一種抗SLA/LP抗體IgG的磁微?；瘜W發(fā)光定量測定試劑盒及制備和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種抗SLA/LP抗體IgG的磁微粒化學發(fā)光定量測定試劑盒，該試劑盒包括：抗SLA/LP抗體IgG校準品；抗SLA/LP抗體IgG質控品；含生物素標記的SLA/LP抗原和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；含堿性磷酸酶標記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；含有鏈霉親和素標記的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；清洗液。該試劑盒的檢測方法在傳統(tǒng)的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法的基礎上，將靈敏度和線性范圍再提高3?5個數量級、實現(xiàn)真正意義的定量檢測，反應迅速，結果可靠，并能夠配合全自動化學發(fā)光免疫分析儀實現(xiàn)全自動使用，對于臨床診斷具有無可替代的重要價值。
【專利說明】
一種抗SLA/LP抗體I gG的磁微?；瘜W發(fā)光定量測定試劑盒及 制備和檢測方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物檢測技術領域。更具體地，涉及一種抗SLA/LP抗體IgG的磁微?；?學發(fā)光定量測定試劑盒及制備和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一類以自身免疫反應為基礎，以 多種自身抗體、高免疫球蛋白血癥、循環(huán)自身抗體和組織學上有界面性肝炎及匯管區(qū)漿細 胞浸潤為特征的慢性肝臟炎性疾病。
[0003] AIH根據血清免疫學檢查可分為I型(ANA、SMA)、n型(抗LKM-1抗體、抗LC-1抗體、） 和m型(抗SLA/LP抗體），抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)抗體是自身免疫性肝炎(AIH) 最特異的診斷標示。雖然它的陽性率只有10%~30%，但其陽性預告值幾乎為100%，如果 出現(xiàn)相應的臨床癥狀基本上能夠診斷為AIH，因此，抗SLA/LP抗體IgG檢測對自身免疫肝炎 的診斷具有重要參考價值。
[0004] 目前臨床上抗SLA/LP抗體IgG的檢測有膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法。膜條免疫 法應用的是膜條顯色技術，其特點為固定幾個項目在同一膜條測定，一般通過手工或者半 自動膜條儀進行實驗操作，最終通過肉眼進行定性判定，該技術靈敏度低，反應時間長，檢 測項目只能固定搭配組合，靈活性差。酶聯(lián)免疫吸附法的靈敏度在膜條免疫法基礎上有所 提升，但仍然較低，并且線性范圍窄，重復性差，反應時間也較長，仍然不能很好滿足臨床的 應用。
[0005] 磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析法，較以前的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法，在檢測靈 敏度、檢測范圍、檢測時間及自動化操作上有了大大提高，且沒有污染，臨床應用廣。目前， 使用磁微?；瘜W發(fā)光分析法在抗SLA/LP抗體IgG免疫分析產品的應用仍未見。
【發(fā)明內容】
[0006] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種抗SLA/LP抗體IgG的磁微?；瘜W發(fā)光定量測定試 劑盒，本發(fā)明提供的試劑盒將化學發(fā)光分析技術與磁性微粒分離技術相結合，采用生物素 和堿性磷酸酶(ALP)分別標記抗原和抗體，以直徑l-3wii的包被鏈霉親和素的超順磁性微粒 作為分離試劑。ALP催化底物發(fā)光后，通過儀器測量發(fā)光強度計算出待測物濃度。該檢測方 法在傳統(tǒng)的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法的基礎上，將靈敏度和線性范圍再提高3-5個數 量級、實現(xiàn)真正意義的定量檢測，反應迅速，結果可靠，并能夠配合全自動化學發(fā)光免疫分 析儀實現(xiàn)全自動使用，對于臨床診斷具有無可替代的重要價值。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種上述試劑盒的制備方法及檢測方法。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案：
[0009] -種抗SLA/LP抗體IgG的磁微粒化學發(fā)光定量測定試劑盒，所述試劑盒包括：
[001 0] 1)抗SLA/LP抗體IgG校準品，含抗SLA/LP抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液， 所述抗SLA/LP抗體IgG校準品為6個水平的液體校準品，所述6個水平的液體校準品中抗 SLA/LP 抗體 IgG 的濃度分別為0，5，20，50，100，200RU/mL;
[0011] 2)抗SLA/LP抗體IgG質控品，含抗SLA/LP抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液， 所述抗SLA/LP抗體IgG質控品包含2個水平的液體質控品，所述2個水平的液體質控品中抗 SLA/LP抗體I gG的靶值濃度范圍分別為（20 ± 4) RU/mL和（100 ± 20) RU/mL;
[0012] 3)試劑1號，含生物素標記的SLA/LP抗原和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；
[0013] 4)試劑2號，含堿性磷酸酶標記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖 液；
[0014] 5)磁分離試劑，含有鏈霉親和素標記的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；
