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一種抗SLA/LP抗體IgG的磁微粒化學發(fā)光定量測定試劑盒及制備和檢測方法

文檔序號:10568771閱讀:907來源:國知局
一種抗SLA/LP抗體IgG的磁微?;瘜W發(fā)光定量測定試劑盒及制備和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種抗SLA/LP抗體IgG的磁微粒化學發(fā)光定量測定試劑盒,該試劑盒包括:抗SLA/LP抗體IgG校準品;抗SLA/LP抗體IgG質控品;含生物素標記的SLA/LP抗原和牛血清白蛋白的Tris緩沖液;含堿性磷酸酶標記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖液;含有鏈霉親和素標記的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液;清洗液。該試劑盒的檢測方法在傳統(tǒng)的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法的基礎上,將靈敏度和線性范圍再提高3?5個數量級、實現(xiàn)真正意義的定量檢測,反應迅速,結果可靠,并能夠配合全自動化學發(fā)光免疫分析儀實現(xiàn)全自動使用,對于臨床診斷具有無可替代的重要價值。
【專利說明】
一種抗SLA/LP抗體I gG的磁微?;瘜W發(fā)光定量測定試劑盒及 制備和檢測方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物檢測技術領域。更具體地,涉及一種抗SLA/LP抗體IgG的磁微?;?學發(fā)光定量測定試劑盒及制備和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一類以自身免疫反應為基礎,以 多種自身抗體、高免疫球蛋白血癥、循環(huán)自身抗體和組織學上有界面性肝炎及匯管區(qū)漿細 胞浸潤為特征的慢性肝臟炎性疾病。
[0003] AIH根據血清免疫學檢查可分為I型(ANA、SMA)、n型(抗LKM-1抗體、抗LC-1抗體、) 和m型(抗SLA/LP抗體),抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)抗體是自身免疫性肝炎(AIH) 最特異的診斷標示。雖然它的陽性率只有10%~30%,但其陽性預告值幾乎為100%,如果 出現(xiàn)相應的臨床癥狀基本上能夠診斷為AIH,因此,抗SLA/LP抗體IgG檢測對自身免疫肝炎 的診斷具有重要參考價值。
[0004] 目前臨床上抗SLA/LP抗體IgG的檢測有膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法。膜條免疫 法應用的是膜條顯色技術,其特點為固定幾個項目在同一膜條測定,一般通過手工或者半 自動膜條儀進行實驗操作,最終通過肉眼進行定性判定,該技術靈敏度低,反應時間長,檢 測項目只能固定搭配組合,靈活性差。酶聯(lián)免疫吸附法的靈敏度在膜條免疫法基礎上有所 提升,但仍然較低,并且線性范圍窄,重復性差,反應時間也較長,仍然不能很好滿足臨床的 應用。
[0005] 磁微?;瘜W發(fā)光免疫分析法,較以前的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法,在檢測靈 敏度、檢測范圍、檢測時間及自動化操作上有了大大提高,且沒有污染,臨床應用廣。目前, 使用磁微?;瘜W發(fā)光分析法在抗SLA/LP抗體IgG免疫分析產品的應用仍未見。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種抗SLA/LP抗體IgG的磁微?;瘜W發(fā)光定量測定試 劑盒,本發(fā)明提供的試劑盒將化學發(fā)光分析技術與磁性微粒分離技術相結合,采用生物素 和堿性磷酸酶(ALP)分別標記抗原和抗體,以直徑l-3wii的包被鏈霉親和素的超順磁性微粒 作為分離試劑。ALP催化底物發(fā)光后,通過儀器測量發(fā)光強度計算出待測物濃度。該檢測方 法在傳統(tǒng)的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法的基礎上,將靈敏度和線性范圍再提高3-5個數 量級、實現(xiàn)真正意義的定量檢測,反應迅速,結果可靠,并能夠配合全自動化學發(fā)光免疫分 析儀實現(xiàn)全自動使用,對于臨床診斷具有無可替代的重要價值。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種上述試劑盒的制備方法及檢測方法。
[0008] 為達到上述目的,本發(fā)明采用下述技術方案:
[0009] -種抗SLA/LP抗體IgG的磁微粒化學發(fā)光定量測定試劑盒,所述試劑盒包括:
[001 0] 1)抗SLA/LP抗體IgG校準品,含抗SLA/LP抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液, 所述抗SLA/LP抗體IgG校準品為6個水平的液體校準品,所述6個水平的液體校準品中抗 SLA/LP 抗體 IgG 的濃度分別為0,5,20,50,100,200RU/mL;
[0011] 2)抗SLA/LP抗體IgG質控品,含抗SLA/LP抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液, 所述抗SLA/LP抗體IgG質控品包含2個水平的液體質控品,所述2個水平的液體質控品中抗 SLA/LP抗體I gG的靶值濃度范圍分別為(20 ± 4) RU/mL和(100 ± 20) RU/mL;
[0012] 3)試劑1號,含生物素標記的SLA/LP抗原和牛血清白蛋白的Tris緩沖液;
[0013] 4)試劑2號,含堿性磷酸酶標記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖 液;
[0014] 5)磁分離試劑,含有鏈霉親和素標記的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液;
[0015] 6)清洗液;
[0016] 所述試劑盒中試劑1號,試劑2號和磁分離試劑的含量比為1:3:1,所述含量比為體 積比。
