煙草ε-番茄紅素環(huán)化酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草ε-番茄紅素環(huán)化酶基因，其堿基序列如SEQIDNO：1所示。本發(fā)明通過同源克隆的方式，從栽培煙草紅花大金元體內(nèi)克隆獲得Ntε-LCY基因序列，并且進(jìn)行了表達(dá)模式及亞細(xì)胞定位分析。利用煙草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus，TRV）誘導(dǎo)基因沉默注射本氏煙草，結(jié)果表明ε-LCY的部分沉默可以提高煙葉中類胡蘿卜素含量，并且增強(qiáng)煙株抵御光抑制的能力。該研究結(jié)果能夠為利用基因工程技術(shù)培育優(yōu)良品種提供理論依據(jù)和基因資源。
【專利說明】煙草ε-番茄紅素環(huán)化酶基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及在煙草中，一種類胡蘿卜素合成關(guān)鍵基 因 Nt ε -LCY及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 類胡蘿卜素是自然界廣泛存在的一類重要萜類物質(zhì)，一切光合組織中都能合成此 類物質(zhì)。高等植物類胡蘿卜素合成通路產(chǎn)生的中間物質(zhì)如α-胡蘿卜素（a-carotene)、 β -胡蘿卜素（β-carotene)、黃體素（lutein)、新黃質(zhì)（neoxanthin)、紫黃質(zhì) (violaxanthin)、玉米黃質(zhì)（zeaxanthin)等參與了高等植物體內(nèi)諸多重要的生理過程。類 胡蘿卜素在光合作用中起重要作用，是光合作用中光傳導(dǎo)途徑和光反應(yīng)中心的重要組成部 分，作為葉綠體光合天線的輔助色素，有助于葉綠體吸收光能；另一方面，類胡蘿卜素在高 溫、強(qiáng)光下能通過葉黃素循環(huán)，以非光化學(xué)輻射的方式耗散光系統(tǒng)II (PSII)的過剩能量， 保護(hù)葉綠素免受氧化損傷的破壞。此外，類胡蘿卜素也是合成植物激素脫落酸（ΑΒΑ)的前 體物，ΑΒΑ廣泛地參與植物生長周期發(fā)育的各個環(huán)節(jié)和抗逆過程。番茄紅素環(huán)化是該通路 的一個重要分支點，番爺紅素在番爺紅素 β-環(huán)化酶（lycopene β-cyclase, β-LCY)或者 番爺紅素 ε-環(huán)化酶（lycopenes-cyclase, ε-LCY)的作用下形成為β-胡蘿卜素或者 胡蘿卜素。ε-LCY和β-LCY兩個酶的活性在一定程度上決定了兩個分支產(chǎn)物黃體素、 胡蘿卜素、紫黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)等胡蘿卜素類物質(zhì)的比例。植物中眾多的研究實例都表明 ε -LCY是調(diào)控黃體素和β-胡蘿卜素含量比例的關(guān)鍵酶。ε -LCY在玉米體內(nèi)的自然變異 能夠解釋玉米品種間58%的黃體素和β-胡蘿卜素含量差異。擬南芥ε-LCY的表達(dá)抑制 株系也出現(xiàn)了黃體素和β-胡蘿卜素含量比例的顯著變化，土豆ε-LCY的表達(dá)抑制同樣造 成了 β_胡蘿卜素含量的顯著上升。油菜種子中ε-LCY的表達(dá)抑制導(dǎo)致β-胡蘿卜素、紫 黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)等物質(zhì)含量的上升，但是黃體素的含量也大幅提高，這表明不同植物體內(nèi) 可能存在不同的遺傳機(jī)制或調(diào)控機(jī)制。
[0003] 類胡蘿卜素是一類重要的香味前體物，其通過降解、轉(zhuǎn)化可形成一系列的致香物 質(zhì)。煙葉中類胡蘿卜素的含量不但決定了烤后煙葉的外觀品質(zhì)，同時也能夠影響煙葉的吸 食品質(zhì)，其降解產(chǎn)物占煙葉總揮發(fā)性香氣成分的8%-12%。類胡蘿卜素的降解和熱裂解產(chǎn) 物可生成近百種香氣化合物，如巨豆三烯酮、β_大馬酮等，這些香味物質(zhì)閾值相對較低，刺 激性較小，對煙葉香氣貢獻(xiàn)率大，是形成烤煙細(xì)膩、高雅和清新香氣的主要成分。Weeks研究 發(fā)現(xiàn)，在煙葉品質(zhì)提高的同時，類胡蘿卜素降解物含量明顯增加。對β_胡蘿卜素降解產(chǎn)物 進(jìn)行了加香實驗，結(jié)果表明添加 β_胡蘿卜素的降解產(chǎn)物能夠豐滿煙氣，增濃煙香。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的探索一種利用基因工程方法增加類胡蘿卜素的合成效率，尤其是 β-胡蘿卜素合成的效率。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：煙草ε -番茄紅素環(huán)化酶基因，其堿基序列如SEQ ID Ν0 :1 所示。煙草ε-番茄紅素環(huán)化酶基因，其編碼序列如SEQ ID NO :2所示。
