煙草（以各種形式，例如，未收獲的或收獲的形式）與一種或多種酶接觸。注意， 雖然本文提供的討論大部分著重于煙草的處理，但各種其他植物（包括水果、蔬菜、花朵及 其組分）可根據(jù)本文提供的方法處理，以提供其中某些化合物水平改變的植物、植物組分 以及由其生產(chǎn)的材料和產(chǎn)品。
[0061] 植物或植物組分可在植物生命周期的各個(gè)階段用一種或多種酶處理。例如，該方 法可包括用一種或多種酶處理未收獲的或收獲的植物或植物組分。術(shù)語(yǔ)"植物"和"植物 組分"涉及植物生命周期任何階段的植物（例如，產(chǎn)生日用品的植物）。植物或植物組分可 以是例如種子、秧苗、未成熟活植物、成熟活植物、收獲的植物、或上面任一種的一部分（例 如，活植物的一部分例如僅僅?；騼H僅葉，或者種子表面的一部分）的形式。由植物產(chǎn)生的 日用品可包括植物的任何部分（例如，葉、可食用部分、果實(shí)、花、種子、?；蛘麄€(gè)植物），并 且因此由于根據(jù)本文提供的酶處理，植物的各個(gè)部分可顯示改變的某些化合物水平。
[0062] 具體地，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法具體涉及酶處理煙草植物或其部分。"煙 草"、"煙草植物"或"煙草植物組分"指在煙草植物生命周期的各個(gè)階段的煙草。例如，應(yīng)用 酶的煙草植物組分可以是煙草種子、煙草苗、未收獲的煙草植物（處于不同的成熟階段）、 收獲的植物、或上面任一種的一部分，其都被認(rèn)為是煙草植物的階段，如本文進(jìn)一步詳細(xì)描 述的。根據(jù)本發(fā)明，收獲的煙草植物可以以下述形式用一種或多種酶處理，例如，未熟化 (原始）材料、熟化/干燥（例如風(fēng)干或烤干）材料、老化材料、完整材料、切斷料、切碎料、 或磨碎材料、提取材料、或煙草提取物。在某些實(shí)施方式中，煙草在干燥之前處理（即收獲 之前或剛好在收獲之后）。在一些實(shí)施方式中，煙草以被認(rèn)為是"活著"的形式被處理。在 某些實(shí)施方式中，煙草在田間處理，這表示酶或其混合物被應(yīng)用至未收獲形式的煙草植物 的至少一部分。在一些實(shí)施方式中，一種或多種酶應(yīng)用的未收獲的煙草植物可以被進(jìn)一步 描述為在田間生長(zhǎng)、在地里具有其根以及繼續(xù)進(jìn)行活生物體的正常生物活動(dòng)。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明，可使用各種酶和其混合物。如本文使用的"酶"指不同大小和結(jié)構(gòu)的 任何球狀蛋白質(zhì)。通常，根據(jù)本發(fā)明可用的酶以一些方式起作用，以催化植物材料內(nèi)的一種 或多種化學(xué)反應(yīng)（例如通過(guò)提高其速率）。任何類型的酶或酶類型的組合可根據(jù)本發(fā)明應(yīng) 用；例如，水解酶（其催化化學(xué)鍵的水解）、異構(gòu)酶（其催化分子內(nèi)的異構(gòu)化）、連接酶（其 功能是連接兩個(gè)或更多個(gè)分子）、裂合酶（其通過(guò)非水解和氧化的機(jī)理裂解化學(xué)鍵）、氧化 還原酶（其催化氧化/還原反應(yīng)）和轉(zhuǎn)移酶（其轉(zhuǎn)移各個(gè)部分，例如官能團(tuán)）。酶的來(lái)源可 以不同，并且酶可以例如從微生物來(lái)源（例如，細(xì)菌來(lái)源或真菌來(lái)源）、植物來(lái)源、動(dòng)物來(lái)源 獲得，和/或可以合成產(chǎn)生。
[0064] 優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明使用的酶是"GRAS"（通常認(rèn)為安全的），盡管非GRAS酶可 在某些實(shí)施方式中使用。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，酶是能夠減少植物或植物組分內(nèi)毒物 或能夠減少毒物前體的酶，所述毒物是在一般加工（例如熱處理）或使用植物或其組分的 過(guò)程中產(chǎn)生的。