[0017]進一步的,所述磁微粒的材質為Fe2〇3;所述磁微粒表面包被有羧基基團,包被物中 羧基基團含量大于20wt%,所述磁微粒的大小為1-3M1。
[0018] -種制備所述抗SLA/LP抗體IgG的磁微粒化學發(fā)光定量測定試劑盒的方法,該方 法包括如下步驟:
[0019] (1)配制抗SLA/LP抗體IgG校準品:
[0020] a.配制抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液:
[0021] 將純化水、TriS、氯化鈉和Procl in300加入容器中,充分攪拌至完全溶解,TriS濃 度為lwt%,氯化鈉濃度為lwt%,Proclin300濃度為0.2v% ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.0- 7.5 ;將牛血清白蛋白加入容器中,充分攪拌至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為 4wt % ;再用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;用孔徑為0.2wii的濾器過濾得抗SLA/LP抗 體IgG校準品稀釋液,2-8°C保存待用;
[0022] b ?配制抗SLA/LP抗體IgG校準品:
[0023] 將抗SLA/LP抗體IgG用抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為0,5,20, 50,100,200RU/mL;
[0024] (2)配制抗SLA/LP抗體IgG質控品:
[0025] 將抗SLA/LP抗體IgG用上述抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為20, 100RU/mL;
[0026] (3)配制試劑1號:
[0027] a.配制試劑1號稀釋液:
[0028] 將純化水、Tris、氯化鈉和Proclin300加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的 濃度為lwt %,氯化鈉濃度為0.5wt %,Proclin300的濃度為0.2v% ;將牛血清白蛋白加入容 器中,充分攪拌至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為〇. 5wt % ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.0- 7.5;用孔徑為0.2mi的濾器過濾得試劑1號稀釋液,2-8°C保存待用;
[0029] b.配制試劑1號:
[0030] 將SLA/LP抗原用純化水溶解,2-8°C條件下用濃度為0.2M,pH為9.0的碳酸鹽緩沖 液透析2h,然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液,用濃度為0.2M,pH為8.5-9的碳酸鹽緩 沖液配制濃度為0.5-1. Omg/ml的生物素溶液;按照SLA/LP抗原與生物素質量比為10:1的比 例在SLA/LP抗原溶液中加入生物素溶液,混合均勻,室溫靜置12-18h,反應生成SLA/LP抗 原-生物素連接物;將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的反應液在2-8°C條件下用濃度為 0.2M,pH為9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天,期間進行4次換液,從而除去未反應的生物素,得到 含有SLA/LP抗原-生物素連接物的溶液;用試劑1號稀釋液將含有SLA/LP抗原-生物素連接 物的溶液稀釋到〇. 1-0.3iig/mL,制得試劑1號;
[0031]本步驟配制的試劑1號可降低實驗成本,而且能有效分離游離生物素和連接物,得 到的連接物較純,減少了非特異反應;
[0032] (4)配制試劑2號:
[0033] a.配制試劑2號稀釋液:
[0034] 將純化水、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉、牛血清白蛋白、ZnCl2和Proclin300加入 容器中,充分攪拌至完全溶解,4 -羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為0.6 w t %,氯化鈉濃度為 0 ? 8wt %,牛血清白蛋白的濃度為0 ? 5wt%,ZnCl2的濃度為0 ? lwt%。,Proclin300的濃度為 0 ? 2v%。,MgCl2的濃度為0 ? 1%。;用4M的HCL將溶液的pH值調為7 ? 5-8 ? 0;用孔徑為0 ? 2_的濾 器過濾得試劑2號稀釋液,2-8°C保存待用;
[0035] b ?配制試劑2號:
[0036]將lmg羊抗人多克隆抗體加入到2-4yL濃度為10mg/mL的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液 中,室溫靜置20min,再加入0 . lm〇L/L的甘氨酸溶液10此,室溫靜置5min,用G-25凝膠柱除 鹽,收集活化后的羊抗人多克隆抗體,2-8°C保存?zhèn)溆?將1.5mg的堿性磷酸酶加入到10-20y L的濃度為5mg/mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中,室溫靜 置30min,用G-25凝膠柱除鹽,收集活化后的堿性磷酸酶,2-8°C保存?zhèn)溆?將活化的羊抗人 多克隆抗體與活化的堿性磷酸酶混合,2-8°C條件下靜置12-24h,用S UpperdeX200凝膠純化 柱純化偶聯(lián)物,獲得羊抗人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液,2-8 °C保存?zhèn)溆?將羊抗 人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液用試劑2號稀釋液稀釋到0.02-0. lyg/mL,制得試 劑2號;
[0037] (5)配制磁分離試劑:
[0038] a.配制磁微粒緩沖液:
