這些CA-SP1嵌合病毒作為HIV-1成熟抑制劑動(dòng)物功效模型的基礎(chǔ)。
將成熟抑制劑敏感性需要的HIV-1 CA-SP1區(qū)域引入選定的慢病毒中。將作為DSB敏感性決定因子的HIV-1 CA-SP1連接處的氨基酸殘基用于替換猴免疫缺陷病毒(SIV)基因組中的相應(yīng)CA-SP1氨基酸。相似地,可將作為DSB決定因子的HIV-1 CA-SP1連接處的氨基酸殘基在貓免疫缺陷病毒(FIV),牛免疫缺陷病毒(BIV),馬傳染性貧血病病毒(EIAV),Visna-Maedi和山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)中替換。表2描繪了HIV-1,SIV,F(xiàn)IV,EIAV和BIV在CA-SP1切割位點(diǎn)區(qū)域中的Gag多肽序列。
表2.HIV-1與SIV,F(xiàn)IV,EIAV和BIV的CA-SP1切割位點(diǎn)區(qū)域的序列比較
用于替換的HIV-1 CA-SP1序列如下CA SP1GHKARVL AEAMSQV(SEQ ID NO80)
上述用于產(chǎn)生SHIV CA-SP1嵌合原病毒DNA克隆的方法用于產(chǎn)生含有替代相應(yīng)野生型序列的來(lái)自HIV-1 CA-SP1區(qū)域的選定殘基或延伸區(qū)域的FIV,EIAV和BIV原病毒克隆(圖16)。
使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)定點(diǎn)誘變來(lái)產(chǎn)生SHIV CA-SP1嵌合原病毒DNA克隆。簡(jiǎn)而言之,鑒定出SIV Gag中CA-SP1區(qū)域周?chē)莫?dú)特限制酶位點(diǎn),即,BamHI(基質(zhì)中)和Sbf-I(NC中)。從其中打算誘變的CA-SP1區(qū)域開(kāi)始,合成兩個(gè)在其5’端引入突變序列即HIVCA-SP1的重疊引物,一個(gè)正向和一個(gè)反向引物。使用野生型SIV原病毒DNA作為模板,建立兩個(gè)分開(kāi)的PCR反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增自誘變位點(diǎn)(CA-SP1區(qū)域)任一方向的SIV-Gag片段,即產(chǎn)生在突變CA-SP1區(qū)域中重疊的兩個(gè)擴(kuò)增片段,Bam HI-CA-SP1區(qū)域和CA-SP1-Sbf-I片段。在第三個(gè)PCR反應(yīng)中,將Bam HI-CA-SP1和CA-SP1-Sbf-I片段在它們共同的HIV-CA-SP1序列退火并用正向SIV Bam HI引物和反向SIV Sbf-I引物擴(kuò)增來(lái)產(chǎn)生全長(zhǎng)嵌合SHIV CA-SP1 gag片段。將嵌合SHIV CA-SP1 PCR片段克隆至SIV原病毒克隆的BamHI-Sbf-I窗口中替代SIV-Gag野生型序列來(lái)產(chǎn)生SHIV CA-SP1原病毒cDNA克隆。
相似地,已經(jīng)鑒定出FIV(Genbank登錄號(hào)#NC_001482),EIAV(GA#AF016316)和BIV(GA#M32690)基因組中CA-SP1區(qū)域周?chē)莫?dú)特限制酶克隆位點(diǎn)(圖16)。合成特異性FIV/EIAV/BIV-HIV1CA-SP1嵌合引物和引入特異性克隆位點(diǎn)序列的FIV,EIAV或BIV的基因組特異性引物。這些引物連同相應(yīng)的原病毒DNA克隆作為模板(FIV,EIAV或BIAV)在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生嵌合HIV-1 CA-SP1片段。用合適的限制酶消化嵌合HIV-1 CA-SP1片段并克隆至FIV原病毒的SacI-EcoRI窗口;或(ii)EIAV原病毒的KasI-EcoRV窗口;或(iii)BIV原病毒的BsrGI-ApaI窗口,替代相應(yīng)的野生型序列(圖16)。將嵌合的FIV/EIAV/BIV-HIV-1 CA-SP1原病毒DNA克隆測(cè)序來(lái)證實(shí)目標(biāo)突變的存在?;谒^察到的表明DSB敏感性轉(zhuǎn)移的結(jié)果,使用上述策略產(chǎn)生另外的構(gòu)建體以便優(yōu)化結(jié)果。
總之,產(chǎn)生嵌合病毒,其中HIV-1成熟抑制劑敏感性的CA-SP1決定因子已經(jīng)替代成熟抑制劑抗性猴免疫缺陷病毒(SIV)中Gag的類(lèi)似區(qū)域。該HIV-1區(qū)域轉(zhuǎn)移至SIV基因組中形成成熟抑制劑敏感性表型。用該HIV-1/SIV嵌合病毒感染非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物應(yīng)形成動(dòng)物功效模型,用于成熟抑制劑的治療研發(fā)。
類(lèi)似方法用于制備和表征與FIV,BIV和EIAV的HIV-1 CA-SP1嵌合體。這些其他的DSB敏感嵌合病毒應(yīng)當(dāng)能夠開(kāi)發(fā)產(chǎn)生另外的動(dòng)物功效模型,用于HIV-1成熟抑制劑的研究。
突變體和嵌合病毒的用途如上所述的本發(fā)明的突變體和嵌合病毒用于各種基于細(xì)胞的以及基于動(dòng)物的試驗(yàn)中。
通過(guò)比較DSB抗性病毒相關(guān)的表型和DSB敏感病毒相關(guān)的表型,可以鑒定出通過(guò)與DSB相似機(jī)理起作用的化合物。因此,本發(fā)明包括鑒定抑制野生型HIV-1中p25裂解成p24但不抑制在CA-SP1區(qū)域中含有缺失的HIV-1中的CA-SP1加工的化合物的方法。通過(guò)這樣的方法獲得的化合物也包括于本發(fā)明中。
SIV和其他不容易感染人的慢病毒的嵌合體具有另外的優(yōu)勢(shì)。首先,這些病毒對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作者具有較低的安全性危害。結(jié)果,例如,可以以較低的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行基于細(xì)胞的測(cè)試來(lái)鑒定抑制CA-SP1加工的新化合物。較低的風(fēng)險(xiǎn)使得可以進(jìn)行使用HIV不容易或不安全進(jìn)行的測(cè)試,并且還可以降低這些測(cè)試的成本。
此外,這樣的嵌合病毒可用于動(dòng)物模型中。例如,DSB敏感的嵌合SIV可以用于鑒定抑制CA-SP1加工的新化合物,例如,來(lái)鑒定用于治療疾病的藥物組合物,給藥途徑和給藥方案;和用于研究聯(lián)合治療的效果,如DSB和蛋白酶抑制劑聯(lián)合。
因?yàn)镾IV通常限于感染猴子,例如,其他慢病毒嵌合體的產(chǎn)生使得允許在較便宜的、更易操作、具有較快疾病進(jìn)展或?qū)τ谌祟?lèi)疾病的特定方面更合適的動(dòng)物中進(jìn)行動(dòng)物研究。
此外,動(dòng)物模型可用于鑒定用于治療動(dòng)物疾病的合適藥物組合物,感興趣的在于治療伴侶動(dòng)物和其他高價(jià)值動(dòng)物,如農(nóng)業(yè)種畜和賽馬。
嵌合病毒可以源自任何逆轉(zhuǎn)錄病毒。例如,衍生的HIV-2,HTLV-I,HTLV-II,SIV,禽類(lèi)白血病病毒(ALV),內(nèi)源性禽類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒(EAV),小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV),貓免疫缺陷病毒(FIV),牛免疫缺陷病毒(BIV),山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV),馬傳染性貧血病病毒(EIAV),Visna-maedi病毒和貓白血病病毒(FeLV)。
這樣的嵌合病毒可用于本文別處所述的本發(fā)明的方法中。例如,這樣的重組非-HIV-1慢病毒可以用于鑒定抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物的方法中,該方法包括比較所述化合物抑制野生型非-HIV-1慢病毒與其DSB-敏感性重組變體的復(fù)制的能力。這樣的抑制可以發(fā)生在細(xì)胞中;動(dòng)物中;或體外。
具有表位標(biāo)記的病毒或多肽的構(gòu)建和用途本發(fā)明還涉及在Gag的CA-SP1區(qū)域中具有表位標(biāo)記的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒??梢詫⒈砦粯?biāo)記插入CA結(jié)構(gòu)域和/或SP1結(jié)構(gòu)域中。合適的標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的,并包括血細(xì)胞凝集素表位HA(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO81),藍(lán)舌病病毒表位VP7(QYPALT)(SEQID NO82),α-微管蛋白表位(EEF),F(xiàn)lag(DYKDDDDK)(SEQ IDNO83)和VSV-G(YTDIEMNRLGK)(SEQ ID NO84)。圖17中說(shuō)明了含有表位標(biāo)記的SP1實(shí)例。
這樣的表位標(biāo)記的病毒及其片段可用于體外在基于細(xì)胞的測(cè)試中和體內(nèi)包括在動(dòng)物模型中鑒定抑制CA-SP1加工的新化合物。本文別處描述了這樣的表位標(biāo)記的病毒及其片段的其他用途。
本發(fā)明的多核苷酸,多肽和抗體本發(fā)明還包括分離的多肽和多核苷酸。一實(shí)施方案中,本發(fā)明包括與選自以下的氨基酸序列至少約40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,99%或100%相同的多肽
(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26);(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)本發(fā)明的另一實(shí)施方案中包括編碼上述多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括簡(jiǎn)并變體,如密碼子的第三個(gè)堿基不同但由于編碼“簡(jiǎn)并性”仍編碼相同氨基酸的那些。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)“約”指的是比所述值大或小10%的值,優(yōu)選大或小5%。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸可用于本發(fā)明的方法中。一方面中,它們可以用于體外測(cè)試中來(lái)鑒定結(jié)合Gag CA-SP1區(qū)域的化合物。另一方面中,它們可以用于產(chǎn)生在本文別處所述的其他方法中有用的抗體。另一方面中,可以將多核苷酸插入載體中,隨即插入宿主細(xì)胞中用于產(chǎn)生多肽。上述實(shí)施方案是示范性的并不是用來(lái)限制。
本發(fā)明包括多核苷酸,該多核苷酸包括編碼含有HIV Gag p25蛋白(CA-SP1)突變的氨基酸序列的序列,所述突變導(dǎo)致DSB對(duì)p25(CA-SP1)加工成p24(CA)的抑制降低。本發(fā)明的多核苷酸包括突變,其可選地位于或接近CA-SP1切割位點(diǎn)或位于CA-SP1的SP1結(jié)構(gòu)域中。所述突變可以存在于選自GHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO2)和SHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO3)的氨基酸序列中。本發(fā)明的多核苷酸還涉及指定為SEQ ID NO4,SEQ ID NO6,SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的序列。本發(fā)明還包括含有所述多核苷酸的載體,含有所述載體的宿主細(xì)胞和產(chǎn)生所述多肽的方法,該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞并從培養(yǎng)基中回收多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步包括在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自SEQ ID NO4,SEQ IDNO6,SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的多核苷酸雜交的多核苷酸。本發(fā)明還包括與SEQ ID NO5,SEQ ID NO7或SEQ ID NO10或12雜交的多核苷酸,其含有突變,該突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工成p24的抑制降低,且其中所述突變可選地位于或接近CA-SP1切割位點(diǎn)或位于CA-SP1的SP1結(jié)構(gòu)域中。本發(fā)明還涉及含有所述多核苷酸的載體,含有所述載體的宿主細(xì)胞和產(chǎn)生所述多肽的方法,該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞并從培養(yǎng)基中回收所述多肽。
如在此關(guān)于多肽所用的“接近”或“鄰近”,意思是從參照點(diǎn)起包括約50,約25,約20或約15個(gè)殘基。例如,接近可以包括HIV-1Gag CA-SP1切割位點(diǎn)任一側(cè)的約50,約25,約20或約15個(gè)殘基;更優(yōu)選HIV-1 Gag CA-SP1切割位點(diǎn)任一側(cè)的約十個(gè)殘基;最優(yōu)選HIV-1Gag CA-SP1切割位點(diǎn)任一側(cè)的約七個(gè)殘基。關(guān)于多核苷酸,術(shù)語(yǔ)“接近”或“鄰近”指的是距參照點(diǎn)約150,約75,約60,約45或約30個(gè)核苷酸。
“分離的”意思是“通過(guò)人的手”從天然狀態(tài)改變的。如果組合物或物質(zhì)天然存在,當(dāng)以其“分離”形式發(fā)現(xiàn)時(shí),其已經(jīng)從其原始環(huán)境發(fā)生改變或取出或這兩者。此外,本發(fā)明“分離的”核酸分子意思是已經(jīng)從其天然環(huán)境中取出的核酸分子,DNA或RNA。例如,對(duì)于本發(fā)明的目的而言,認(rèn)為載體中所含的重組DNA分子是分離的。分離的DNA分子的更多實(shí)例包括異種宿主細(xì)胞中維持的重組DNA分子或溶液中(部分或基本上)純化的DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明的分離核酸分子進(jìn)一步包括合成產(chǎn)生的這類(lèi)分子。
“多核苷酸”通常指的是任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸,其可以是未修飾的RNA或DNA或修飾過(guò)的RNA或DNA?!岸嗪塑账帷卑?,但不限制于單鏈和雙鏈DNA,為單-和雙-鏈區(qū)域混合物的DNA,單-和雙-鏈RNA,以及為單-和雙-鏈區(qū)域混合物的RNA,包括DNA和RNA的雜交分子,其可以是單鏈,或更常見(jiàn)為雙鏈,或單-和雙-鏈區(qū)域的混合物。此外,“多核苷酸”還指含有RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)域。術(shù)語(yǔ)多核苷酸還包括含有一個(gè)和多個(gè)經(jīng)修飾堿基的DNA或RNA和為了穩(wěn)定性或其他原因主鏈經(jīng)修飾的DNA或RNA?!靶揎椀摹眽A基包括,例如,氚化的堿基和不常用的堿基如次黃嘌呤核苷。對(duì)DNA和RNA已作出各種修飾;因此,“多核苷酸”包含通常天然發(fā)現(xiàn)的多核苷酸的化學(xué)、酶促和代謝修飾的形式,以及病毒和細(xì)胞特征性的DNA和RNA的嵌合形式。“多核苷酸”還包含相對(duì)短的多核苷酸,通常稱(chēng)為寡核苷酸。
“多肽”指的是包括兩個(gè)或多個(gè)通過(guò)肽鍵或修飾的肽鍵相互連接的氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì),即肽等排體。“多肽”既指短鏈,通常稱(chēng)為肽,寡肽或寡聚物,也指更長(zhǎng)的鏈,通常稱(chēng)為蛋白質(zhì)。多肽可以含有20個(gè)基因編碼氨基酸以外的氨基酸?!岸嚯摹卑ㄍㄟ^(guò)天然過(guò)程修飾的氨基酸序列,如翻譯后加工,或通過(guò)本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)改變的氨基酸序列。在基礎(chǔ)教科書(shū)和更詳細(xì)的專(zhuān)題論文,以及大量研究文獻(xiàn)中充分描述了這樣的修飾。修飾可以發(fā)生在多肽的任何位置,包括肽主鏈,氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。將認(rèn)識(shí)到相同類(lèi)型的修飾可以以相同或不同程度存在于給定多肽的幾個(gè)位點(diǎn)。此外,給定多肽可以含有多種類(lèi)型的修飾。作為遍在蛋白化的結(jié)果多肽可以是分枝的,且它們可以是環(huán)狀的,具有或不具有分枝。環(huán)狀,分枝和分枝環(huán)狀的多肽可以由翻譯后天然過(guò)程形成或由合成方法制得。修飾包括乙?;?,?;?,ADP-核糖化,酰胺化,核黃素的共價(jià)連接,血紅素部分的共價(jià)連接,核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接,脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接,磷脂酰肌醇的共價(jià)連接,交聯(lián),環(huán)化,二硫鍵形成,脫甲基,共價(jià)交聯(lián)的形成,胱氨酸的形成,焦谷氨酸的形成,甲?;?,γ-羧化,糖基化,GPI錨形成,羥基化,碘化,甲基化,肉豆蔻?;?,氧化,蛋白酶解加工,磷酸化,異戊烯化,外消旋,selenoylation,硫酸化,轉(zhuǎn)移RNA-介導(dǎo)的氨基酸添加至蛋白如精氨酰化和遍在蛋白化。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)“突變體”是分別不同于參照多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽。通常的多核苷酸突變體的核苷酸序列不同于另一個(gè)參照多核苷酸。突變體核苷酸序列中的改變可以改變或不改變參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸改變可以導(dǎo)致參照序列編碼的多肽中氨基酸置換,添加,缺失,融合和截短,如下所討論的。通常的多肽突變體的氨基酸序列不同于另一個(gè)參照多肽。通常,差異是有限的使得參照多肽的序列和變體總體上非常相似,在許多區(qū)域中是相同的。突變體和參照多肽的氨基酸序列可以區(qū)別在于任意組合的一個(gè)或多個(gè)置換,添加,缺失。置換或插入的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼子編碼的。多核苷酸或多肽的突變體可以是天然產(chǎn)生的,如等位基因變體,或可以是已知不是天然產(chǎn)生的突變體。可以通過(guò)誘變技術(shù)或直接合成來(lái)制備非天然產(chǎn)生的多核苷酸和多肽的突變體。
因此,由在此所述的任一個(gè)多核苷酸編碼的多肽的突變體,(或片段,衍生物或類(lèi)似物)可以是(i)其中至少一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基由保守或非保守氨基酸殘基(保守氨基酸殘基,或至少一個(gè)但低于十個(gè)保守氨基酸殘基)置換且這樣置換的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼子編碼的,(ii)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括取代基,(iii)其中成熟肽與另一種化合物融合,如提高多肽半衰期的化合物(例如,聚乙二醇),或(iv)其中另外的氨基酸與成熟多肽融合,如IgG:Fc融合區(qū)域肽或前導(dǎo)或分泌序列或用于成熟多肽純化的序列或前蛋白序列。認(rèn)為這樣的突變體是在本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)在此的教導(dǎo)的范圍內(nèi)的。編碼這些突變體的多核苷酸也包括于本發(fā)明中。如在此所用的“突變體”等同于術(shù)語(yǔ)“變體”。
包括用另一個(gè)帶電荷的氨基酸或用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸置換帶電荷的氨基酸。此外,本發(fā)明多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(例如,精氨酸和賴氨酸殘基)可以缺失或用另一個(gè)殘基置換以消除蛋白酶如弗林蛋白酶和kexin的不利加工。防止聚集是高度理想的。蛋白質(zhì)的聚集不僅導(dǎo)致活性喪失,而且當(dāng)制備藥物制劑時(shí)也可成問(wèn)題,因?yàn)樗鼈兛梢允敲庖咴缘?Pincka rd等,Clin Exp.Immunol.2331-340(1967);Robbins等,Diabetes 36838-845(1987);Cleland等Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier System 10307-377(1993))。因此,本發(fā)明的多肽可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換,缺失或添加,來(lái)自天然突變或人工操作。
如所示的,改變優(yōu)選是次要性質(zhì),如不顯著影響蛋白質(zhì)折疊或活性的保守氨基酸置換(參見(jiàn)表3)。
表3.保守氨基酸置換
然而,一些實(shí)施方案中,理想的是使用氨基酸的非保守置換。例如,氨基酸的非保守置換用于使得DSB敏感病毒對(duì)DSB抵抗。
本發(fā)明包括的多核苷酸與參照序列可具有至少約40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%或100%同一性,只要參照序列編碼含有CA-SP1蛋白突變的氨基酸序列,所述突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工成p24的抑制降低。本發(fā)明還包括的多核苷酸包括“沉默”的那些突變,其中不同密碼子編碼相同的氨基酸(擺動(dòng))。
“同一性”是核苷酸序列或氨基酸序列一致性的衡量指標(biāo)。術(shù)語(yǔ)“同一性”在此可以與詞語(yǔ)“同源性”交換使用。通常,將序列進(jìn)行比對(duì)使得獲得最高的匹配度。“同一性”本身具有本領(lǐng)域公認(rèn)的意思并可以使用公開(kāi)的技術(shù)來(lái)計(jì)算。盡管存在多種方法來(lái)測(cè)量?jī)蓚€(gè)多核苷酸或多肽序列之間的同一性,術(shù)語(yǔ)“同一性“是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常用于測(cè)定兩個(gè)序列之間的同一性或相似性的方法包括,但不限于,Baxevanis和Oullette公開(kāi)的那些,BioinformaticsAPractical Guide to the Analysis of Genes and Proteins(生物信息學(xué)基因和蛋白質(zhì)分析的實(shí)踐指導(dǎo)),第二版,Wiley-Interscience,紐約,(2001)。將測(cè)定同一性和相似性的方法編成了計(jì)算機(jī)程序。測(cè)定兩個(gè)序列之間同一性和相似性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括,但不限于,GCS程序包(Devereux,J等,Nucleic AcidsResearch 12(1)387,(1984)),BLASTP,BLASTN,F(xiàn)ASTA(Atschul,S.F.等,J.Molec.Biol.215403,(1990))。
具有與參照核苷酸序列至少例如95%“同一性”的多核苷酸的多核苷酸旨在表明該多核苷酸的核苷酸序列與參照序列相同,除了該多核苷酸序列可以包括最多五個(gè)點(diǎn)突變/參照核苷酸序列的100個(gè)核苷酸,參照序列中最多5%的核苷酸可以缺失或由另一個(gè)核苷酸置換,或可以將最多參照序列中總核苷酸5%數(shù)目的核苷酸插入?yún)⒄招蛄兄?。參照序列的這些突變可以發(fā)生在參照核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之間的任何地方,單個(gè)散布于參照序列的核苷酸中間,或參照序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組中。
相似地,具有與參照氨基酸序列至少例如95%“同一性”的氨基酸序列的多肽是指多肽的氨基酸序列與參照序列相同,除了多肽序列可以包括參照氨基酸序列的每100個(gè)氨基酸最多五個(gè)氨基酸改變。為了獲得具有與參照氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的多肽,參照序列中最多5%的氨基酸殘基可以缺失或由另一個(gè)氨基酸置換,或可以將最多參照序列中總氨基酸殘基5%數(shù)目的氨基酸插入?yún)⒄招蛄兄?。參照序列的這些改變可以發(fā)生在參照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置之間的任何地方,單個(gè)散布于參照序列內(nèi)的殘基中間或參照序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組中。參照(查詢)序列可以是本發(fā)明任一核苷酸序列的完整核苷酸序列或任何多核苷酸片段(例如,編碼本發(fā)明氨基酸序列和/或C末端缺失的多核苷酸)。
任何特定核酸分子是否與例如本發(fā)明的核苷酸序列具有至少40%,50%,60%,70%,80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%,99%同一性或與之相同,可以使用公知的計(jì)算機(jī)程序來(lái)常規(guī)地測(cè)定,如BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Unix的版本8,Genetic Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman的局部同源性算法,(Advances in Applied Ma thematics 2482-489(1981)),來(lái)找到兩個(gè)序列之間的最佳同源性片段。當(dāng)使用BESTFIT或任何其他序列比對(duì)程序來(lái)確定特定序列與根據(jù)本發(fā)明的參照序列是否例如95%相同時(shí),設(shè)定參數(shù),使得計(jì)算全長(zhǎng)參照核苷酸序列的同一性百分比并允許參照序列中高達(dá)5%核苷酸總數(shù)的同源性的缺口。
特定實(shí)施方案中,本發(fā)明序列和對(duì)象序列之間的同一性,也稱(chēng)為總體序列比對(duì),使用基于Brutlag等的算法的FASTDB計(jì)算機(jī)程序來(lái)測(cè)定(Comp.App.Biosci.6237-245(1990))。計(jì)算百分比同一性的DNA序列FASTDB比對(duì)中所用的優(yōu)選參數(shù)為矩陣=一元,k-元組=4,錯(cuò)配懲罰=1,連接懲罰=30,隨機(jī)化組長(zhǎng)度=0,截?cái)喾种担?,缺口懲罰=5,缺口大小懲罰0.05,窗口大?。?00或?qū)ο蠛塑账嵝蛄械拈L(zhǎng)度,較短的那個(gè)。根據(jù)該實(shí)施方案,如果由于5’或3’缺失,不是由于內(nèi)部缺失,對(duì)象序列短于參照序列,考慮到計(jì)算百分比同一性時(shí)FASTDB程序不考慮對(duì)象序列5’和3’截短的事實(shí),對(duì)結(jié)果進(jìn)行人工校正。對(duì)于在5’或3’端截短的對(duì)象序列,相對(duì)于查詢序列,通過(guò)計(jì)算查詢序列在對(duì)象序列5’和3’沒(méi)有匹配/比對(duì)的堿基數(shù)作為查詢序列全部堿基的百分比來(lái)校正百分比同一性。核苷酸錯(cuò)配/比對(duì)通過(guò)FASTDB序列比對(duì)的結(jié)果來(lái)確定。然后從通過(guò)以上FASTDB程序使用特定參數(shù)計(jì)算的百分比同一性中減去該百分比,來(lái)獲得最終的百分比同一性分值。該校正的分值就是用于該實(shí)施方案目的的。只有與查詢序列沒(méi)有匹配/比對(duì)的對(duì)象序列5’和3’堿基外的堿基,如通過(guò)FASTDB比對(duì)呈現(xiàn)的,被計(jì)算用于人工校準(zhǔn)百分比同一性分值的目的。例如,將90個(gè)堿基的對(duì)象序列與100個(gè)堿基的查詢序列比對(duì)來(lái)測(cè)定百分比同一性。缺失發(fā)生在對(duì)象序列的5’端,因此FASTDB比對(duì)沒(méi)有顯示5’端頭10個(gè)堿基的匹配/比對(duì)。10個(gè)未配對(duì)的堿基占序列的10%(5’和3’端未匹配的堿基數(shù)/查詢序列中的堿基總數(shù)),因此從FASTDB程序計(jì)算的百分比同一性分值中減去10%。如果剩余的90個(gè)堿基完全匹配,最終的百分比同一性為90%。另一個(gè)實(shí)例中,將90個(gè)堿基的對(duì)象序列與100個(gè)堿基的查詢序列相比較。這次缺失是內(nèi)部缺失,使得對(duì)象序列的5’或3’沒(méi)有與查詢序列不匹配/比對(duì)的堿基。在這種情況中,通過(guò)FASTDB計(jì)算的百分比同一性不用人工校正。只對(duì)對(duì)象序列的5’或3’與查詢序列不匹配/比對(duì)的堿基進(jìn)行人工校正。對(duì)于該實(shí)施方案的目的,不進(jìn)行其他的人工校正。
本申請(qǐng)涉及與在此公開(kāi)的核酸序列或其片段具有至少約40%,50%,60%,70%,80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%同一性或與之相同的核酸分子,無(wú)論它們是否編碼具有公開(kāi)的功能活性的多肽。這是因?yàn)榧词固囟ê怂岱肿硬痪幋a具有公開(kāi)的功能活性的多肽,本領(lǐng)域技術(shù)人員仍然知道怎樣使用該核酸分子,例如,作為雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。本發(fā)明的不編碼具有公開(kāi)功能活性的多肽的核酸分子的用途包括,特別是(1)分離cDMA文庫(kù)中的其變體;(2)在原位雜交中(例如,“FISH”)測(cè)定公開(kāi)序列的細(xì)胞定位或存在,和(3)RNA印跡分析來(lái)測(cè)定特定組織中的mRNA表達(dá)。
如在此所用的,術(shù)語(yǔ)“PCR”指的是Mullis等的U.S.專(zhuān)利No.4,683,195和4,683,202主題的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),以及本領(lǐng)域目前已知的改進(jìn)。根據(jù)本發(fā)明,可以使用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué),微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的解釋。參見(jiàn),例如,Sambrook,J和Russell,D.W.(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual,(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)條件”指的是雜交中的同源性,基于鹽、溫度、有機(jī)溶劑和其他雜交反應(yīng)中通??刂频那冶绢I(lǐng)域公知的參數(shù)的組合條件(Sambrook等,上文)。本發(fā)明包括分離的核酸分子,該核酸分子包括在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與上述本發(fā)明核酸分子中的一部分多核苷酸雜交的多核苷酸,例如,與在此所述的任何多核苷酸或多核苷酸片段的編碼和/或非編碼(即,轉(zhuǎn)錄的,未翻譯的)序列互補(bǔ)的序列。“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”意思是在含有以下物質(zhì)或可供選擇地由以下物質(zhì)構(gòu)成的溶液中42℃溫育過(guò)夜50%甲酰胺,5×SSC(750mM NaCl,75mM檸檬酸三鈉),50mM磷酸鈉(pH7.6),5×Denhardt’s溶液,10%硫酸葡聚糖和20μg/ml變性的剪切鮭精DNA,接著在約65℃的0.1×SSC中洗滌。本發(fā)明還包括由這些多核苷酸編碼的多肽。
本發(fā)明還包括含有本發(fā)明多核苷酸的病毒,且其中病毒包括含有所述多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒,且其中逆轉(zhuǎn)錄病毒可以是由HIV-1,HIV-2,HTLV-I,HTLV-II,SIV,禽類(lèi)白血病病毒(ALV),內(nèi)源性禽類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒(EAV),小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV),貓免疫缺陷病毒(FIV)或貓白血病病毒(FeLV)構(gòu)成的組中的成員。
本發(fā)明進(jìn)一步包括含有CA-SP1蛋白突變的多肽,所述突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工成p24的抑制降低,且其中所述突變可選地位于或接近CA-SP1切割位點(diǎn)或位于編碼CA-SP1蛋白的SEQ ID NO5或SEQ ID NO7(親本多核苷酸序列)的SP1結(jié)構(gòu)域中。所述多肽可由選自SEQ ID NO4,SEQ ID NO6,SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的多核苷酸編碼,或可以包括選自GHKARVLVEAMSQV(SEQID NO2)和SHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO3)的序列。本發(fā)明的多肽可以進(jìn)一步由與選自SEQ ID NO4,SEQ ID NO6,SEQ ID NO8和SEQID NO9的多核苷酸雜交的多核苷酸來(lái)編碼。本發(fā)明還包括由與SEQ IDNO5,SEQ ID NO7或SEQ ID NO10或12雜交的多核苷酸序列編碼的多肽,其含有導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工成p24的抑制降低的突變,且其中所述突變可選地位于或接近CA-SP1切割位點(diǎn)或在CA-SP1的SP1結(jié)構(gòu)域內(nèi)。本發(fā)明的多肽進(jìn)一步包括為嵌合或融合蛋白一部分的多肽。所述嵌合蛋白可以源自以下物種,包括但不限于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物,包括猿猴和人;嚙齒目,包括大鼠和小鼠;貓;牛;羊;包括山羊和綿羊;犬;或豬。融合蛋白可以包括合成的肽序列,雙功能抗體,連接來(lái)自上述物種的蛋白或連接肽的肽。本發(fā)明的多肽可以進(jìn)一步連接可檢測(cè)的標(biāo)記;金屬化合物;輔因子;色譜分離標(biāo)記,如但不限于組氨酸,蛋白A等,或連接物;血液穩(wěn)定部分,如但不限于轉(zhuǎn)鐵蛋白等;治療劑等。