[0065] 用酶對(duì)活植物和/或田地的一般處理用于例如幫助減小植物中壓力（例如 AgPro? Foliaraplex)、刺激植物生長(zhǎng)和維持植物健康（例如Bio-Stimulants, Verde BioScience)、控制害蟲（即用作殺蟲劑）（例如weetMint?, Safe Solutions?，公開在 Tvedten的美國(guó)專利7,393,528中，通過(guò)引用將其并入本文）以及增強(qiáng)土壤中肥料和礦物 質(zhì)的消化和輸送至植物根部（Agzyme, International Enzymes)。處理煙草材料，特別是用 某些類型的酶處理，是已知的，并且公開在例如美國(guó)專利Kiefer的3, 132,651 ;Bavley的 3, 240, 214 Jeng 的 4, 307, 733 ;Gaisch 等人的 4, 407, 307 ;Poulose 的 4, 716, 911 ;Clapp 等人的 4, 941，484 ;De GrandPr6 等人的 5, 601，097 Jeague 的 5, 343, 879 ;和 Kierulff 等 人的6, 298, 859 ;美國(guó)專利申請(qǐng)公開Harris等人的2011/0155152和Coleman, III等人的 2011/0174323 ;國(guó)際申請(qǐng)公開 Kierulff 的 WO 2000/02464 ;Kierulff 的歐洲申請(qǐng) 1094724 ; 以及Liu等人Food and Chem.Toxic. (2011)，doi:10.1016中，通過(guò)引用將其并入本文。
[0066] 根據(jù)本發(fā)明，在一些實(shí)施方式中，應(yīng)用至煙草植物或植物組分的一種或多種酶包 括淀粉酶（其催化淀粉分解為糖）或蛋白酶（其催化蛋白質(zhì)肽鍵的水解）或其組合。淀粉 酶可包括α -淀粉酶、β -淀粉酶、γ -淀粉酶、或其組合。蛋白酶可包括絲氨酸蛋白酶、蘇氨 酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和谷氨酸蛋白酶，并且某些示例 性蛋白酶包括但不限于地衣芽孢桿菌蛋白酶、芽孢桿菌屬某種蛋白酶、米曲霉蛋白酶、解淀 粉芽胞桿菌蛋白酶、芽孢桿菌屬蛋白酶和灰色鏈霉菌蛋白酶，其可包括商業(yè)上可得到的酶 產(chǎn)品 AlcalaseTM、EsperaseTM、EverlaseTM、Flavourzyme TM、NeutraseTM、ProtamexTM、Savinase? 和Substilisin A?，來(lái)自Novozymes A/S。在某些實(shí)施方式中，一種或多種酶包括天冬酰胺 酶（例如，PreventASe?，DSM Food Specialties, Heerlen, NL和 Acrylaway?，Novozymes, A/ S，BagSvaerd，DK)。在某些實(shí)施方式中，一種或多種酶包括多酚氧化酶（ΡΡ0)。在一些實(shí)施 方式中，一種或多種酶包括氧化酶，例如單酚氧化酶（絡(luò)氨酸酶）或鄰二酚氧氧化還原酶 (兒茶酚氧化酶）。根據(jù)本發(fā)明使用的另一示例性氧化酶是漆酶。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明，除了一種或多種酶或者代替一種或多種酶，植物或植物組分在一些 實(shí)施方式中可接觸一種或多種其他類型的試劑。示例性試劑包括氨基酸（例如，賴氨酸、甘 氨酸、組氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和精氨酸）， 并入二和/或三價(jià)陽(yáng)離子的組合物，某些非還原多糖，某些還原劑，酚化合物（例如，具有 至少一個(gè)酚官能度的化合物），具有至少一個(gè)游離硫醇基團(tuán)或官能度的某些化合物，氧化劑 (例如，過(guò)氧化氫或臭氧），氧化催化劑（例如，二氧化鈦），天然植物提取物（例如，迷迭香 提取物），以及其組合。
[0068] 在某些實(shí)施方式中，本文所述的酶處理可結(jié)合益生菌處理使用，如2012年4月11 日提交的Marshall等人的美國(guó)專利申請(qǐng)13/444,272中描述的，通過(guò)引用將其并入本文。 如本文公開的，某些示例性益生菌包括但不限于青春雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、兩歧雙歧桿 菌、短雙岐桿菌、嬰兒雙岐桿菌、乳雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、假鏈狀雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙岐桿菌、 雙岐桿菌屬、嗜熱雙岐桿菌、嗜酸乳酸桿菌、消化乳桿菌、嗜淀粉乳桿菌、保加利亞乳桿菌、 雙歧乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、高加索乳桿菌、卷曲乳桿菌、彎曲乳桿菌、德氏乳桿菌、 發(fā)酵乳桿菌、鶴雞乳桿菌、格氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、約氏乳桿菌、乳酸乳桿菌、萊希曼氏乳 桿菌、類干酪乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌、乳桿菌屬某 種、芽孢乳酸桿菌、乳酸乳球菌、cermoris鏈球菌、屎鏈球菌、嬰兒鏈球菌、嗜熱鏈球菌、屎腸 球菌、乳酸片球菌、嗜熱葡萄球菌、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、布拉酵母菌、釀酒酵母、布拉 酵母、蠟樣芽孢桿菌變種東洋、枯草芽胞桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。