[0039] 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的濃度為lwt%, 氯化鈉的濃度為〇.8wt% ;再將牛血清白蛋白、新生牛血清和Proclin300加入容器中,充分 攪拌至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為〇.5wt%,新生牛血清濃度為5v%,Pr 〇clin300濃 度為0.2v%。;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用孔徑為0.2mi的濾器過濾得磁微粒緩 沖液,2-8 °C保存待用;
[0040] b.配制磁分離試劑:
[0041 ]取100mg磁微粒,使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L,pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液1〇11^,充分混勻;再加入〇.5-11^新配 制的濃度均為10mg/mL的1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺水溶 液,室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系;使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液配制濃度為5mg/ mL的鏈霉親和素溶液,然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8-1.6mL的鏈霉親和 素,4°C條件下混懸16-20h;再使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向磁微粒中加入10mL 濃度為1M,pH為8.5的乙醇胺溶液,室溫反應1-2h,再使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上 清,向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL,制得磁分離試劑;
[0042] 本步驟中,加入N-羥基琥珀酰亞胺能夠對偶聯(lián)劑1_(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳 二亞胺起到穩(wěn)定作用;加入鏈霉親和素后在4度條件下混懸,能夠更好的保留蛋白質活性, 同時減少室溫變化對偶聯(lián)效果的影響,使批次之間偶聯(lián)結果更加穩(wěn)定;加入乙醇胺,可使乙 醇胺分子中的氨基與磁珠活化后未結合蛋白的活性位點反應,起到終止反應和封閉作用, 能夠產生更低的本底值;
[0043] (6)配制清洗液:
[0044] 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的濃度為lwt%, 氯化鈉的濃度為〇.8wt%;再將Tween-20和TritonlOO加入容器中,充分攪拌至完全混勻, Tween-20的濃度為0 ? 5wt %,Triton100 的濃度為0 ? 5wt % ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.5-8.0,用孔徑為0.2mi的濾器過濾得清洗液,2-8 °C保存。
[0045] 抗SLA/LP抗體IgG的磁微?;瘜W發(fā)光定量測定試劑盒的檢測方法,該方法包括如 下步驟:
[0046] 1)將抗SLA/LP抗體IgG校準品放到全自動化學發(fā)光免疫分析儀測試位置,得到由 全自動化學發(fā)光免疫分析儀輸出的擬合曲線;
[0047] 2)將抗SLA/LP抗體IgG質控品放到上述分析儀測試位置,得到由全自動化學發(fā)光 免疫分析儀輸出的所述質控品的測試發(fā)光值和通過步驟1得到的擬合曲線擬合得到抗SLA/ LP抗體IgG質控品的濃度值;
[0048] 3)將待測樣本放到上述分析儀測試位置,由所述分析儀自動按1:20將樣本稀釋, 得到由全自動化學發(fā)光免疫分析儀輸出的待測樣本的濃度值。
[0049] 進一步的,該檢測方法具體包括如下步驟:
[0050] 1)加20此抗SLA/LP抗體IgG校準品或質控品或1:20稀釋后的待測標本至檢測管 中;
[0051 ] 2)加50yL的試劑1號至步驟1)所述檢測管中,混勻后,37 ±0.5°C溫1 Omin;
[0052] 3)加50此的磁分離試劑至步驟2)所述檢測管中,混勻后,37±0.5°C溫育5min,進 行磁分離,去上清;
[0053] 4)加300yL的清洗液至步驟3)檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清;
[0054] 5)重復步驟4)兩遍;
[0055] 6)加150此試劑2號至步驟5)檢測管中,混勻后,37 ± 0.5°C溫育lOmin,進行磁分 離,去上清;
[0056] 7)加300yL的清洗液至步驟6)檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清;
[0057] 8)重復步驟7)兩遍;
[0058] 9)加200iiL的化學發(fā)光底物至步驟8)檢測管中,混勻,檢測發(fā)光強度;
[0059] 所述步驟1)、步驟2)和步驟3)均包括全自動化學發(fā)光免疫分析儀的全自動檢測步 驟。
[0060] 本發(fā)明的有益效果如下:
[0061] 本發(fā)明公開了一種測定抗SLA/LP抗體IgG的新技術,使得反應過程更加快速可靠, 提高了靈敏度和線性范圍,實現(xiàn)真正意義的定量測定,并可搭配全自動化學發(fā)光免疫分析 儀實現(xiàn)全自動的使用,大大提高工作效率;試劑盒中的校準品、生物素標記試劑、酶標記試 劑、磁分離試劑和清洗液等均是該反應體系下的最優(yōu)配方,給該試劑盒的使用效期及檢測 性能提供了有力保障。
【附圖說明】
[0062] 圖la為實施例7空白限評價中零濃度校準品與相鄰校準品之間的濃度值與發(fā)光值 結果進行兩點回歸擬合得出的一次方程;
[0063] 圖lb為對比例1空白限評價中零濃度校準品與相鄰校準品之間的濃度值與發(fā)光值 結果進行兩點回歸擬合得出的一次方程;
[0064] 圖2為實施例7線性范圍評價中樣本濃度平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直 線擬合方程;
[0065] 圖3為實施例7同已有的商品化的試劑盒臨床樣本測值相關性散點圖。