[0006] 所述的煙草ε -番茄紅素環(huán)化酶基因的應(yīng)用，所述煙草番茄紅素 ε環(huán)化酶基因提 高煙草類胡蘿卜素含量。
[0007] 一種提高煙草類胡蘿卜素含量的方法，通過瞬時表達(dá)技術(shù)干擾、沉默煙草番茄紅 素 ε環(huán)化酶基因，獲得類胡蘿卜素含量提高的煙草轉(zhuǎn)化植株。
[0008] 所述的提高煙草類胡蘿卜素含量的方法，以所述煙草番茄紅素 ε環(huán)化酶基因的 特異性核苷酸片段作為引導(dǎo)序列，將特異性核酸片段以正反兩個方向插入到植物表達(dá)載體 中，構(gòu)建煙草番茄紅素 ε環(huán)化酶基因的病毒誘導(dǎo)基因沉默載體和RNAi載體。
[0009] 本發(fā)明利用一種快速、簡單、可靠的方法，病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)，即可下調(diào)類胡 蘿卜素合成關(guān)鍵基因 ε -番茄紅素環(huán)化酶，從而顯著提高類胡蘿卜素含量且增強(qiáng)植株抵御 光抑制的能力。
[0010] 本發(fā)明通過同源克隆的方式，從栽培煙草紅花大金元體內(nèi)克隆獲得Nt ε-LCY基 因序列，并且進(jìn)行了表達(dá)模式及亞細(xì)胞定位分析。利用煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV)誘導(dǎo)基因沉默注射本氏煙草，結(jié)果表明ε-LCY的部分沉默可以提高煙葉中類 胡蘿卜素含量，并且增強(qiáng)煙株抵御光抑制的能力。該研究結(jié)果能夠為利用基因工程技術(shù)培 育優(yōu)良品種提供理論依據(jù)和基因資源。
[0011] 首先，從普通煙草cDNA中擴(kuò)增出ε-番茄紅素環(huán)化酶基因，命名為Nt ε-LCY。并 且從基因組DNA中擴(kuò)增出Nt ε -LCY的全長序列，繪制該基因結(jié)構(gòu)圖；研究了 Nt ε -LCY基因 在煙草不同時期不同器官中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)該基因主要在幼葉中表達(dá)。采用激 光共聚焦發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在葉綠體中；利用煙草脆裂病毒介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)研 究了四倍體煙草類胡蘿卜素合成通路基因表達(dá)和類胡蘿卜素含量變化，及對葉片光合系統(tǒng) ε -LCY基因部分沉默情況下發(fā)生光抑制程度的變化。
[0012] 在煙草中，探索一個類胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因 Nt ε -LCY，并建立起一種快速提高 類胡蘿卜素含量，提高光抑制效應(yīng)的可靠的方法。該方法無需采用費(fèi)時費(fèi)力的轉(zhuǎn)基因技術(shù)， 在一個月內(nèi)即可達(dá)到目的。本發(fā)明揭示了煙草中ε-LCY基因在類胡蘿卜素合成中的重要 功能，對類胡蘿卜素組成的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用，為植物分子改良提供了良好的理論 指導(dǎo)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1 :Nt ε -LCY全長基因序列和擬南芥At ε -LCY、西紅柿S1 ε -LCY、絨毛煙草 Ntom ε -LCY和林煙草sly ε -LCY基因結(jié)構(gòu)比對；
[0014] 圖2 :Nt ε -LCY-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位。將融合表達(dá)載體Nt ε -LCY-GFP基因 槍法轟擊ΒΥ-2懸浮細(xì)胞進(jìn)行Confocal觀察，Α是Nt ε -LCY-GFP熒光，Β是葉綠素?zé)晒?，C 是明場下細(xì)胞圖像，D是A、B、C圖像的疊加；