本發(fā)明還包括選擇性結(jié)合含有CA-SP1蛋白突變的氨基酸序列的抗體,該突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工成p24的抑制降低,且其中所述的突變可選地位于或接近CA-SP1切割位點(diǎn)或在CA-SP1的SP1結(jié)構(gòu)域內(nèi)。本發(fā)明還包括選擇性結(jié)合具有突變的多肽的抗體,該多肽包括GHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO2),SHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO3)之一的序列。所述抗體可以選擇性結(jié)合由選自SEQ IDNO4,SEQ ID NO6,SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的多核苷酸序列編碼的多肽。所述抗體還可以選擇性地結(jié)合由在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自SEQ ID NO4,SEQ ID NO6,SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還包括選擇性結(jié)合SP1的抗體,其能夠從CA-SP1(p25)中區(qū)分出SP1。本發(fā)明還包括選擇性結(jié)合CA(p24)的抗體,其能夠從CA-SP1中區(qū)分出CA。本發(fā)明還包括選擇性結(jié)合CA-SP1的抗體,其能夠從CA-SP1中區(qū)分出CA。本發(fā)明另外包括選擇性結(jié)合CA-SP1切割位點(diǎn)或附近的抗體。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體,單克隆抗體或所述抗體可以是嵌合或雙功能的,或融合蛋白的一部分。本發(fā)明進(jìn)一步包括本發(fā)明任何抗體的一部分,包括單鏈,輕鏈,重鏈,CDR,F(xiàn)(ab’)2,F(xiàn)ab,F(xiàn)ab’,F(xiàn)v,sFv或dsFv或其任意的組合。
如在此所用的,當(dāng)其結(jié)合目標(biāo)肽但不顯著結(jié)合不相關(guān)蛋白時(shí),抗體“選擇性結(jié)合”目標(biāo)肽。術(shù)語(yǔ)“選擇性結(jié)合”還包括測(cè)定相對(duì)于天然目標(biāo)序列抗體是否選擇性結(jié)合目標(biāo)突變序列。如在此所用的,“選擇性結(jié)合”目標(biāo)序列的抗體等同于對(duì)目標(biāo)肽“特異性的”抗體。即使還結(jié)合與目標(biāo)肽沒(méi)有顯著同源性的其他蛋白,仍然認(rèn)為抗體是選擇性地結(jié)合肽,只要這樣的蛋白具有與抗體肽目標(biāo)的片段或結(jié)構(gòu)域的同源性。在這種情況中,盡管一定程度的交叉反應(yīng),可以理解結(jié)合肽的抗體仍然是選擇性的。另一實(shí)施方案中,測(cè)定抗體是否選擇性結(jié)合突變目標(biāo)序列包括(a)測(cè)定抗體對(duì)突變目標(biāo)序列和對(duì)天然目標(biāo)序列的結(jié)合親和性;和(b)比較如此測(cè)定的結(jié)合親和性,存在對(duì)突變目標(biāo)序列的結(jié)合親和性高于對(duì)天然目標(biāo)序列表明抗體選擇性結(jié)合突變目標(biāo)序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及固定于不溶性載體上的抗體,包括在此公開(kāi)的任一種抗體。固定抗體的不溶性載體包括多孔平板,培養(yǎng)平板,培養(yǎng)管,試管,珠子,球,濾器,電泳材料,顯微鏡載玻片,膜或親和色譜介質(zhì)。
本發(fā)明還包括標(biāo)記的抗體,其包括可檢測(cè)信號(hào)。本發(fā)明標(biāo)記的抗體用可檢測(cè)的分子來(lái)標(biāo)記,可檢測(cè)的分子包括酶,熒光物質(zhì),化學(xué)發(fā)光物質(zhì),辣根過(guò)氧化物酶,堿性磷酸酶,生物素,抗生物素蛋白,電子致密物質(zhì)和放射性同位素或其任意的組合。
本發(fā)明進(jìn)一步包括生產(chǎn)雜交瘤的方法,包括將哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞與產(chǎn)生單克隆抗體的哺乳動(dòng)物B細(xì)胞融合,該抗體選擇性結(jié)合含有CA-SP1蛋白突變的氨基酸序列,所述突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工成p24的抑制降低;和產(chǎn)生在此公開(kāi)的任一種單克隆抗體的雜交瘤。本發(fā)明進(jìn)一步包括生產(chǎn)抗體的方法,包括使產(chǎn)生在此公開(kāi)的單克隆抗體的雜交瘤在合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并從培養(yǎng)基中分離抗體,按照本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明還包括多克隆抗體的產(chǎn)生,包括將本發(fā)明的任一種多肽注射(一次注射或多次注射)至本領(lǐng)域已知的任一種用于產(chǎn)生多克隆抗體的動(dòng)物中,包括但不限于小鼠,大鼠,倉(cāng)鼠,兔子,山羊,綿羊,鹿,豚鼠或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物,并在其中所產(chǎn)生的血清中回收抗體。本發(fā)明包括在其中所產(chǎn)生的高抗體親抗原性或高親和性抗體。本發(fā)明還包括從所列物種產(chǎn)生的B細(xì)胞,進(jìn)一步用于制造產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤的細(xì)胞融合程序中,如在此公開(kāi)的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有在此所公開(kāi)的抗體或其部分,含有所述抗體的容器和使用說(shuō)明書(shū)的試劑盒;含有本發(fā)明的多肽和使用說(shuō)明書(shū)的試劑盒;和含有本發(fā)明多核苷酸,含有所述多核苷酸的容器和使用說(shuō)明書(shū)的試劑盒;或其任意的組合。這些試劑盒包括但不限于核酸檢測(cè)試劑盒,其利用或不利用PCR和免疫測(cè)定試劑盒。這樣的試劑盒可用于臨床診斷使用并提供目前臨床實(shí)踐中所需要的標(biāo)準(zhǔn)化試劑。這些試劑盒提供關(guān)于治療之前突變存在與否的信息或監(jiān)測(cè)治療過(guò)程中患者的進(jìn)展。本發(fā)明的試劑盒還可以用于提供研究實(shí)驗(yàn)室研究中所用的標(biāo)準(zhǔn)化試劑。
本發(fā)明的化合物一方面中,本發(fā)明還涉及化合物,使用化合物的方法,鑒定化合物的方法等。
本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“一”,“一種”或“一個(gè)”可以指單數(shù)或復(fù)數(shù)。例如,“一種化合物”包括一種或多種化合物。
本發(fā)明中有用的化合物包括各自在U.S.專(zhuān)利No.5,679,828和6,172,110以及U.S.申請(qǐng)No.60/443,180和10/670,797中呈現(xiàn)的樺木酸和白樺脂醇的衍生物,在此將其引入作為參考。其他有用的化合物包括Zhu等(Bioorg.Chem Lett.113115-3118(2001))公開(kāi)的齊墩果醇酸衍生物;Kashiwada等(J.Nat.Prod.611090-1095(1998))公開(kāi)的齊墩果醇酸和promoli cacid衍生物;Kashiwada等(J.Nat.Prod.631619-1622(2000))公開(kāi)的3-O-?;芄嵫苌铮缓蚄ashiwada等(Chem.Pharm.Bull.481387-1390(2000))公開(kāi)的3-烷基酰氨基-3-脫氧-樺木酸衍生物。(全部文獻(xiàn)引入作為參考)。
一些實(shí)施方案中,本發(fā)明中有用的化合物包括但不限于具有通式I的那些樺木酸衍生物和通式II的二氫樺木酸衍生物 或其藥物學(xué)上可接受的鹽,其中R是C2-C20取代或未取代的羧基?;?,R’是氫,C2-C10取代或未取代的烷基,或芳基。優(yōu)選的化合物是其中R是以下表4中取代基之一且R’是氫的那些。
其它實(shí)施方案中,有用的化合物包括通式III的白樺脂醇和二氫白樺脂醇的衍生物 或其藥物學(xué)上可接受的鹽,其中,R1是C2-C20取代或未取代的羧基酰基,或其酯;R2是氫,C(C6H5)3,或C2-C20取代或未取代的羧基?;缓蚏3是氫,鹵素,氨基,可選取代的單-或二-烷基氨基,或-OR4,
其中R4是氫,C1-4烷?;?,苯甲酰,或C2-C20取代或未取代的羧基?;?;其中虛線表示C20與C29之間的可選雙鍵。
本發(fā)明中有用的優(yōu)選化合物是其中R1是表4取代基之一,R2是氫或表4中取代基之一且R3是氫的那些。
表4R,R’,R1,R2的優(yōu)選取代基 和 更優(yōu)選的化合物是3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)二氫樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)白樺脂醇和3-O-(3’,3’-二甲基琥珀?;蛭於?二氫白樺脂醇。
特別優(yōu)選的化合物是3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸。
一些實(shí)施方案中,本發(fā)明中有用的化合物通過(guò)通式IV,V,VI和VII來(lái)描述。

R11=-OR14或-NHR15;R12=COOR17,COO-A+或CH2OR17R13=-H,鹵素,氨基,可選取代的單-或二-烷基氨基,或-OR16;R14=-H,C2-C20取代或未取代的羧基?;籖15=-H,C2-C20取代或未取代的羧基?;?;R16=-H,C4-C7烷?;?,苯甲酰,或C2-C20取代或未取代的羧基?;籖17=-H,C(C6H5)3,或C2-C20取代或未取代的羧基?;?;其中虛線表示C20與C29之間的可選雙鍵,和其中A=Na+,K+或其他陽(yáng)離子,
其中
除氫以外的R38部分通過(guò)與羰基碳的共價(jià)鍵連接到R33氧。
優(yōu)選的化合物是其中R38不是氫的那些。
其他實(shí)施方案中,R38,R40和/或R41中的任何取代基是甲基。
一些實(shí)施方案中,本發(fā)明方法中有用的化合物還包括U.S.臨時(shí)申請(qǐng)No.60/559,358中所述的那些,在此將其全部引入作為參考。一方面中,通過(guò)參考以下化合物VIII至XI來(lái)描述這些化合物一些實(shí)施方案中,本發(fā)明中有用的化合物具有通式VIII 或其藥物學(xué)上可接受的鹽或酯其中A是以下通式的稠合環(huán) 其中A的通式中指定為x和y的環(huán)碳與通式VIII中指定為x和y的環(huán)碳相同;R51是羧基烷酰基,其中烷酰基鏈可以可選地由一個(gè)或多個(gè)羥基或鹵素來(lái)取代,或可以由氮,硫或氧原子或其組合來(lái)間斷;R52,R53和R54獨(dú)立地為氫,甲基,鹵素或羥基,羰基或-COOR66,其中R66是烷基或羧基烷基,其中烷基鏈可以可選地由一個(gè)或多個(gè)羥基或鹵素來(lái)取代,或可以由氮,硫或氧原子或其組合來(lái)間斷;R55是羧基烷氧基羰基,烷氧基羰基,烷?;跫谆然轷;跫谆?,烷氧基甲基或羧基烷氧基甲基,其中的任何基團(tuán)可選地由一個(gè)或多個(gè)羥基或鹵素來(lái)取代,或R55是羧基或羥甲基;R56是氫,甲基,羥基或鹵素;R57和R58獨(dú)立地為氫或C1-6烷基;R59是CH2或CH3;R60是氫,羥基或甲基;R61是甲基,甲氧基羰基,羧基烷氧基羰基,烷?;跫谆檠趸谆螋然檠趸谆?,其中的任何基團(tuán)由一個(gè)或多個(gè)羥基或鹵素可選取代;R62是氫或甲基;R63是氫或甲基;R64是氫或羥基;如果C12和C13形成單鍵,R65是氫,或如果C12和C13形成雙鍵,R65不存在;和其中直的虛線表示C12和C13之間或C20和C29之間的可選雙鍵;條件是當(dāng)A是以下結(jié)構(gòu)時(shí) 當(dāng)C12和C13之間存在雙鍵時(shí),R51不是戊二?;蜱牾?;當(dāng)A是(ii)且R61是甲基時(shí),R51不是琥珀酰;當(dāng)A是(iii)且R52,R53和R63各自是氫時(shí),R51不是琥珀酰;和條件是R52和R53都是甲基且C12和C13之間存在雙鍵時(shí),A(I)不是
或 一些實(shí)施方案中,R51是羧基(C2-6)烷基羰基或羧基(C2-6)烷氧基(C1-6)烷基羰基。合適的基團(tuán)選自 和 根據(jù)本發(fā)明,一些實(shí)施方案中,化合物具有通式IX 其中R51,R54,R55,R56,R57,R58和R64與以上對(duì)于通式VIII的定義一樣。一實(shí)施方案中,R56是β-甲基,R58是氫,R55是羥甲基和R51是3’,3’-二甲基戊二酰,3’,3’-二甲基琥珀酰,戊二?;蜱牾!A硪粚?shí)施方案中,R56是氫,R57和R58都是甲基,R55是羧基和R51是3’,3’-二甲基戊二酰,3’,3’-二甲基琥珀酰,戊二?;蜱牾?。
一些實(shí)施方案中,R55是羧基烷氧基羰基,烷氧基羰基,烷酰基氧甲基,羧基烷?;跫谆?,烷氧基甲基或羧基烷氧基甲基,其中的任何基團(tuán)由一個(gè)或多個(gè)羥基或鹵素可選取代,或R55是羧基或羥甲基。一些實(shí)施方案中,R55選自羧基,羥甲基,-CO2(CH2)nCOOH,-CO2(CH2)nCH3,-CH2OC(O)(CH2)nCH3,-CH2OC(O)(CH2)nCOOH,-CO(CH2)nCH3和-CO(CH2)nCOOH。一些實(shí)施方案中,R55選自 和 一些實(shí)施方案中,R55是羥甲基。一些實(shí)施方案中,R55是羧基。一些實(shí)施方案中,n為0至20,優(yōu)選0至6。一些實(shí)施方案中,n為1至10。一些實(shí)施方案中,n為2至8。一些實(shí)施方案中,n為1至6。一些實(shí)施方案中,n為2至6。
一些實(shí)施方案中,本發(fā)明中有用的化合物具有通式X 其中R51,R59,R60和R61與以上對(duì)于通式VIII的定義一樣。一些實(shí)施方案中,R51是3’,3’-二甲基戊二酰,3’,3’-二甲基琥珀酰,戊二酰或琥珀酰。
一些實(shí)施方案中,R61是甲基,甲氧基羰基,羧基烷氧基羰基,烷?;跫谆?,烷氧基甲基或羧基烷氧基甲基,其中的任何基團(tuán)由一個(gè)或多個(gè)羥基或鹵素取代。一些實(shí)施方案中,R61選自甲基,-CO2(CH2)nCOOH,-COC(O)(CH2)nCH3,-CO(CH2)nCH3和-CO(CH2)nCOOH。
一些實(shí)施方案中,n為0至20,或優(yōu)選0至6。一些實(shí)施方案中,n為1至10。一些實(shí)施方案中,n為2至8。一些實(shí)施方案中,n為1至6。一些實(shí)施方案中,n為2至6。一些實(shí)施方案中,R61為甲基。一些實(shí)施方案中,R61是甲氧基羰基。一些實(shí)施方案中,R61選自甲氧基甲基和乙氧基甲基。一些實(shí)施方案中,R61中見(jiàn)到的甲基可以被鹵素或羥基取代。
一些實(shí)施方案中,本發(fā)明中有用的化合物具有通式XI 其中R51,R52,R53,R54和R63與以上對(duì)于通式VIII的定義一樣。一實(shí)施方案中,R51是3’,3’-二甲基戊二酰,3’,3’-二甲基琥珀酰,戊二?;蜱牾?。一些實(shí)施方案中,R52和R53都是甲基。
可以使用落入通式VIII范圍內(nèi)的任何三萜烯。根據(jù)本發(fā)明,一些實(shí)施方案中,通式VIII的化合物選自烏蘇醇,熊果酸,高根二醇,刺囊酸,齊墩果醇酸,蘇門(mén)樹(shù)脂酸,羽扇醇,二氫羽扇醇,樺木酸甲酯,二氫樺木酸甲酯,17-α-甲基-雄烷二醇、雄烷二醇和4,4-二甲基-雄烷二醇的衍生物。
一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的化合物如通式VIII中所定義的,其中R52和R53都是甲基。一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的化合物如通式VIII中所定義的,其中R51是3’,3’-二甲基琥珀酰。一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的化合物如通式VIII中所定義的,其中R51是琥珀酰,即, 根據(jù)本發(fā)明,一些實(shí)施方案中,側(cè)鏈取代基的立體化學(xué)是重要的。一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的化合物如通式VIII中所定義的,其中A是(i)且R55在β位置。一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的化合物如通式VIII中所定義的,其中A是(i)且R56在β位置。一些實(shí)施方案中,本發(fā)明化合物如通式VIII中所定義的,其中A是(i)且R64在α位置。一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的化合物如通式VIII中所定義的,其中A是(i)且R57是α-甲基,R58是氫。一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的化合物如通式VIII中所定義的,其中A是(i)且R58是α-甲基,R57是氫。一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的化合物如通式VIII中所定義的,其中A是(i)且R57和R58都是甲基。一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的化合物如通式VIII中所定義的,其中A是(ii)且R61位于β位置。
一些實(shí)施方案中,3’,3’-二甲基琥珀酰在C3位置。一些實(shí)施方案中,通式IX的化合物是3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)烏蘇醇;3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)高根二醇;3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)刺囊酸或3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)蘇門(mén)樹(shù)脂酸。一些實(shí)施方案中,通式X的化合物是3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)羽扇醇;3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)二氫羽扇醇;3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)17β-甲酯-樺木酸;或3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)17β-甲酯-二氫樺木酸。一些實(shí)施方案中,通式XI的化合物是3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)4,4-二甲基雄烷二醇;3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)17α-甲基雄烷二醇;3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)雄烷二醇。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明包括通式XII的化合物和使用通式XII化合物的方法
其中R72是以下之一 或 其中Z是羥基或鹵素;和R73是低級(jí)烷基,如甲基,乙基或丙基。
其他實(shí)施方案中,本發(fā)明中有用的化合物是通式XIII的白樺脂醇衍生物化合物
或其藥物學(xué)上可接受的鹽或藥物前體,其中R51是C3-C20烷?;?,羧基烷?;?,羧基烯?;?alkenoyl),烷氧基羰基烷酰基,烯基氧羰基烷?;?,氰基烷?;?,羥基烷?;?,氨基羰基烷?;u基氨基羰基烷?;?,單烷基氨基羰基烷?;?,二烷基氨基羰基烷酰基,雜芳基烷酰基,雜環(huán)基烷?;s環(huán)基羰基烷?;?,雜芳基氨基羰基烷?;?,雜環(huán)基氨基羰基烷?;?,氰基氨基羰基烷酰基,烷基磺酰氨基羰基烷?;?,芳基磺酰氨基羰基烷?;?,磺氨基羰基烷?;?,膦?;被驶轷;?,四唑基烷?;?,膦?;腔?,膦?;轷;?,磺基烷酰基,烷基磺?;轷;蛲榛Ⅴ;轷;?br> R82是甲?;?,羧基烯基,雜環(huán)基,雜芳基,-CH2SR94, 或 R83是羥基,異丙烯基,異丙基,1’-羥基異丙基,1’-鹵素異丙基,1’-硫代異丙基,1’-三氟甲基異丙基,2’-羥基異丙基,2’-鹵素異丙基,2’-硫代異丙基,2’-三氟甲基異丙基,1’-羥基乙基,1’-(烷氧基)乙基,1’-(烷氧基烷氧基)乙基,1’-(芳基烷氧基)乙基;1’-(芳基羰基氧)乙基,1’-(氧代)乙基,1’-(羥基)-1’-(羥基烷基)乙基,1’(氧代)唑烷基,1’,2’-環(huán)氧異丙基,2’-鹵素異丙烯基,2’-羥基異丙烯基,2’-氨基異丙烯基,或
其中Y是-SR111或-NR113R114;R111是甲基;R112是氫或羥基;R113和R114獨(dú)立地為氫,烷基,烷?;蓟榛?,雜芳基烷基,芳基磺酰基和芳基氨基羰基;或R113和R114可以與它們連接的氮一起形成雜環(huán),其中雜環(huán)可以任選地包括一個(gè)或多個(gè)另外的氮,硫或氧原子;m是零至三;R84是氫;或R83和R84可以一起形成氧代,烷基亞氨基,烷氧基亞氨基或芐基氧亞氨基;R85是C2-C20烷基,烯基,C2-C20羧基烷基,氨基,氨基烷基,單烷基氨基烷基,二烷基氨基烷基,烷氧基烷基,氰基,氰基烷基,烷基硫代烷基,環(huán)烷基,環(huán)烷基烷基,芳基,芳基烷基,雜環(huán)基,雜芳基,雜環(huán)基烷基,雜芳基烷基,磺基,膦?;?,磺基烷基,膦?;榛?,烷基磺?;?,烷基膦?;轷;被榛?,氨基羰基烷基,烷基氨基羰基烷基,二烷基氨基羰基烷基,雜環(huán)基羰基烷基,環(huán)烷基羰基烷基,雜芳基烷基氨基羰基烷基,芳基烷基氨基羰基烷基,雜環(huán)基烷基氨基羰基烷基,羧基烷基氨基羰基烷基,芳基磺?;被驶榛?,烷基磺?;被驶榛蓟Ⅴ;被驶榛?,烷基膦?;被驶榛蛄u基亞氨基(氨基)烷基;R86是氫,膦?;腔?,氰基,烷基,磺基烷基,膦酰基烷基,烷基磺?;?,烷基膦?;h(huán)烷基,雜環(huán)基,芳基,雜芳基,羧基烷基,烷氧基羰基烷基或氰基烷基;R87或R88獨(dú)立地是氫,烷基,氨基烷基,單烷基氨基烷基,二烷基氨基烷基,羧基烷基,烷氧基烷基,烷氧基烷氧基烷基,烷氧基羰基氨基烷氧基烷基,烷氧基羰基氨基烷基,氨基烷氧基烷基,烷基羰基氨基烷基,雜環(huán)基,雜環(huán)基烷基,芳基,芳基烷基,芳基羰基氨基烷基或環(huán)烷基,或R87和R88可以與它們連接的氮原子一起形成雜環(huán)基或雜芳基,其中雜環(huán)基或雜芳基可以任選地包括一個(gè)或多個(gè)另外的氮,硫或氧原子;R89是氫,膦?;?,磺基,氰基,烷基,烷基甲硅烷基,環(huán)烷基,羧基烷基,烷氧基羰基氧烷基,氨基烷基,單烷基氨基烷基,二烷基氨基烷基,氰基烷基,膦?;榛?,磺基烷基,烷基磺?;?,烷基膦酰基,芳基,雜芳基,雜環(huán)基,芳基烷基,雜芳基烷基,雜環(huán)基烷基或二烷氧基烷基;R90和R91獨(dú)立地是氫,羥基,氰基,烷基,氨基,氨基烷基,單烷基氨基烷基,二烷基氨基烷基,羧基,羧基烷基,烷?;跬榛檠趸榛?,烷氧基烷氧基烷基,烷氧基羰基氨基烷氧基烷基,烷氧基羰基氨基烷基,氨基烷氧基烷基,烷基羰基氨基烷基,雜環(huán)基,雜環(huán)基烷基,芳基,芳基烷基,芳基羰基氨基烷基,芳基磺?;颦h(huán)烷基,或由一個(gè)或多個(gè)氧原子間斷的烷基,或R90和R91可以與它們連接的氮原子一起形成雜環(huán)基,其中雜環(huán)基可以任選地包括一個(gè)或多個(gè)另外的氮,硫或氧原子;R92和R93獨(dú)立地是氫,烷基,烷氧基羰基,烷氧基氨基烷基,環(huán)烷氧基,雜環(huán)基氨基烷基,環(huán)烷基,氰基烷基,氰基,磺基,膦?;?,磺基烷基,膦酰基烷基,烷基磺酰基,烷基膦酰基,烷氧基烷基,雜環(huán)基烷基,或R92和R93可以與它們連接的氮原子一起形成雜環(huán)基,其中雜環(huán)基可以任選地包括一個(gè)或多個(gè)另外的氮,硫或氧原子,或R92和R93可以與它們連接的氮原子一起形成烷基偶氮基團(tuán),且b是一至六;R94是氫,烷基,烯基,芳基烷基,羧基烷基,羧基烯基,烷氧基羰基烷基,烯基氧羰基烷基,氰基烷基,羥基烷基,羧基芐基,氨基羰基烷基;R95和R96獨(dú)立地是氫,烷基,烷氧基羰基,烷氧基氨基烷基,環(huán)烷基氧,雜環(huán)基氨基烷基,環(huán)烷基,氰基烷基,氰基,磺基,膦?;?,磺基烷基,膦?;榛榛酋;榛Ⅴ;?,烷氧基烷基,雜環(huán)基烷基,或R95和R96可以與它們連接的氮原子一起形成雜環(huán)基團(tuán),其中雜環(huán)基可以任選地包括一個(gè)或多個(gè)另外的氮,硫或氧原子,或R95和R96可以與它們連接的氮原子一起形成烷基偶氮基團(tuán);R97是氫,烷基,烯基,羧基烷基,氨基,氨基烷基,單烷基氨基烷基,二烷基氨基烷基,烷氧基烷基,烷氧基羰基,氰基烷基,烷基硫代烷基,環(huán)烷基,環(huán)烷基烷基,芳基,芳基烷基,雜環(huán)基,雜芳基,雜環(huán)基烷基,雜芳基烷基,烷酰基氨基烷基,氨基羰基烷基,烷基氨基羰基烷基,二烷基氨基羰基烷基,雜環(huán)基羰基烷基,環(huán)烷基羰基烷基,雜芳基烷基氨基羰基烷基,芳基烷基氨基羰基烷基,雜環(huán)基烷基氨基羰基烷基,羧基烷基氨基羰基烷基,芳基磺?;被驶榛?,烷基磺?;被驶榛蛄u基亞氨基(氨基)烷基;R98和R99獨(dú)立地是氫,甲基或乙基,優(yōu)選氫或甲基;且d是一至六。
本發(fā)明化合物的烷基和含烷基的基團(tuán)可以是直鏈或支鏈基團(tuán),優(yōu)選具有一至十個(gè)碳原子。一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的烷基或含烷基的基團(tuán)可由C3-7環(huán)烷基取代。一些實(shí)施方案中,環(huán)烷基包括但不限于環(huán)丁基,環(huán)戊基或環(huán)己基。
此外,本發(fā)明范圍內(nèi)包括的是本發(fā)明化合物的無(wú)毒藥物學(xué)上可接受的鹽。這些鹽可以在化合物的最終分離和純化過(guò)程中原位制得或通過(guò)分開(kāi)地將游離酸形式的純化化合物與合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)堿反應(yīng)并分離因此形成的鹽。這些可以包括基于堿金屬和堿土金屬的陽(yáng)離子,如鈉,鋰,鉀,鈣,鎂等,以及無(wú)毒銨,季銨和胺陽(yáng)離子,包括但不限于,銨,四甲銨,四乙銨,甲胺,二甲胺,三甲胺,乙胺,N-甲基葡糖胺等。
此外,本發(fā)明范圍內(nèi)包括的是本發(fā)明化合物的無(wú)毒藥物學(xué)上可接受的酯。酯基團(tuán)優(yōu)選在生理?xiàng)l件下相對(duì)容易水解的類(lèi)型。本發(fā)明化合物的藥物學(xué)上可接受酯的實(shí)例包括C1-6烷基酯,其中烷基是直鏈或支鏈。可接受的酯還包括C5-7環(huán)烷基酯以及芳基烷基酯,如但不限于芐基。優(yōu)選C1-4烷基酯。一些實(shí)施方案中,酯選自烷基羧酸酯,如乙酸酯,和單-或二烷基磷酸酯,如甲基磷酸酯或二甲基磷酸酯??梢愿鶕?jù)常規(guī)方法來(lái)制得本發(fā)明化合物的酯。
以上所列特定化合物的衍生物稱(chēng)為“藥物前體”。例如,這包括通式VIII至XI范圍內(nèi)的化合物。表述“藥物前體”指的是在體內(nèi)通過(guò)酶促或化學(xué)過(guò)程快速轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生上述通式的母體化合物的化合物,例如,通過(guò)血液中的水解。Higuchi,T.和V.Stella在Pro-drugs asNovel Delivery System(藥物前體作為新的傳送系統(tǒng)),第14卷,A.C.S.論文集系列中和Bioreversible Carriers in Drug Design(藥物設(shè)計(jì)中的生物可逆載體),Edward B.編輯,Roche,AmericanPharmaceutical Association,Pergamon Press,1987中提供了詳盡的討論。有用的藥物前體可以是例如,通式VIII,IX,X和XI化合物的酯。一些藥物前體實(shí)施方案中,通過(guò)合適的酸用一個(gè)或多個(gè)羥基或鹵素基團(tuán)來(lái)取代低級(jí)烷基。合適的酸包括,例如,羧酸,磺酸,磷酸或其低級(jí)烷基酯,和膦酸或其低級(jí)烷基酯。例如,合適的羧酸包括烷基羧酸,如乙酸,芳基羧酸和芳基烷基羧酸。合適的磺酸包括烷基磺酸,芳基磺酸和芳基烷基磺酸。合適的磷酸酯和膦酸酯是甲基或乙基酯。
一些實(shí)施方案中,在C3’位置具有二甲基或氧的C3?;亲钣谢钚缘幕衔?。該觀察表明這些類(lèi)型的?;鶎?duì)于提高的抗HIV活性可能是重要的。
一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及治療患者HIV-1感染的方法,通過(guò)給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物,其中所述化合物是通式I至XIII的化合物。
一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及治療患者HIV-1感染的方法,通過(guò)給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物,其中所述化合物是通式I至XIII的化合物,除了DSB。
一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及治療患者HIV-1感染的方法,通過(guò)給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物,其中所述化合物是通式I至VII以外的化合物,或是通式I至XIII以外的化合物。一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及治療患者HIV-1感染的方法,通過(guò)給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物,其中所述化合物是通式I至XI以外的化合物;或在其他實(shí)施方案中是I至XIII以外的化合物。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞中病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的方法,其中所述化合物是通式組I至XIII的化合物。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞中病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的方法,其中所述化合物是通式I至VII以外的化合物;或在其他實(shí)施方案中,是通式I至XIII以外的化合物。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞中病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的方法,其中所述化合物是通式I至XI以外的化合物;或在其他實(shí)施方案中,是通式I至XIII以外的化合物。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及處理人血液或血液制品的方法,通過(guò)抑制細(xì)胞中病毒Gag蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟,其中所述化合物是通式I至XIII的化合物。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及處理人血液或血液制品的方法,通過(guò)抑制細(xì)胞中病毒Gag蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟,其中所述化合物是通式I至VII以外的化合物;或在其他實(shí)施方案中,是通式I至XIII以外的化合物。
Dsb和相關(guān)化合物的合成樺木酸和二氫樺木酸與二甲基琥珀酸酐的反應(yīng)各自產(chǎn)生3-O-(2’,2’-二甲基琥珀酰)和3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸和二氫樺木酸的混合物。通過(guò)產(chǎn)生純樣品的制備級(jí)HPLC成功地分離了混合物。通過(guò)長(zhǎng)程1H-13C COSY檢測(cè)來(lái)測(cè)定這些異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)。
都是通過(guò)將無(wú)水吡啶(5-10mL)中的樺木酸或二氫樺木酸,二甲基氨基吡啶(1當(dāng)量摩爾)和合適的酐(2.5-10當(dāng)量摩爾)的溶液回流來(lái)合成本發(fā)明的樺木酸和二氫樺木酸的衍生物。然后用冰水稀釋反應(yīng)混合物并用CHCl3萃取。用水洗滌有機(jī)層,通過(guò)MgSO4干燥,并在減壓下濃縮。使用硅膠柱或半制備級(jí)HPLC將殘余物進(jìn)行色譜來(lái)產(chǎn)生產(chǎn)物。
3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸的制備產(chǎn)量70%(從542mg樺木酸開(kāi)始);從MeOH結(jié)晶獲得無(wú)色針狀物;mp274°-276℃;[α]D19+23.5°(c=0.71),CHCl3-MeOH[1∶1]);正極FABMS m/z585(M+H)+;負(fù)極FABMS m/z 583(M-H)-;HR-FABMS對(duì)C36H57O6計(jì)算值585.4155,實(shí)測(cè)值為m/z 585.4161;1H NMR(吡啶-d5)0.73,0.92,0.97,1.01,1.05(各3H,s;4-(CH3)2,8-CH3,10-CH3,14-CH3),1.55(6H,s,3’-CH3x2),1.80(3H,s,20-CH3),2.89,2.97(各1H,d,J=15.5Hz,H-2’),3.53(1H,m,H-19),4.76(1H,dd,J=5.0,11.5Hz,H-3),4.78,4.95(各1H,brs,H-30)。
3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)二氫樺木酸產(chǎn)量24.5%(從155.9mg二氫樺木酸開(kāi)始);從MeOH-H2O結(jié)晶獲得無(wú)色針狀物;mp291°-292℃;[α]D20-13.4°(c=1.1,CHCl3-MeOH[1∶1],1H NMR(吡啶-d5)0.85,0.94(各3H,d,J=7.0Hz;20-(CH3)2),0.75,0.93,0.97,1.10,1.03(各3H,s;4-(CH3)2,8-CH3,10-CH3,14-CH3),1.55(6H,s,3’-CH3x2),2.89,2.97(各1H,d,J=15.5Hz;H-2’),4.77(1H,dd,J=5.0,11.0Hz,H-3);C36H58O65/2H2O分析計(jì)算值為C68.43,H10.04;實(shí)測(cè)值為C68.64,H9.78。
U.S.專(zhuān)利No.5,679,828公開(kāi)了3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)樺木酸的合成,作為化合物NO.4。