【具體實施方式】
[0066] 為了更清楚地說明本發(fā)明,下面結合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說 明。
[0067] 實施例1
[0068]抗SLA/LP抗體IgG校準品的制備:
[0069] a.配制抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液:
[0070] 將800ml的純化水、11.2g的Tris、8.6g氯化鈉和2ml Proclin300加入容器中,充分 攪拌至完全溶解;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;將40g牛血清白蛋白加入容器中, 充分攪拌至完全溶解;再用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至1L, 用0.2mi濾器過濾得抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液,2-8 °C保存待用;
[0071 ] b ?配制抗SLA/LP抗體IgG校準品:
[0072] 將抗SLA/LP抗體IgG用抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為0,5,20, 50,100,200RU/mL。
[0073] 實施例2
[0074]抗SLA/LP抗體IgG質控品的制備:
[0075] 將抗SLA/LP抗體IgG用上述抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為20, 100RU/mL〇
[0076] 實施例3
[0077]試劑1號的制備:
[0078] a.配制試劑1號稀釋液:
[0079] 將800ml純化水、12.1g的Tris、5.8g氯化鈉和2ml Proclin300加入容器中,充分攪 拌至完全溶解;將5g牛血清白蛋白加入容器中,充分攪拌至完全溶解;用4M的HCL將溶液的 pH值調為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至1L,用0.2mi濾器過濾得試劑1號稀釋液,2-8°C保 存待用;
[0080] b.配制試劑1號:
[0081 ] 將SLA/LP抗原用純化水溶解,2-8°C條件下用濃度為0.2M,pH為9.0的碳酸鹽緩沖 液透析2h,然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液,用濃度為0.2M,pH為8.5-9的碳酸鹽緩 沖液配制濃度為0.5-1. Omg/ml的生物素溶液;按照SLA/LP抗原與生物素質量比為10:1的比 例在SLA/LP抗原溶液中加入生物素溶液,混合均勻,室溫靜置12-18h,反應生成SLA/LP抗 原-生物素連接物;將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的反應液在2-8°C條件下用濃度為 0.2M,pH為9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天,期間進行4次換液,從而除去未反應的生物素,得到 含有SLA/LP抗原-生物素連接物的溶液;用試劑1號稀釋液將含有SLA/LP抗原-生物素連接 物的溶液稀釋到〇. 1-0.3iig/mL,制得試劑1號;
[0082] 本步驟配制的試劑1號可降低實驗成本,而且能有效分離游離生物素和連接物,得 到的連接物較純,減少了非特異反應。
[0083] 實施例4 [0084]試劑2號的制備:
[0085] a.配制試劑2號稀釋液:
[0086] 將800ml純化水、6.06g的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、8.5g氯化鈉、5g牛血清白蛋白、 0.1gZnCl2、0.2ml Proclin300和O.lg MgCl2加入容器中,充分攪拌至完全溶解;用4M的HCL 將溶液的pH值調為7.5-8.0;用純化水將溶液定容至1L,用0.2mi濾器過濾得試劑2號稀釋 液,2-8 °C保存待用;
[0087] b.配制試劑2號:
[0088]將lmg羊抗人多克隆抗體加入到2-4yL濃度為10mg/mL的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液 中,室溫靜置20min,再加入0 . lm〇L/L的甘氨酸溶液10此,室溫靜置5min,用G-25凝膠柱除 鹽,收集活化后的羊抗人多克隆抗體,2-8°C保存?zhèn)溆?將1.5mg的堿性磷酸酶加入到10-20y L的濃度為5mg/mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中,室溫靜 置30min,用G-25凝膠柱除鹽,收集活化后的堿性磷酸酶,2-8°C保存?zhèn)溆?將活化的羊抗人 多克隆抗體與活化的堿性磷酸酶混合,2-8°C條件下靜置12-24h,用S UpperdeX200凝膠純化 柱純化偶聯(lián)物,獲得羊抗人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液,2-8 °C保存?zhèn)溆?將羊抗 人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液用試劑2號稀釋液稀釋到0.02-0. lyg/mL,制得試 劑2號。
[0089] 實施例5
[0090]磁分離試劑的制備:
[0091] a.配制磁微粒緩沖液:
[0092] 將800mL純化水、12.1g Tris和8.5g氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解;再 將5g牛血清白蛋白、50mL新生牛血清和0.2mL Proclin300加入容器中,充分攪拌至完全溶 解;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用純化水將溶液定容至1L,用0.2圓濾器過濾得 磁微粒緩沖液,2-8 °C保存待用;
[0093] b.配制磁分離試劑:
