快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條及其試劑盒，包括底板(5)，在底板(5)的板面上沿其長(zhǎng)度方向順次設(shè)置有噴涂有布魯氏菌抗原的樣品墊(1)、帶有布魯氏菌單克隆抗體的膠體金復(fù)合物墊(2)、硝酸纖維素膜(3)以及吸水墊(4)；所述硝酸纖維素膜(3)上設(shè)有檢測(cè)帶(10)和對(duì)照線(11)。本發(fā)明采用樣本中的特異性布魯氏菌抗體來阻斷膠體金標(biāo)記的布魯氏菌單抗和抗原的結(jié)合，利用單克隆抗體的高特異性和均一性使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。
【專利說明】
快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條及其試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于免疫膠體金層析分析領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)試紙條及其試劑盒，尤其涉 及一種快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條及其試劑盒，用于對(duì)動(dòng)物全血或血清樣本進(jìn)行布 魯氏菌病抗體的檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 血清學(xué)檢測(cè)通常用于了解動(dòng)物的群體免疫水平和對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。常用 的方法有以下幾種：（1)布魯氏菌病凝集試驗(yàn)，（2)中和試驗(yàn)，（3)間接ELI SA試驗(yàn)，（4)膠體金 免疫檢測(cè)等技術(shù)，其中，間接ELISA法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可用于臨 床布魯氏菌病血清/血漿抗體的定性和定量檢測(cè)，為布魯氏菌病免疫效果的監(jiān)測(cè)提供參考。 但是，上述檢測(cè)手段對(duì)布魯氏菌病抗體的檢測(cè)存在重復(fù)性不好，操作技術(shù)繁瑣的問題。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，布魯氏菌膠體金抗體檢測(cè)主要采用間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、夾心法。
[0004] 間接法：用膠體金標(biāo)記抗原(LPS或BP26蛋白）或二抗（鼠抗牛IgG八鼠抗羊IgG/兔抗 牛IgG/SPA/SPG等），檢測(cè)線（T線）處包被對(duì)應(yīng)的二抗（鼠抗牛IgGA鼠抗羊IgG/兔抗牛IgG/ SPA/SPG等)或者抗原(LPS或BP26蛋白）。間接法中不管采用以上哪種方式，都因?yàn)榧?xì)菌菌體 擁有多種抗原成分，且完整的抗原會(huì)與多種其它細(xì)菌感染產(chǎn)生的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，這兩 種因素的影響，不可避免的都會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的假陽性，使得特異性不佳。
[0005] 雙抗原夾心法:采用雙抗原夾心法，因?yàn)榭乖旧泶嬖诘慕徊娣磻?yīng)，所以同樣存在 與間接法相同的假陽性問題。
[0006] 競(jìng)爭(zhēng)法:雖然此方法中也采用了 一個(gè)單克隆抗體金標(biāo)復(fù)合物，但是，其模式是待檢 抗體與單克隆抗體金標(biāo)復(fù)合物同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)線(T線）的抗原。此模式的問題是待檢抗 體、單克隆抗體金標(biāo)復(fù)合物與檢測(cè)線上的抗原結(jié)合是同等機(jī)會(huì)的，而因?yàn)樯飩€(gè)體的差異， 如果待檢樣本中的抗體含量較低，或者親和力低，則競(jìng)爭(zhēng)不過單克隆抗體金標(biāo)復(fù)合物，從而 使得檢測(cè)結(jié)果呈假陰性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種采用樣本中的特 異性布魯氏菌抗體來阻斷膠體金標(biāo)記的布魯氏菌單抗和抗原的結(jié)合，利用單克隆抗體的高 特異性和均一性使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確的試紙條。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步要解決的技術(shù)問題在于，提供一種使用方便、檢測(cè)快速準(zhǔn)確的快速 檢測(cè)布魯氏囷病抗體的試劑盒。
[0009] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試 紙條，包括底板，在底板的板面上沿其長(zhǎng)度方向順次設(shè)置有噴涂有布魯氏菌抗原的樣品墊、 帶有布魯氏菌單克隆抗體的膠體金復(fù)合物墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊;所述硝酸纖維素 膜上設(shè)有檢測(cè)帶和對(duì)照線。
[0010] 所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條中，優(yōu)選所述硝酸纖維素膜設(shè)有一條由 布魯氏菌多克隆抗體包被而成的檢測(cè)帶。
[0011] 所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條中，優(yōu)選所述硝酸纖維素膜設(shè)有一條由 羊抗鼠抗體包被而成的對(duì)照線。
[0012] 所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條中，優(yōu)選所述膠體金復(fù)合物墊是采用布 魯氏菌單克隆抗體與膠體金顆粒標(biāo)記后干燥于玻璃纖維制成。
[0013] -種快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試劑盒，包括膠體金試紙卡和樣品稀釋機(jī)構(gòu)；