3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)二氫樺木酸產(chǎn)量93.3%(從100.5mg二氫樺木酸開(kāi)始);從針狀物MeOH-H2O結(jié)晶獲得無(wú)色針狀物;mp287°-289℃;[α]D20-17.9°(c=0.5,CHCl3-MeOH[1∶1]);1H NMR(吡啶-d5)0.86,0.93(各3H,d,J=6.5Hz;20-(CH3)2),0.78,0.92,0.96,1.02,1.05(各3H,s;4-(CH3)2,8-CH3,10-CH3,14-CH3),1.38,1.39(各3H,s;3’-CH3x2),2.78(4H,m,H2-2’和4’),4.76(1H,dd,J=4.5,11.5 Hz;H-3)。C37H60O6分析計(jì)算值為C73.96,H10.06;實(shí)測(cè)值為C73.83,H10.10。
U.S.專(zhuān)利No.5,679,828中公開(kāi)了3-O-二乙醇酰-樺木酸的合成,作為化合物NO.5。
3-O-二乙醇酰-二氫樺木酸產(chǎn)量79.2%(從103.5mg二氫樺木酸開(kāi)始);乳白色非晶形粉末;[α]D20-9.8°(c=1.1,CHCl3-MeOH[1∶1]);1H NMR(吡啶-d5)0.79,0.87(各3H,d,J=6.5Hz;20-(CH3)2),0.87,0.88,0.91,0.98,1.10(各3H,s;4-(CH3)2,8-CH3,10-CH3,14-CH3),4.21,4.23(各2H,s,H2-2’和4’),4.57(1H,dd,J=6.5,10.0Hz;H-3)。對(duì)C34H54O7.2H2O分析計(jì)算值為C66.85,H9.57;實(shí)測(cè)值為C67.21,H9.33。
U.S.申請(qǐng)10/670,797中公開(kāi)了3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)白樺脂醇和3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)白樺脂醇的合成。
用化合物抑制Hiv的方法如在此所用的“抑制HIV”或“HIV抑制”的方法,意思是使用本發(fā)明方法對(duì)HIV的任何干預(yù)、抑制和/或預(yù)防。因此,抑制的方法可用于抑制HIV的感染性,抑制p25加工,抑制病毒成熟,呈現(xiàn)改變表型的病毒粒體的形成等。優(yōu)選,本發(fā)明的方法作用于動(dòng)物細(xì)胞中的p25加工,但不受作用方法的限制。
用化合物抑制HIV的方法可以與治療患者HIV感染的方法相關(guān)。因此,用化合物抑制HIV的方法可以相似地用于治療患者。
抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的方法包括將感染的細(xì)胞接觸以上通式I至通式XIII的化合物。相關(guān)的實(shí)施方案包括治療患者HIV-1感染的方法,包括給藥通式I至XIII的化合物;通過(guò)給藥抑制所述p25加工的化合物來(lái)在細(xì)胞中、體內(nèi)和/或體外抑制p25加工的方法;和通過(guò)給予通式I至XIII的化合物處理人血液或血液制品的方法。此外還包括鑒定抑制p25加工、HIV成熟、HIV感染性、HIV病毒粒體表型等中任意之一的化合物的方法。
一實(shí)施方案中,化合物是樺木酸、白樺脂醇或二氫樺木酸或二氫白樺脂醇的衍生物,且包括表4的優(yōu)選取代基。優(yōu)選的化合物包括但不限于3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)白樺脂醇,3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)白樺脂醇,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)二氫樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)樺木酸,(3’,3’-二甲基戊二酰)二氫樺木酸,3-O-二乙醇酰-樺木酸和3-O-二乙醇酰-二氫樺木酸。
一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的方法,通過(guò)將感染的細(xì)胞接觸抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物,其中所述化合物是以上通式I至XIII的化合物。
一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的方法,通過(guò)將感染的細(xì)胞接觸抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物,其中所述化合物是通式I至XIII的化合物,除了DSB。
一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的方法,通過(guò)將感染的細(xì)胞接觸抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物,其中所述化合物是從通式I至VI那些排除的化合物。一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及治療患者HIV-1感染的方法,通過(guò)給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物,其中所述化合物是通式I至XIII那些以外的化合物。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞中病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的方法,其中所述化合物是通式I至XIII的化合物。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞中病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的方法,其中所述化合物是通式I至VI那些以外的化合物。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞中病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的方法,其中所述化合物是通式I至XIII那些以外的化合物。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞中病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的方法,其中所述化合物是通式I至VI那些以外的化合物。另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及處理人血液或血液制品的方法,通過(guò)抑制細(xì)胞中病毒Gagp25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟,其中所述化合物是通式I至XIII的化合物。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及處理人血液或血液制品的方法,通過(guò)抑制細(xì)胞中病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟,其中所述化合物是通式I至VI那些以外的化合物。
另一實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及處理人血液或血液制品的方法,通過(guò)抑制細(xì)胞中病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟,其中所述化合物是通式I至VIII那些以外的化合物。
在此所公開(kāi)的方法,進(jìn)一步包括將所述細(xì)胞接觸一種或多種藥物,該藥物選自抗病毒劑,抗真菌劑,抗細(xì)菌劑,抗癌劑,免疫刺激劑及其組合。該方法可以包括對(duì)人血液制品的處理。
還可以結(jié)合治療癌癥的方法來(lái)使用本發(fā)明,這些治療癌癥的方法包括將一種或多種抗腫瘤劑給藥于動(dòng)物,將動(dòng)物暴露于殺滅癌細(xì)胞量的照射,或兩者的組合。
鑒定化合物的方法本發(fā)明進(jìn)一步包括鑒定在此公開(kāi)的抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIL-1復(fù)制的化合物的方法。一實(shí)施方案中,所述方法包括
(a)將含有CA-SP1切割位點(diǎn)的Gag多肽接觸測(cè)試化合物;(b)將在CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近選擇性結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)加入;(c)測(cè)量CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近測(cè)試化合物的結(jié)合。
經(jīng)標(biāo)記的物質(zhì)或分子包括經(jīng)標(biāo)記的抗體或經(jīng)標(biāo)記的DSB,且標(biāo)記包括酶,熒光物質(zhì),化學(xué)發(fā)光物質(zhì),辣根過(guò)氧化物酶,堿性磷酸酶,生物素,抗生物素蛋白,電子致密物質(zhì),如金,四氧化鋨,鉛或乙酸鈾酰,和放射性同位素,用這樣的分子物質(zhì)標(biāo)記的抗體,或其組合。測(cè)試可以包括,但不限于ELISA,單和雙夾心技術(shù),免疫擴(kuò)散或免疫沉淀技術(shù),如本領(lǐng)域已知的(“ImmunoassayHandbook,2nded.”(免疫測(cè)定手冊(cè),第2版)D.Wild,Nature Publishing Group,(2001))。所述的鑒定方法還可包括但不限于蛋白質(zhì)印跡測(cè)試,比色測(cè)試,光學(xué)和電子顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡,或本領(lǐng)域已知的其他技術(shù)。
鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV復(fù)制的化合物的方法進(jìn)一步包括(a)在測(cè)試化合物的存在下,將含有野生型CA-SP1切割位點(diǎn)的Gag蛋白接觸HIV-1蛋白酶;(b)分開(kāi)地,在測(cè)試化合物的存在下,將含有突變CA-SP1切割位點(diǎn)的Gag蛋白或包括另一可供選擇的蛋白酶切割位點(diǎn)的蛋白接觸HIV-1蛋白酶;和(c)將天然野生型Gag蛋白的裂解與突變Gag蛋白的裂解量或包括可供選擇的蛋白酶切割位點(diǎn)的肽的裂解量相比較。
以上的步驟(b)是作為對(duì)照來(lái)進(jìn)行的,為了消除可能直接結(jié)合并因此抑制蛋白酶的化合物。上述方法還包括其中野生型CA-SP1,突變CA-SP1或可供選擇的蛋白酶切割位點(diǎn)包含于多肽片段或重組肽內(nèi)的方法。
鑒定在此公開(kāi)的抑制HIV-1的化合物的方法還包括其中用熒光部分和熒光淬滅部分標(biāo)記所述肽或蛋白的方法,這兩個(gè)部分各自結(jié)合CA-SP1切割位點(diǎn)的相對(duì)側(cè),且其中所述檢測(cè)包括測(cè)量來(lái)自熒光部分的信號(hào),或其中用兩個(gè)熒光部分標(biāo)記所述的肽或蛋白,這兩個(gè)部分各自結(jié)合CA-SP1切割位點(diǎn)的相對(duì)側(cè),且其中所述的檢測(cè)包括測(cè)量在測(cè)試化合物和HIV-1蛋白酶存在下熒光能量從一個(gè)部分至另一個(gè)部分的轉(zhuǎn)移,并將所述的熒光能量轉(zhuǎn)移與相同方法應(yīng)用于包括含有CA-SP1切割位點(diǎn)突變的序列或包括含有另一個(gè)切割位點(diǎn)的序列的肽時(shí)所觀察到的相比較?;跓晒獾牡鞍酌富钚詼y(cè)試的實(shí)例是本領(lǐng)域公知的。一個(gè)這樣的實(shí)例中,用綠色熒光染料分子標(biāo)記蛋白酶底物,當(dāng)?shù)鞍酌噶呀獾孜飼r(shí)該染料分子發(fā)出熒光(Molecular Probes,Protease AssayKit)。
為了測(cè)量測(cè)試化合物抑制CA-SP1裂解的程度,以上比較裂解的方法還包括使用選擇性結(jié)合CA或SP1或CA-SP1的標(biāo)記抗體??捎眠x自酶,熒光物質(zhì),化學(xué)發(fā)光物質(zhì),辣根過(guò)氧化物酶,堿性磷酸酶,生物素,抗生物素蛋白,電子致密物質(zhì)和放射性同位素或其組合的分子來(lái)標(biāo)記抗體。該方法還包括使用特異性表位標(biāo)記序列的抗體來(lái)選擇性檢測(cè)CA-SP1(p25)或SP1,已經(jīng)根據(jù)本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法向其中工程化入該表位標(biāo)記的氨基酸序列。合適的標(biāo)記是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的,并包括血細(xì)胞凝集素表位HA(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO81),藍(lán)舌病病毒表位VP7(QYPALT)(SEQ ID NO82),α-微管蛋白表位(EEF),F(xiàn)lag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO83),和VSV-G(YTDOEMNRLGK)(SEQ ID NO84)。圖17中說(shuō)明了含有表位標(biāo)記的SP1實(shí)例。
例如,通過(guò)Gag表達(dá)質(zhì)粒的寡核苷酸定點(diǎn)誘變將FLAG表位標(biāo)記(Sigma-Aldrich)的序列插入Gag的p2(SP1)區(qū)域中。然后使用可購(gòu)得的抗FLAG單克隆抗體(Sigma-Aldrich)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)的蛋白中SP1結(jié)構(gòu)域的存在。(Hopp,T.P.Biotechnology 61204-1210(1988))。
鑒定破壞CA-SP1裂解的化合物的方法還包括將化合物加入HIV-1感染的細(xì)胞中并通過(guò)裂解和分析細(xì)胞或釋放的病毒粒體來(lái)檢測(cè)CA-SP1裂解產(chǎn)物。可使用病毒蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析并使用p25的抗體檢測(cè)p25來(lái)進(jìn)行本發(fā)明中所包括的方法,或其中通過(guò)進(jìn)行病毒蛋白的凝膠電泳和代謝標(biāo)記蛋白的顯像來(lái)分析所述的混合物,或其中通過(guò)使用選擇性結(jié)合p25的抗體或選擇性結(jié)合以便區(qū)分p25和p24的抗體的免疫測(cè)定來(lái)分析混合物。本發(fā)明包括使用針對(duì)插入SP1的C-末端結(jié)構(gòu)域的特異性表位標(biāo)記序列的抗體來(lái)選擇性檢測(cè)p25或SP1。例如,可以進(jìn)行夾心ELISA測(cè)試,其中使用選擇性結(jié)合Gag CA區(qū)域的抗體來(lái)捕獲去污劑溶解病毒中的p25和p24,該抗體結(jié)合到多孔平板。洗滌步驟后,使用插入SP1中的表位標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)結(jié)合的p25,該抗體綴合至合適的檢測(cè)試劑(例如,用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的堿性磷酸酶)。與未處理的病毒粒體相比較,通過(guò)該機(jī)理作用的化合物處理過(guò)的細(xì)胞釋放的病毒通常具有提高水平的p25。
所公開(kāi)的方法涉及選擇性結(jié)合p25的抗體,或選擇性結(jié)合SP1的抗體,或插入SP1中的表位標(biāo)記序列的抗體,用選自酶,熒光物質(zhì),化學(xué)發(fā)光物質(zhì),辣根過(guò)氧化物酶,堿性磷酸酶,生物素,抗生物素蛋白,電子致密物質(zhì)和放射性同位素或其組合的分子來(lái)標(biāo)記所述抗體。
如在此所用的“感染的細(xì)胞”,包括通過(guò)膜融合和隨后病毒基因組插入細(xì)胞而天然感染的細(xì)胞,或用病毒遺傳物質(zhì)通過(guò)人工方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這些方法包括,但不限于,磷酸鈣轉(zhuǎn)染,DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,微注射,脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,電穿孔或感染。
在測(cè)試化合物的存在下,在合適的培養(yǎng)條件下和進(jìn)行不同的時(shí)間段,用HIV的感染性株體外感染靶細(xì)胞來(lái)實(shí)施本發(fā)明??梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的方法處理感染的細(xì)胞或上清液并上樣于聚丙烯酰胺凝膠上用于檢測(cè)病毒水平。非感染和非處理細(xì)胞各自可以用作陰性和陽(yáng)性感染對(duì)照?;蛘撸谟肏IV株感染細(xì)胞之前,通過(guò)在測(cè)試化合物存在下培養(yǎng)靶細(xì)胞來(lái)實(shí)施本發(fā)明。
本發(fā)明還包括鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的化合物的方法,包括(a)將測(cè)試化合物接觸野生型病毒分離株并分開(kāi)地接觸對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸敏感性降低的病毒分離株;和(b)與對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸敏感性降低的病毒分離株相比較,選擇對(duì)抗野生型病毒分離株更有活性的測(cè)試化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步包括鑒定通過(guò)上述任一種機(jī)理起作用的化合物的方法,包括用化合物處理HIV-1感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,然后通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法,通過(guò)薄層切片和透射電子顯微鏡分析化合物處理過(guò)的細(xì)胞釋放的病毒顆粒。如果檢測(cè)到顆粒呈現(xiàn)相對(duì)于病毒顆粒而言非中心的球形凝聚核心和/或就在病毒膜內(nèi)的新月形電子致密層,則化合物通過(guò)上述機(jī)理起作用。
對(duì)于電子顯微鏡研究,可以將感染細(xì)胞或從上清液獲得的離心病毒沉淀物接觸固定劑,如戊二醛或新鮮制得的多聚甲醛,和/或四氧化鋨或其他本領(lǐng)域已知的電子顯微鏡相容的固定劑。將上清液中的病毒或細(xì)胞脫水并包埋于電子透明聚合物如環(huán)氧樹(shù)脂或甲基丙烯酸酯中,使用超薄切片機(jī)來(lái)薄層切片,使用電子致密染色劑如乙酸鈾酰和/或檸檬酸鉛來(lái)染色,并在透射電子顯微鏡中觀察。非感染和非處理細(xì)胞各自可以用作陰性和陽(yáng)性感染對(duì)照?;蛘?,在用HIV株感染細(xì)胞之前,通過(guò)在測(cè)試化合物存在下培養(yǎng)靶細(xì)胞來(lái)實(shí)施本發(fā)明。通過(guò)與對(duì)照相比較形態(tài)異常病毒顆粒的存在來(lái)檢測(cè)由本發(fā)明化合物引起的成熟缺陷,如在此所述的。
對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)研究,可以觀察病毒感染細(xì)胞的合胞體形成,或可以測(cè)試上清液中HIV顆粒的存在。收集上清液中存在的病毒以感染其他首次用于試驗(yàn)的培養(yǎng)物來(lái)測(cè)定感染性。
本發(fā)明還包括的是測(cè)定個(gè)體是否受到對(duì)通過(guò)抑制p35加工的化合物治療敏感的HIV-1感染的方法,該方法包括從患者取血,對(duì)病毒RNA作基因分型并測(cè)定病毒RNA是否含有CA-SP1切割位點(diǎn)的突變。
本發(fā)明還包括鑒定通過(guò)上述機(jī)理起作用的化合物的方法,包括通過(guò)在此所述的方法的組合來(lái)測(cè)試。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來(lái)表達(dá)或合成用于上述測(cè)試中的HIV Gag蛋白及其片段??梢栽隗w外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)中使用兔子網(wǎng)狀細(xì)胞裂解物來(lái)生產(chǎn)Gag。已經(jīng)表明該系統(tǒng)中表達(dá)的Gag以與感染細(xì)胞中觀察到的相似模式得到按序的加工(Pettit,S.C.等,J.Viral.7610226-10233(2002))。此外,當(dāng)融合到異源D型逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞質(zhì)自我裝配結(jié)構(gòu)域時(shí),通過(guò)該方法表達(dá)的Gag能夠裝配成不成熟的病毒顆粒(Sakalian,M.等,J.Virol.7610811-10820(2002))。從NIH ADIS Reagent Program獲得的質(zhì)粒pDAB72可以用于該目的(Erickson-Viitanen,S.等,ADIS Res.Hum.Retroviruses.5577-91(1989));Sidhu M.K.等,Biotechniques,1820,22,24(1995))?;邴溠炕蚣?xì)菌裂解物的其他體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)也可以用于該目的。還可以使用各種可購(gòu)得的表達(dá)載體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)HIV Gag。從NIH ADIS Reagent Program可獲得的質(zhì)粒p55-GAG/GFP,可以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)HIV Gag-綠色熒光蛋白融合蛋白用于藥物相互作用研究(Sandefur,S.等,J.Virol.722723-2732(1998))。該構(gòu)建體允許使用GFP-特異性單克隆抗體捕獲和純化Gag融合蛋白。此外,可以使用重組病毒載體如痘病毒、腺病毒或桿狀病毒系統(tǒng)中所用的那些,在細(xì)胞中表達(dá)Gag。還可以通過(guò)用HIV感染細(xì)胞或用原病毒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)表達(dá)Gag。最后,可以在用合適表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母或細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)Gag。
除了在細(xì)胞中或在體外使用細(xì)胞裂解物表達(dá)的Gag蛋白外,使用標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)可以商業(yè)合成對(duì)應(yīng)于Gag各個(gè)區(qū)域的肽。
本發(fā)明進(jìn)一步包括通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的化合物和/或根據(jù)本發(fā)明的方法抑制HIV-1復(fù)制的化合物,和包括一種或多種在此所公開(kāi)的化合物,或其藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或藥物前體,和藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
藥物組合物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的化合物具有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性,尤其是抗HIV活性。預(yù)期本發(fā)明的鹽和其他制劑具有提高的水溶性,和提高的口服生物利用率。此外,由于提高的水溶性,更容易將本發(fā)明的鹽配制成藥物制劑。此外,預(yù)期根據(jù)本發(fā)明的化合物具有改進(jìn)的生物分布特征。
一實(shí)施方案中,化合物是通式I至XIII的那些,另一實(shí)施方案中,它們是是通式I至XIII化合物以外的化合物。
本發(fā)明還包括藥物組合物,其包括抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但對(duì)其他Gag加工步驟沒(méi)有顯著影響的化合物,或抑制從處理過(guò)的感染細(xì)胞釋放的病毒顆粒成熟的化合物,如通式I至XIII的化合物。本發(fā)明包括藥物組合物,其包括一種或多種在此公開(kāi)的化合物,或其藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或藥物前體,和藥物學(xué)上可接受的載體,其中所述化合物是以上通式I至XIII的化合物,或優(yōu)選,其中所述化合物選自3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)白樺脂醇,3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)白樺脂醇,3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)二氫樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)樺木酸,3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)二氫樺木酸,3-O-二乙醇酰-樺木酸和3-O-二乙醇酰-二氫樺木酸。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物,進(jìn)一步包括一種或多種選自抗病毒劑、抗真菌劑、抗癌劑或免疫刺激劑的藥物。
本發(fā)明的藥物組合物可以包括至少一種在此公開(kāi)的通式I至XIII的化合物。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還可以進(jìn)一步包括其他抗病毒劑,如但不限于,AZT(齊多夫定,PETROVIR,GlaxoSmithKline),3TC(拉米夫定,EPIVIR,GlaxoSmithKline),AZT+3TC(COMBIVIR,GlaxoSmithKline),AZT+3TC+阿巴卡韋(TRIZIVIR,GlaxoSmithKline),ddI(去羥肌苷,VIDEX,Bristol-MyersSquibb),ddC(扎西他賓,HIVID,Hoffmann-LaRoche),D4T(司他夫定,ZERIT,Bristol-Myers Squibb),阿巴卡韋(ZIAGEN,GlaxoSmithKline),替諾福韋(VIREAD,Gilead Sciences),奈韋拉平(VIRAMUNE,Boehringer Ingelheim),地拉韋定(Pfizer),恩曲他賓(EMTRIVA,Gilead Sciences),依法韋倫(SUSTIVA,DuPont Pharmaceuticals),沙喹那韋(INVIRASE,F(xiàn)ORTOVASE,Hoffmann-LaRoche),利托那韋(NORVIR,Abbott Laboratories),茚地那韋(CRIXIVIN,Merckand Company),奈非那韋(VIRACEPT,Pfizer),安潑那韋(amprenavir)(AGENERASE,GlaxoSmithKline),adefovir(PREVEON,HEPSERA,Gilead Science),atazanavir(Bristol-Myers Squibb),福沙那韋(Lexiva,GlaxoSmithKline)和羥基脲(HYDREA,Bristol-MyersSquibb),或任何其他抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物或抗體,彼此相互組合,或與基于生物學(xué)的治療劑相結(jié)合,例如,gp41衍生的肽enfuvirtide(Fuzeon;Roche and Timeris)和T-1249,或可溶性CD4,CD4的抗體,以及CD4或抗CD4的綴合物,或在此另外呈現(xiàn)的。
用于和本發(fā)明通式I至XIII化合物之一一起最佳使用的其他合適抗病毒劑包括,但不限于,兩性霉素B(FUNGIZONE);Hemis pherxBiopharma研發(fā)的聚肌胞(錯(cuò)配RNA);BETASERON(β-干擾素,Chiron);丁基化羥基甲苯;Carrosyn(聚甘露醋酸酯);澳栗精胺;Contracan(硬脂酸衍生物);Creme Pharmatex(含有苯扎氯銨);齊多夫定的5-未取代衍生物;噴昔洛韋(DENAVIRNovartis);泛昔洛韋(FAMVIRNovartis);阿昔洛韋(ZOVIRAX,GlaxoSmithKline);cytofovir(VISTIDEGilead);更昔洛韋(CYTOVENE,Hoffman LaRoche);硫酸葡聚糖;D-青霉胺(3-巰基-D-纈氨酸);FOSCARNET(膦酰甲酸三鈉;AstraZeneca);梭鏈孢酸;甘草甜(甘草的一種成分);HPA-23(銨-21-鎢-9-銻酸鹽);ORNIDYL(田邊依氟鳥(niǎo)氨酸(eflornithine);Aventis);壬苯醇醚;戊烷脒羥乙基磺酸鹽(PENTAM-300);肽T(八肽序列;PeninsulaLaboratories);苯妥英(Phenytoin)(Pfizer);INH或異煙肼;病毒唑(VIRAZOLE,Valeant Pharmaceuticals);利福布丁,ansamysin(MYCOBUTINPfizer);CD4-IgG2(ProgenicsPharmaceuticals)或其他含有CD4或基于CD4的分子;三甲曲沙(Medimmune);蘇拉明及其類(lèi)似物(Bayer);和WELLFERON(α-干擾素,GlaxoSmithKline)。
本發(fā)明的藥物組合物還可以進(jìn)一步包括免疫調(diào)節(jié)劑。根據(jù)本發(fā)明用于和本發(fā)明的樺木酸或白樺脂醇衍生物一起任選使用的合適免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于ABPP(Bropririmine);聚肌胞(錯(cuò)配的RNA)Hemispherx Biopharma;抗人干擾素α抗體;抗壞血酸及其衍生物;干擾素-β;Ciamexon;環(huán)孢霉素;甲氰咪胺;CL-246,738;集落刺激因子,包括GM-CSF;二硝基氯苯;HE2000(Hollis-EdenPharmaceuticals);干擾素-γ;葡聚糖;超免疫γ球蛋白(Bayer);immuthiol(二乙基硫代氨基甲酸鈉);白介素-1(Hoffmann-LaRoche;Amgen),白介素-2(IL-2)(Chiron);異丙肌苷(次黃苷pranobex);Krestin;LC-9018(Yakult);香菇多糖(Yamanouchi);LF-1695;甲硫氨酸-腦啡肽;Minophagen-C;胞壁酰三肽,MTP-PE;納曲酮(BarrLaborator ies);RNA免疫調(diào)節(jié)劑;REMUNE(Immune ResponseCorporation);RETICULOSE(Advanced Viral ResearchCorporation);小柴胡;人參;胸腺體液因子;胸腺五肽;胸腺素因子5;胸腺素1(ZADAXIN,SciClone),胸腺刺激素,TNF(腫瘤壞死因子,Genentech)和維生素制劑。
本發(fā)明的藥物組合物還可以進(jìn)一步包括抗癌治療劑。用于任選使用的合適抗癌治療劑包括有效抑制腫瘤的抗癌組合物,該組合物包括所述抗癌劑的化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽或藥物前體,其可以用于聯(lián)合治療,包括但不限于烷化劑,如白消安,順鉑,絲裂霉素C和卡鉑抗有絲分裂劑,如秋水仙堿,長(zhǎng)春堿,紫杉酚類(lèi),如紫杉醇(TAXOL,Bristol-Meyers Squibb),多西他賽(TAXOTERE,Aventis),拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑,如喜樹(shù)堿,伊立替康(irinotecan)和拓?fù)涮婵?topotecan)(HYCAMTIN,ClaxoSmithKline),拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑,如阿霉素,柔紅霉素和足葉乙甙如VP16;RNA/DNA抗代謝物,如5-氮胞苷,5-氟尿嘧啶和氨甲蝶呤,DNA抗代謝物,如5-氟-2’-脫氧-尿苷,ara-C,羥基脲,硫鳥(niǎo)嘌呤,和抗體,如曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN,Genentech)和利妥昔單抗(rituximab)(RITUXAN,Genentech和Biogen-Idec),苯丙氨酸氮芥,苯丁酸氮芥,環(huán)磷酰胺,異環(huán)磷酰胺,長(zhǎng)春新堿,丙脒腙,表柔比星,阿克拉霉素A,博來(lái)霉素,米托蒽醌,elliptinium,氟達(dá)拉濱(fludarabine),奧曲肽(octreotide),視黃酸,他莫西芬,丙氨菌素及其組合。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于提供抗細(xì)菌治療劑,抗寄生蟲(chóng)治療劑和抗真菌治療劑的方法,用于與本發(fā)明的化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽聯(lián)合??辜?xì)菌治療劑的實(shí)例包括化合物,如青霉素,氨芐青霉素,阿莫西林,氨環(huán)已青霉素,依匹西林,二甲氧基苯青霉素,乙氧萘青霉素,苯甲異噁唑青霉素,鄰氯青霉素,雙氯青霉素,氟氯青霉素,羧芐青霉素,頭孢菌素,頭孢拉定,cefadoxil,氯氨芐青霉素,頭孢西丁,頭孢噻肟,頭孢唑肟,cefinenoxine,頭孢三嗪,羥羧氧酰胺菌素,亞胺培南(imipenem),克拉維酸鹽(clavulanate),timentin,舒巴坦(sulbactam),紅霉素,新霉素,慶大霉素,鏈霉素,甲硝唑,氯霉素,克林霉素,林肯霉素,喹諾酮,利福平,磺胺,桿菌肽,多粘菌素B,萬(wàn)古霉素,強(qiáng)力霉素,甲烯土霉素,二甲胺四環(huán)素,四環(huán)素,兩性霉素B,環(huán)絲氨酸,環(huán)丙沙星,諾氟沙星,異煙肼,乙胺丁醇和萘啶酮酸,以及這些化合物中每一種的衍生物和變型。
抗寄生蟲(chóng)治療劑的實(shí)例包括硫氯酚,二乙基卡馬西平檸檬酸鹽,甲苯噠唑,美曲膦酯(metrifonate),niclosamine,硝咪唑,奧沙尼喹和其他奎寧衍生物,哌嗪檸檬酸鹽,吡喹酮,雙羥萘酸喹嘧啶和涕必靈,以及這些化合物中每一種的衍生物和變型。
抗真菌治療劑的實(shí)例包括兩性霉素B,克霉唑,益康唑硝酸鹽,氟胞嘧啶,灰黃霉素,酮康唑和咪康唑,以及這些化合物中每一種的衍生物和變型??拐婢衔镞€包括aculeacin A和papulocandin B。
本發(fā)明優(yōu)選的動(dòng)物患者是哺乳動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”意思是屬于哺乳動(dòng)物綱的個(gè)體。本發(fā)明特別用于治療人患者。