[0094]取100mg磁微粒,使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L,pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液1〇11^,充分混勻;再加入〇.5-11^新配 制的濃度均為10mg/mL的1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺水溶 液,室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系;使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液配制濃度為5mg/ mL的鏈霉親和素溶液,然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8-1.6mL的鏈霉親和 素,4°C條件下混懸16-20h;再使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向磁微粒中加入10mL 濃度為1M,pH為8.5的乙醇胺溶液,室溫反應1-2h,再使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上 清,向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL,制得磁分離試劑;
[0095] 本步驟中,加入N-羥基琥珀酰亞胺能夠對偶聯(lián)劑1_(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳 二亞胺起到穩(wěn)定作用;加入鏈霉親和素后在4度條件下混懸,能夠更好的保留蛋白質活性, 同時減少室溫變化對偶聯(lián)效果的影響,使批次之間偶聯(lián)結果更加穩(wěn)定;加入乙醇胺,可使乙 醇胺分子中的氨基與磁珠活化后未結合蛋白的活性位點反應,起到終止反應和封閉作用, 能夠產生更低的本底值。
[0096] 實施例6 [0097]清洗液的制備:
[0098] 將800mL純化水、12.1g Tris和8.5g氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解;再 將5g Tween-20和5g TritonlOO加入容器中,充分攪拌至完全混勻;用4M的HCL將溶液的pH 值調為7.5-8.0用純化水將溶液定容至1L,用0.2mi濾器過濾得清洗液,2-8°C保存。
[0099] 實施例7
[0100]抗SLA/LP抗體IgG的磁微粒化學發(fā)光定量測定試劑盒:
[0101] 該試劑盒包括:
[0102] 按照實施例1方法制備的抗SLA/LP抗體IgG校準品,每個水平的校準品用量為 0.5ml;
[0103]按照實施例2方法制備的抗SLA/LP抗體IgG質控品,質控品用量為lml;
[0104]按照實施例3方法制備的試劑1號,試劑1號的用量為5ml;
[0105]按照實施例4方法制備的試劑2號,試劑2號的用量為15ml;
[0106] 按照實施例5方法制備的磁分離試劑,磁分離試劑的用量為5ml;
[0107] 按照實施例6方法制備的清洗液,清洗液用量為1L。
[0108] 實施例8
[0109] 采用實施例7的試劑盒對抗SLA/LP抗體IgG進行定量檢測:
[0110] 該檢測方法包括:
[0111] 1)加20此抗SLA/LP抗體IgG校準品或質控品或1:20稀釋后的待測標本至檢測管 中;
[0112] 2)加50yL的試劑1號至步驟1)所述檢測管中,混勻后,37 ±0.5°C溫1 Omin;
[0113] 3)加50此的磁分離試劑至步驟2)所述檢測管中,混勻后,37±0.5°C溫育5min,進 行磁分離,去上清;
[0114] 4)加300iiL的清洗液至步驟3)檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清;
[0115] 5)重復步驟4)兩遍;
[0116] 6)加150此試劑2號至步驟5)檢測管中,混勻后,37 ± 0.5°C溫育lOmin,進行磁分 離,去上清;
[0117] 7)加300yL的清洗液至步驟6)檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清;
[0118] 8)重復步驟7)兩遍;
[0119] 9)加200iiL的化學發(fā)光底物至步驟8)檢測管中,混勻,檢測發(fā)光強度;
[0120] 所述步驟1)、步驟2)和步驟3)均包括全自動化學發(fā)光免疫分析儀的全自動檢測步 驟。
[0121] 對比例1
[0122] 與實施例7制備的試劑盒不同的是試劑盒中的試劑1號和磁分離試劑,其余成分相 同。
[0123] 試劑1號的制備如下:
[0124] a.配制試劑1號稀釋液:
[0125] 將800ml純化水、12.1g的Tris、5.8g氯化鈉和2ml Proclin300加入容器中,充分攪 拌至完全溶解;將5g牛血清白蛋白加入容器中,充分攪拌至完全溶解;用4M的HCL將溶液的 pH值調為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至1L,用0.2mi濾器過濾得試劑1號稀釋液,2-8°C保 存待用;
[0126] b.配制試劑1號:
[0127] 用濃度0.2M,pH為9的碳酸鹽緩沖液配制0.5mg/ml的生物素溶液;按照SLA/LP抗原 與生物素質量比為10:1的比例在SLA/LP抗原溶液中加入生物素溶液,混合均勻,室溫靜置 18h,反應生成SLA/LP抗原-生物素連接物;將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的反應液通過 G-25凝膠柱進行分離,除去未反應的生物素,得到含有SLA/LP抗原-生物素連接物的溶液; 用試劑1號稀釋液將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的溶液稀釋到0.1-0.3iig/mL,制得試劑 1號;
[0128] 磁分離試劑的制備如下:
[0129] a.配制磁微粒緩沖液:
[0130] 將800mL純化水、12.1g Tris和8.5g氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解;再 將5g牛血清白蛋白、50mL新生牛血清和0.2mL Proclin300加入容器中,充分攪拌至完全溶 解;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用純化水將溶液定容至1L,用0.2圓濾器過濾得 磁微粒緩沖液,2-8 °C保存待用;