在進(jìn)一步的 實(shí)施方式中，酶處理可用于結(jié)合用一種或多種酵母處理。在酶處理煙草植物或植物組分用 于結(jié)合一種或多種附加類型的處理（例如，用氨基酸、陽(yáng)離子、多糖、還原劑、酚化合物、含 硫醇化合物、氧化劑、氧化催化劑、天然植物提取物和/或益生菌處理）的情況下，所述處理 可以同時(shí)、緊密銜接或在顯著不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。酶和一種或多種試劑可以并入相同制劑 或不同制劑中。在一些實(shí)施方式中，酶和一種或多種試劑可以提供在單獨(dú)的制劑中，并且在 煙草植物生命周期的不同點(diǎn)應(yīng)用（例如，一種應(yīng)用于在田間生長(zhǎng)的植物，一種在收獲后應(yīng) 用，或者一種應(yīng)用于種子并且一種應(yīng)用于在田間生長(zhǎng)的植物）。
[0069] 根據(jù)本文提供的方法酶處理煙草材料對(duì)形成的煙草材料可具有多種效果。例如， 已知某些酶促進(jìn)抗病性，改進(jìn)植物的生長(zhǎng)，改變植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和/或?qū)崿F(xiàn)植物中某些化 合物的釋放和/或反應(yīng)等等功能。應(yīng)注意，獲得的具體效果可能至少部分與在處理中使用 的一種或多種酶的具體類型相關(guān)。
[0070] 例如，在某些實(shí)施方式中，用一種或多種酶處理煙草顯示某些化學(xué)化合物改進(jìn)的 水平。認(rèn)為，不同的酶對(duì)煙草中各種化合物的水平可具有不同的影響。例如，已知淀粉酶和 蛋白酶分別分解淀粉和蛋白質(zhì)，并且因此根據(jù)本發(fā)明相應(yīng)地預(yù)期降低煙草植物或植物組分 中某些淀粉和/或蛋白質(zhì)的含量。
[0071] 這些變化在一些實(shí)施方式中可導(dǎo)致煙草的感官性質(zhì)的改進(jìn)，例如味道或香味的改 變（例如，苦味減小或風(fēng)味更柔和）。盡管不意欲被理論所限制，但這些變化可能例如由煙 草或煙草組分中某些化合物的分解和/或某些化合物的轉(zhuǎn)化引起。在一些實(shí)施方式中，所 述變化可導(dǎo)致煙草材料中一種或多種毒物和/或毒物前體（例如，煙草煙毒物的前體）的 量的減少。可有利地根據(jù)本發(fā)明某些方面通過(guò)酶處理減少的各種煙毒物前體包括但不限于 結(jié)構(gòu)性碳水化合物例如膠質(zhì)和纖維素以及糖類、蛋白質(zhì)和氨基酸、吡啶和喹啉、丙烯酰胺、 兒茶酚、2-氨基萘、4-氨基聯(lián)苯、多酚（例如，綠原酸）、蕓香苷和咖啡酸。
[0072] 在具體的實(shí)施方式中，一種或多種氨基酸和/或氨基酸衍生物的水平可通過(guò)本文 提供的酶處理改變。例如，煙草材料中天冬酰胺、天冬氨酸和/或脯氨酸的含量可通過(guò)用酶 例如天冬酰胺酶處理而改變（例如，包括但不限于通過(guò)處理煙草種子、秧苗或活植物）。用 天冬酰胺酶處理收獲的煙草已經(jīng)例如在Chen等人的美國(guó)專利申請(qǐng)公開2011/0048434中討 論，通過(guò)引用將其并入本文。在一些實(shí)施方式中，天冬酰胺酶處理可導(dǎo)致煙草材料的天冬酰 胺酸含量的降低以及該煙草材料中天冬氨酸的增加。雖然不意欲被理論限制，認(rèn)為，天冬酰 胺酶催化天冬酰胺酸水解為天冬氨酸。
[0073] 天冬酰胺酸可被有利地減少，因?yàn)樘於０匪崾潜０返那绑w，丙烯酰胺存在 于香煙的煙中。通過(guò)降低煙草中天冬酰胺酸的水平，包含這種煙草的香煙的煙中丙烯酰胺 水平可被降低。此外，降低無(wú)煙煙草產(chǎn)品中使用的煙草中天冬酰胺酸含量可降低在應(yīng)用于 該煙草的任何熱處理過(guò)程（例如巴斯德殺菌法）中產(chǎn)生的丙烯酰胺的量。在一個(gè)實(shí)施方 式中，用一種或多種酶處理煙草可導(dǎo)致天冬酰胺酸含量按重量計(jì)小于未處理煙草中的大約 50%，小于未處理煙草中的大約40%，小于未處理煙草中的大約30%或小于未處理煙草中 的大約20%。例如，酶處理的煙草材料可具有未處理煙草材料的天冬酰胺酸含量的按重量 計(jì)大約0 %至大約70%，例如大約5 %至大約60%，并且有利地大約10 %至大約40%。
[0074] 相應(yīng)地，在某些實(shí)施方式中，使用酶處理的煙草可提供在由其產(chǎn)生的煙中顯示降 低的丙烯酰胺水平的發(fā)煙材料。例