[0015] 6)清洗液；
[0016] 所述試劑盒中試劑1號，試劑2號和磁分離試劑的含量比為1:3:1，所述含量比為體 積比。
[0017]進一步的，所述磁微粒的材質為Fe2〇3;所述磁微粒表面包被有羧基基團，包被物中 羧基基團含量大于20wt%，所述磁微粒的大小為1-3M1。
[0018] -種制備所述抗SLA/LP抗體IgG的磁微粒化學發(fā)光定量測定試劑盒的方法，該方 法包括如下步驟：
[0019] (1)配制抗SLA/LP抗體IgG校準品：
[0020] a.配制抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液：
[0021] 將純化水、TriS、氯化鈉和Procl in300加入容器中，充分攪拌至完全溶解，TriS濃 度為lwt%，氯化鈉濃度為lwt%，Proclin300濃度為0.2v% ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.0- 7.5 ;將牛血清白蛋白加入容器中，充分攪拌至完全溶解，牛血清白蛋白的濃度為 4wt % ;再用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;用孔徑為0.2wii的濾器過濾得抗SLA/LP抗 體IgG校準品稀釋液，2-8°C保存待用；
[0022] b ?配制抗SLA/LP抗體IgG校準品：
[0023] 將抗SLA/LP抗體IgG用抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為0，5，20， 50，100,200RU/mL;
[0024] (2)配制抗SLA/LP抗體IgG質控品：
[0025] 將抗SLA/LP抗體IgG用上述抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為20， 100RU/mL；
[0026] (3)配制試劑1號：
[0027] a.配制試劑1號稀釋液：
[0028] 將純化水、Tris、氯化鈉和Proclin300加入容器中，充分攪拌至完全溶解，Tris的 濃度為lwt %，氯化鈉濃度為0.5wt %，Proclin300的濃度為0.2v% ;將牛血清白蛋白加入容 器中，充分攪拌至完全溶解，牛血清白蛋白的濃度為〇. 5wt % ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.0- 7.5;用孔徑為0.2mi的濾器過濾得試劑1號稀釋液，2-8°C保存待用；
[0029] b.配制試劑1號：
[0030] 將SLA/LP抗原用純化水溶解，2-8°C條件下用濃度為0.2M，pH為9.0的碳酸鹽緩沖 液透析2h，然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液，用濃度為0.2M，pH為8.5-9的碳酸鹽緩 沖液配制濃度為0.5-1. Omg/ml的生物素溶液;按照SLA/LP抗原與生物素質量比為10:1的比 例在SLA/LP抗原溶液中加入生物素溶液，混合均勻，室溫靜置12-18h，反應生成SLA/LP抗 原-生物素連接物；將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的反應液在2-8°C條件下用濃度為 0.2M，pH為9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天，期間進行4次換液，從而除去未反應的生物素，得到 含有SLA/LP抗原-生物素連接物的溶液；用試劑1號稀釋液將含有SLA/LP抗原-生物素連接 物的溶液稀釋到〇. 1-0.3iig/mL，制得試劑1號；
[0031]本步驟配制的試劑1號可降低實驗成本，而且能有效分離游離生物素和連接物，得 到的連接物較純，減少了非特異反應；
[0032] (4)配制試劑2號：
[0033] a.配制試劑2號稀釋液：
[0034] 將純化水、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉、牛血清白蛋白、ZnCl2和Proclin300加入 容器中，充分攪拌至完全溶解，4 -羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為0.6 w t %，氯化鈉濃度為 0 ? 8wt %，牛血清白蛋白的濃度為0 ? 5wt%，ZnCl2的濃度為0 ? lwt%。，Proclin300的濃度為 0 ? 2v%。，MgCl2的濃度為0 ? 1%。；用4M的HCL將溶液的pH值調為7 ? 5-8 ? 0;用孔徑為0 ? 2_的濾 器過濾得試劑2號稀釋液，2-8°C保存待用；
[0035] b ?配制試劑2號：
[0036]將lmg羊抗人多克隆抗體加入到2-4yL濃度為10mg/mL的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液 中，室溫靜置20min，再加入0 . lm〇L/L的甘氨酸溶液10此，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除 鹽，收集活化后的羊抗人多克隆抗體，2-8°C保存?zhèn)溆?將1.5mg的堿性磷酸酶加入到10-20y L的濃度為5mg/mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中，室溫靜 置30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后的堿性磷酸酶，2-8°C保存?zhèn)溆?將活化的羊抗人 多克隆抗體與活化的堿性磷酸酶混合，2-8°C條件下靜置12-24h，用S UpperdeX200凝膠純化 柱純化偶聯(lián)物，獲得羊抗人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液，2-8 °C保存?zhèn)溆?將羊抗 人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液用試劑2號稀釋液稀釋到0.02-0. lyg/mL，制得試 劑2號；
[0037] (5)配制磁分離試劑：
[0038] a.配制磁微粒緩沖液：