[0131] b.配制磁分離試劑:
[0132] 取100mg磁微粒,磁分離去上清,用濃度為0.025mol/L,pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉) 乙磺酸緩沖液10mL重懸;加入0.5-lmL新配制的濃度為10mg/mL的EDC水溶液,室溫混懸30-60min;使磁珠充分活化,磁分離,去上清,用濃度為0.025mol/L,pH為4.5-5 2-(N-嗎啡啉) 乙磺酸緩沖液10mL重懸;加入4-8mg的鏈霉親和素,室溫混懸16-20h;再進行磁分離,去上 清,用磁微粒緩沖液稀釋重懸到0.5mg/mL,制得磁分離試劑。
[0133] 實施例9
[0134] 對實施例7和對比例1的試劑盒進行性能評價:
[0135] 1.實施例7的準確度評價
[0136] 將濃度約為200RU/mL(允許其濃度偏差為±20%)的抗51^/1^抗體46樣品4加入 到血清或其他相應基質的樣品B中,所加入A的體積不超過總體積(A+B)的10%,根據公式 (1)計算回收率R,本方法的回收率在85-115%范圍內,數據參見表1,評價結果符合要求。
[0138] R:回收率;
[0139] V:加入標準溶液的體積;
[0140] Vo:人源樣品的體積;
[0141 ] C:人源樣品加入標準溶液后的檢測濃度;
[0142] Co:人源樣品的檢測濃度;
[0143] Cs:標準溶液的濃度。
[0144] 表1準確度評價
[0146] 2.實施例7和對比例1的空白限評價
[0147] 用零濃度校準品作為樣本進行檢測,重復測定20次,得出20次測量結果的RLU值 (相對發(fā)光值),計算其平均值(M)和標準差(SD),得出M+2SD所對應的RLU值,根據零濃度校 準品與相鄰校準品之間的濃度-RLU值結果進行兩點回歸擬合得出一次方程,將M+2SD所對 應的RLU值帶入上述方程中,求出對應的濃度值,即為空白限。本方法的空白限不大于1RU/ mL,數據參見表2,A、B點連點擬合曲線及擬合方程見圖la,對比例1制備的試劑盒測得的空 白限數據見表2_1,A、B點連點擬合曲線及擬合方程見圖lb,由數據可見,實施例7與對比例1 相比,得到的本底值更低,從而得到的空白限更低,代表試劑盒的靈敏度更好。
[0148] 表2空白限評價
[0151]表2-1空白限評價
[0153] 3.實施例7的線性范圍評價
[0154] 將接近線性范圍上限(200RU/mL)的高值樣本按一定比例稀釋為至少5種濃度,其 中低值濃度的樣本須接近線性范圍的下限。按試劑盒說明書進行操作,對每一濃度的樣本 均重復檢測2次,計算其平均值,將結果平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直線擬合,并 計算線性相關系數r,本方法的測量范圍為[2,200]RU/mL,相關系數r應多0.9900。數據參見 表3,擬合曲線及相關系數見圖2,評價結果符合要求。
[0155] 表3線性范圍評價
[0158] 4.實施例7和對比例1的重復性評價
[0159] 取實施例7中的試劑盒重復檢測濃度為(20±4)RU/mL和(100±20)RU/mL的樣本各 10次,計算10次測量結果的平均值M和標準差SD,根據公式CV = SD/MX 100%得出變異系數 CV,本方法變異系數(CV)不大于8%,數據參見表4,對比例1制備的試劑盒測得的重復性數 據見表4-1,由數據可見,實施例7與對比例1相比,得到的CV值更低,代表試劑盒的重復性更 好,
[0160] CV = SD/MX100%......................................(2)
[0161] 式中:CV-變異系數;SD-10次測量結果的標準差;M-10次測量結果的平均值。
[0162] 表4重復性評價
[0164] 表4-1重復性評價
[0165]
[0166] 5.實施例7和對比例1的批間差評價
[0167] 將實施例7的試劑盒取三批,每批試劑盒均測定濃度在(20 ± 4) RU/mL和(100 ± 20) RU/mL范圍內的樣本,每批重復測定10次,計算30次測定結果的平均值(M)和標準差(SD),根 據公式(3)計算變異系數(CV),本方法變異系數(CV)不大于15%,數據參見表5,對比例1制 備的試劑盒測得的批間差數據見表5-1,由數據可見,實施例7與對比例1相比,得到的CV值 更低,代表試劑盒的批間差更好,
[0168] CV = SD/MX100%......................................(3)
[0169] 式中:CV-變異系數;SD-30次測定結果的標準差;M-30次測定結果的平均值。
[0170] 表5批間差評價
[0173] 表5-1批間差評價
[0174]
[0175] 6.實施例7的特異性評價
[0176] 取1份Anti-SLA/LP IgG含量為0的樣本,加入抗LKM-1抗體IgG濃度為200RU/mL,使 用該試劑盒對該樣本進行檢測,測定樣本中的Anti-SLA/LP IgG含量,結果見表6,本方法與 抗LKM-1抗體IgG均無交叉反應,數據參見表6,評價結果符合要求。
[0177] 表6特異性實驗
[0179] 7.實施例7的相關性評價
[0180]用實施例7的試劑盒和商品化的抗SLA/LP抗體IgG檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法) 對240份人血清樣品同時進行檢測。其檢測結果參見附圖3,以抗SLA/LP抗體IgG檢測試劑盒 (酶聯(lián)免疫吸附法)測定的結果為橫坐標,以本發(fā)明方法的測定的結果為縱坐標作回歸分 析,相關方程為:y = 〇. 9952X+0.4455,相關系數為R2:0.9886,經統(tǒng)計學處理結果表明,本方 法同其他方法的試劑盒臨床樣本測值相關性良好。
[0181 ] 8.實施例7的穩(wěn)定性評價
[0182] 對試劑盒分別進行4°C 12個月和37°C 7天的加速穩(wěn)定性實驗,結果表明試劑盒標 準品發(fā)光強度的變化、批內和批間精密度、準確度等指標均在正常范圍之內,試劑盒有效期 可達12個月。