[0015] 圖3 :3A為四倍體栽培煙草中不同時期、（stagel-Stage4分別為還苗期、盛花期、 打頂期和成熟期）的各類器官[根-R、莖-S、葉-L (5葉位-5L，10葉位-10L，15葉位-15L)、 花-F]中Nt ε -LCY-GFP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式，3B是在低溫弱光脅迫下Nt ε -LCY表達(dá)模式。用 定量PCR技術(shù)檢測；
[0016] 圖4:本氏煙草中定量PCR檢測病毒介導(dǎo)的ε-LCY基因沉默效果。圖中C0N代表 未接種病毒的煙草，TRV代表接種了 TRV空病毒載體的煙草，TRV- ε -LCY代表接種了帶有 ε-LCY基因片段病毒的煙草；
[0017] 圖5:本氏煙草中HPLC檢測病毒介導(dǎo)的ε-LCY基因沉默后煙草植株類蘿卜素 (β_胡蘿卜素、紫黃質(zhì)、新黃質(zhì)和黃體素）含量及葉綠素 Α和Β的含量。圖中C0N代表未接 種病毒的煙草，TRV代表接種了 TRV空病毒載體的煙草，TRV- ε -LCY代表接種了帶有ε -LCY 基因片段病毒的煙草；
[0018] 圖6 :本氏煙草中定量PCR檢測病毒介導(dǎo)的ε -LCY基因沉默后類胡蘿卜素合成通 路基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)圖，圖中C0N代表未接種病毒的煙草，TRV代表接種了 TRV空病毒載體的煙 草，TRV- ε -LCY代表接種了帶有ε -LCY基因片段病毒的煙草；
[0019] 圖7 :7Α為四倍體栽培煙草中病毒介導(dǎo)的ε -LCY基因沉默后葉片在低溫弱光脅迫 條件下Fv/Fm的變化，F(xiàn)v/Fm是指植物葉片光合系統(tǒng)II的最大光化學(xué)效率；7Β為四倍體栽 培煙草中病毒介導(dǎo)的ε-LCY基因沉默后葉片在低溫弱光脅迫條件下NPQ的變化（非光化 學(xué)耗散）?！揪唧w實施方式】
[0020] 煙草ε -番茄紅素環(huán)化酶基因，其堿基序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0021] 煙草ε -番茄紅素環(huán)化酶基因，其編碼序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0022] 所述的煙草ε -番茄紅素環(huán)化酶基因的應(yīng)用，所述煙草番茄紅素 ε環(huán)化酶基因提 高煙草類胡蘿卜素含量。
[0023] -種提高煙草類胡蘿卜素含量的方法，通過瞬時表達(dá)技術(shù)干擾、沉默煙草番茄紅 素 ε環(huán)化酶基因，獲得類胡蘿卜素含量提高的煙草轉(zhuǎn)化植株。
[0024] 所述的提高煙草類胡蘿卜素含量的方法，以所述煙草番茄紅素 ε環(huán)化酶基因的 特異性核苷酸片段作為引導(dǎo)序列，將特異性核酸片段以正反兩個方向插入到植物表達(dá)載體 中，構(gòu)建煙草番茄紅素 ε環(huán)化酶基因的病毒誘導(dǎo)基因沉默載體和RNAi載體。
[0025] l、Nt ε -LCY基因的同源克隆以及基因結(jié)構(gòu)分析
[0026] 通過NCBI網(wǎng)站搜索到ε -LCY基因所有的EST序列，通過比對拼接，在ATG和TGA 處設(shè)計保守引物進(jìn)行克隆，從栽培煙草cDNA中依次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段，Τ-Α連 接，轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)，菌落PCR鑒定得到陽性克隆，陽性質(zhì)粒提取，最后進(jìn)行 質(zhì)粒酶切鑒定和測序，得到Nt ε -LCY編碼區(qū)（⑶S)全長序列1575bp。將此基因氨基酸序列 與西紅柿、馬鈴薯及擬南芥氨基酸序列進(jìn)行比對，其相似性分別高達(dá)89 %、89 %和72 %，推 測煙草Nt ε -LCY可能與其他植物具體相似的生物學(xué)功能。利用保守引物以栽培煙DNA為 模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到Nt ε -LCY基因全長序列4356bp，將栽培煙草基因結(jié)構(gòu)圖與西紅柿、擬 南芥、林煙草和絨毛煙草的基因結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行比對，結(jié)果如圖1所示：該基因結(jié)構(gòu)在不同物種 間相當(dāng)保守，包含了 11個外顯子和10個內(nèi)含子。