[0039] 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中，充分攪拌至完全溶解，Tris的濃度為lwt%， 氯化鈉的濃度為〇.8wt% ;再將牛血清白蛋白、新生牛血清和Proclin300加入容器中，充分 攪拌至完全溶解，牛血清白蛋白的濃度為〇.5wt%，新生牛血清濃度為5v%，Pr 〇clin300濃 度為0.2v%。;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用孔徑為0.2mi的濾器過濾得磁微粒緩 沖液，2-8 °C保存待用；
[0040] b.配制磁分離試劑：
[0041 ]取100mg磁微粒，使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L，pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液1〇11^，充分混勻;再加入〇.5-11^新配 制的濃度均為10mg/mL的1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺水溶 液，室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系；使用2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液配制濃度為5mg/ mL的鏈霉親和素溶液，然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8-1.6mL的鏈霉親和 素，4°C條件下混懸16-20h;再使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向磁微粒中加入10mL 濃度為1M，pH為8.5的乙醇胺溶液，室溫反應1-2h，再使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上 清，向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL，制得磁分離試劑；
[0042] 本步驟中，加入N-羥基琥珀酰亞胺能夠對偶聯(lián)劑1_(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳 二亞胺起到穩(wěn)定作用；加入鏈霉親和素后在4度條件下混懸，能夠更好的保留蛋白質活性， 同時減少室溫變化對偶聯(lián)效果的影響，使批次之間偶聯(lián)結果更加穩(wěn)定;加入乙醇胺，可使乙 醇胺分子中的氨基與磁珠活化后未結合蛋白的活性位點反應，起到終止反應和封閉作用， 能夠產生更低的本底值；
[0043] (6)配制清洗液：
[0044] 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中，充分攪拌至完全溶解，Tris的濃度為lwt%， 氯化鈉的濃度為〇.8wt%;再將Tween-20和TritonlOO加入容器中，充分攪拌至完全混勻， Tween-20的濃度為0 ? 5wt %，Triton100 的濃度為0 ? 5wt % ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.5-8.0，用孔徑為0.2mi的濾器過濾得清洗液，2-8 °C保存。
[0045] 抗SLA/LP抗體IgG的磁微?；瘜W發(fā)光定量測定試劑盒的檢測方法，該方法包括如 下步驟：
[0046] 1)將抗SLA/LP抗體IgG校準品放到全自動化學發(fā)光免疫分析儀測試位置，得到由 全自動化學發(fā)光免疫分析儀輸出的擬合曲線；
[0047] 2)將抗SLA/LP抗體IgG質控品放到上述分析儀測試位置，得到由全自動化學發(fā)光 免疫分析儀輸出的所述質控品的測試發(fā)光值和通過步驟1得到的擬合曲線擬合得到抗SLA/ LP抗體IgG質控品的濃度值；
[0048] 3)將待測樣本放到上述分析儀測試位置，由所述分析儀自動按1:20將樣本稀釋， 得到由全自動化學發(fā)光免疫分析儀輸出的待測樣本的濃度值。
[0049] 進一步的，該檢測方法具體包括如下步驟：
[0050] 1)加20此抗SLA/LP抗體IgG校準品或質控品或1:20稀釋后的待測標本至檢測管 中；
[0051 ] 2)加50yL的試劑1號至步驟1)所述檢測管中，混勻后，37 ±0.5°C溫1 Omin;
[0052] 3)加50此的磁分離試劑至步驟2)所述檢測管中，混勻后，37±0.5°C溫育5min，進 行磁分離，去上清；
[0053] 4)加300yL的清洗液至步驟3)檢測管中，混勻，進行磁分離，去上清；
[0054] 5)重復步驟4)兩遍；
[0055] 6)加150此試劑2號至步驟5)檢測管中，混勻后，37 ± 0.5°C溫育lOmin，進行磁分 離，去上清；
[0056] 7)加300yL的清洗液至步驟6)檢測管中，混勻，進行磁分離，去上清；
[0057] 8)重復步驟7)兩遍；
[0058] 9)加200iiL的化學發(fā)光底物至步驟8)檢測管中，混勻，檢測發(fā)光強度；
[0059] 所述步驟1)、步驟2)和步驟3)均包括全自動化學發(fā)光免疫分析儀的全自動檢測步 驟。
[0060] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0061] 本發(fā)明公開了一種測定抗SLA/LP抗體IgG的新技術，使得反應過程更加快速可靠， 提高了靈敏度和線性范圍，實現(xiàn)真正意義的定量測定，并可搭配全自動化學發(fā)光免疫分析 儀實現(xiàn)全自動的使用，大大提高工作效率;試劑盒中的校準品、生物素標記試劑、酶標記試 劑、磁分離試劑和清洗液等均是該反應體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測 性能提供了有力保障。
【附圖說明】
[0062] 圖la為實施例7空白限評價中零濃度校準品與相鄰校準品之間的濃度值與發(fā)光值 結果進行兩點回歸擬合得出的一次方程；
[0063] 圖lb為對比例1空白限評價中零濃度校準品與相鄰校準品之間的濃度值與發(fā)光值 結果進行兩點回歸擬合得出的一次方程；
[0064] 圖2為實施例7線性范圍評價中樣本濃度平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直 線擬合方程；