術(shù)語(yǔ)“治療”意思是將通式I至XIII的化合物或通過(guò)本發(fā)明內(nèi)的一種或多種測(cè)試鑒定的化合物給藥于患者,用于包括預(yù)防、緩解或治愈逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)病況的目的。所述通過(guò)本發(fā)明內(nèi)的一種或多種測(cè)試鑒定的用于治療患者的化合物鑒定為具有在此所述的破壞Gag加工的能力的化合物。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)“抑制相互作用”意思是阻止或降低一種或多種分子、肽、蛋白質(zhì)、酶或受體的直接或間接結(jié)合的速率;或阻止或降低一種或多種分子、肽、蛋白質(zhì)、酶或受體的正常活性。
如果藥物同時(shí)提供給患者或如果各個(gè)藥物給藥之間的時(shí)間允許生物學(xué)活性重疊,認(rèn)為藥物“聯(lián)合”另一種藥物提供。
一優(yōu)選實(shí)施方案中,以上通式I至XIII的至少一種化合物構(gòu)成單一藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明給藥的藥物組合物包括至少一種以上通式I至XIII的化合物或通過(guò)本發(fā)明內(nèi)的一種或多種測(cè)試鑒定的化合物。所述通過(guò)本發(fā)明內(nèi)的一種或多種測(cè)試鑒定的用于治療患者的化合物鑒定為具有破壞在此所述的Gag加工的能力的化合物。根據(jù)本發(fā)明的化合物進(jìn)一步包括于藥物學(xué)上可接受的形式中,任選地聯(lián)合藥物學(xué)上可接受的載體。這些組合物可以通過(guò)實(shí)現(xiàn)它們預(yù)期目的的任何方式來(lái)給藥。治療逆轉(zhuǎn)錄病毒病況臨床領(lǐng)域的那些普通技術(shù)人員可以容易地決定根據(jù)本發(fā)明通式I至XIII的化合物的給藥量和方案。
例如,可以通過(guò)非腸道給藥,如皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、眼內(nèi)、直腸、陰道內(nèi)或口腔含化途徑。或者,或同時(shí),可以通過(guò)口服途徑給藥。給藥可以是口腔噴霧或鼻噴霧,或局部,如粉末、膏劑、滴液或貼劑。給藥的劑量取決于接受者的年齡、健康和體重,之前或同時(shí)治療的類(lèi)型(如果有的話),治療的頻率以及預(yù)期效果的性質(zhì)。
可以以其他方式來(lái)使用本發(fā)明的化合物和方法。例如,這樣的化合物可以預(yù)防性使用以最小化感染的風(fēng)險(xiǎn)。另一實(shí)施方案中,化合物可以用于最小化來(lái)自感染人員的疾病播散。
本發(fā)明還涉及治療感染個(gè)體HIV的新方法。一實(shí)施方案中,本發(fā)明特別用于刺激感染HIV患者的免疫應(yīng)答。例如,通過(guò)允許非感染性的病毒從感染細(xì)胞中釋放出來(lái),這樣的感染細(xì)胞持續(xù)暴露抗原并受到免疫系統(tǒng)或其他對(duì)抗這樣抗原的治療劑的有效靶向。另一實(shí)例中,通過(guò)持續(xù)允許非感染性病毒的釋放,感染個(gè)體持續(xù)產(chǎn)生對(duì)所述病毒的免疫應(yīng)答而沒(méi)有遭受該病毒的不利影響。
本發(fā)明還用于擴(kuò)展治療的范圍,并提供治療有此需要的患者的疾病的新手段。另一實(shí)施方案中,可以在出于病毒抗性以外的原因不響應(yīng)其他療法的患者中實(shí)施本發(fā)明。例如,如本領(lǐng)域已知的治療HIV的常規(guī)方法與不利的副作用相關(guān)。一實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法和組合物用于治療一種或多種不利副作用沒(méi)有減輕的患者。一實(shí)施方案中,本發(fā)明包括用不具有特定副作用或具有較低特定副作用的化合物治療患者的方法。
藥物的生物利用率在治療中也是相關(guān)的。一實(shí)施方案中,實(shí)施本發(fā)明使得化合物更有效地吸收至感染細(xì)胞中。一實(shí)施方案中,本發(fā)明包括將藥物傳送至HIV感染細(xì)胞的改進(jìn)方法。
本發(fā)明范圍內(nèi)的組合物包括所有含有有效實(shí)現(xiàn)其預(yù)期目的量的至少一種根據(jù)本發(fā)明以上通式I至XIII的化合物的組合物。盡管個(gè)體需要不同,各種成分有效量最佳范圍的確定是在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的。例如,劑量包括0.0001mg至10g/kg體重。常用的劑量包括約0.1至約100mg/kg體重。優(yōu)選的劑量包括約1至約100mg/kg體重的活性成分。更優(yōu)選的劑量包括約5至約50mg/kg體重。
本發(fā)明化合物的給藥還任選地包括之前、同時(shí)、隨后或輔助使用免疫系統(tǒng)激發(fā)劑或免疫調(diào)節(jié)劑的治療。除了藥理學(xué)上的活性化合物,本發(fā)明的藥物組合物還可以含有合適的藥物學(xué)上可接受的載體,包括藥物上可使用的促進(jìn)活性化合物加工成制劑的賦形劑和輔劑。優(yōu)選,制劑,特別是那些可以口服給藥和可以用于優(yōu)選給藥類(lèi)型的制劑,如片劑、糖錠和膠囊,以及可以直腸給藥的制劑,如栓劑,以及用于注射或口服給藥的合適溶液,含有約0.01至99%,優(yōu)選約20至75%的活性化合物,和賦形劑。
以自身已知的方法來(lái)制造本發(fā)明的藥物制劑,例如,通過(guò)常規(guī)的混合、制粒、制糖錠、溶解或凍干過(guò)程。因此通過(guò)混合活性化合物和固體賦形劑,任選地研磨所得到的混合物,并加工粒狀混合物可以獲得用于口服的藥物制劑,如果期望或需要,在加入合適的輔劑后,獲得片劑或糖錠核芯。
合適的賦形劑是,例如,填充劑,如糖,例如,乳糖或蔗糖,甘露醇或山梨糖醇;纖維素制劑和/或磷酸鈣,如磷酸三鈣或磷酸氫鈣;以及粘合劑,如淀粉糊,使用例如玉米淀粉,小麥淀粉,大米淀粉,馬鈴薯淀粉,明膠,黃蓍膠,纖維素,甲基纖維素,羥丙甲基纖維素,羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要,可以加入崩解劑,如上述的淀粉以及羧甲基淀粉,交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮,瓊脂或藻酸或其鹽,如藻酸鈉。輔劑主要是流動(dòng)調(diào)節(jié)劑和潤(rùn)滑劑,例如,硅石,滑石,硬脂酸或其鹽,如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣,和/或聚乙二醇。如果需要,給糖錠核芯提供合適的耐胃液的包衣。為此,可以使用濃縮的糖溶液,其可以任選地含有阿拉伯膠,滑石,聚乙烯吡咯烷酮,聚乙二醇和/或二氧化鈦,漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。為了產(chǎn)生耐胃液的包衣,使用合適的纖維素制劑如乙酰纖維素酞酸酯或羥丙甲基纖維素酞酸酯的溶液??梢詫⑷玖匣蛏丶尤肫瑒┗蛱清V包衣中,例如,用于區(qū)別或?yàn)榱吮碚骰钚曰衔飫┝康慕M合。
其他可以口服使用的藥物制劑包括由明膠制得的拼裝(push-fit)膠囊,以及由明膠和增塑劑如甘油或山梨糖醇制得的軟密封膠囊。拼裝膠囊可以含有顆粒形式的活性化合物,其可以與填充劑如乳糖、粘合劑如淀粉,和/或潤(rùn)滑劑如滑石或硬脂酸鎂,以及任選的穩(wěn)定劑混合。軟膠囊中,活性化合物優(yōu)選溶解或懸浮于合適的液體中,如脂肪油或液體石蠟。此外,可以加入穩(wěn)定劑。
可以直腸使用的可行藥物制劑包括,例如,由活性化合物和栓劑基料的組合構(gòu)成的栓劑。合適的栓劑基料是,例如,天然或合成的甘油三酯,或石蠟碳?xì)浠衔?。此外,還可以使用由活性化合物和基料的組合構(gòu)成的明膠直腸膠囊??捎玫幕衔镔|(zhì)包括,例如液體甘油三酯,聚乙二醇或石蠟碳?xì)浠衔铩?br> 用于非腸道給藥的合適制劑包括水溶形式活性化合物例如水溶鹽的水溶液。此外,活性化合物的懸浮劑可以作為合適的油性注射懸浮液來(lái)給藥。合適的親脂溶劑或載體包括脂肪油,如芝麻油,或合成的脂肪酸酯,如油酸乙酯,甘油三酯或乙二醇-400??梢院刑岣邞腋∫拐扯鹊奈镔|(zhì)的含水注射懸浮液包括,例如羧甲基纖維素鈉,山梨糖醇和/或葡聚糖。任選地,懸浮液還可以含有穩(wěn)定劑。
用于口服給藥的液體劑型包括藥物學(xué)上可接受的乳液,溶液,懸浮液,糖漿和酏劑。除了活性化合物,液體劑型還可以含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑,如例如,水或其他溶劑,增溶劑和乳化劑如,例如,水或其他溶劑,增溶劑和乳化劑,如乙醇,異丙醇,碳酸乙酯,醋酸乙酯,苯甲醇,苯甲酸芐酯,丙二醇,1,3-丁二醇,二甲基甲酰胺,油,如棉籽油,花生油,玉米油,胚芽油,橄欖油,蓖麻油和芝麻油,甘油,四氫糠醇,聚乙二醇和失水山梨醇的脂肪酸酯,及其混合物。
除了活性化合物,懸浮液可以含有懸浮劑,例如,乙氧基化的異硬脂醇,聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨醇酯,纖維素,微晶纖維素,偏氫氧化鋁,膨潤(rùn)土,瓊脂和黃蓍膠及其組合。
用于局部給藥的藥物組合物包括適于給藥于皮膚、粘膜、肺或眼睛表面的制劑??梢宰鳛榧訅夯蚍羌訅焊煞?、液體或懸浮液來(lái)制得組合物。非加壓粉末制劑中的活性成分可以細(xì)碎形式混合于藥物學(xué)上可接受的惰性載體中,這些載體包括但不限于甘露醇,果糖,葡萄糖,蔗糖,乳糖,糖精或其他糖或甜味劑。
加壓組合物可以含有壓縮氣體,如氮?dú)?,或液化氣體推進(jìn)劑。推進(jìn)劑還可以含有表面活性成分,其可以是液體或固體非離子或陰離子試劑。陰離子試劑可以是鈉鹽的形式。
用于眼睛中的制劑可以包括藥物學(xué)上可接受的眼藥載體,如膏劑,油,如植物油,或包囊材料。待治療的眼睛區(qū)域包括角膜區(qū)域,或內(nèi)部區(qū)域,如虹膜,晶狀體,睫狀體,前房,后房,房水,玻璃體,脈絡(luò)膜或視網(wǎng)膜。
用于直腸給藥的組合物可以是栓劑的形式。用于陰道中的組合物可以是栓劑、霜?jiǎng)⑴菽蛲A羰疥幍啦迦胛锏男问健?br> 可以以脂質(zhì)體的形式給藥組合物。可以由磷脂、磷脂酰膽堿(卵磷脂)或其他本領(lǐng)域已知的天然或合成的類(lèi)似脂肪的化合物制得脂質(zhì)體。可以使用任何能夠形成脂質(zhì)體的無(wú)毒、藥理學(xué)上可接受的脂質(zhì)。脂質(zhì)體可以是多層或單層的。
可以將根據(jù)本發(fā)明用于全身給藥的藥物制劑配制成用于腸內(nèi)、腸外或局部給藥。實(shí)際上,可以同時(shí)使用全部三種類(lèi)型的制劑來(lái)獲得活性成分的全身給藥。
用于口服的合適制劑包括硬明膠膠囊或軟明膠膠囊、糖錠、丸劑、片劑包括包衣的片劑、酏劑、懸浮液、糖漿或吸入劑及其控釋形式。
當(dāng)與生物可降解的緩釋載體復(fù)合時(shí),上述化合物或由本發(fā)明內(nèi)一種或多種測(cè)試鑒定的并具有破壞Gag加工的能力的化合物,也可以以植入物的形式來(lái)給藥?;蛘?,本發(fā)明的化合物可以配制成經(jīng)皮的貼劑用于活性成分的持續(xù)釋放。
以下實(shí)施例只是說(shuō)明性的而并不是用來(lái)限制由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚在本發(fā)明的方法中可以形成各種改進(jìn)和改變而沒(méi)有脫離本發(fā)明的精神和范圍。因此,本發(fā)明意圖涵蓋了本發(fā)明的改進(jìn)和改變,只要它們?cè)谒綑?quán)利要求及其等同方案的范圍內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例1對(duì)抗原代HIV-1分離株的抗病毒活性將加強(qiáng)的病毒抑制測(cè)試用于評(píng)價(jià)DSB對(duì)抗在PMBC中繁殖的原代HIV-1分離株的抗病毒活性。簡(jiǎn)而言之,在96孔組織培養(yǎng)平板中的培養(yǎng)基中形成DSB的連續(xù)稀釋。將25-250 TCID50的病毒和5×105PHA-刺激的PBMC加入每個(gè)孔中。在感染后第1、3和5天,從每個(gè)孔中除去培養(yǎng)基并替換含有合適濃度DSB的新鮮培養(yǎng)基。在感染后的第7天,從每個(gè)孔中取出培養(yǎng)物上清液用于病毒復(fù)制的p24檢測(cè)并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算50%抑制濃度(IC50)。
表5顯示了DSB對(duì)抗一組原代HIV-1分離株的有效抗病毒活性。DSB呈現(xiàn)與平行測(cè)試的獲批準(zhǔn)藥物相似的活性水平。重要地,DSB的活性不受輔助受體使用的限制。
表5---------IC50(nM)-----------
表5DSB和兩種獲批準(zhǔn)的藥物對(duì)抗一組原代分化體B HIV-1分離株的抑制活性(IC50)。在Panacos分離用*表示的臨床HIV-1分離株。所有其他病毒分離株從NIH AIDS Reference Repository獲得。
標(biāo)注R5和X4各自指的是趨化因子受體CCR5和CXCR4。
以一定范圍濃度與PHA-刺激的PBMC溫育7天,然后使用XTT方法測(cè)定細(xì)胞存活力來(lái)分析DSB的毒性。50%細(xì)胞毒性濃度>30μM,對(duì)應(yīng)于約5000的體外治療指數(shù)。
實(shí)施例2DSB對(duì)抗藥物抗性HIV-1分離株的抗病毒活性測(cè)試DSB對(duì)抗一組對(duì)獲批準(zhǔn)藥物耐藥的HIV-1分離株的活性。這些病毒從NIH AIDS Research and Reference Reagent Program獲得。使用在PBMC中繁殖的病毒來(lái)進(jìn)行測(cè)試,使用p24終點(diǎn)(上),或使用細(xì)胞系目標(biāo)(MT-2細(xì)胞)和細(xì)胞殺滅終點(diǎn)。MT-2測(cè)試形式如下。在96孔平板中制得DSB或每種獲批準(zhǔn)藥物的連續(xù)稀釋。向每個(gè)樣品孔中加入含有3×105細(xì)胞/mL MT-2細(xì)胞的培養(yǎng)基和在感染后(PI)5天導(dǎo)致80%細(xì)胞目標(biāo)殺滅所需要濃度的病毒接種物。在感染后的第5天,通過(guò)XTT方法測(cè)定病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞殺滅并測(cè)定化合物的抑制活性。
表6顯示了DSB對(duì)抗一組藥物抗性HIV-1分離株的有效抗病毒活性。結(jié)果與以一組野生型分離株獲得的那些(表5)沒(méi)有顯著差異,證明了DSB保持了其對(duì)抗對(duì)所有主要類(lèi)別獲批準(zhǔn)藥物耐藥的病毒株的活性。
表6-----------IC50(nM)----------
表6DSB對(duì)抗一組耐藥HIV-1分離株的抑制活性(nM IC50)。在新鮮PBMC中用p24終點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試,除了NNRTI-耐藥分離株在MT-2細(xì)胞中進(jìn)行,用細(xì)胞存活力(XTT)終點(diǎn)。*抗性倍數(shù)。
標(biāo)注R5和X4各自指的是趨化因子受體CCR5和CXCR4。
實(shí)施例3DSB在病毒生命周期中的晚期步驟抑制HIV-1復(fù)制為了區(qū)分DSB對(duì)抗早期和晚期復(fù)制目標(biāo)的抑制活性,使用半乳糖苷酶指示劑的多核激活(MAGI)測(cè)試。該測(cè)試中,目標(biāo)是穩(wěn)定表達(dá)CD4,CXCR4,CCR5的HeLa細(xì)胞和由通過(guò)截短的HIV-1 LTR驅(qū)動(dòng)的半乳糖苷酶基因(經(jīng)修飾以定位于核)組成的報(bào)道構(gòu)建體。這些細(xì)胞的感染導(dǎo)致驅(qū)動(dòng)β-半乳糖苷酶報(bào)道基因激活的Tat的表達(dá)。使用顯色底物X-gal檢測(cè)感染細(xì)胞中β-半乳糖苷酶的表達(dá)。如表7中所示的,由于它們破壞病毒復(fù)制中影響Tat蛋白表達(dá)的早期步驟的能力,進(jìn)入抑制劑T-20,NRTI AZT和NNRTI奈韋拉平導(dǎo)致HIV-1感染的MAGI細(xì)胞中β-半乳糖苷酶基因表達(dá)的顯著降低。相反,蛋白酶抑制劑茚地那韋靶向病毒復(fù)制中的晚期步驟(Tat表達(dá)后)而不阻止該系統(tǒng)中的β-半乳糖苷酶基因表達(dá)。用DSB獲得與茚地那韋相似的結(jié)果,表明DSB在完成原病毒DNA整合和病毒轉(zhuǎn)活蛋白合成后的時(shí)間點(diǎn)阻斷病毒復(fù)制(表7)。
表7
(β-半乳糖苷酶表達(dá))表7DSB和進(jìn)入抑制劑(gp41肽T-20),RT抑制劑(AZT和奈韋拉平)和蛋白酶抑制劑(茚地那韋)對(duì)HIV-1感染的MAGI細(xì)胞中β-半乳糖苷酶表達(dá)的效果。DMSO對(duì)照不含藥物。
Kanamoto等(Antimicrob.Agents Chemother.4月;45(4)1225-30,(2002))也報(bào)道了DSB作用于HIV復(fù)制的晚期步驟。然而,他們報(bào)道了該化合物抑制病毒從慢性感染細(xì)胞的釋放。相反,我們使用各種實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的數(shù)據(jù)表明DSB對(duì)病毒釋放不具有顯著效果(例如實(shí)施例6)。
實(shí)施例4DSB不抑制HIV-1蛋白酶活性之前使用通過(guò)追蹤合成肽底物裂解來(lái)表征酶活性的無(wú)細(xì)胞熒光測(cè)試確定了DSB對(duì)HIV-1蛋白酶功能沒(méi)有效果。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明高達(dá)50μg/mL濃度的DSB對(duì)蛋白酶功能不具有效果。觀察到DSB阻斷病毒復(fù)制的晚期步驟后,還進(jìn)行了使用重組形式Gag蛋白的研究,重組形式Gag蛋白是比最初測(cè)試中所用的合成肽底物更相關(guān)的系統(tǒng)。重組Gag蛋白作為底物的使用獲得相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些實(shí)驗(yàn)中,高達(dá)50μg/mL濃度的DSB沒(méi)有破壞蛋白酶介導(dǎo)的Gag蛋白加工。相反,如預(yù)期的,蛋白酶抑制劑茚地那韋在5μg/ml阻斷了Gag蛋白加工(圖1)。
實(shí)施例5DSB導(dǎo)致與病毒成熟缺陷相關(guān)的Gag加工最后步驟(CA-SP1裂解)的缺陷為了更好地定義DSB的作用機(jī)理,對(duì)用DSB處理的HIV-1感染的細(xì)胞系產(chǎn)生的病毒進(jìn)行詳細(xì)檢查。簡(jiǎn)而言之,用1μg/mL DSB處理HIV-1IIIB分離株慢性感染的H9細(xì)胞48小時(shí)。將茚地那韋用作對(duì)照。在48hr的時(shí)間點(diǎn),除去用過(guò)的培養(yǎng)基并加入含有化合物的新鮮培養(yǎng)基。在新鮮化合物加入后24,48和72hr,回收細(xì)胞和上清液用于分析。測(cè)定培養(yǎng)物上清液中的病毒水平并使用蛋白質(zhì)印跡來(lái)表征細(xì)胞相關(guān)病毒和無(wú)細(xì)胞病毒中的病毒蛋白產(chǎn)生。如之前實(shí)驗(yàn)中所觀察到的,DSB沒(méi)有導(dǎo)致慢性感染H9細(xì)胞產(chǎn)生的病毒量的顯著降低,然而,細(xì)胞相關(guān)病毒和無(wú)細(xì)胞病毒中都存在Gag加工缺陷。該缺陷表現(xiàn)為蛋白質(zhì)印跡中對(duì)應(yīng)于p25的附加條帶的形式(圖2)。該p25條帶由衣殼CA-SP1前體的不完全加工引起。對(duì)HIV-2和SIV慢性感染細(xì)胞系的DSB處理呈現(xiàn)了正常的Gag加工,與觀察到缺乏對(duì)抗這些病毒的抗病毒活性相一致。DSB存在下看到的Gag加工缺陷完全不同于用蛋白酶抑制劑茚地那韋所觀察到的(圖2)。如上所討論的,阻止加工的p25至p24切割位點(diǎn)處的突變與病毒成熟和感染性的缺陷相關(guān)(Wiegers K.等,J.Virol.722846-54(1998))。
如之前所討論的(C.T.Wild等,XIVInt.AIDS Cnf.Barcelona,西班牙,摘要MoPeA3030,(2002年7月)),在其他成熟出芽缺陷中也看到了p25至p24的異常加工。這些包括Gag晚期結(jié)構(gòu)域(PTAP)中的突變或TSG-101介導(dǎo)的病毒裝配中破壞出芽的缺陷(Garrus,J.E等,Cell,10755-65,(2001);Demirov,D.G.等,J.Virology76105-117,(2002))。然而,這些突變導(dǎo)致病毒釋放的抑制,而DSB處理對(duì)病毒釋放不具有顯著作用。這些成熟/出芽突變體的形態(tài)與DSB處理后的也非常不同(參見(jiàn)實(shí)施例6)。
此外,干擾病毒RNA二聚作用并導(dǎo)致具有缺陷核心結(jié)構(gòu)的不成熟病毒產(chǎn)生的突變獲得了相似的Gag加工表型(Liang,C.等,J.Virology,736147-6151,(1999))。然而,那些情況中,RNA引入受到抑制和釋放顆粒的形態(tài)與DSB處理后的那些截然不同(參見(jiàn)實(shí)施例6)。
實(shí)施例6DSB處理影響HIV-1成熟,如通過(guò)電子顯微鏡檢(EM)測(cè)定的已經(jīng)證明了HIV-1 Gag中破壞p25加工成p24的突變產(chǎn)生了特征在于內(nèi)部形態(tài)與正常病毒不同的非感染性病毒顆粒(Wiegers K.等,J.Virol.722846-54(1998))。為了確定DSB存在下產(chǎn)生的病毒是否呈現(xiàn)這種不同的形態(tài),進(jìn)行了以下的實(shí)驗(yàn)。
用HIV-1感染性分子克隆pNL4-3轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞并如之前所述的用DSB處理。處理后,用戊二醛固定DSB處理過(guò)的受感染細(xì)胞并通過(guò)EM來(lái)分析。該分析的結(jié)果顯示于圖3中。
這些結(jié)果與破壞p25加工成p24的產(chǎn)生非感染性形態(tài)異常病毒顆粒的化合物一致。
3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)是破壞p25加工成p24并有效抑制HIV-1復(fù)制的化合物實(shí)例。然而,這種化合物不抑制PR活性,且它的作用對(duì)于p25加工成p24的步驟是特異性的,而不是Gag加工中的其他步驟。此外,DSB處理導(dǎo)致上述的異常HIV顆粒形態(tài)。
實(shí)施例7體外選擇對(duì)破壞病毒Gag衣殼(CA)蛋白從CA-間隔肽1蛋白前體加工的化合物抗性的HIV-1分離株。
進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)的抑制抗性的病毒,DSB是HIV-1成熟的抑制劑。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn),將NL4-3或RF病毒分離株用于感染兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物。感染后,在含有DSB的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中維持一個(gè)培養(yǎng)物,而在缺乏DSB的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中平行維持另一個(gè)培養(yǎng)物。
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,在遞增濃度(0.05-1.6μg/ml)的DSB存在或缺乏下維持已經(jīng)用RF病毒感染的H9細(xì)胞。每2-3天加入新鮮藥物使細(xì)胞傳代。每7天通過(guò)p24 ELISA來(lái)監(jiān)測(cè)病毒復(fù)制。同時(shí),在1x或2x初始濃度的DSB存在下以1∶1的細(xì)胞比例與新鮮未感染的H9細(xì)胞共同培養(yǎng)來(lái)傳代經(jīng)DSB處理的具有高水平p24的培養(yǎng)物。共同培養(yǎng)8周后,從含有1.6μg/ml濃度DSB的培養(yǎng)物中收集無(wú)細(xì)胞病毒并用于感染新鮮H9細(xì)胞。每7天,在1x或2x初始濃度的DSB存在下將來(lái)自含有高水平p24的培養(yǎng)物的病毒通過(guò)無(wú)細(xì)胞感染傳代。無(wú)細(xì)胞傳代5周后,從含有3.2μg/ml DSB的培養(yǎng)物收集病毒并用于感染MT-2細(xì)胞。通過(guò)顯微鏡觀察合胞體的形成來(lái)監(jiān)測(cè)MT-2細(xì)胞中的病毒復(fù)制。每1-3天,將細(xì)胞洗滌來(lái)除去輸入的病毒,并將新鮮藥物加入在選擇下的培養(yǎng)物中。每3-4天,選擇下培養(yǎng)物中廣泛合胞體出現(xiàn)后,收集各個(gè)培養(yǎng)物的上清液并通過(guò)0.45μm濾器來(lái)除去細(xì)胞碎片。然后在新鮮藥物的存在或缺乏下將該濾過(guò)的病毒上清液用于感染新鮮MT-2細(xì)胞。在4輪無(wú)細(xì)胞感染后(約培養(yǎng)2周),藥物濃度為3.2μg/ml,收集病毒原種并冷凍用于進(jìn)一步的分析。
第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中,將源自分子克隆pNL4-3的病毒原種(5.7×104TCID50)用于感染MT-2細(xì)胞(6×106細(xì)胞)并在1.6μg/ml濃度的DSB存在或缺乏下維持培養(yǎng)。每1-3天,將細(xì)胞洗滌來(lái)除去輸入的病毒,將新鮮藥物加入選擇下的培養(yǎng)物中。通過(guò)顯微鏡觀察合胞體的形成來(lái)監(jiān)測(cè)病毒復(fù)制。每3-7天,選擇下培養(yǎng)物中大量合胞體出現(xiàn)后,收集各個(gè)培養(yǎng)物的上清液并通過(guò)0.45μm濾器來(lái)除去細(xì)胞碎片。然后在新鮮藥物的存在或缺乏下將該濾過(guò)的病毒上清液用于感染新鮮MT-2細(xì)胞。5輪無(wú)細(xì)胞感染后,且此后每隔一輪,將藥物的濃度加倍。10輪無(wú)細(xì)胞感染后(約培養(yǎng)7周),當(dāng)藥物的濃度達(dá)到12.8μg/ml時(shí),收集病毒原種并冷凍用于進(jìn)一步的分析。
實(shí)施例8選擇對(duì)破壞病毒Gag衣殼(CA)蛋白從CA-間隔肽1蛋白前體加工的化合物抗性的HIV-1分離株的表征。
進(jìn)一步在表型和基因型上分析如上所述產(chǎn)生的病毒原種來(lái)表征它們藥物抗性的性質(zhì)。在病毒復(fù)制測(cè)試中測(cè)定病毒對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)-樺木酸(DSB)的抗性。簡(jiǎn)而言之,通過(guò)定量用連續(xù)4倍稀釋的病毒感染后8天培養(yǎng)物中的p24水平(通過(guò)ELISA),首先在H9細(xì)胞中滴定病毒原種。然后為了第二個(gè)測(cè)試將病毒輸入標(biāo)準(zhǔn)化,在第二個(gè)測(cè)試中在連續(xù)4倍稀釋的藥物存在下將每種病毒培養(yǎng)8天。以與無(wú)藥物對(duì)照相比較降低p24終點(diǎn)水平達(dá)50%的藥物稀釋度來(lái)測(cè)定每種病毒的IC50。這些測(cè)試中,與對(duì)于藥物不存在下平行培養(yǎng)病毒的0.02μM的IC50相比較,兩個(gè)獨(dú)立產(chǎn)生的病毒原種對(duì)于DSB產(chǎn)生高于2μM的IC50值。在隨后系列的實(shí)驗(yàn)中,將A364V突變工程化至HIV-1NL4-3原病毒DNA中,隨后將其轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中。收集所得到的病毒并用于在病毒復(fù)制測(cè)試中測(cè)試DSB的活性,如上所述。這些測(cè)試中,DSB抗性病毒產(chǎn)生0.1μM的IC50值,而野生型NL4-3獲得0.01μM的IC50值。
為了測(cè)定抗性病毒是否能夠逃避由DSB在野生型病毒中引起的CA-SP1裂解缺陷,通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析在藥物存在或缺乏下生長(zhǎng)的每種病毒的原種。濾過(guò)的培養(yǎng)物上清液通過(guò)20%蔗糖墊來(lái)沉淀病毒,該培養(yǎng)物上清液是在感染后60hr和洗滌細(xì)胞并加入新鮮藥物后18hr收集的。將病毒裂解,并通過(guò)定量每個(gè)樣品中的p24水平將每種病毒的量標(biāo)準(zhǔn)化。每個(gè)樣品中病毒蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析證明了在DSB存在下藥物抗性病毒不含有CA-SP1產(chǎn)物,證實(shí)了這些病毒對(duì)藥物對(duì)于這種裂解事件的作用是抗性的。
最后,為了鑒定DSB抗性的遺傳決定因子,通過(guò)高保真度RT-PCR將病毒基因組的完整Gag和PR編碼區(qū)域擴(kuò)增用于測(cè)序。從如上所述制得的每種病毒裂解物純化病毒RNA,并用DNA酶消化來(lái)除去任何污染的DNA。然后將RT-PCR產(chǎn)物凝膠純化來(lái)除去任何非特異性的PCR產(chǎn)物。最后,使用重疊的系列引物將所得到DNA片段的兩條鏈測(cè)序。鑒定出兩個(gè)獨(dú)立地能夠賦予對(duì)DSB抗性的氨基酸突變,NL4-3分離株中殘基364處和RF分離株中殘基366處Gag多肽中丙氨酸至纈氨酸的置換。這些各自是CA-SP1切割位點(diǎn)下游(SP1的N-末端)的第一個(gè)和第三個(gè)殘基。數(shù)據(jù)庫(kù)中所有HIV-1分化體在這些位置每一個(gè)處丙氨酸是高度保守的。
實(shí)施例9將HIV-1成熟抑制劑DSB活性的決定因子作圖于Gag蛋白CA-SP1結(jié)構(gòu)域?yàn)榱诉M(jìn)一步限定DSB活性的分子決定因子,制得一系列嵌合病毒,其中將鄰近DSB-敏感病毒HIV-1的CA-SP1切割位點(diǎn)的殘基插入DSB抗性逆轉(zhuǎn)錄病毒SIV的Gag蛋白的類(lèi)似區(qū)域中。這些SIV/HIV嵌合體(SHIV)關(guān)于DSB活性的表征允許進(jìn)一步鑒定對(duì)于DSB活性必需和足夠的最小HIV-1 Gag序列。
材料和方法SHIV DNA克隆的構(gòu)建使用DSB-抗性SIVmac239作為主鏈聯(lián)合來(lái)自DSB敏感HIV-1pNL4-3的Gag CA-SP1區(qū)域的殘基來(lái)產(chǎn)生三組SHIV。這些SHIV構(gòu)建體的CA-SP1序列顯示于圖20中。使用PCR-重疊-PCR策略進(jìn)行所有的DNA誘變。(Ho,S.H.,H.D.Hunt,R.M.Horton,J.K.Pullen,和L.R.Pease(1989)Site-directed muta genesis by overlapextension using the polymerase chain reaction(使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)通過(guò)重疊延伸定點(diǎn)誘變)Gene 7751-59)和其他標(biāo)準(zhǔn)分子克隆方法(Sambrook,J.,E.F.Fritsch,和T.Maniatis(1989)Molecular cloningalaboratory manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)),第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
細(xì)胞培養(yǎng)和DNA轉(zhuǎn)染將HeLa細(xì)胞維持于DMEM(Invitrogen)(補(bǔ)充10%FBS,100U/ml青霉素,和100μg/ml鏈霉素)中并在匯合時(shí)傳代。使用midiprep試劑盒(Qiagen)制得所有質(zhì)粒DNA。通過(guò)使用FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)用野生型SIVmac 239,HIV-1 pNL4-3或SHIV原病毒DNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之,在使用的前一天將細(xì)胞以1.5×105細(xì)胞每孔的濃度接種于6孔平板(Corning)中并在轉(zhuǎn)染那天使其達(dá)到60至80%匯合。對(duì)于每次轉(zhuǎn)染,將3μl的FuGENE6稀釋至100μl無(wú)血清DMEM中,接著加入1μg DNA。溫和混合后,將DNA-脂質(zhì)復(fù)合物的混合物逐滴溫和地加入1.5ml完全DMEM培養(yǎng)基中的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí),將含有DNA-FuGENE 6復(fù)合物的培養(yǎng)基除去并將1.5ml新鮮DMEM加入轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后48h,收集細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液用于進(jìn)一步的分析。
SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡為了表征將HIV-1的CA-SP1結(jié)構(gòu)域的殘基引入SIV對(duì)病毒顆粒產(chǎn)生和Gag多蛋白加工的作用,進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡。簡(jiǎn)而言之,在轉(zhuǎn)染后48h,收集含有病毒顆粒的培養(yǎng)基并在Sorvall RT 6000B離心機(jī)中以2,000rpm和4℃離心20分鐘來(lái)澄清。然后在微離心機(jī)中通過(guò)20%蔗糖墊以13,000rpm 4℃120分鐘來(lái)濃縮含有顆粒的上清液在并將沉淀物重懸浮于裂解緩沖液中(150mM Tris-HCl,5%曲通X-100,1%脫氧膽酸鹽,0.1%十二烷基硫酸鈉[SDS],pH8.0)。對(duì)于細(xì)胞裂解物,在轉(zhuǎn)染后48小時(shí),將細(xì)胞用PBS洗一次并裂解(150mM Tris-HCl,5%曲通X-100,1%脫氧膽酸鹽,pH8.0),然后以13,000rpm于4℃離心5分鐘來(lái)除去核部分。將病毒沉淀物和細(xì)胞裂解物在12%NuPAGEBis-Tris凝膠(Invitrogen)上分離并轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜(Inviteogen),接著在含有0.5%吐溫和5%干奶粉PBS緩沖液中封閉。用抗-SIVmac 251 p27 McAb(NIH AIDS Research and Reference ReagentProgram)溫育膜并用山羊抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶(Sigma)雜交。對(duì)于含有HIV-1蛋白的膜,用HIV-1感染患者的免疫球蛋白(HIV-Ig)(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)溫育膜并用山羊抗人辣根過(guò)氧化物酶(Sigma)來(lái)雜交。用ECL系統(tǒng)(Amers hamPharmacia Biotech)根據(jù)制造商提供的說(shuō)明來(lái)顯現(xiàn)免疫復(fù)合物。
DSB對(duì)SHIV Gag加工的作用為了了解Gag置換對(duì)DSB抑制CA-SP1加工的能力的作用,通過(guò)使用上述的程序,用野生型SIVmac 239,HIV-1 pNL4-3或SHIV原病毒DNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。在整個(gè)培養(yǎng)階段中維持1μg/ml濃度的DSB或DMSO(無(wú)藥物對(duì)照),且如上所述進(jìn)行分析這些培養(yǎng)物產(chǎn)生的病毒蛋白的SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡。