[0027] 具體步驟如下所述：
[0028] 所用引物為 5' -ATGGATTGTATTGGAGCTCGAAAT-3' 和 5' -CTAAAATGTAAGATAAGTTC TTATCA-3'。作為模板的cDNA和DNA都來自栽培煙草紅花大金元旺長期幼葉片（RNA和DNA 提取按照QIAGEN公司RNA或DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行）。按照Reverse transcription system試劑盒說明書，以O(shè)ligo (dT) 18 (TaKaRa公司）為引物合成cDNA第一鏈。首先 以cDNA為模板PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件如下：反應(yīng)體系為50 μ L，模板2 μ L，引物各 2. 5 μ L (10 μ moL/L)，dNTPs (10 μ moL/L) 4 μ L，buffer (10 X，Mg2+plus) 5 μ L，Taq 酶（北京全 式金生物技術(shù)有限公司）0. 5 μ L，滅菌水33. 5 μ L。其反應(yīng)參數(shù)：94°C預(yù)變性3min，94°C變性 3〇8,521：退火3〇8,721：延伸9〇8,35個循環(huán)；最后721：延伸1〇1^11。？0?產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝 膠電泳，用凝膠提取試劑盒（Gel Extraction KIT,購自QIAGEN公司）從瓊脂糖凝膠上純化 目標(biāo)ε -LCY Q)S片段（方法參照試劑盒說明書），用Eppendorf公司BioPhotometer測定 濃度后用于連接或存_20°C備用。純化的ε-LCY CDS片段與pMD19-T載體（TaKaRa公司， 氨節(jié)霉素抗性）連接（Solution I ligase，TaKaRa公司，按照試劑盒說明書操作），熱激轉(zhuǎn) 化（42°C 90s)入大腸桿菌DH5 a (TaKaRa公司）。從得到的克隆轉(zhuǎn)化子中用菌落PCR(引物 為上述擴(kuò)增引物）鑒定陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒Nt ε -LCY-T (小提質(zhì)粒試劑盒，QIAGEN 公司，方法參照試劑盒說明書進(jìn)行）。陽性質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測 序。
[0029] 煙草Nt ε -LCY基因全長擴(kuò)增以栽培煙草DNA組為模板，其反應(yīng)參數(shù)：94°C預(yù)變性 3min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸5min，35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。反應(yīng) 體系及純化、連接、轉(zhuǎn)化條件與上述條件一致。經(jīng)菌落PCR驗證陽性后，提取陽性克隆質(zhì)粒 送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。
[0030] 2、Nt ε -LCY的蛋白定位于葉綠體
[0031] 為了得到最確切的Nt ε -LCY蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果，構(gòu)建Nt ε -LCY-GFP融合蛋白 載體。采用基因槍轟擊轉(zhuǎn)化煙草懸浮細(xì)胞（ΒΥ-2)，用激光共聚焦顯微鏡觀察其定位，結(jié)果如 附圖2所示，Α為融合蛋白綠色熒光，Β為葉綠素自身的紅色熒光，C為明場下的細(xì)胞圖像，D 為三者的重疊圖像，由D圖可見，融合蛋白的綠色熒光恰與葉綠素的紅色熒光重疊在一起， 表明Nt ε -LCY蛋白定位在葉綠體中，這與其可能發(fā)揮的光合生理作用是一致的。
[0032] 具體方法如下所述：
[0033] 以 5，-ΤΑ GTCGAC ATGGATTGTATTGGAGCTCGAAAT-3，（含 Sail 酶切位點）和 5' -GCGGATCCMATGTAAGATMGTTCTTATCA-3'(含BamH I 酶切位點）為引物，以測序正確 的Nt ε -LCY-T為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物回收純化，使用Sail和BamH I進(jìn)行酶切再純化，連接 同樣由Sail和BamH I酶切之后回收純化的pJIT163-GFP載體，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α， 經(jīng)菌落PCR定陽性克隆，提取質(zhì)粒并測序正確后，得到pJIT163-Nt ε -LCY-GFP融合表達(dá)載 體。具體的分子克隆技術(shù)如1中所不。