[0065] 圖3為實施例7同已有的商品化的試劑盒臨床樣本測值相關性散點圖。
【具體實施方式】
[0066] 為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說 明。
[0067] 實施例1
[0068]抗SLA/LP抗體IgG校準品的制備：
[0069] a.配制抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液：
[0070] 將800ml的純化水、11.2g的Tris、8.6g氯化鈉和2ml Proclin300加入容器中，充分 攪拌至完全溶解；用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;將40g牛血清白蛋白加入容器中， 充分攪拌至完全溶解;再用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至1L， 用0.2mi濾器過濾得抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液，2-8 °C保存待用；
[0071 ] b ?配制抗SLA/LP抗體IgG校準品：
[0072] 將抗SLA/LP抗體IgG用抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為0，5，20， 50，100,200RU/mL。
[0073] 實施例2
[0074]抗SLA/LP抗體IgG質控品的制備：
[0075] 將抗SLA/LP抗體IgG用上述抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為20， 100RU/mL〇
[0076] 實施例3
[0077]試劑1號的制備：
[0078] a.配制試劑1號稀釋液：
[0079] 將800ml純化水、12.1g的Tris、5.8g氯化鈉和2ml Proclin300加入容器中，充分攪 拌至完全溶解;將5g牛血清白蛋白加入容器中，充分攪拌至完全溶解；用4M的HCL將溶液的 pH值調為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至1L，用0.2mi濾器過濾得試劑1號稀釋液，2-8°C保 存待用；
[0080] b.配制試劑1號：
[0081 ] 將SLA/LP抗原用純化水溶解，2-8°C條件下用濃度為0.2M，pH為9.0的碳酸鹽緩沖 液透析2h，然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液，用濃度為0.2M，pH為8.5-9的碳酸鹽緩 沖液配制濃度為0.5-1. Omg/ml的生物素溶液;按照SLA/LP抗原與生物素質量比為10:1的比 例在SLA/LP抗原溶液中加入生物素溶液，混合均勻，室溫靜置12-18h，反應生成SLA/LP抗 原-生物素連接物；將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的反應液在2-8°C條件下用濃度為 0.2M，pH為9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天，期間進行4次換液，從而除去未反應的生物素，得到 含有SLA/LP抗原-生物素連接物的溶液；用試劑1號稀釋液將含有SLA/LP抗原-生物素連接 物的溶液稀釋到〇. 1-0.3iig/mL，制得試劑1號；
[0082] 本步驟配制的試劑1號可降低實驗成本，而且能有效分離游離生物素和連接物，得 到的連接物較純，減少了非特異反應。
[0083] 實施例4 [0084]試劑2號的制備：
[0085] a.配制試劑2號稀釋液：
[0086] 將800ml純化水、6.06g的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、8.5g氯化鈉、5g牛血清白蛋白、 0.1gZnCl2、0.2ml Proclin300和O.lg MgCl2加入容器中，充分攪拌至完全溶解；用4M的HCL 將溶液的pH值調為7.5-8.0;用純化水將溶液定容至1L，用0.2mi濾器過濾得試劑2號稀釋 液，2-8 °C保存待用；
[0087] b.配制試劑2號：
[0088]將lmg羊抗人多克隆抗體加入到2-4yL濃度為10mg/mL的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液 中，室溫靜置20min，再加入0 . lm〇L/L的甘氨酸溶液10此，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除 鹽，收集活化后的羊抗人多克隆抗體，2-8°C保存?zhèn)溆?將1.5mg的堿性磷酸酶加入到10-20y L的濃度為5mg/mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中，室溫靜 置30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后的堿性磷酸酶，2-8°C保存?zhèn)溆?將活化的羊抗人 多克隆抗體與活化的堿性磷酸酶混合，2-8°C條件下靜置12-24h，用S UpperdeX200凝膠純化 柱純化偶聯(lián)物，獲得羊抗人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液，2-8 °C保存?zhèn)溆?將羊抗 人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液用試劑2號稀釋液稀釋到0.02-0. lyg/mL，制得試 劑2號。
[0089] 實施例5
[0090]磁分離試劑的制備：
[0091] a.配制磁微粒緩沖液：
[0092] 將800mL純化水、12.1g Tris和8.5g氯化鈉加入容器中，充分攪拌至完全溶解;再 將5g牛血清白蛋白、50mL新生牛血清和0.2mL Proclin300加入容器中，充分攪拌至完全溶 解；用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用純化水將溶液定容至1L，用0.2圓濾器過濾得 磁微粒緩沖液，2-8 °C保存待用；