[0183] 顯然,本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例,而并非是對 本發(fā)明的實施方式的限定,對于所屬領域的普通技術人員來說,在上述說明的基礎上還能 夠做出其它不同形式的變化或變動,這里無法對所有的實施方式予以窮舉,凡是屬于本發(fā) 明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。
【主權項】
1. 一種抗SLA/LP抗體IgG的磁微?;瘜W發(fā)光定量測定試劑盒,其特征在于,所述試劑盒 包括: 1) 抗SLA/LP抗體IgG校準品,含抗SLA/LP抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液,所述 抗SLA/LP抗體IgG校準品為6個水平的液體校準品,所述6個水平的液體校準品中抗SLA/LP 抗體 IgG 的濃度分別為O,5,20,50,100,200RU/mL; 2) 抗SLA/LP抗體IgG質控品,含抗SLA/LP抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液,所述 抗SLA/LP抗體IgG質控品包含2個水平的液體質控品,所述2個水平的液體質控品中抗SLA/ LP抗體I gG的靶值濃度范圍分別為(20 ± 4) RU/mL和(100 ± 20) RU/mL; 3) 試劑1號,含生物素標記的SLA/LP抗原和牛血清白蛋白的Tr i s緩沖液; 4) 試劑2號,含堿性磷酸酶標記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖液; 5) 磁分離試劑,含有鏈霉親和素標記的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液; 6) 清洗液; 所述試劑盒中試劑1號,試劑2號和磁分離試劑的含量比為1:3:1,所述含量比為體積 比。2. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于:所述磁微粒的材質為Fe2O3;所述磁微粒 表面包被有羧基基團,包被物中羧基基團含量大于20wt%,所述磁微粒的大小為1-3μπι。3. -種制備如權利要求1-2任一項所述試劑盒的方法,其特征在于,該方法包括如下步 驟: (1) 配制抗SLA/LP抗體IgG校準品: a. 配制抗SLA/LP抗體I gG校準品稀釋液: 將純化水、Tris、氯化鈉和Pr〇clin300加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris濃度為 lwt%,氯化鈉濃度為lwt%,Proclin300濃度為0.2v% ;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;將牛血清白蛋白加入容器中,充分攪拌至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為4wt % ;再 用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得抗SLA/LP抗體IgG校準 品稀釋液,2-8°C保存待用; b. 配制抗SLA/LP抗體IgG校準品: 將抗SLA/LP抗體IgG用抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為0,5,20,50, 100,200RU/mL; (2) 配制抗SLA/LP抗體IgG質控品: 將抗SLA/LP抗體IgG用上述抗SLA/LP抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為20, 100RU/mL; (3) 配制試劑1號: a. 配制試劑1號稀釋液: 將純化水、Tris、氯化鈉和ProcI in300加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的濃度 為Iwt %,氯化鈉濃度為0.5wt %,Procl in300的濃度為0.2v % ;將牛血清白蛋白加入容器 中,充分攪拌至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為〇 . 5wt% ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.0-7.5;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得試劑1號稀釋液,2-8°C保存待用; b. 配制試劑1號: 將SLA/LP抗原用純化水溶解,2-8 °C條件下用濃度為0.2M,pH為9.0的碳酸鹽緩沖液透 析2h,然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液,用濃度為O . 2M,pH為8.5-9的碳酸鹽緩沖液 配制濃度為〇 .5-1 .Omg/ml的生物素溶液;按照SLA/LP抗原與生物素質量比為10:1的比例在 SLA/LP抗原溶液中加入生物素溶液,混合均勻,室溫靜置12-18h,反應生成SLA/LP抗原-生 物素連接物;將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的反應液在2-8°C條件下用濃度為0.2MpH為 9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天,期間進行4次換液,從而除去未反應的生物素,得到含有SLA/ LP抗原-生物素連接物的溶液;用試劑1號稀釋液將含有SLA/LP抗原-生物素連接物的溶液 稀釋到〇. I-0.3yg/mL,制得試劑1號; (4) 配制試劑2號: a. 配制試劑2號稀釋液: 將純化水、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉、牛血清白蛋白、ZnCl2和Proclin300加入容器 中,充分攪拌至完全溶解,4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為0.6wt %,氯化鈉濃度為0. Swt %, 牛血清白蛋白的濃度為0.5wt %,ZnCl2的濃度為0 . lwt%。,Proclin300的濃度為0.2v%〇, MgCl2的濃度為0.1%。;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.5-8.0;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得 試劑2號稀釋液,2-8°C保存待用; b. 