只有對(duì)DSB作用完全敏感的病毒評(píng)價(jià)為敏感,而具有殘余抗性的那些評(píng)價(jià)為抗性。因此,實(shí)驗(yàn)9中的評(píng)價(jià)不同于之前的評(píng)價(jià),之前的評(píng)價(jià)將不是完全抗性的病毒評(píng)價(jià)為敏感。出于該原因,在實(shí)驗(yàn)9中將SHIV.DM評(píng)價(jià)為DSB抗性,但之前評(píng)價(jià)為DSB敏感。
結(jié)果Gag SHIV的表征制得三組HIV-1/SIV Gag嵌合體(圖20)。組1由含有SIV主鏈的病毒組成,該主鏈中插入了HIV-1 SP1結(jié)構(gòu)域的殘基。這些嵌合體中的HIV-1插入片段大小從單點(diǎn)置換(SHIV DA)至SIV SP1結(jié)構(gòu)域完全替換為來(lái)自HIV-1的SP1序列(SHIV DN)。組2由含有相同SP1置換加上包括HIV-1的兩個(gè)C-末端CA殘基(LM至VL)的病毒組成。組3SHIV與組2中的那些相同,除外除了SP1結(jié)構(gòu)域中的置換和HIV-1的兩個(gè)C-端CA殘基(LM至VL)外,這些嵌合體中的每一個(gè)在CA-SP1切割位點(diǎn)上游的第6個(gè)位置(P6)還引入了Q(SIV)至H(HIV-1)的改變。
測(cè)定了從轉(zhuǎn)染細(xì)胞釋放的病毒顆粒水平和每個(gè)SHIV的Gag加工特征(圖21)。所有組1的SHIV在顆粒產(chǎn)生和Gag加工方面行為相似;這些嵌合病毒與親本SIV相比較呈現(xiàn)了接近野生型水平的顆粒產(chǎn)生和正常的Gag加工特征。組2中大部分嵌合體的特征在于正常的Gag加工特征,而SHIV FC和11的細(xì)胞表達(dá)有些降低(圖21A)。對(duì)于組2的所有SHIV,相對(duì)于細(xì)胞相關(guān)表達(dá)的病毒產(chǎn)生量比得上親本SIV。與組1和2的SHIV相反,組3中的大部分嵌合體呈現(xiàn)了Gag加工的缺陷。這些SHIV中,只有GH,GI和23呈現(xiàn)了正常的Gag加工特征。從這些結(jié)果清楚的是CA-SP1切割位點(diǎn)上游六個(gè)殘基處Q至H的改變影響了SIV PR加工嵌合Gag蛋白的能力。
圖21中顯示了SHIV組2的結(jié)果,組2包括在SP1和CA結(jié)構(gòu)域都含有HIV-1殘基的病毒。如之前所述的,這組的SHIV與組1的相同,除外除了SP1結(jié)構(gòu)域中的置換,這些嵌合體中的每一個(gè)還引入了兩個(gè)HIV-1 CA C-末端殘基(HIV-1的VL替代了SIV的LM)。和組1中的病毒一樣,組2中嵌合體的特征在于正常的Gag加工特征(圖21),且盡管SHIV FC和11的細(xì)胞表達(dá)有些降低(圖21A),用編碼這些SHIV的DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液中發(fā)現(xiàn)的病毒比例與所有組2病毒觀察到的病毒釋放水平成比例。
圖21中顯示了病毒在Gag SP1和CA結(jié)構(gòu)域中都含有HIV-1殘基的SHIV組3的結(jié)果。這組的SHIV與組1中的那些相同,除外除了SP1結(jié)構(gòu)域中的置換,這些嵌合體中的每個(gè)還引入了兩個(gè)來(lái)自HIV-1的C-末端殘基(SIV的LM至HIV-1的VL)加上CA-SP1切割位點(diǎn)上游第6個(gè)位置處Q(SIV)至H(HIV-1)改變。和頭兩組不一樣,組3中的大部分嵌合體呈現(xiàn)了Gag加工的缺陷(圖21)。這些SHIV中,只有GH,GI和23呈現(xiàn)了正常的Gag加工特征。從這些結(jié)果清楚的是CA-SP1切割位點(diǎn)上游六個(gè)殘基處Q至H改變對(duì)SIV蛋白酶加工所得到的嵌合Gag蛋白的能力具有顯著的影響。
Gag SHIV對(duì)DSB的敏感性表征組1,2和3中的每個(gè)SHIV對(duì)DSB的敏感性。如上所述,DSB破壞了HIV-1 CA-SP1裂解,導(dǎo)致呈現(xiàn)異常核心形態(tài)的非感染性病毒顆粒的釋放(Li,F(xiàn),R.Golia-Gaur,K.Salzwedel,N.R.Kilgore,M.Reddick,C.Matallana,A.Castillo,D.Zoumplis,D.E.Martin,J.M.Orenstein,G.P.Allaway,E.O.Freed,和C.T.Wild(2003)PA-457a potent HIV inhibitor that disrupts core condensationby targeting a late step in Gag processing(通過(guò)靶向Gag加工的晚期步驟破壞核心凝聚的有效HIV抑制劑)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10013555-13560)。在本研究中,在1μg/ml濃度的DSB存在下將表達(dá)SHIV的細(xì)胞培養(yǎng)48hr。在該時(shí)間結(jié)束時(shí),從培養(yǎng)物上清液中收集病毒和分析每個(gè)嵌合病毒的Gag加工特征并與化合物不存在下的Gag蛋白加工相比較(圖22)。
如圖22中所看到的,SP1 SHIV(組1)中沒(méi)有一個(gè)呈現(xiàn)對(duì)DSB的敏感性。甚至SHIV DN,其含有完整的HIV-1 SP1結(jié)構(gòu)域,在濃度超過(guò)組織培養(yǎng)測(cè)定的IC50的化合物存在下也呈現(xiàn)了正常的Gag加工特征(圖22)(Li等)。組1嵌合體的結(jié)果證明了DSB活性的決定因子包括SP1結(jié)構(gòu)域外的HIV-1 Gag區(qū)域。組2 SHIV的結(jié)果與組1觀察到的那些相同。特別地,這些CA-SP1嵌合體中沒(méi)有一個(gè)呈現(xiàn)DSB敏感性(圖22)。由于組2的病毒除了HIV-1的SP1序列外,還含有C-末端VL氨基酸殘基,這些結(jié)果證明除緊靠CA-SP1切割位點(diǎn)兩側(cè)那些殘基以外的HIV-1 Gag殘基在DSB敏感性中起作用。
如圖22A中所示的,對(duì)于組3 SHIV的一個(gè)亞組,DSB確實(shí)破壞CA-SP1加工。這些嵌合病毒中,SHIV 23和GI呈現(xiàn)了比得上原型HIV-1分離株NL4-3的DSB敏感性水平(圖22A)。在重復(fù)的實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)CA-SP1與CA的相對(duì)比例測(cè)定的化合物對(duì)這些病毒中每一種的作用大小幅度幾乎相同。此外在組3中,SHIV GH呈現(xiàn)了一定水平的DSB敏感性,然而,在定性的水平上,與對(duì)SHIV 23和GI觀察到的相比較,對(duì)抗該病毒觀察到的活性降低。對(duì)于SHIV GH,DSB對(duì)Gag加工的作用降低至在免疫印跡中觀察到的非常淡的CA-SP1條帶在圖22A中不明顯的點(diǎn)。上樣于凝膠上的病毒蛋白量的5X增加將蛋白質(zhì)印跡測(cè)試的敏感性提高至允許觀察對(duì)于SHIV GH的DSB介導(dǎo)的加工缺陷的水平(圖22B)。對(duì)于組3中剩余的病毒,由于Gag加工中的序列相關(guān)缺陷,不能測(cè)定化合物的效果(圖21B)。組3 SHIV的結(jié)果表明CA-SP1切割位點(diǎn)上游第6個(gè)位置處的His殘基在DSB敏感性中起著重要作用且就在切割位點(diǎn)附近以外的CA和SP1相當(dāng)大部分對(duì)于DSB活性是必需的。
討論制得(圖20)并表征三組SIV/HIV-1嵌合體。對(duì)于SP1或CA/SP1置換對(duì)Gag蛋白加工、病毒顆粒釋放和DSB敏感性的效果,所有組1和2的SHIV行為相似(圖21和22)。盡管組2中的一些病毒(即,F(xiàn)D和11)的特征在于病毒顆粒產(chǎn)生水平的降低,該效果很可能是由于轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒量的整體降低而引起的(圖21A)。通過(guò)化合物對(duì)CA-SP1加工的效果測(cè)定的這些組1和2 SHIV中沒(méi)有一個(gè)對(duì)DSB敏感的事實(shí)表明,就在HIV-1 CA-SP1切割位點(diǎn)附近以外的Gag序列在DSB活性中起著關(guān)鍵作用。
與組1和2中的病毒相反,組3 SHIV中的三個(gè)成員呈現(xiàn)了一定程度的DSB敏感性。這些病毒中,SHIV 23和GI呈現(xiàn)了NL4-3樣的DSB敏感性,而SHIV GH呈現(xiàn)了有些降低的對(duì)化合物敏感性水平。另外的組3病毒中,CA-SP1置換對(duì)Gag加工的作用使得不可能測(cè)定化合物對(duì)剩余嵌合體的作用。
DSB對(duì)這3組CA-SP1 SHIV的Gag加工特征的作用表明化合物活性的決定因子包括CA-SP1切割位點(diǎn)兩側(cè)相對(duì)大的Gag區(qū)域。DSB對(duì)抗組2 SHIV 11(不敏感)與組3 SHIV 23(敏感)的活性比較表明,位于切割位點(diǎn)上游第6個(gè)CA位置的His殘基對(duì)DSB活性是關(guān)鍵的(圖22B)。與該觀察相一致,體外抗性選擇研究已經(jīng)鑒定出賦予一定水平的DSB不敏感性的該位置處的突變。
在此的結(jié)果表明了CA-SP1區(qū)域中高親和性和低親和性結(jié)合位點(diǎn)的存在。低親和性相互作用將產(chǎn)生部分DSB活性(即,SIVm3),而高親和性結(jié)合將獲得完全化合物敏感性(即,SHIV23)。
實(shí)施例10病毒分離株的基因分型如上所示,已經(jīng)證明了HIV中的序列多態(tài)性與病毒在DSB存在下的復(fù)制能力相符。大部分序列多態(tài)性簇集在gag中尤其是在編碼CA-SP1的區(qū)域中。因此,病毒分離株的基因分型可以用于容易地確定這種病毒的復(fù)制是否可能受到DSB或任何其他干擾p25加工的化合物抑制。
這樣基因分型的結(jié)果可用于,例如,確定是否可以用DSB或以相似方式干擾p25加工的任何其他化合物來(lái)治療患者的病毒感染,或用于測(cè)定DSB治療過(guò)程中抗性變體的出現(xiàn)。
可以通過(guò)各種方法來(lái)進(jìn)行基因分型。一些實(shí)施方案中,通過(guò)測(cè)序來(lái)進(jìn)行基因分型。
方法從每名患者獲得血漿的單一冷凍等份試樣(約1.2ml體積)。將血漿樣品存儲(chǔ)于-70℃直至準(zhǔn)備處理。使用三位數(shù)的患者ID編號(hào)來(lái)識(shí)別每個(gè)樣品。
在處理那天,將各個(gè)血漿樣品在37℃水浴中快速解凍然后置于冰上。取出140μl血漿的等份試樣置于單獨(dú)的管中用于核酸純化,使用QIAamp迷你病毒RNA純化試劑盒(Qiagen)。將剩余的血漿樣品轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的管中用于簡(jiǎn)短的低速離心(8,000rpm 3分鐘)來(lái)澄清血漿。然后將1ml澄清的上清液轉(zhuǎn)移至新鮮管中并以全速(13,000rpm)離心2hr來(lái)沉淀病毒。使用移液管小心地取出上清液并轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的管中存儲(chǔ)于-70℃作為對(duì)病毒沉淀物可能破壞的預(yù)防措施。將病毒沉淀物重懸浮于140μl的PBS中并存儲(chǔ)于-70℃作為備用樣品,以防從非沉淀血漿初始等份試樣沒(méi)有獲得足夠的RT-PCR產(chǎn)物。
表8 HIV-1Gag引物分化體B中保守的HIV-1 Gag CA/SP1引物
純化后,以約60μl的終體積洗脫病毒RNA。只有7μl該儲(chǔ)液最初用作模板用于逆轉(zhuǎn)錄,使用StrataScript第一鏈合成系統(tǒng)(Stratagene)。將剩余的RNA儲(chǔ)液存儲(chǔ)于-70℃作為備份。逆轉(zhuǎn)錄的引物(R+625)退火在CA-SP1切割位點(diǎn)下游約625bp。已經(jīng)設(shè)計(jì)所有用于該計(jì)劃中的RT-PCR和測(cè)序的引物退火至分化體BHIV分離株中高度保守的gag區(qū)域并已經(jīng)使用42名不同患者的血漿樣品證實(shí)。
以50μl的總體積來(lái)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。只有5μl該反應(yīng)最初用作CA-SP1區(qū)域PCR擴(kuò)增的模版,使用PicoMaxx高保真度PCR Master Mix(Stratagene)。將剩余的反應(yīng)物保存于-20℃作為備份。使用發(fā)現(xiàn)其提供高產(chǎn)量的非常純凈的DNA產(chǎn)物的兩步“巢式(nested)”P(pán)CR策略。第一輪PCR擴(kuò)增的正向和反向引物(F-625和R+525)各自退火在CA-SP1切割位點(diǎn)上游約625bp和下游525bp。該第一個(gè)PCR反應(yīng)后通過(guò)瓊脂糖凝膠分析通??床坏疆a(chǎn)物。
以50μl總體積進(jìn)行最初的PCR反應(yīng)。循環(huán)后,取出該反應(yīng)的5μl并用作第二輪“巢式”P(pán)CR反應(yīng)的模版,使用引物F-575和R-450,其退火至最初引物對(duì)退火區(qū)域內(nèi)部的gag區(qū)域。將剩余的第一輪PCR反應(yīng)物存儲(chǔ)于-20℃作為備份。用于第二輪PCR反應(yīng)的正向和反向引物各自退火在CA-SP1切割位點(diǎn)上游約575bp和下游450bp。取出5μl最終“巢式”P(pán)CR反應(yīng)物用于通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析DNA產(chǎn)物。如果,如預(yù)期的,反應(yīng)只含有一條對(duì)于所需的產(chǎn)物預(yù)測(cè)大小(~1.1kb)的顯著條帶,且估計(jì)產(chǎn)量足以允許測(cè)序(即,總共~200ng),則取出40μl反應(yīng)物用于DNA產(chǎn)物的純化,使用MinElute PCR純化試劑盒(Qiagen)。將剩余的~5μl反應(yīng)物存儲(chǔ)于-20℃作為備份。純化的DNA產(chǎn)物洗脫后,將合適的體積(對(duì)應(yīng)于至少40ng DNA)轉(zhuǎn)移至兩個(gè)管中,每個(gè)管中含有不同的測(cè)序引物(DNA的每一鏈一條)。“+”鏈測(cè)序引物(F-300)退火在CA-SP1切割位點(diǎn)上游約300bp?!?”鏈測(cè)序引物(R+275)退火在CA-SP1切割位點(diǎn)下游約275bp。運(yùn)送模板/引物混合物用于測(cè)序和分析。將剩余的純化DNA產(chǎn)物存儲(chǔ)于-20℃作為備份。所得到序列的分析提供了每條DNA鏈的重疊讀數(shù)來(lái)幫助解決任何單個(gè)測(cè)序反應(yīng)中的任何不確定性。
如果在兩個(gè)測(cè)序反應(yīng)中都發(fā)現(xiàn)不確定性,使用備選的經(jīng)驗(yàn)證的測(cè)序引物來(lái)分析另外的測(cè)序反應(yīng),以防問(wèn)題在于原始測(cè)序引物退火的gag區(qū)域的不均一性。這些將包括各自退火在CA-SP1切割位點(diǎn)上游約375和125bp的兩條“+”鏈引物(F-375和F-125)和退火在CA-SP1切割位點(diǎn)下游約100和400bp的兩條“-”鏈引物(R+100和R+400)。
如果在瓊脂糖凝膠上分析時(shí)最后的“巢式”P(pán)CR反應(yīng)物含有明顯的背景條帶(即,高于約10%的總產(chǎn)量),或如果測(cè)序不能產(chǎn)生純凈的序列,則通過(guò)將整個(gè)PCR反應(yīng)物(如果需要從備份樣品再擴(kuò)增)在瓊脂糖凝膠上跑膠并切割所需的條帶來(lái)純化所需的DNA產(chǎn)物。然后使用QIAEXII凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖純化DNA并制得洗脫的產(chǎn)物用于如上所述的測(cè)序中。
如果PCR反應(yīng)不能產(chǎn)生足夠的產(chǎn)物用于測(cè)序,如果需要,可以進(jìn)行另外的RT-PCR或PCR反應(yīng),使用上述任何備份樣品和另外驗(yàn)證的引物組,包括退火在CA-SP1切割位點(diǎn)上游約550,375,300和125bp的四種正向引物(F-550,F(xiàn)-375,F(xiàn)-300和F-125)和引物退火在CA-SP1切割位點(diǎn)下游400,275和100bp的三種反向引物(R+400,R+275和R+100)。例如,使用引物R+525用于逆轉(zhuǎn)錄以及引物F-575和R+450用于單輪PCR擴(kuò)增獲得了極好的結(jié)果。引物F-550和R+400對(duì)于PCR擴(kuò)增也很好用。
然后將所得到的基因型和本文別處鑒定的病毒基因型相匹配來(lái)確定病毒是否受到DSB的抑制或不受到抑制。可以通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)如通過(guò)對(duì)病毒分離株的直接實(shí)驗(yàn)獲得對(duì)基因分型結(jié)果的進(jìn)一步證實(shí)。
實(shí)施例11DSB治療過(guò)程中的遺傳改變?yōu)榱藴y(cè)定DSB治療過(guò)程中HIV-1基因型的改變,獲得各個(gè)患者在給藥之前和研究結(jié)束時(shí)(28天)的病毒群基因型來(lái)確定在治療過(guò)程中是否已經(jīng)發(fā)生了任何突變。如果在研究結(jié)束時(shí)的樣品中鑒定出給藥之前不存在的任何突變,則對(duì)給藥后第7和10天采取的中間樣品也進(jìn)行基因分型來(lái)確定突變是何時(shí)發(fā)生的。
使用該方法,測(cè)定了研究過(guò)程中總病毒群中可能發(fā)生的突變。將突變鑒定為對(duì)于給定密碼子指定的氨基酸高于25%的變異。一旦鑒定出突變,回顧原始數(shù)據(jù)的色譜來(lái)確定較小病毒群中該位置的氨基酸的身份。如果使用這些標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有鑒定出上述抗性突變中的任意一個(gè),則回顧每個(gè)反應(yīng)的色譜來(lái)確定任何相關(guān)位置是否存在任何次要種類(lèi)(低于總?cè)后w的25%)。
現(xiàn)已全面描述了本發(fā)明,本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以在廣泛和等同范圍的條件、制劑和其他參數(shù)內(nèi)進(jìn)行本發(fā)明而不影響本發(fā)明的范圍或其任意的實(shí)施方案。在此引用的所有專(zhuān)利、申請(qǐng)和出版物全部以其整體引入作為參考。
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<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa可為纈氨酸或異亮氨酸<400>1Xaa His Lys Ala Arg Xaa Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val1 5 10<210>2<211>14<212>PRT<213>HIV-1 NL4-3<400>2Gly His Lys Ala Arg Val Leu Val Glu Ala Met Ser Gln Val1 5 10<210>3
<211>14<212>PRT<213>HIV-1 RF<400>3Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Val Met Ser Gln Val1 5 10<210>4<211>1823<212>DNA<213>HIV-1 NL4-3<220>
<221>misc_feature<222>(1365)..(1365)<223>N可為任何核苷酸a,t,g,c<400>4atgggtgcga gagcgtcggt attaagcggg ggagaattag ataaatggga aaaaattcgg 60ttaaggccag ggggaaagaa acaatataaa ctaaaacata tagtatgggc aagcagggag120ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctt ttagagacat cagaaggctg tagacaaata180ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat240acaatagcag tcctctattg tgtgcatcaa aggatagatg taaaagacac caaggaagcc300ttagataaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aggcacagca agcagcagct360gacacaggaa acaacagcca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa cctccagggg420caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa480gagaaggctt tcagcccaga agtaataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc540ccacaagatt taaataccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg600ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gattgcatcc agtgcatgca660gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact720agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acacataatc cacctatccc agtaggagaa780atctataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc840agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccgattc900tataaaactc taagagccga gcaagcttca caagaggtaa aaaattggat gacagaaacc960ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagga 1020gcgacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca 1080agagttttgg ttgaagcaat gagccaagta acaaatccag ctaccataat gatacagaaa 1140ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200
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<223>用于抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)<400>21Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Phe Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp1 5 10 15Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu20 25 30Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro His Lys Ala Arg Ile35 40 45Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met50 55 60<210>22<211>64<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)<400>22Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp1 5 10 15Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu20 25 30Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg35 40 45Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met50 55 60
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<223>用于抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)<400>23Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Ser His Lys Ala Arg Ile Leu1 5 10 15Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met20 25 30<210>24<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)<400>24Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val1 5 10 15Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met20 25 30<210>25<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)<400>25Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val1 5 10<210>26<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)<400>26
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<223>有待插入SIVmac239主鏈的HIV-1 CA-SP1殘基<400>32Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val1 5<210>33<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>33Ala Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala ThrIle Met1 5 10<210>34<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>34Ala Glu Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met1 5 10<210>35<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域
<400>35Ala Glu Ala Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met1 5 10<210>36<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>36Ala Glu Ala Met Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met1 5 10<210>37<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>37agccaaaact cttgctttat ggcc24<210>38<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>38agtcagtgtg gaaaatctct agcagtgg28<210>39<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>39gcaatgagcc aagtaacaaa tcca24<210>40<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>40aggtatggta aatgcagtat acttcctgaa g31<210>41<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>41ttcagccaaa actcttgctt tatggcc27<210>42<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>42atgagccaagtaacaaatcc agc23<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>43tgcttcagcc aaaactcttg c21<210>44<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>44agccaagtaa caaatccagc t21<210>45<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>45cattgcttca gccaaaactc ttgc24<210>46<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>46caagtaacaa atccagctac ca22<21D>47<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>47gctcattgct tcagccaaaa ctctt25<210>48<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>48gtaacaaatc cagctaccat aa22<210>49<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>49acaaatccag ctaccataat gatac25<210>50<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列
<400>50ttggctcattgcttcagcca aaactc26<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>51tacttggctc attgcttcag ccaa24<210>52<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>52aatccagcta ccataatgat acag24<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>53tgttacttgg ctcattgctt c21<210>54<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>54ccagctacca taatgataca gaaa24<210>55<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列
<400>55atttgttact tggctcattg cttc24<210>56<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>56gctaccataa tgatacagaa aggcaa26<210>57<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>57tggatttgtt acttggctca ttgc24<210>58<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>58accataatga tacagaaagg c21<210>59<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>59agctggattt gttacttggc tc22<210>60<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>60
ataatgatac agaaaggcaa ttttagg27<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>61ggtagctgga tttgttactt g21<210>62<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>62atgatacaga aaggcaattt taggaacc28<210>63<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>63tatggtagct ggatttgtta c21<210>64<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>64atacagaaag gcaattttag g21<210>65<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>65ccacctatcc cagtaggag19
<210>66<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>66ggcacagcaa gcagcagctg20<210>67<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>67gtagaccaac agcaccatct agcggcaga29<210>68<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>68ggtaaagtaa aggcagtgta ctgcctaa28<210>69<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>69cactggtgcg aggacctgac tcatggcttc tgccatt37<210>70<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>70aatggcagaa gccatgagtc aggtcctcgc accagtg37
<210>71<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>71ggcttctgcc agtactctag ccttctgt28<210>72<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>72acagaaggct agagtactgg cagaagcc28<210>73<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>73ggcttctgcc agtactctag ccttctgt28<210>74<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>74acagaaggct agagtactgg cagaagcc28<210>75<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入Gag SP1結(jié)構(gòu)域的序列<400>75atccaactgg ggttgcaaaa atgtg25