[0093] b.配制磁分離試劑：
[0094]取100mg磁微粒，使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L，pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液1〇11^，充分混勻;再加入〇.5-11^新配 制的濃度均為10mg/mL的1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺水溶 液，室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系；使用2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液配制濃度為5mg/ mL的鏈霉親和素溶液，然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8-1.6mL的鏈霉親和 素，4°C條件下混懸16-20h;再使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向磁微粒中加入10mL 濃度為1M，pH為8.5的乙醇胺溶液，室溫反應1-2h，再使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上 清，向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL，制得磁分離試劑；
[0095] 本步驟中，加入N-羥基琥珀酰亞胺能夠對偶聯(lián)劑1_(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳 二亞胺起到穩(wěn)定作用；加入鏈霉親和素后在4度條件下混懸，能夠更好的保留蛋白質活性， 同時減少室溫變化對偶聯(lián)效果的影響，使批次之間偶聯(lián)結果更加穩(wěn)定;加入乙醇胺，可使乙 醇胺分子中的氨基與磁珠活化后未結合蛋白的活性位點反應，起到終止反應和封閉作用， 能夠產生更低的本底值。
[0096] 實施例6 [0097]清洗液的制備：
[0098] 將800mL純化水、12.1g Tris和8.5g氯化鈉加入容器中，充分攪拌至完全溶解;再 將5g Tween-20和5g TritonlOO加入容器中，充分攪拌至完全混勻；用4M的HCL將溶液的pH 值調為7.5-8.0用純化水將溶液定容至1L，用0.2mi濾器過濾得清洗液，2-8°C保存。
[0099] 實施例7
[0100]抗SLA/LP抗體IgG的磁微粒化學發(fā)光定量測定試劑盒：
[0101] 該試劑盒包括：
[0102] 按照實施例1方法制備的抗SLA/LP抗體IgG校準品，每個水平的校準品用量為 0.5ml;
[0103]按照實施例2方法制備的抗SLA/LP抗體IgG質控品，質控品用量為lml;
[0104]按照實施例3方法制備的試劑1號，試劑1號的用量為5ml;
[0105]按照實施例4方法制備的試劑2號，試劑2號的用量為15ml;
[0106] 按照實施例5方法制備的磁分離試劑，磁分離試劑的用量為5ml;
[0107] 按照實施例6方法制備的清洗液，清洗液用量為1L。
[0108] 實施例8
[0109] 采用實施例7的試劑盒對抗SLA/LP抗體IgG進行定量檢測：
[0110] 該檢測方法包括：
[0111] 1)加20此抗SLA/LP抗體IgG校準品或質控品或1:20稀釋后的待測標本至檢測管 中；
[0112] 2)加50yL的試劑1號至步驟1)所述檢測管中，混勻后，37 ±0.5°C溫1 Omin;
[0113] 3)加50此的磁分離試劑至步驟2)所述檢測管中，混勻后，37±0.5°C溫育5min，進 行磁分離，去上清；
[0114] 4)加300iiL的清洗液至步驟3)檢測管中，混勻，進行磁分離，去上清；
[0115] 5)重復步驟4)兩遍；
[0116] 6)加150此試劑2號至步驟5)檢測管中，混勻后，37 ± 0.5°C溫育lOmin，進行磁分 離，去上清；
[0117] 7)加300yL的清洗液至步驟6)檢測管中，混勻，進行磁分離，去上清；
[0118] 8)重復步驟7)兩遍；
[0119] 9)加200iiL的化學發(fā)光底物至步驟8)檢測管中，混勻，檢測發(fā)光強度；
[0120] 所述步驟1)、步驟2)和步驟3)均包括全自動化學發(fā)光免疫分析儀的全自動檢測步 驟。
[0121] 對比例1
[0122] 與實施例7制備的試劑盒不同的是試劑盒中的試劑1號和磁分離試劑，其余成分相 同。
[0123] 試劑1號的制備如下：
[0124] a.配制試劑1號稀釋液：
[0125] 將800ml純化水、12.1g的Tris、5.8g氯化鈉和2ml Proclin300加入容器中，充分攪 拌至完全溶解;將5g牛血清白蛋白加入容器中，充分攪拌至完全溶解；用4M的HCL將溶液的 pH值調為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至1L，用0.2mi濾器過濾得試劑1號稀釋液，2-8°C保 存待用；
[0126] b.配制試劑1號：
[0127] 用濃度0.2M，pH為9的碳酸鹽緩沖液配制0.5mg/ml的生物素溶液;按照SLA/LP抗原 與生物素質量比為10:1的比例在SLA/LP抗原溶液中加入生物素溶液，混合均勻，室溫靜置 18h，反應生成SLA/LP抗原-生物素連接物;將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的反應液通過 G-25凝膠柱進行分離，除去未反應的生物素，得到含有SLA/LP抗原-生物素連接物的溶液； 用試劑1號稀釋液將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的溶液稀釋到0.1-0.3iig/mL，制得試劑 1號；
[0128] 磁分離試劑的制備如下：
[0129] a.配制磁微粒緩沖液：
[0130] 將800mL純化水、12.1g Tris和8.5g氯化鈉加入容器中，充分攪拌至完全溶解;再 將5g牛血清白蛋白、50mL新生牛血清和0.2mL Proclin300加入容器中，充分攪拌至完全溶 解；用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用純化水將溶液定容至1L，用0.2圓濾器過濾得 磁微粒緩沖液，2-8 °C保存待用；