配制試劑2號: 將Img羊抗人多克隆抗體加入到2-4yL濃度為10mg/mL的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液中, 室溫靜置20min,再加入0. lm〇L/L的甘氨酸溶液IOyL,室溫靜置5min,用G-25凝膠柱除鹽,收 集活化后的羊抗人多克隆抗體,2-8°C保存?zhèn)溆?將1.5mg的堿性磷酸酶加入到10-20yL的濃 度為5mg/mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中,室溫靜置 30min,用G-25凝膠柱除鹽,收集活化后的堿性磷酸酶,2-8°C保存?zhèn)溆?將活化的羊抗人多 克隆抗體與活化的堿性磷酸酶混合,2-8°C條件下靜置12-24h,用SupperdeUOO凝膠純化柱 純化偶聯(lián)物,獲得羊抗人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液,2-8 °C保存?zhèn)溆?將羊抗人 多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液用試劑2號稀釋液稀釋到0.02-0. lyg/mL,制得試劑2 號; (5) 配制磁分離試劑: a. 配制磁微粒緩沖液: 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的濃度為lwt%,氯化 鈉的濃度為〇. 8wt % ;再將牛血清白蛋白、新生牛血清和Proclin300加入容器中,充分攪拌 至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為0.5wt %,新生牛血清濃度為5v%,Procl in300濃度為 0.2v%。;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得磁微粒緩沖 液,2-8 °C保存待用磁; b. 配制磁分離試劑: 取IOOmg磁微粒,使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L,pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液1〇11^,充分混勻;再加入〇.5-11^新配 制的濃度均為10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺水溶 液,室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系;使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液配制濃度為5mg/ mL的鏈霉親和素溶液,然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8-1.6mL的鏈霉親和 素,4°C條件下混懸16-20h;再使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向磁微粒中加入IOmL 濃度為1M,pH為8.5的乙醇胺溶液,室溫反應1-2h,再使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上 清,向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL,制得磁分離試劑; (6)配制清洗液: 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的濃度為lwt%,氯化 鈉的濃度為〇 · 8wt% ;再將Tween-20和TritonlOO加入容器中,充分攪拌至完全混勻,Tween-20的濃度為0.5wt % ,TritonlOO的濃度為0.5wt % ;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.5-8.0, 用孔徑為〇. 2μπι的濾器過濾得清洗液,2-8°C保存。4. 如權利要求1所述的試劑盒的檢測方法,其特征在于,該方法包括如下步驟: 1) 將抗SLA/LP抗體IgG校準品放到全自動化學發(fā)光免疫分析儀測試位置,得到由全自 動化學發(fā)光免疫分析儀輸出的擬合曲線; 2) 將抗SLA/LP抗體IgG質控品放到上述分析儀測試位置,得到由全自動化學發(fā)光免疫 分析儀輸出的所述質控品的測試發(fā)光值和通過步驟1得到的擬合曲線擬合得到抗SLA/LP抗 體IgG質控品的濃度值; 3) 將待測樣本放到上述分析儀測試位置,由所述分析儀自動按1:20將樣本稀釋,得到 由全自動化學發(fā)光免疫分析儀輸出的待測樣本的濃度值。5. 根據權利要求4所述的檢測方法,其特征在于:該方法具體包括如下步驟: 1) 加20yL抗SLA/LP抗體IgG校準品或質控品或1:20稀釋后的待測標本至檢測管中; 2) 加50yL的試劑1號至步驟1)所述檢測管中,混勻后,37 ±0.5°C溫IOmin; 3) 加50yL的磁分離試劑至步驟2)所述檢測管中,混勻后,37±0.5°C溫育5min,進行磁 分離,去上清; 4) 加300yL的清洗液至步驟3)檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清; 5) 重復步驟4)兩遍; 6) 加15 0 μ L試劑2號至步驟5)檢測管中,混勻后,3 7 ± 0.5 °C溫育10 m i η,進行磁分離,去 上清; 7) 加300yL的清洗液至步驟6)檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清; 8) 重復步驟7)兩遍; 9) 加200yL的化學發(fā)光底物至步驟8)檢測管中,混勻,檢測發(fā)光強度; 所述步驟1)、步驟2)和步驟3)均包括全自動化學發(fā)光免疫分析儀的全自動檢測步驟。
【文檔編號】G01N33/576GK105929165SQ201610249001
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】北京中航賽維生物科技有限公司
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