[0034] 米用基因槍〇i〇-Rad FOSIOOO/He system)轟擊煙草ΒΥ2懸浮細(xì)胞系技術(shù)進(jìn)行。 BY-2懸浮細(xì)胞接種在MS培養(yǎng)基中，26°C，130rpm震蕩培養(yǎng)7天。0. 5mg DNA與金粉混合， 轟擊BY2懸浮細(xì)胞系；轟擊后要26°C暗培養(yǎng)12小時，之后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光 (BX50-FLA, Olympus) 〇
[0035] 3、Nt ε -LCY表達(dá)模式分析
[0036] 采集栽培煙草的各個時期（還苗期、盛花期、打頂期和成熟期）的各類器官[根、 莖、葉（5葉位，10葉位，15葉位）、花]樣品，并提取它們的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA(方法 參看1)。定量PCR ((BI0-RAD，USA))分析Nt ε -LCY時空表達(dá)模式和低溫弱光脅迫下的表達(dá) 模式。如附圖3Α中所示，Nt ε -LCY在盛花期表達(dá)量較高，且多表達(dá)在幼葉中（表達(dá)水平： 15葉位> 10葉位> 5葉位>花彡莖>根）。在低溫弱光脅迫下，Nt ε -LCY表達(dá)量呈上升 趨勢（見圖3Β)。轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式的研究結(jié)果表明，該基因與植物的生理狀態(tài)密切相關(guān)， 在煙株光合生理較為強(qiáng)盛的幼嫩組織表達(dá)量較高，且能夠被光抑制條件誘導(dǎo)，參與煙株抵 御光抑制的過程，其生物學(xué)功能必然與光合生理過程存在密切的關(guān)系。
[0037] 表達(dá)模式分析所用煙草器官樣品均在云南大田采樣，所用的引物見表1 中ε -LCY-Q-F/R，采用26s RNA作為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 °C預(yù)變性3min ; 95°〇208,601：208,40個循環(huán)。反應(yīng)體系：1以1^。0嫩，1(^1^3￥81?6代611，上下游引物各 1 μ L (10 μ mol/L)，補(bǔ) ddH20 至 20 μ L。
[0038] 4、煙草中下調(diào)ε -LCY表達(dá)提高類胡蘿卜素含量并增強(qiáng)植物抵御光抑制能力
[0039] 為研究如何增加煙草中類胡蘿卜素含量，采用了一種快速可靠的方法，利用煙草 脆裂病毒介導(dǎo)的煙草內(nèi)源基因沉默，在本氏煙中下調(diào)了 ε-LCY基因的表達(dá)，在ε-LCY基因 部分沉默的情況下，煙草中類胡蘿卜素含量發(fā)生顯著變化，同時在正常生長條件和脅迫條 件下的光合系統(tǒng)效率也隨之變化。
[0040] 煙草脆裂病毒載體感染能力強(qiáng)，病毒癥狀輕，空載體侵染與對照植株生長發(fā)育無 明顯差異。TRV- ε -LCY混合陽性菌株接種本氏煙草后，煙株新葉中ε -LCY基因表達(dá)被抑 制，只有對照植株的10% (甚至更低），說明TRV-VIGS系統(tǒng)沉默本氏煙草的ε -LCY基因效 果是顯著的（圖4)。在ε-LCY基因表達(dá)受到抑制的植株（ε-Icy)后，β -胡蘿卜素、紫黃 質(zhì)、玉米黃質(zhì)含量上升顯著，而葉黃素含量出現(xiàn)下降，同時葉綠素 Α和Β含量顯著上升，胡蘿 卜素的總量上升（圖5)。同時，應(yīng)用定量PCR對類胡蘿卜素合成通路上其它基因進(jìn)行了轉(zhuǎn) 錄表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)除β_胡蘿卜素羥基化酶（β-OHase)外，八氫番茄紅素合成酶（PSY)，八 氫番茄紅素脫氫酶（PDS)，ζ -胡蘿卜素脫氫酶（ZDS)，類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTIS0)，β -番 茄紅素環(huán)化酶（β -LCY)，玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶（ΖΕ)，紫黃質(zhì)去環(huán)氧化酶（VDE)，新黃素合成酶 (NXS)表達(dá)量均顯著提高（圖6)。