[0131] b.配制磁分離試劑：
[0132] 取100mg磁微粒，磁分離去上清，用濃度為0.025mol/L，pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉） 乙磺酸緩沖液10mL重懸;加入0.5-lmL新配制的濃度為10mg/mL的EDC水溶液，室溫混懸30-60min;使磁珠充分活化，磁分離，去上清，用濃度為0.025mol/L，pH為4.5-5 2-(N-嗎啡啉） 乙磺酸緩沖液10mL重懸；加入4-8mg的鏈霉親和素，室溫混懸16-20h;再進行磁分離，去上 清，用磁微粒緩沖液稀釋重懸到0.5mg/mL，制得磁分離試劑。
[0133] 實施例9
[0134] 對實施例7和對比例1的試劑盒進行性能評價：
[0135] 1.實施例7的準確度評價
[0136] 將濃度約為200RU/mL(允許其濃度偏差為±20%)的抗51^/1^抗體46樣品4加入 到血清或其他相應基質的樣品B中，所加入A的體積不超過總體積(A+B)的10%，根據公式 (1)計算回收率R，本方法的回收率在85-115%范圍內，數據參見表1，評價結果符合要求。
[0138] R:回收率；
[0139] V:加入標準溶液的體積；
[0140] Vo:人源樣品的體積；
[0141 ] C:人源樣品加入標準溶液后的檢測濃度；
[0142] Co:人源樣品的檢測濃度；
[0143] Cs:標準溶液的濃度。
[0144] 表1準確度評價
[0146] 2.實施例7和對比例1的空白限評價
[0147] 用零濃度校準品作為樣本進行檢測，重復測定20次，得出20次測量結果的RLU值 (相對發(fā)光值），計算其平均值(M)和標準差(SD)，得出M+2SD所對應的RLU值，根據零濃度校 準品與相鄰校準品之間的濃度-RLU值結果進行兩點回歸擬合得出一次方程，將M+2SD所對 應的RLU值帶入上述方程中，求出對應的濃度值，即為空白限。本方法的空白限不大于1RU/ mL，數據參見表2，A、B點連點擬合曲線及擬合方程見圖la，對比例1制備的試劑盒測得的空 白限數據見表2_1，A、B點連點擬合曲線及擬合方程見圖lb，由數據可見，實施例7與對比例1 相比，得到的本底值更低，從而得到的空白限更低，代表試劑盒的靈敏度更好。
[0148] 表2空白限評價
[0151]表2-1空白限評價
[0153] 3.實施例7的線性范圍評價
[0154] 將接近線性范圍上限（200RU/mL)的高值樣本按一定比例稀釋為至少5種濃度，其 中低值濃度的樣本須接近線性范圍的下限。按試劑盒說明書進行操作，對每一濃度的樣本 均重復檢測2次，計算其平均值，將結果平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直線擬合，并 計算線性相關系數r，本方法的測量范圍為[2,200]RU/mL，相關系數r應多0.9900。數據參見 表3,擬合曲線及相關系數見圖2,評價結果符合要求。
[0155] 表3線性范圍評價
[0158] 4.實施例7和對比例1的重復性評價
[0159] 取實施例7中的試劑盒重復檢測濃度為(20±4)RU/mL和（100±20)RU/mL的樣本各 10次，計算10次測量結果的平均值M和標準差SD，根據公式CV = SD/MX 100%得出變異系數 CV，本方法變異系數(CV)不大于8%，數據參見表4,對比例1制備的試劑盒測得的重復性數 據見表4-1，由數據可見，實施例7與對比例1相比，得到的CV值更低，代表試劑盒的重復性更 好，
[0160] CV = SD/MX100%......................................(2)
[0161] 式中：CV-變異系數;SD-10次測量結果的標準差;M-10次測量結果的平均值。
[0162] 表4重復性評價
[0164] 表4-1重復性評價
[0165]
[0166] 5.實施例7和對比例1的批間差評價
[0167] 將實施例7的試劑盒取三批，每批試劑盒均測定濃度在(20 ± 4) RU/mL和（100 ± 20) RU/mL范圍內的樣本，每批重復測定10次，計算30次測定結果的平均值(M)和標準差(SD)，根 據公式(3)計算變異系數(CV)，本方法變異系數(CV)不大于15%，數據參見表5,對比例1制 備的試劑盒測得的批間差數據見表5-1，由數據可見，實施例7與對比例1相比，得到的CV值 更低，代表試劑盒的批間差更好，
[0168] CV = SD/MX100%......................................(3)
[0169] 式中：CV-變異系數;SD-30次測定結果的標準差;M-30次測定結果的平均值。
[0170] 表5批間差評價
[0173] 表5-1批間差評價
[0174]
[0175] 6.實施例7的特異性評價
[0176] 取1份Anti-SLA/LP IgG含量為0的樣本，加入抗LKM-1抗體IgG濃度為200RU/mL，使 用該試劑盒對該樣本進行檢測，測定樣本中的Anti-SLA/LP IgG含量，結果見表6，本方法與 抗LKM-1抗體IgG均無交叉反應，數據參見表6，評價結果符合要求。
[0177] 表6特異性實驗
[0179] 7.實施例7的相關性評價
[0180]用實施例7的試劑盒和商品化的抗SLA/LP抗體IgG檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法） 對240份人血清樣品同時進行檢測。其檢測結果參見附圖3，以抗SLA/LP抗體IgG檢測試劑盒 (酶聯(lián)免疫吸附法)測定的結果為橫坐標，以本發(fā)明方法的測定的結果為縱坐標作回歸分 析，相關方程為:y = 〇. 9952X+0.4455，相關系數為R2:0.9886，經統(tǒng)計學處理結果表明，本方 法同其他方法的試劑盒臨床樣本測值相關性良好。
[0181 ] 8.實施例7的穩(wěn)定性評價
[0182] 對試劑盒分別進行4°C 12個月和37°C 7天的加速穩(wěn)定性實驗，結果表明試劑盒標 準品發(fā)光強度的變化、批內和批間精密度、準確度等指標均在正常范圍之內，試劑盒有效期 可達12個月。