<210>76<211>25<212>PRT<213>HIV-1<400>76Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala MetSer Gln Val Thr Asn1 5 10 15Pro Ala Thr Ile Met Ile Gln Lys Gly20 25<210>77<211>19<212>PRT<213>FIV<400>77Gly Tyr Lys Met Gln Leu Leu Ala Glu Ala Leu Thr Lys Val Gln Val1 5 10 15Val Gln Ser<210>78<211>16<212>PRT<213>EIAV<400>78Lys Gln Lys Met Met Leu Leu Ala Lys Ala Leu Gln Thr Gly Leu Ala1 5 10 15<210>79<211>36<212>PRT<213>BIV<400>79Lys Ser Lys Met Gln Phe Leu Val Ala Ala Met Lys Glu Met Gly Ile1 5 10 15Gln Ser Pro Ile Pro Ala Val Leu Pro His Thr Pro Glu Ala Tyr Ala20 25 30Ser Gln Thr Ser35<210>80
<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于替換的HIV-1 CA-SPl序列<400>80Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val1 5 10<210>81<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>血細(xì)胞凝集素表位HA<400>81Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5<210>82<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>藍(lán)舌病病毒表位VP7<400>82Gln Tyr Pro Ala Leu Thr1 5<210>83<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Flag表位<400>83Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>84<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>VSV-G表位<400>84Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys1 5 10<210>85<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>85Ala Glu Ala Met Ser Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met1 5 10<210>86<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>86Ala Glu Ala Met Ser Gln Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met1 5 10<210>87<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>87Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Asn Pro Ala Thr Ile Met1 5 10<210>88<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>88Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Pro Ala Thr Ile Met
1 5 10<210>89<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>89Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Ala Thr Ile Met1 5 10<210>90<211>1530<212>DNA<213>SIV DM<400>90atgggcgtga gaaactccgt cttgtcaggg aagaaagcag atgaattaga aaaaattagg 60ctacgaccca acggaaagaa aaagtacatg ttgaagcatg tagtatgggc agcaaatgaa120ttagatagat ttggattagc agaaagcctg ttggagaaca aagaaggatg tcaaaaaata180ctttcggtct tagctccatt agtgccaaca ggctcagaaa atttaaaaag cctttataat240actgtctgcg tcatctggtg cattcacgca gaagagaaag tgaaacacac tgaggaagca300aaacagatag tgcagagaca cctagtggtg gaaacaggaa caacagaaac tatgccaaaa360acaagtagac caacagcacc atctagcggc agaggaggaa attacccagt acaacaaata420ggtggtaact atgtccacct gccattaagc ccgagaacat taaatgcctg ggtaaaattg480atagaggaaa agaaatttgg agcagaagta gtgccaggat ttcaggcact gtcagaaggt540tgcaccccct atgacattaa tcagatgtta aattgtgtgg gagaccatca agcggctatg600cagattatca gagatattat aaacgaggag gctgcagatt gggacttgca gcacccacaa660ccagctccac aacaaggaca acttagggag ccgtcaggat cagatattgc aggaacaact720agttcagtag atgaacaaat ccagtggatg tacagacaac agaaccccat accagtaggc780aacatttaca ggagatggat ccaactgggg ttgcaaaaat gtgtcagaat gtataaccca840acaaacattc tagatgtaaa acaagggcca aaagagccat ttcagagcta tgtagacagg900ttctacaaaa gtttaagagc agaacagaca gatgcagcag taaagaattg gatgactcaa960acactgctga ttcaaaatgc taacccagat tgcaagctag tgctgaaggg gctgggtgtg 1020aatcccaccc tagaagaaat gctgacggct tgtcaaggag taggggggcc gggacagaag 1080gctagagtat tggcagaagc catgagtcag gtcctcgcac cagtgccaat cccttttgca 1140
gcagcccaac agaggggacc aagaaagcca attaagtgtt ggaattgtgg gaaagaggga 1200cactctgcaa ggcaatgcag agccccaaga agacagggat gctggaaatg tggaaaaatg 1260gaccatgtta tggccaaatg cccagacaga caggcgggtt ttttaggcct tggtccatgg 1320ggaaagaagc cccgcaattt ccccatggct caagtgcatc aggggctgat gccaactgct 1380cccccagagg acccagctgt ggatctgcta aagaactaca tgcagttggg caagcagcag 1440agagaaaagc agagagaaag cagagagaag ccttacaagg aggtgacaga ggatttgctg 1500cacctcaatt ctctctttgg aggagaccag1530<210>91<211>67<212>PRT<213>SIV DM<400>91Lys Asn Trp Met Thr Gln Thr Leu Leu Ile Gln Asn Ala Asn Pro Asp1 5 10 15Cys Lys Leu Val Leu Lys Gly Leu Gly Val Asn Pro Thr Leu Glu Glu20 25 30Met Leu Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly Gln Lys Ala Arg35 40 45Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Leu Ala Pro Val Pro Ile Pro50 55 60Phe Ala Ala65<210>92<211>1530<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SIV嵌合體的GAG基因,其中Q358變?yōu)镠358<400>92atgggcgtga gaaactccgt cttgtcaggg aagaaagcag atgaattaga aaaaattagg60ctacgaccca acggaaagaa aaagtacatg ttgaagcatg tagtatgggc agcaaatgaa 120ttagatagat ttggattagc agaaagcctg ttggagaaca aagaaggatg tcaaaaaata 180ctttcggtct tagctccatt agtgccaaca ggctcagaaa atttaaaaag cctttataat 240actgtctgcg tcatctggtg cattcacgca gaagagaaag tgaaacacac tgaggaagca 300
aaacagatag tgcagagaca cctagtggtg gaaacaggaa caacagaaac tatgccaaaa 360acaagtagac caacagcacc atctagcggc agaggaggaa attacccagt acaacaaata 420ggtggtaact atgtccacct gccattaagc ccgagaacat taaatgcctg ggtaaaattg 480atagaggaaa agaaatttgg agcagaagta gtgccaggat ttcaggcact gtcagaaggt 540tgcaccccct atgacattaa tcagatgtta aattgtgtgg gagaccatca agcggctatg 600cagattatca gagatattat aaacgaggag gctgcagatt gggacttgca gcacccacaa 660ccagctccac aacaaggaca acttagggag ccgtcaggat cagatattgc aggaacaact 720agttcagtag atgaacaaat ccagtggatg tacagacaac agaaccccat accagtaggc 780aacatttaca ggagatggat ccaactgggg ttgcaaaaat gtgtcagaat gtataaccca 840acaaacattc tagatgtaaa acaagggcca aaagagccat ttcagagcta tgtagacagg 900ttctacaaaa gtttaagagc agaacagaca gatgcagcag taaagaattg gatgactcaa 960acactgctga ttcaaaatgc taacccagat tgcaagctag tgctgaaggg gctgggtgtg1020aatcccaccc tagaagaaat gctgacggct tgtcaaggag taggggggcc gggacataag1080gctagagtat tggcagaagc catgagtcag gtcctcgcac cagtgccaat cccttttgca1140gcagcccaac agaggggacc aagaaagcca attaagtgtt ggaattgtgg gaaagaggga1200cactctgcaa ggcaatgcag agccccaaga agacagggat gctggaaatg tggaaaaatg1260gaccatgtta tggccaaatg cccagacaga caggcgggtt ttttaggcct tggtccatgg1320ggaaagaagc cccgcaattt ccccatggct caagtgcatc aggggctgat gccaactgct1380cccccagagg acccagctgt ggatctgcta aagaactaca tgcagttggg caagcagcag1440agagaaaagc agagagaaag cagagagaag ccttacaagg aggtgacaga ggatttgctg1500cacctcaatt ctctctttgg aggagaccag 1530<210>93<211>67<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SIV嵌合體的GAG基因,其中Q358變?yōu)镠358<400>93Lys Asn Trp Met Thr Gln Thr Leu Leu Ile Gln Asn Ala Asn Pro Asp1 5 10 15Cys Lys Leu Val Leu Lys Gly Leu Gly Val Asn Pro Thr Leu Glu Glu20 25 30
Met Leu Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg35 40 45Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Leu Ala Pro Val Pro Ile Pro50 55 60Phe Ala Ala65<210>94<211>1353<212>DNA<213>FIV<400>94atggggaatg gacaggggcg agattggaaa atggccatta agagatgtag taatgttgct 60gtaggagtag gggggaagag taaaaaattt ggagaaggga atttcagatg ggccattaga 120atggctaatg tatctacagg acgagaacct ggtgatatac cagagacttt agatcaacta 180aggttggtta tttgcgattt acaagaaaga agagaaaaat ttggatctag caaagaaatt 240gatatggcaa ttgtgacatt aaaagtcttt gcggtagcag gacttttaaa tatgacggtg 300tctactgctg ctgcagctga aaatatgtat tctcaaatgg gattagacac taggccatct 360atgaaagaag caggtggaaa agaggaaggc cctccacagg catatcctat tcaaacagta 420aatggagtac cacaatatgt agcacttgac ccaaaaatgg tgtccatttt tatggaaaag 480gcaagagaag gactaggagg tgaggaagtt caactatggt ttactgcctt ctctgcaaat 540ttaacaccta ctgacatggc cacattaata atggccgcac cagggtgcgc tgcagataaa 600gaaatattgg atgaaagctt aaagcaactg acagcagaat atgatcgcac acatccccct 660gatgctccca gaccattacc ctattttact gcagcagaaa ttatgggtat aggattaact 720caagaacaac aagcagaagc aagatttgca ccagctagga tgcagtgtag agcatggtat 780ctcgaggcat taggaaaatt ggctgccata aaagctaagt ctcctcgagc tgtgcagtta 840agacaaggag ctaaggaaga ttattcatcc tttatagaca gattgtttgc ccaaatagat 900caagaacaaa atacagctga agttaagtta tatttaaaac agtcattgag catagctaat 960gctaatgcag actgtaaaaa ggcaatgagc caccttaagc cagaaagtac cctagaagaa1020aagttgagag cttgtcaaga aataggctca ccaggccata aagcaagagt tttggctgaa1080gcaatgagcc aagtacaagt agtgcaatca aaaggatcag gaccagtgtg ttttaattgt1140aaaaaaccag gacatctagc aagacaatgt agagaagtga aaaaatgtaa taaatgtgga1200aaacctggtc atgtagctgc caaatgttgg caaggaaata gaaagaattc gggaaactgg1260aaggcggggc gagctgcagc cccagtgaat caaatgcagc aagcagtaat gccatctgca1320
cctccaatgg aggagaaact attggattta taa1353<210>95<211>4<212>DNA<213>傘枝犁頭霉(Absidi a corymbifera)<400>95aaaa4<210>96<211>1467<212>DNA<213>EIAV<400>96atgggagacc ctttgacatg gagcaaggcg ctcaagaagt tagagaaggt gacggtacaa 60gggtctcaga aattaactac tggtaactgt aattgggcgc taagtctagt agacttattt 120catgatacca actttgtaaa agaaaaggac tggcagctga gggatgtcat tccattgctg 180gaagatgtaa ctcagacgct gtcaggacaa gaaagagagg cctttgaaag aacatggtgg 240gcaatttctg ctgtaaagat gggcctccag attaataatg tagtagatgg aaaggcatca 300ttccagctcc taagagcgaa atatgaaaag aagactgcta ataaaaagca gtctgagccc 360tctgaagaat atccaatcat gatagatggg gctggaaaca gaaattttag acctctaaca 420cctagaggat atactacttg ggtgaatacc atacagacaa atggtctatt aaatgaagct 480agtcaaaact tatttgggat attatcagta gactgtactt ctgaagaaat gaatgcattt 540ttggatgtgg tacctggcca ggcaggacaa aagcagatat tacttgatgc aattgataag 600atagcagatg attgggataa tagacatcca ttaccgaatg ctccactggt ggcaccacca 660caagggccta ttcccatgac agcaaggttt attagaggtt taggagtacc tagagaaaga 720cagatggagc ctgcttttga tcagtttagg cagacatata gacaatggat aatagaagcc 780atgtcagaag gcatcaaagt gatgattgga aaacctaaag ctcaaaatat taggcaagga 840gctaaggaac cttacccaga atttgtagac agactattat cccaaataaa aagtgaggga 900catccacaag agatttcaaa attcttgact gatacactga ctattcagaa cgcaaatgag 960gaatgtagaa atgctatgag acatttaaga ccagaggata cattagaaga gaaaatgtat1020gcttgcagag acattggaac tacaggccat aaagcaagag ttttggctga agcaatgagc1080caagtaactg gtcttgcggg cccatttaaa ggtggagcct tgaaaggagg gccactaaag1140gcagcacaaa catgttataa ctgtgggaag ccaggacatt tatctagtca atgtagagca1200cctaaagtct gttttaaatg taaacagcct ggacatttct caaagcaatg cagaagtgtt1260
ccaaaaaacg ggaagcaagg ggctcaaggg aggccccaga aacaaacttt cccgatacaa1320cagaagagtc agcacaacaa atctgttgta caagagactc ctcagactca aaatctgtac1380ccagatctga gcgaaataaa aaaggaatac aatgtcaagg agaaggatca agtagaggat1440ctcaacctgg acagtttgtg ggagtaa1467<210>97<211>4<212>PRT<213>Acanthamoeba griffini<400>97Ala Ala Ala Ala1<210>98<211>1431<212>DNA<213>BIV<400>98atgaagagaa gggagttaga aaagaagctt cgtaaggtta gggtgacacc ccaacaggat 60aaatattata ctatagggaa tcttcaatgg gccattagaa tgataaatct aatggggatc 120aaatgtgtgt gtgacgagga gtgctcggca gcagaggtag cccttatcat aacccaattt 180tcagctttag acttagaaaa ttctcctatc agaggtaagg aggaggtggc cataaaaaat 240actctgaagg ttttctggtc cctgctggcg gggtacaaac cagagagtac agaaacggcc 300ctaggatatt gggaggcctt tacatataga gaaagggagg ccagagctga taaggaaggc 360gaaattaaga gtatttaccc ttccctaaca cagaacacac agaataagaa gcagacatcg 420aatcagacaa acactcaatc attaccagct atcactactc aagatggtac tcctaggttt 480gatcctgacc tcatgaagca gcttaagatc tggtcagacg ccactgaaag aaatggggtt 540gaccttcatg cagtgaatat attaggggtc attacagcaa acctagtaca ggaagaaatt 600aaactcctct tgaatagtac acccaagtgg agattagatg tacaacttat agaatcaaaa 660gtaagagaga aagaaaatgc ccacagaacg tggaaacagc atcatccaga agccccaaaa 720acagatgaaa tcatcggtaa ggggcttagt tctgctgaac aagccaccct gatctcagta 780gaatgcagag aaactttcag acagtgggtg ctgcaggcag ctatggaggt ggcacaggca 840aaacatgcta ccccaggtcc catcaacatt catcagggac ccaaggagcc gtacacagac 900tttataaata gattagtggc agcccttgaa ggtatggcgg ctccagaaac cacaaaagaa 960tacttactcc aacatctatc tattgatcat gccaatgaag actgccagtc tattctaaga1020cctttgggac ccaacacccc aatggagaaa aaattagaag catgtagggt agtgggatct1080
cagggccata aagcaagagt tttggctgaa gcaatgagcc aagtagggat ccaatcacca1140attccagcag tcttgcctca cacaccagaa gcatatgcct cccaaacctc agggcccgag1200gatggtagga gatgttacgg atgtgggaag acaggacatt tgaagaggaa ttgtaaacag1260caaaaatgct accattgtgg caaacctggc caccaagcaa gaaactgcag gtcaaaaaac1320gggaagtgct cctctgcccc ttatgggcag aggagccaac cacagaacaa ttttcaccag1380agcaacatga gttctgtgac cccatctgca ccccctctta tattagatta g 1431<210>99<211>10<212>DNA<213>Abudefduf declivifrons<400>99aaaaaaaaaa10<210>100<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>100Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Thr Ile Met1 5 10<210>101<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>101Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Ile Met1 5 10<210>102<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>102
Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Met1 5 10<210>103<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1 NL4-3中的突變SP1區(qū)域<400>103Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile1 5 10<210>104<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶HA表位的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1<400>104Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr15 10 15Ala Thr Ile Met20<210>105<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶HA表位的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1<400>105Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr1 5 10 15Ala Ile Met<210>106<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶HA表位的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1
<400>106Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5 10 15Thr Ile Met<210>107<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶HA表位的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1<400>107Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5 10 15Ile Met<210>108<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶藍(lán)舌病病毒VP7表位的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1<400>108Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln Tyr Pro Ala Leu Thr Ile Met1 5 10 15<210>109<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶藍(lán)舌病病毒VP7表位的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1<400>109Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln Tyr Pro Ala Leu Thr Ala Thr Ile1 5 10 15Met
<210>110<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶α-微管蛋白表位的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1<400>110Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Glu Glu Phe Ala Thr Ile1 5 10 15Met<210>111<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶α-微管蛋白表位的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1<400>111Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Glu Glu Phe Glu Glu Phe Ala Thr1 5 10 15Ile Met<210>112<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶flag表位的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1<400>112Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asp Tyr LysAsp Asp Asp Asp Lys1 5 10 15Ala Thr Ile Met20<210>113<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶flag表位的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1
<400>113Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5 10 15Ile Met<210>114<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶flag表位的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1<400>114Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Asp Tyr Lys1 5 10 15Asp Asp Asp Asp Ile Met20<210>115<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶VSV-G-標(biāo)記構(gòu)建體的HIV-1 NL4-3中的CA-SP1<400>115Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg1 5 10 15Leu Gly Lys Ala Thr Ile Met20<210>116<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)<400>116Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15
<210>117<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)<400>117Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala MetSer Gln Val Thr Asn1 5 10 15<210>118<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)<400>118Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Ala Thr Ile Met20<210>119<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)<400>119Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Pro Ala Thr Ile Met20<210>120<211>45<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在丙氨酸45位突變的突變慢病毒<400>120His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro
1 5 10 15Ala Thr Ile Met Ile Gln Lys Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr20 25 30Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala35 40 45<210>121<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>121Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln Gln1 5 10 15Pro Asn Ile Met20<210>122<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>122Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln His1 5 10 15Thr Asn Ile Met20<210>123<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>123Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Gln Gln1 5 10 15
His Thr Thr Val Met20<210>124<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>124Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln His1 510 15Pro Asn Ile Met20<210>125<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>125Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln Gln1 5 10 15Ala Asn Val Met20<210>126<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>126Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Gln Gln1 5 10 15Thr Asn Ile Met20<210>127<211>20<232>PRT