在光抑制條件下，對照植株的PSII最大光化學(xué)效率（Fv/ Fm)是顯著下降的，而ε-Icy煙株表現(xiàn)出色的抵御光抑制能力（圖6A)。而植物光合系統(tǒng) 生理狀態(tài)另一個重要參數(shù)非光化學(xué)耗散（NPQ)反映植株過剩光能耗散的狀態(tài)，ε-Icy煙株 NPQ在光抑制條件下顯著低于對照植株（圖6B)。上述結(jié)果表明煙草ε-LCY基因表達(dá)受到 抑制后可以增加 β_胡蘿卜素分枝色素的含量，進(jìn)而提高類胡蘿卜素物質(zhì)的總含量，也同 時提高了煙株的葉綠素 Α和Β的含量，使植物的光合能力得到提高，也增強(qiáng)了煙株抵御光抑 制的能力。
[0041] 具體方法如下所述：
[0042] 構(gòu)建TRV- ε -LCY載體：所用引物為5 ^ -GCGGTACC GTCCTGCTGGTCTTGCTCTTGCT-3 '(包含 ΚρηΙ 酶切位點）和 5 ' -GCCTCGAG GACTCCTGTTTTAGTCATGGGCATG-3'(包含 Xhol 酶切位點）；以 1 中測序正確的 Nt ε -LCY-T 質(zhì)粒為模版擴(kuò)增，回收純化PCR產(chǎn)物，使用ΚρηΙ和Xhol酶切PCR回收片段和TRV2病毒載 體，回收目的片段并連接，轉(zhuǎn)化細(xì)菌（DH5a，TaKaRa公司），菌落PCR鑒定陽性克隆，提取質(zhì) 粒得到目的載體酶切驗證并測序。測序正確的TRV2- ε -LCY質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，菌落PCR驗證 陽性后，注射本氏煙草。具體的分子克隆技術(shù)如1中所示。載體圖譜和病毒介導(dǎo)的基因沉默 (VIGS，Virus Induced Gene Silencing)操作流程詳見參考文獻(xiàn)[Hayward A，Padmanabhan M,Dinesh-Kumar SP,Plant Reverse Genetics:Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 678, 55-63]〇
[0043] 病毒載體接種本氏煙草葉片后30天，提取煙草同葉位葉片的RNA并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，實時定量PCR分析ε-LCY的沉默效果（相對于未接種的煙草對照和接種帶有空病毒 載體的煙草）。ε-LCY沉默效果檢測用引物及類胡蘿卜素通路轉(zhuǎn)錄表達(dá)定量PCR引物見表 1〇
[0044] 表1 ε -LCY沉默效果檢測引物及類胡蘿卜素通路轉(zhuǎn)錄表達(dá)定量PCR引物
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 煙草ε -番茄紅素環(huán)化酶基因，其堿基序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 煙草ε -番茄紅素環(huán)化酶基因，其編碼序列如SEQ ID NO :2所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的煙草番茄紅素環(huán)化酶基因的應(yīng)用，其特征在于：所述煙草 番茄紅素 f環(huán)化酶基因提高煙草類胡蘿卜素含量。
4. 一種提高煙草類胡蘿卜素含量的方法，其特征在于：通過瞬時表達(dá)技術(shù)干擾、沉默 煙草番茄紅素 f環(huán)化酶基因，獲得類胡蘿卜素含量提高的煙草轉(zhuǎn)化植株。
5. 如權(quán)利要求4所述的提高煙草類胡蘿卜素含量的方法，其特征在于：以所述煙草番 茄紅素 f環(huán)化酶基因的特異性核苷酸片段作為引導(dǎo)序列，將特異性核酸片段以正反兩個 方向插入到植物表達(dá)載體中，構(gòu)建煙草番茄紅素 ε環(huán)化酶基因的病毒誘導(dǎo)基因沉默載體 和RNAi載體。
【文檔編號】A01H5/00GK104152475SQ201410405714
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】王燃, 史艷梅, 羅朝鵬, 李鋒, 劉萍萍, 魏攀, 金立鋒, 魏春陽, 楊軍, 林福呈, 屈凌波, 武明珠, 陳霞, 鄭慶霞 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院