[0183] 顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對 本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還能 夠做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā) 明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。
【主權項】
1. 一種抗SLA/LP抗體IgG的磁微?；瘜W發(fā)光定量測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 包括： 1) 抗SLA/LP抗體IgG校準品，含抗SLA/LP抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液，所述 抗SLA/LP抗體IgG校準品為6個水平的液體校準品，所述6個水平的液體校準品中抗SLA/LP 抗體 IgG 的濃度分別為O，5，20，50，100，200RU/mL; 2) 抗SLA/LP抗體IgG質控品，含抗SLA/LP抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液，所述 抗SLA/LP抗體IgG質控品包含2個水平的液體質控品，所述2個水平的液體質控品中抗SLA/ LP抗體I gG的靶值濃度范圍分別為(20 ± 4) RU/mL和（100 ± 20) RU/mL; 3) 試劑1號，含生物素標記的SLA/LP抗原和牛血清白蛋白的Tr i s緩沖液； 4) 試劑2號，含堿性磷酸酶標記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖液； 5) 磁分離試劑，含有鏈霉親和素標記的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液； 6) 清洗液； 所述試劑盒中試劑1號，試劑2號和磁分離試劑的含量比為1:3:1，所述含量比為體積 比。2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述磁微粒的材質為Fe2O3;所述磁微粒 表面包被有羧基基團，包被物中羧基基團含量大于20wt%，所述磁微粒的大小為1-3μπι。3. -種制備如權利要求1-2任一項所述試劑盒的方法，其特征在于，該方法包括如下步 驟： (1) 配制抗SLA/LP抗體IgG校準品： a. 配制抗SLA/LP抗體I gG校準品稀釋液： 將純化水、Tris、氯化鈉和Pr〇clin300加入容器中，充分攪拌至完全溶解，Tris濃度為 lwt%，氯化鈉濃度為lwt%，Proclin300濃度為0.2v% ;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;將牛血清白蛋白加入容器中，充分攪拌至完全溶解，牛血清白蛋白的濃度為4wt % ;再 用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得抗SLA/LP抗體IgG校準 品稀釋液，2-8°C保存待用； b. 配制抗SLA/LP抗體IgG校準品： 將抗SLA/LP抗體IgG用抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為0，5，20，50， 100,200RU/mL; (2) 配制抗SLA/LP抗體IgG質控品： 將抗SLA/LP抗體IgG用上述抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為20， 100RU/mL； (3) 配制試劑1號： a. 配制試劑1號稀釋液： 將純化水、Tris、氯化鈉和ProcI in300加入容器中，充分攪拌至完全溶解，Tris的濃度 為Iwt %，氯化鈉濃度為0.5wt %，Procl in300的濃度為0.2v % ;將牛血清白蛋白加入容器 中，充分攪拌至完全溶解，牛血清白蛋白的濃度為〇 . 5wt% ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.0-7.5;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得試劑1號稀釋液，2-8°C保存待用； b. 配制試劑1號： 將SLA/LP抗原用純化水溶解，2-8 °C條件下用濃度為0.2M，pH為9.0的碳酸鹽緩沖液透 析2h，然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液，用濃度為O . 2M，pH為8.5-9的碳酸鹽緩沖液 配制濃度為〇 .5-1 .Omg/ml的生物素溶液;按照SLA/LP抗原與生物素質量比為10:1的比例在 SLA/LP抗原溶液中加入生物素溶液，混合均勻，室溫靜置12-18h，反應生成SLA/LP抗原-生 物素連接物;將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的反應液在2-8°C條件下用濃度為0.2MpH為 9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天，期間進行4次換液，從而除去未反應的生物素，得到含有SLA/ LP抗原-生物素連接物的溶液;用試劑1號稀釋液將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的溶液 稀釋到〇. I-0.3yg/mL，制得試劑1號； (4) 配制試劑2號： a. 配制試劑2號稀釋液： 將純化水、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉、牛血清白蛋白、ZnCl2和Proclin300加入容器 中，充分攪拌至完全溶解，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為0.6wt %，氯化鈉濃度為0. Swt %， 牛血清白蛋白的濃度為0.5wt %，ZnCl2的濃度為0 . lwt%。，Proclin300的濃度為0.2v%〇， MgCl2的濃度為0.1%。；用4M的HCL將溶液的pH值調為7.5-8.0;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得 試劑2號稀釋液，2-8°C保存待用； b. 