<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>127Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln Asn1 5 10 15Ala Asn Ile Met20<210>128<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>128Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln Gln1 5 10 15Thr Ser Ile Met20<210>129<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>129Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Gln His1 5 10 15Thr Asn Ile Met20<210>130<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>130
Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln Asn1 5 10 15Thr Asn Ile Met20<210>131<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>131Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser His Val Gln Ser1 5 10 15Thr Asn Thr Asn Ile Met20<210>132<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>132Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Asn Ile Met20<210>133<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>133Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser His Val Gln Asn1 5 10 15Thr Asn Thr Asn Ile Met20
<210>134<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>134Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln Asn1 5 10 15Thr Asn Thr Asn Ile Met20<210>135<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>135Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Ala Thr Ile Met20<210>136<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>136Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Ser Ala Ile Met20<210>137<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>137Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Thr Asn1 5 10 15Ser Ala Thr Ile Met20<210>138<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>138Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Pro Ala Thr Ile Met20<210>139<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>139Gly His Lys Ala Arg Asp Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Ala Thr Ile Met20<210>140<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>140Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln Asn1 5 10 15
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>141Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Thr Asn1 5 10 15Ala Ala Thr Val Met20<210>142<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>142Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Ala Thr Ile Met20<210>143<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>143Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Ala Thr Thr Met20<210>144<211>21
<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>144Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Thr Gln1 5 10 15Ser Ala Thr Val Met20<210>145<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>145Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Thr Ser1 5 10 15Ser Ala Ala Val Met20<210>146<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>146Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Ser1 5 10 15Pro Ala Asn Ile Met20<210>147<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>147
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>148Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser His Met Thr Asn1 5 10 15Ser Ala Ala Thr Val Met20<210>149<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>149Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Thr Asn1 5 10 15Ser His Ala Ile Met20<210>150<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>150Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Pro Ala Thr Ile Met20
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>151Ser His Lys Ala Lys Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Pro Ala Thr Ile Met20<210>152<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>152Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Ala Ser Ile Met20<210>153<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>153Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Ala Ser Ile Met20<210>154<211>21<212>PRT<213>人工序列
<223>HIV-1的CA-SP1<400>154Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Thr Asn Ile Met20<210>155<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>155Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Thr Ser Ile Met20<210>156<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>156Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Ala Ile Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met20 25<210>157<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>157Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Thr Asn1 5 10 15
Ser Asn Ile Ile Met20<210>158<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>158Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Met Thr Asn1 5 10 15Ser Ala Thr Ile Met20<210>159<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
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<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>162Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ser Ser Ala1 5 10 15Thr Ile Met<210>163<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>163Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Pro Thr Asn1 5 10 15Ala Ala Thr Ile Met20<210>164<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1
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20<210>168<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>168Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Asn Ser1 5 10 15Ala Thr Ile Met20<210>169<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>169Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Ser Thr Thr Ile Met20<210>170<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>170Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Ile Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Pro Ala Thr Ile Met20<210>171<211>21<212>PRT<213>人工序列
<220>
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1 510 15Ser Ala Thr Ile Met20<210>175<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>HIV-1的CA-SP1
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>186Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn1 5 10 15Asn Pro Val Ile Met20<210>187<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>210Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Asn Thr1 5 10 15Thr Asn Ile Met20<210>211<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>HIV-1的CA-SP1
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>227Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Gly Gln Ala Asn Ser1 5 10 15Met Asn Ile Met20<210>228<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>234Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Asn Asn1 5 10 15Thr Asn Ile Met20<210>235<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>235Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser His Ala Asn Asn
1 5 10 15Thr Ser Ile Met20<210>236<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>236Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Asn Thr1 5 10 15Asn Ile Met<210>237<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>237Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Asn Asn1 5 10 15Ile Gln Val Met20<210>238<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>238Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser His Thr Asn Ser1 5 10 15Ile Met
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>241Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Gly Asn1 5 10 15Ala Asn Ile Met20<210>242<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>243Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Asn Asn1 5 10 15Ala Ser Val Met20<210>244<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>244Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Gly Gln Val Asn Ser1 5 10 15Thr Asn Ile Met20<210>245<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>247Ala His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Asn Asn1 5 10 15Thr Thr Ile Met20<210>248<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>HIV-1的CA-SP1<400>250Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Thr Asn Ser1 5 10 15Thr Ile Met<210>251<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>251Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Asn Ser1 5 10 15Asn Ile Leu<210>252<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>252
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<210>435<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>435Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Thr Asn1 510 15Thr Asn Ile Leu20<210>436<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>436Ala His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Thr Asn1 5 10 15Thr Ala Ile Met20<210>437<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>437Ala His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ala Gln Ala Gln Thr1 5 10 15Ala Thr Ser Val Phe20<210>438<211>22<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>438Ala His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Gln Gln1 5 10 15Pro Thr Thr Ser Val Phe20<210>439<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>439Thr His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ala Thr Ala Gln Gln1 5 10 15Asp Leu Lys Gly Gly Tyr Thr Ala Val Phe20 25<210>440<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>440Thr His Lys Ala Lys Ile Leu Ala Glu Ala Met Ala Ser Ala Gln Gln1 5 10 15Asp Leu Lys Gly Gly Tyr Thr Ala Val Phe20 25<210>441<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>441Thr His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ala Ser Ala Gln Gln1 5 10 15
Asp Leu Lys Gly Gly Tyr Thr Ser Val Phe20 25<210>442<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>442Thr His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ala Ala Ala Gln Asp1 5 10 15Leu Lys Gly Gly Tyr Thr Ala Val Phe20 25<210>443<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HIV-1的CA-SP1<400>443Thr His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Ala Ala Gln Asp1 5 10 15Leu Lys Gly Gly Tyr Ser Ala Val Phe20 2權(quán)利要求
1.治療患者HIV-1感染的方法,包括給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述方法不顯著降低所述患者的感染細(xì)胞釋放的病毒粒體量。
3.權(quán)利要求1的方法,其中所述方法對(duì)所述患者細(xì)胞釋放的病毒粒體中的RNA摻入量沒(méi)有顯著影響。
4.權(quán)利要求1的方法,其中所述化合物抑制所述患者的細(xì)胞釋放的病毒粒體的成熟。
5.權(quán)利要求1的方法,其中所述患者細(xì)胞釋放的大部分病毒粒體相對(duì)于野生型病毒粒體呈現(xiàn)改變了的表型,其中所述表型選自(a)具有相對(duì)于病毒顆粒而言非中心的球形電子致密核心的病毒粒體;(b)具有恰位于病毒膜內(nèi)的新月形電子致密層的病毒粒體;(c)具有降低的感染性或無(wú)感染性的病毒粒體;和(d)(a)至(c)任一的組合。
6.治療患者HIV-1感染的方法,包括給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物,其中所述化合物結(jié)合由具有與選自以下的序列至少約70%相同的序列的多核苷酸編碼的多肽(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
7.權(quán)利要求6的方法,其中所述多核苷酸具有選自以下的序列(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
8.治療患者HIV-1感染的方法,包括給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物,其中所述化合物可結(jié)合具有與選自以下的序列至少約70%相同的序列的多肽(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTE3TLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
9.權(quán)利要求8的方法,其中所述多肽具有選自以下的序列(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
10.治療患者HIV-1感染的方法,包括給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物,其中所述化合物可結(jié)合具有選自SEQ ID NO121至443任一序列的多肽。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法,其中所述患者的HIV-1感染包括不響應(yīng)其他HIV-1治療的HIV-1的感染。
12.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法,其中具有所述HIV-1感染的所述患者不另外響應(yīng)其他HIV-1治療。
13.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法,進(jìn)一步包括將另外的化合物給藥于所述患者,該另外的化合物是免疫調(diào)節(jié)劑、抗癌劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑或其組合。
14.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法,其中對(duì)所述患者給藥所述化合物聯(lián)合至少一種其他的抗病毒劑。
15.權(quán)利要求14的方法,其中所述的其他抗病毒劑選自齊多夫定;拉米夫定;去羥肌苷;扎西他賓;司他夫定;阿巴卡韋;奈韋拉平;地拉韋定;恩曲他賓;依法韋倫;沙喹那韋;利托那韋;茚地那韋;奈非那韋;安普那韋;替諾福韋;阿德福韋;atazanavir;福沙那韋;羥基脲;AL-721;聚肌胞;丁基化羥基甲苯;聚甘露乙酸酯;澳栗精胺;contracan;creme pharmatex;CS-87;噴昔洛韋;泛昔洛韋;阿昔洛韋;cytofovir;更昔洛韋;硫酸葡聚糖;D-青霉胺膦酰甲酸三鈉;梭鏈孢酸;HPA-23;-二氟甲基鳥(niǎo)氨酸;壬苯醇醚;戊烷脒羥乙基磺酸鹽;肽T;苯妥英;異煙肼;病毒唑;利福布??;安莎霉素;三甲曲沙;SK-818;蘇拉明;UA001;enfuvirtide;gp41-衍生的肽;CD4抗體;可溶性CD-4;含有CD4的分子;CD4-IgG2;及其組合。
16.抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的方法,包括給藥抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物。
17.抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的方法,包括給藥可結(jié)合由具有與選自以下的序列至少約70%相同的序列的多核苷酸編碼的多肽的化合物(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
18.權(quán)利要求17的方法,其中所述多核苷酸具有選自以下的序列(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
19.抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的方法,包括給藥可結(jié)合具有與選自以下的序列至少約70%相同的序列的多肽的化合物(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
20.權(quán)利要求19的方法,其中所述多肽具有選自以下的序列(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
21.抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的方法,包括給藥可結(jié)合具有選自SEQ ID NO121至443任一序列的多肽的化合物。
22.處理人血液制品的方法,包括將所述的血液制品接觸抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著影響其他Gag加工步驟的化合物。
23.權(quán)利要求22的方法,其中所述抑制不顯著降低用所述化合物處理的感染細(xì)胞釋放的病毒粒體量。
24.權(quán)利要求22的方法,其中所述抑制對(duì)引入用所述化合物處理的感染細(xì)胞釋放的病毒粒體中的RNA量沒(méi)有顯著影響。
25.權(quán)利要求22的方法,其中所述化合物抑制用所述化合物處理的感染細(xì)胞釋放的病毒粒體的成熟。
26.權(quán)利要求22的方法,其中處理的感染細(xì)胞釋放的大部分病毒粒體相對(duì)于野生型病毒粒體呈現(xiàn)改變了的表型,其中所述表型選自(a)具有相對(duì)于病毒顆粒而言非中心的球形電子致密核心的病毒粒體;(b)具有恰位于病毒膜內(nèi)的新月形電子致密層的病毒粒體;(c)具有降低的感染性或無(wú)感染性的病毒粒體;和(d)(a)至(c)任一的組合
27.處理人血液制品的方法,包括將所述的血液制品接觸抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物,其中所述化合物可結(jié)合由具有與選自以下的序列至少約70%相同的序列的多核苷酸編碼的多肽(a)SEQ ID NO1 8的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
28.權(quán)利要求27的方法,其中所述多核苷酸具有選自以下的序列(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
29.處理人血液制品的方法,包括將所述的血液制品接觸抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物,其中所述化合物可結(jié)合具有與選自以下的序列至少約70%相同的序列的多肽(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
30.權(quán)利要求29的方法,其中所述多肽具有選自以下的序列(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
31.處理人血液制品的方法,包括將所述的血液制品接觸抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)的化合物,其中所述化合物可結(jié)合具有選自SEQ ID NO121至443任一序列的多肽。
32.權(quán)利要求1至10,16至31任一項(xiàng)的方法,其中所述化合物抑制HIV蛋白酶與CA-SP1的相互作用。
33.權(quán)利要求32的方法,其中所述化合物直接抑制HIV蛋白酶與CA-SP1的相互作用。
34.權(quán)利要求32的方法,其中所述化合物間接抑制HIV蛋白酶與CA-SP1的目互作用。
35.權(quán)利要求1至10,16至31任一項(xiàng)的方法,其中所述化合物結(jié)合病毒Gag蛋白,使得HIV蛋白酶與CA-SP1的相互作用受到抑制。
36.權(quán)利要求1至10,16至31任一項(xiàng)的方法,其中所述化合物在病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)裂解成p24(CA)的切割位點(diǎn)處或附近結(jié)合。
37.權(quán)利要求1至10,16至31任一項(xiàng)的方法,其中所述化合物是二甲基琥珀酰樺木酸的衍生物或二甲基琥珀酰白樺脂醇的衍生物。
38.權(quán)利要求37的方法,其中所述化合物選自3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸;3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)白樺脂醇;3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)白樺脂醇;3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)二氫樺木酸;3-O-(3’,3’-二甲基戊二酰)樺木酸;(3’,3’-二甲基戊二酰)二氫樺木酸;3-O-二乙醇酰-樺木酸;3-O-二乙醇酰-二氫樺木酸;及其組合。
39.權(quán)利要求1至10,16至31任一項(xiàng)的方法,其中所述化合物不是通式I至III的白樺脂醇或二氫白樺脂醇的衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽 其中,R是C2-C20取代或未取代的羧基?;?,R’是氫,C2-C20取代或未取代的烷基,或芳基;R1是C2-C20取代或未取代的羧基?;?,R2是氫,C(C6H5)3,或C2-C20取代或未取代的羧基?;?;和R3是氫,鹵素,氨基,可選取代的單-或雙-烷基氨基,或-OR4,其中R4是氫,C1-4烷?;?,苯甲酰基,或C2-C20取代或未取代的羧基酰基;其中虛線表示C20與C29之間可選的雙鍵。
40.突變慢病毒,包括編碼Gag的核酸序列中的突變,其使得所述突變慢病毒的復(fù)制對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)的敏感性較低。
41.權(quán)利要求40的突變慢病毒,其中所述病毒的Gag多肽不結(jié)合3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸。
42.權(quán)利要求40的突變慢病毒,其中所述突變進(jìn)一步使得所述突變慢病毒對(duì)DSB抑制p25(CA-SP1)加工成p24(CA)的敏感性較低。
43.權(quán)利要求40的突變慢病毒,包括編碼Gag p25蛋白(CA-SP1)的核苷酸序列中的突變。
44.權(quán)利要求43的突變慢病毒,其編碼Gag多肽,其中從CA-SP1區(qū)域的氨基酸序列中刪除或置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
45.權(quán)利要求40的突變慢病毒,其中所述突變發(fā)生于編碼與選自以下的序列至少約70%相同的氨基酸序列的核苷酸序列中(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
46.權(quán)利要求40的突變慢病毒,其中所述突變發(fā)生于編碼選自以下的氨基酸序列的核苷酸序列中(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
47.權(quán)利要求40的突變慢病毒,其中所述突變發(fā)生于與選自以下的序列至少約70%相同的核苷酸序列中(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
48.權(quán)利要求40的突變慢病毒,其中所述突變發(fā)生于選自以下的核苷酸序列中(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
49.權(quán)利要求40的突變慢病毒,其中CA-SP1中的所述突變發(fā)生于編碼選自以下的氨基酸的密碼子中(a)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸1(甘氨酸);(b)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸2(組氨酸);(c)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸6(纈氨酸或異亮氨酸);(d)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸7(亮氨酸);(e)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸8(丙氨酸);(f)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸10(丙氨酸);(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸11(甲硫氨酸);(h)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸12(絲氨酸);(i)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸13(谷氨酰胺);(j)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸14(纈氨酸);(k)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸15(蘇氨酸);(l)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的氨基酸16(天冬酰胺);和(m)HKARILAEAMSQVTNPATIMIQKGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIA(SEQ IDNO120)中的氨基酸45(丙氨酸)。