配制試劑2號： 將Img羊抗人多克隆抗體加入到2-4yL濃度為10mg/mL的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液中， 室溫靜置20min，再加入0. lm〇L/L的甘氨酸溶液IOyL，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除鹽，收 集活化后的羊抗人多克隆抗體，2-8°C保存?zhèn)溆?將1.5mg的堿性磷酸酶加入到10-20yL的濃 度為5mg/mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中，室溫靜置 30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后的堿性磷酸酶，2-8°C保存?zhèn)溆?將活化的羊抗人多 克隆抗體與活化的堿性磷酸酶混合，2-8°C條件下靜置12-24h，用SupperdeUOO凝膠純化柱 純化偶聯(lián)物，獲得羊抗人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液，2-8 °C保存?zhèn)溆?將羊抗人 多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液用試劑2號稀釋液稀釋到0.02-0. lyg/mL，制得試劑2 號； (5) 配制磁分離試劑： a. 配制磁微粒緩沖液： 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中，充分攪拌至完全溶解，Tris的濃度為lwt%，氯化 鈉的濃度為〇. 8wt % ;再將牛血清白蛋白、新生牛血清和Proclin300加入容器中，充分攪拌 至完全溶解，牛血清白蛋白的濃度為0.5wt %，新生牛血清濃度為5v%，Procl in300濃度為 0.2v%。；用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得磁微粒緩沖 液，2-8 °C保存待用磁； b. 配制磁分離試劑： 取IOOmg磁微粒，使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L，pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液1〇11^，充分混勻;再加入〇.5-11^新配 制的濃度均為10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺水溶 液，室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系；使用2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液配制濃度為5mg/ mL的鏈霉親和素溶液，然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8-1.6mL的鏈霉親和 素，4°C條件下混懸16-20h;再使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向磁微粒中加入IOmL 濃度為1M，pH為8.5的乙醇胺溶液，室溫反應1-2h，再使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上 清，向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL，制得磁分離試劑； (6)配制清洗液： 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中，充分攪拌至完全溶解，Tris的濃度為lwt%，氯化 鈉的濃度為〇 · 8wt% ;再將Tween-20和TritonlOO加入容器中，充分攪拌至完全混勻，Tween-20的濃度為0.5wt % ,TritonlOO的濃度為0.5wt % ;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.5-8.0， 用孔徑為〇. 2μπι的濾器過濾得清洗液，2-8°C保存。4. 如權利要求1所述的試劑盒的檢測方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： 1) 將抗SLA/LP抗體IgG校準品放到全自動化學發(fā)光免疫分析儀測試位置，得到由全自 動化學發(fā)光免疫分析儀輸出的擬合曲線； 2) 將抗SLA/LP抗體IgG質控品放到上述分析儀測試位置，得到由全自動化學發(fā)光免疫 分析儀輸出的所述質控品的測試發(fā)光值和通過步驟1得到的擬合曲線擬合得到抗SLA/LP抗 體IgG質控品的濃度值； 3) 將待測樣本放到上述分析儀測試位置，由所述分析儀自動按1:20將樣本稀釋，得到 由全自動化學發(fā)光免疫分析儀輸出的待測樣本的濃度值。5. 根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于:該方法具體包括如下步驟： 1) 加20yL抗SLA/LP抗體IgG校準品或質控品或1:20稀釋后的待測標本至檢測管中； 2) 加50yL的試劑1號至步驟1)所述檢測管中，混勻后，37 ±0.5°C溫IOmin; 3) 加50yL的磁分離試劑至步驟2)所述檢測管中，混勻后，37±0.5°C溫育5min，進行磁 分離，去上清； 4) 加300yL的清洗液至步驟3)檢測管中，混勻，進行磁分離，去上清； 5) 重復步驟4)兩遍； 6) 加15 0 μ L試劑2號至步驟5)檢測管中，混勻后，3 7 ± 0.5 °C溫育10 m i η，進行磁分離，去 上清； 7) 加300yL的清洗液至步驟6)檢測管中，混勻，進行磁分離，去上清； 8) 重復步驟7)兩遍； 9) 加200yL的化學發(fā)光底物至步驟8)檢測管中，混勻，檢測發(fā)光強度； 所述步驟1)、步驟2)和步驟3)均包括全自動化學發(fā)光免疫分析儀的全自動檢測步驟。
【文檔編號】G01N33/576GK105929165SQ201610249001
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】北京中航賽維生物科技有限公司