50.權(quán)利要求40的突變慢病毒,其中CA-SP1序列中的所述突變導(dǎo)致選自以下的所編碼的氨基酸的改變(a)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中的甘氨酸;(b)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸2處組氨酸至谷氨酰胺;(c)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸2處組氨酸至酪氨酸;(d)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸6處纈氨酸或異亮氨酸至亮氨酸;(e)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸7處亮氨酸至甲硫氨酸;(f)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸8處丙氨酸至纈氨酸;(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸10處丙氨酸至纈氨酸;(h)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸11處甲硫氨酸至亮氨酸;(i)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸12處絲氨酸至賴氨酸;(j)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸13處谷氨酰胺至谷氨酸;(k)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸14處纈氨酸至丙氨酸;(l)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸15處蘇氨酸至亮氨酸;(m)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116)或GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117)中氨基酸16處天冬酰胺至丙氨酸;(n)HKARILAEAMSQVTNPATIMIQKGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIA(SEQ IDNO525)中氨基酸45處丙氨酸至蘇氨酸。
51.權(quán)利要求40的突變慢病毒,其中所述突變發(fā)生于編碼選自SEQID NO121至443任一氨基酸序列的多核苷酸中。
52.權(quán)利要求40至51任一項(xiàng)的突變慢病毒,其是突變的HIV-1。
53.重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其復(fù)制受到3-0-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)的抑制。
54.權(quán)利要求53的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其中DSB抑制病毒Gag p25蛋白(CA-SP1)加工成p24(CA)但不顯著抑制其它Gag加工步驟。
55.權(quán)利要求53的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其中所述病毒的Gag多肽結(jié)合3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸。
56.權(quán)利要求53的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其含有p25(CA-SP1)蛋白,該蛋白包括與以下的序列至少約70%相同的氨基酸序列(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
57.權(quán)利要求56的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其含有p25(CA-SP1)蛋白,該蛋白包括選自以下的氨基酸序列(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
58.權(quán)利要求5 3的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其包括編碼CA-SP1的多核苷酸,后者與選自以下的序列至少約70%相同(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-143 5;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
59.權(quán)利要求53的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其包括編碼CA-SP1的多核苷酸,后者具有選自以下的序列(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
60.權(quán)利要求53的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其含有p25(CA-SP1)蛋白,該蛋白包括選自SEQ ID NO121至443任一的氨基酸序列。
61.權(quán)利要求53的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其具有與選自以下的序列至少約70%相同的核苷酸序列(a)SEQ ID NO90;(b)SEQ ID NO92;(c)SEQ ID NO94;(d)SEQ ID NO96;和(e)SEQ ID NO98。
62.權(quán)利要求53的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其具有選自以下的核苷酸序列(a)SEQ ID NO90;(b)SEQ ID NO92;(c)SEQ ID NO94;(d)SEQ ID NO96;和(e)SEQ ID NO98。
63.權(quán)利要求53的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其是由選自以下的病毒衍生的HIV-2,HTLV-I,HTLV-II,SIV,禽類(lèi)白血病病毒(ALV),內(nèi)源性禽類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒(EAV),小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV),貓免疫缺陷病毒(FIV),牛免疫缺陷病毒(BIV),山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV),Visna-maedi病毒和貓白血病病毒(FeLV)。
64.權(quán)利要求63的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒,其是由選自以下的病毒衍生的(a)SIV;(b)FIV;(c)EAIV;(d)BIV;(e)CAEV;和(f)Visna-maedi病毒。
65.慢病毒感染的動(dòng)物模型,包括用權(quán)利要求53的重組非HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的合適的非人動(dòng)物宿主。
66.權(quán)利要求65的動(dòng)物模型,其中所述非人動(dòng)物宿主選自(a)貓;(b)猴子;(c)猿;(d)馬;(e)綿羊;(f)山羊;(g)奶牛;(h)小鼠;(i)大鼠;和(j)鳥(niǎo)。
67.制備對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)抑制敏感的重組非HIV-1慢病毒的方法,包括用編碼DSB敏感性HIV-1病毒的CA-SP1的序列替換編碼對(duì)DSB不敏感的非HIV-1慢病毒的CA-SP1的多核苷酸序列。
68.權(quán)利要求67的方法,其中所述重組非HIV-1慢病毒中編碼CA-SP1的多核苷酸序列包括與選自以下的序列至少約70%相同的序列(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
69.權(quán)利要求68的方法,其中所述重組非HIV-1慢病毒中編碼CA-SP1的多核苷酸序列包括選自以下的序(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
70.權(quán)利要求67的方法,其中所述重組DSB-敏感性非HIV-1慢病毒的CA-SP1蛋白包括與選自以下的序列至少約70%相同的氨基酸序列(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
71.權(quán)利要求67的方法,其中所述DSB-敏感性重組非HIV-1慢病毒的CA-SP1蛋白包括選自以下的氨基酸序列(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
72.權(quán)利要求67的方法,其中所述重組DSB-敏感性非HIV-1慢病毒的CA-SP1蛋白具有選自SEQ ID NO121至443任一的氨基酸序列。
73.權(quán)利要求67的方法,包括(a)從所述慢病毒基因組中刪除對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO18的核苷酸1370-1413的核苷酸;和(b)將SEQ ID NO18的核苷酸1370-1413或SEQ ID NO19的核苷酸1857-1899插入所述非HIV-1慢病毒的所述區(qū)域中。
74.通過(guò)權(quán)利要求67至73任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的重組非HIV-1慢病毒。
75.在Gag的CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近選擇性結(jié)合的抗體。
76.權(quán)利要求75的抗體,其結(jié)合與選自以下的序列至少約70%相同的氨基酸序列(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
77.權(quán)利要求75的抗體,其結(jié)合選自以下的氨基酸序列(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
78.權(quán)利要求75的抗體,其結(jié)合選自SEQ ID NO121至443任一的氨基酸序列。
79.權(quán)利要求75的抗體,其選擇性地結(jié)合含有HIV CA-SP1多肽突變的多肽,該突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25(CA-SP1)加工成p24(CA)的抑制降低。
80.權(quán)利要求79的抗體,其中所述突變位于或接近CA-SP1切割位點(diǎn)或在CA-SP1的SP1結(jié)構(gòu)域中。
81.權(quán)利要求79的抗體,其中所述多肽選自(a)GHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO2);(b)SHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO3);(c)SQKARILAEAMSQVTN;(d)GQKARVLAEAMSQVTN;(e)SYKARILAEAMSQVTN;(f)GYKARVLAEAMSQVTN;(g)SHKARLLAEAMSQVTN;(h)GHKARLLAEAMSQVTN;(i)SHKARIMAEAMSQVTN;(j)GHKARVMAEAMSQVTN;(k)SHKARILAEVMSQVTN;(l)GHKARVLAEVMSQVTN;(m)SHKARILVEAMSQVTN;(n)GHKARVLVEAMSQVTN;(o)SHKARILAEALSQVTN;(p)GHKARVLAEALSQVTN;(q)SHKARILAEAMLQVTN;(r)GHKARVLAEAMLQVTN;(s)SHKARILAEAMSEVTN;(t)GHKARVLAEAMSEVTN;(u)SHKARILAEAMSQATN;(v)GHKARVLAEAMSQATN;(w)SHKARILAEAMSQVLN;(x)GHKARVLAEAMSQVLN;(y)SHKARILAEAMSQVTA;(z)GHKARVLAEAMSQVTA;和(aa)HKARILAEAMSQVTNPATIMIQKGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIT。
82.權(quán)利要求79的抗體,其選擇性地結(jié)合選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的氨基酸序列。
83.權(quán)利要求75的抗體,其選自(a)選擇性結(jié)合SP1但不結(jié)合CA-SP1的抗體;(b)選擇性結(jié)合CA-SP1但不結(jié)合CA的抗體;和(c)選擇性結(jié)合CA但不結(jié)合CA-SP1的抗體。
84.權(quán)利要求75的抗體,其抑制3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸與Gag的結(jié)合。
85.分離的CA-SP1多肽,其與選自以下的序列至少約70%相同(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
86.權(quán)利要求85的分離的CA-SP1多肽,其與選自以下的序列相同(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTIKALGPAAEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVINPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
87.分離的CA-SP1多肽,其由與選自以下的序列至少約70%相同的多核苷酸序列編碼(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
88.權(quán)利要求87的分離的CA-SP1多肽,其由選自以下的多核苷酸序列編碼(a)SEQ ID NO18的約核苷酸1243-1435;(b)SEQ ID NO19的約核苷酸1729-1920;(c)SEQ ID NO18的約核苷酸1344-1435;(d)SEQ ID NO19的約核苷酸1828-1920;(e)SEQ ID NO18的約核苷酸1370-1413;(f)SEQ ID NO19的約核苷酸1857-1899;(g)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1419;(h)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1905;(i)SEQ ID NO18的約核苷酸1372-1434;和(j)SEQ ID NO19的約核苷酸1858-1920。
89.來(lái)自HIV-1的CA-SP1區(qū)域的分離的多肽,其由選自SEQ ID NO121至443任一的氨基酸序列組成。
90.來(lái)自HIV CA-SP1多肽的分離的多肽,其含有導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工的抑制降低的突變。
91.權(quán)利要求90的分離的多肽,其中所述突變位于CA-SP1切割位點(diǎn)中或SP1結(jié)構(gòu)域中。
92.權(quán)利要求90的分離的多肽,其由選自SEQ ID NO4,SEQ IDNO6,SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的多核苷酸編碼。
93.權(quán)利要求90的分離的多肽,其含有導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25加工的抑制降低的突變;其中所述突變發(fā)生于編碼選自以下的多肽的核酸序列中(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
94.權(quán)利要求90的分離的多肽,其選自(a)GHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO2);(b)SHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO3);(c)SQKARILAEAMSQVTN;(d)GQKARVLAEAMSQVTN;(e)SYKARILAEAMSQVTN;(f)GYKARVLAEAMSQVTN;(g)SHKARLLAEAMSQVTN;(h)GHKARLLAEAMSQVTN;(i)SHKARIMAEAMSQVTN;(j)GHKARVMAEAMSQVTN;(k)SHKARILAEVMSQVTN;(l)GHKARVLAEVMSQVTN;(m)SHKARILVEAMSQVTN;(n)GHKARVLVEAMSQVTN;(o)SHKARILAEALSQVTN;(p)GHKARVLAEALSQVTN;(q)SHKARILAEAMLQVTN;(r)GHKARVLAEAMLQVTN;(s)SHKARILAEAMSEVTN;(t)GHKARVLAEAMSEVTN;(u)SHKARILAEAMSQATN;(v)GHKARVLAEAMSQATN;(w)SHKARILAEAMSQVLN;(x)GHKARVLAEAMSQVLN;(y)SHKARILAEAMSQVTA;(z)GHKARVLAEAMSQVTA;和(aa)HKARILAEAMSQVTNPATIMIQKGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHTT。
95.權(quán)利要求90的分離的多肽,其由分離的多核苷酸編碼,該分離的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自SEQ ID NO5,SEQ ID NO7和10的多核苷酸雜交。
96.權(quán)利要求90的分離的多肽,其是嵌合或融合蛋白的一部分。
97.分離的多核苷酸,其編碼含有HIV Gag p25蛋白(CA SP1)突變的氨基酸序列,所述突變導(dǎo)致3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸對(duì)p25(CA-SP1)加工成p24(CA)的抑制降低。
98.權(quán)利要求97的分離的多核苷酸,其中所述對(duì)p25加工抑制的降低是由于對(duì)HIV-1蛋白酶與Gag相互作用抑制的降低。
99權(quán)利要求97的分離的多核苷酸,其中所述對(duì)p25加工抑制的降低是由于3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸與Gag結(jié)合的降低。
100.權(quán)利要求97的分離的多核苷酸,其中所述對(duì)p25加工抑制的降低是由于DSB在Gag的CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近的結(jié)合降低。
101.權(quán)利要求97的分離的多核苷酸,其中所述突變位于或接近CA-SP1切割位點(diǎn)或在CA-SP1的SP1結(jié)構(gòu)域中。
102.權(quán)利要求97的分離的多核苷酸,其中所述突變位于或接近編碼選自以下的氨基酸序列的多核苷酸(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
103.權(quán)利要求97的分離的多核苷酸,選自SEQ ID NO4,SEQ IDNO6,SEQ ID NO8和SEQ ID NO9。
104.權(quán)利要求97的分離的多核苷酸,與選自SEQ ID NO4和SEQID NO6的多核苷酸具有至少約95%的同一性。
105.權(quán)利要求97的分離的多核苷酸,與選自SEQ ID NO;8和SEQID NO9的多核苷酸具有至少約80%的同一性。
106.權(quán)利要求97的分離的多核苷酸,與選自SEQ ID NO5和SEQID NO7的多核苷酸具有至少約95%的同一性。
107.權(quán)利要求97的分離的多核苷酸,與SEQ ID NO10的多核苷酸具有至少約80%的同一性。
108.含有權(quán)利要求97的分離的多核苷酸的載體。
109.含有權(quán)利要求108的載體的宿主細(xì)胞。
110.生產(chǎn)多肽的方法,包括在培養(yǎng)基中培育權(quán)利要求109的宿主細(xì)胞并從所述培養(yǎng)基中回收該多肽。
111.鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的化合物的方法,包括(a)將含有CA-SP1切割位點(diǎn)的多肽接觸測(cè)試化合物;(b)加入在CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近選擇性結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記物質(zhì);和(c)測(cè)量所述經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)與所述多肽的結(jié)合。
112.權(quán)利要求111的方法,其中所述化合物在CA-SP1切割位點(diǎn)處或附近結(jié)合。
113.權(quán)利要求111的方法,其中所述化合物抑制HIV-1蛋白酶與CA-SP1切割位點(diǎn)的相互作用。
114.權(quán)利要求111的方法,其中含有CA-SP1切割位點(diǎn)的所述多肽是多肽片段或重組肽。
115.權(quán)利要求111的方法,其中所述經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)是經(jīng)標(biāo)記的CA-SP1特異性抗體;和其中所述測(cè)量包括測(cè)量與對(duì)照相比較在所述測(cè)試化合物存在下結(jié)合蛋白的標(biāo)記抗體量的改變。
116.權(quán)利要求111的方法,其中經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)是3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸,且其中該方法包括測(cè)量與對(duì)照相比較在測(cè)試化合物存在下結(jié)合蛋白的標(biāo)記3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸量的改變。
117.權(quán)利要求111的方法,其中所述經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)上的標(biāo)記是酶,熒光物質(zhì),化學(xué)發(fā)光物質(zhì),辣根過(guò)氧化物酶,堿性磷酸酶,生物素,抗生物素蛋白,電子致密物質(zhì),放射性同位素,或其組合。
118.鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的測(cè)試化合物的方法,包括(a)在測(cè)試化合物存在下將含有CA-SP1切割位點(diǎn)的多肽接觸蛋白酶;和(b)檢測(cè)蛋白酶與所述多肽的相互作用。
119.權(quán)利要求118的方法,其中所述蛋白酶基本上由HIV-1蛋白酶組成。
120.權(quán)利要求118的方法,其中用兩個(gè)熒光部分來(lái)標(biāo)記所述的多肽,這兩個(gè)熒光部分各自結(jié)合CA-SP1切割位點(diǎn)的相對(duì)側(cè),且其中所述檢測(cè)包括測(cè)量在測(cè)試化合物存在下熒光能量從一個(gè)部分至另一個(gè)部分的轉(zhuǎn)移。
121.權(quán)利要求118的方法,其中通過(guò)測(cè)量SP1,p24(CA)或CA-SP1(p25)中至少一個(gè)的抗體的結(jié)合來(lái)檢測(cè)測(cè)試化合物對(duì)所述多肽的裂解的作用。
122.權(quán)利要求121的方法,其中所述標(biāo)記的抗體是用選自酶,熒光物質(zhì),化學(xué)發(fā)光物質(zhì),辣根過(guò)氧化物酶,堿性磷酸酶,生物素,抗生物素蛋白,電子致密物質(zhì),放射性同位素及其組合的分子來(lái)標(biāo)記的。
123.權(quán)利要求118的方法,包括(a)在所述測(cè)試化合物的存在下將含有HIV-1野生型CA-SP1切割位點(diǎn)的第一個(gè)多肽接觸HIV-1蛋白酶;(b)在所述測(cè)試化合物的存在下將含有突變CA-SP1切割位點(diǎn)或另一可供選擇的蛋白酶切割位點(diǎn)的第二個(gè)多肽接觸HIV-1蛋白酶;其中所述突變切割位點(diǎn)或可供選擇的蛋白酶切割位點(diǎn)的裂解實(shí)質(zhì)上不受3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸的抑制;(c)檢測(cè)HIV-1蛋白酶與所述的第一個(gè)和第二個(gè)肽的相互作用;和(d)將所述第一個(gè)多肽的裂解與所述第二個(gè)多肽的裂解相比較。
124.權(quán)利要求123的方法,其中野生型CA-SP1,突變CA-SP1,或可供選擇的蛋白酶切割位點(diǎn)區(qū)域包含于多肽片段或重組肽內(nèi)。
125.權(quán)利要求123的方法,其中用各自結(jié)合CA-SP1切割位點(diǎn)相對(duì)側(cè)的熒光部分和熒光淬滅部分來(lái)標(biāo)記所述多肽,且其中所述的檢測(cè)包括測(cè)量來(lái)自熒光部分的信號(hào)。
126.權(quán)利要求123的方法,其中所述第一個(gè)或所述第二個(gè)多肽中的至少一個(gè)進(jìn)一步包括表位標(biāo)記。
127.權(quán)利要求123的方法,其中(a)和(b)在細(xì)胞中進(jìn)行。
128.權(quán)利要求123的方法,其中對(duì)所述化合物與所述第一個(gè)和第二個(gè)多肽相互作用的所述檢測(cè)包括凝膠電泳。
129.鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的化合物的方法,包括(a)將測(cè)試化合物接觸感染第一種病毒的細(xì)胞,該病毒的復(fù)制對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)的抑制是敏感的;(b)將測(cè)試化合物接觸感染對(duì)DSB敏感性顯著降低的第二種病毒的細(xì)胞;(c)測(cè)定經(jīng)處理的感染第一種病毒和第二種病毒的細(xì)胞的表型;和(d)選擇與第二種病毒相比較對(duì)抗第一種病毒更有活性的測(cè)試化合物。
130.權(quán)利要求129的方法,其中所述表型選自(a)病毒復(fù)制(b)CA-SP1的裂解;和(c)改變的病毒粒體表型的產(chǎn)生。
131.鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的化合物的方法,包括(a)將測(cè)試化合物應(yīng)用至感染慢病毒的細(xì)胞,該病毒的復(fù)制對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)的抑制是敏感的;和(b)分析所述感染細(xì)胞產(chǎn)生的裂解物來(lái)確定是否發(fā)生了CA-SP1蛋白的裂解。
132.權(quán)利要求131的方法,其中通過(guò)裂解以下至少一種來(lái)獲得所述裂解物(a)所述感染的細(xì)胞;或(b)釋放的病毒顆粒。
133.權(quán)利要求131的方法,其中確定CA-SP1蛋白裂解是否已經(jīng)發(fā)生的所述分析包括測(cè)量p25的存在與否。
134.權(quán)利要求131的方法,其中確定CA-SP1蛋白裂解是否已經(jīng)發(fā)生的所述分析包括進(jìn)行病毒蛋白的蛋白質(zhì)印跡和使用p2 5的抗體來(lái)檢測(cè)p25。
135.權(quán)利要求131的方法,其中確定CA-SP1蛋白裂解是否已經(jīng)發(fā)生的所述分析包括進(jìn)行病毒蛋白的凝膠電泳和代謝標(biāo)記蛋白的顯像。
136.權(quán)利要求131的方法,其中確定CA-SP1蛋白裂解是否已經(jīng)發(fā)生的所述分析包括進(jìn)行免疫測(cè)定。
137.權(quán)利要求133的方法,其中所述免疫測(cè)定包括(a)使用選擇性結(jié)合p24的抗體在基質(zhì)上捕獲p25和p24;(b)用選擇性結(jié)合p25的抗體檢測(cè)基質(zhì)上p25的存在與否。
138.權(quán)利要求131的方法,其中將表位標(biāo)記序列插入SP1中,且其中所述分析包括使用表位標(biāo)記的抗體來(lái)選擇性檢測(cè)p25。
139.鑒定抑制動(dòng)物細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的化合物的方法,包括將測(cè)試化合物應(yīng)用至感染慢病毒的細(xì)胞,該病毒的復(fù)制對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)的抑制是敏感的,且此后就改變的病毒粒體表型來(lái)分析細(xì)胞釋放的病毒顆粒。
140.權(quán)利要求139的方法,其中所述分析包括透射電子顯微鏡檢。
141.權(quán)利要求139的方法,其中所述改變的表型選自(a)具有相對(duì)于病毒顆粒而言非中心的球形電子致密核心的病毒粒體;(b)具有恰位于病毒膜內(nèi)的新月形電子致密層的病毒粒體;(c)具有降低的感染性或無(wú)感染性的病毒粒體;和(d)(a)至(c)任一的組合。
142.權(quán)利要求129,131或139任一項(xiàng)的方法,其中其復(fù)制對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)的抑制敏感的所述慢病毒是HIV-1。
143.權(quán)利要求129,131或139任一項(xiàng)的方法,其中其復(fù)制對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)的抑制敏感的所述慢病毒是重組非HIV-1慢病毒,其包括編碼HIV-1 CA-SP1的核苷酸,且其中所述慢病毒源自選自以下的慢病毒(a)SIV;(b)FIV;(c)EAIV;(d)BIV;(e)CAEV;(f)Visna-Maedi病毒;和(g)HIV-2。
144.權(quán)利要求131的方法,其中具有顯著降低的對(duì)DSB的敏感性的所述病毒選自(a)SIV;(b)FIV;(c)EAIV;(d)BIV;(e)CAEV;(f)Visna-Maedi病毒;(g)HIV-2;和(h)突變HIV-1。
145.鑒定化合物的方法,包括(a)測(cè)量經(jīng)處理的感染慢病毒的動(dòng)物的疾病進(jìn)展,其中所述慢病毒對(duì)3-O-(3,,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)是敏感的;(b)測(cè)量未處理的感染所述慢病毒的動(dòng)物的疾病進(jìn)展,(c)比較所述經(jīng)處理動(dòng)物和所述未處理動(dòng)物的反應(yīng)。
146.鑒定化合物的方法,包括(a)將所述化合物給藥于感染第一種慢病毒的動(dòng)物,其中所述第一種慢病毒的復(fù)制受3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)的抑制;(b)將所述化合物給藥于感染第二種慢病毒的動(dòng)物,其中所述第二種慢病毒的復(fù)制實(shí)質(zhì)上不受3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)的抑制;(c)測(cè)量和比較感染所述第一種慢病毒的動(dòng)物的疾病進(jìn)程,與感染所述第二種慢病毒的動(dòng)物相比較。
147.鑒定化合物的方法,包括測(cè)量所述化合物與選自以下的氨基酸序列的相互作用(a)KNWMTETFLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO21);(b)KNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO22);(c)TACQGVGGPSHKARILAEAMSQVTNSATIM;(SEQ IDNO23);(d)TACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ IDNO24);(e)SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO25);(f)GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO26)(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO116);(h)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO117);(i)SHKARILAEAMSQVTNSATIM(SEQ ID NO118);和(j)GHKARVLAEAMSQVTNPATIM(SEQ ID NO119)。
148.確定患者是否感染了對(duì)用抑制p25加工的化合物治療敏感的HIV-1的方法,包括(a)從所述患者獲得標(biāo)本;(b)從該標(biāo)本獲得編碼CA-SP1的病毒核酸;(c)對(duì)所述病毒核酸進(jìn)行基因分型;(d)確定該核酸是否編碼其加工對(duì)3-O-(3’,3’-二甲基琥珀酰)樺木酸(DSB)的抑制敏感的CA-SP1變體。
149.在有此需要的患者中治療疾病的方法,包括(a)鑒定抑制病毒Gag p25(CA-SP1)加工成p24(CA)但對(duì)其他Gag加工步驟沒(méi)有顯著影響的化合物;(b)獲得銷(xiāo)售和使用所述化合物的法規(guī)許可;包裝該化合物用于銷(xiāo)售并治療有此需要的患者的疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)破壞病毒Gag衣殼(CA)蛋白(p24)從CA-間隔肽1(SP1)蛋白前體(p25)的加工來(lái)抑制HIV-1的復(fù)制。還包括了含有Gag p25蛋白突變的氨基酸序列,該突變導(dǎo)致二甲基琥珀酰樺木酸或二甲基琥珀酰白樺脂醇對(duì)p25加工成p24的抑制降低;編碼該突變序列的多核苷酸和選擇性結(jié)合該突變序列的抗體。包括了抑制方法,抑制性化合物和發(fā)現(xiàn)靶向HIV Gag蛋白的蛋白酶解加工的抑制性化合物的方法。一實(shí)施方案中,這樣的化合物通過(guò)結(jié)合Gag而不是蛋白酶來(lái)抑制HIV蛋白酶與Gag的相互作用。另一實(shí)施方案中,在Gag蛋白酶解切割位點(diǎn)區(qū)域中含有突變的病毒或重組蛋白可以用于篩選測(cè)試中來(lái)鑒定靶向蛋白酶解加工的化合物。
文檔編號(hào)A61K49/00GK101022834SQ200580024103
公開(kāi)日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2005年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月24日
發(fā)明者K·扎爾茨韋德?tīng)? 李鋒, C·T·韋爾德, G·P·阿拉維, E·O·弗里德 申請(qǐng)人:帕納克斯醫(yī)藥公司, (由衛(wèi)生與公眾服務(wù)部部長(zhǎng)代表的)美利堅(jiān)合眾國(guó)政府
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