[0014] 其中，所述膠體金試紙卡包括封閉的盒體，在盒體內(nèi)設(shè)置有上述的試紙條；
[0015] 所述樣品稀釋機(jī)構(gòu)包括用于樣品稀釋的容器、磷酸鹽緩沖溶液。
[0016] 所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試劑盒中，優(yōu)選所述盒體上設(shè)有觀察窗和加樣 孔。
[0017] 所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試劑盒中，優(yōu)選所述加樣孔對(duì)應(yīng)設(shè)置在所述樣 品墊上方，所述觀察窗對(duì)應(yīng)設(shè)置在所述硝酸纖維素膜上方。
[0018] 本發(fā)明試紙條和試劑盒采用阻斷法檢測(cè)抗體，通過待檢樣本中的抗體阻斷膠體金 標(biāo)記的單克隆抗體與抗原的結(jié)合。因?yàn)閱慰寺】贵w所具有的良好的親和力、特異性和均一 性，使得這種模式建立的檢測(cè)試劑具有更好的準(zhǔn)確率和穩(wěn)定性。
[0019] 試紙條或試劑盒在使用時(shí)，把待檢樣本加入到加樣孔后，樣品先溶解樣品墊(現(xiàn)有 技術(shù)的樣品墊中沒有抗原）中的布魯氏菌病抗原，并且一起沿著試紙條側(cè)向流動(dòng)，并在流經(jīng) 膠體金墊時(shí)同樣溶解膠體金墊中的膠體金標(biāo)記的布魯氏菌單抗(現(xiàn)有技術(shù)中為膠體金標(biāo)記 的布魯氏菌抗原或SPA蛋白，或者二抗），再一起沿著NC膜流動(dòng)。當(dāng)樣品中沒有布魯氏菌病抗 體時(shí)，樣品墊中的抗原先與膠體金標(biāo)記的布魯氏菌病單抗結(jié)合形成布魯氏菌病抗原-布魯 氏菌病單抗-膠體金的復(fù)合物，當(dāng)此復(fù)合物流經(jīng)檢測(cè)帶時(shí)，又被固定在NC膜上檢測(cè)線(T線） 處的布魯氏菌病抗體捕獲，形成"布魯氏菌病抗體-布魯氏菌病抗原-膠體金標(biāo)記的布魯氏 菌病單抗"的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，因?yàn)槟z體金顆粒的富集而顯示紅色線條。當(dāng)樣品中含有布魯氏菌 病抗體時(shí)，樣品中的抗體先與樣品墊中的抗原相遇并結(jié)合，從而阻斷了膠體金標(biāo)記的布魯 氏菌病單抗與抗原的結(jié)合，這樣也就造成了無法在檢測(cè)線(T線)處形成"布魯氏菌病抗體-布魯氏菌病抗原-膠體金標(biāo)記的布魯氏菌病單抗"的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，因而在檢測(cè)線(T線)處就 不會(huì)有膠體金顆粒的富集，無紅色條帶形成。
[0020] 相比間接法和夾心法，本申請(qǐng)采用的阻斷法膠體金抗體檢測(cè)試紙條因?yàn)椴捎昧藛?克隆抗體標(biāo)記膠體金作為示蹤劑，且單克隆抗體具有良好的特異性，不存在間接法或夾心 法與其它菌體抗原的交叉反應(yīng)或者抗原本身存在的交叉反應(yīng)的問題，也不會(huì)有與正常血清 中IgM的F_c段的結(jié)合，所以保證了檢測(cè)方法的高特異性。
[0021] 相比競(jìng)爭(zhēng)法，本發(fā)明采用的阻斷法的膠體金抗體檢測(cè)試紙條是將樣本中的待檢抗 體先與樣品墊中的抗原充分接觸反應(yīng)，待此反應(yīng)完成后，再流經(jīng)單克隆抗體金標(biāo)復(fù)合物，待 檢抗體有優(yōu)先與抗原反應(yīng)的機(jī)會(huì)，所以避免了競(jìng)爭(zhēng)法的問題，從而使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[0022] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0023] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例的試紙條側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖；
[0024]圖2是本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒正面結(jié)構(gòu)示意圖；
[0025] 圖3-6是本發(fā)明實(shí)施例的各種檢測(cè)結(jié)果圖示。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 為了對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對(duì)照附圖詳細(xì)說明 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0027] 如圖1所示，一種快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條，包括底板5,在底板5的板面 上沿其長(zhǎng)度方向順次設(shè)置有噴涂有布魯氏菌抗原的樣品墊1、帶有布魯氏菌單克隆抗體的 膠體金復(fù)合物墊2、硝酸纖維素膜3以及吸水墊4;所述硝酸纖維素膜3上設(shè)有檢測(cè)帶10和對(duì) 照線11。
[0028] 所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條中，優(yōu)選所述硝酸纖維素膜3設(shè)有一條 由布魯氏菌多克隆抗體包被而成的檢測(cè)帶10。優(yōu)選所述硝酸纖維素膜3設(shè)有一條由羊抗鼠 抗體包被而成的對(duì)照線11。
[0029] 所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條中，優(yōu)選所述膠體金復(fù)合物墊2是采用 布魯氏菌單克隆抗體與膠體金顆粒標(biāo)記后干燥于玻璃纖維制成。
[0030] 如圖1、2所示，一種快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試劑盒，包括膠體金試紙卡和樣品 稀釋機(jī)構(gòu)；
[0031] 其中，所述膠體金試紙卡包括封閉的盒體6,在盒體6內(nèi)設(shè)置有上述的試紙條100; 所述樣品稀釋機(jī)構(gòu)包括用于樣品稀釋的容器、磷酸鹽緩沖溶液。樣品稀釋的容器可以采用 盛裝液體的5毫升滴瓶，磷酸鹽緩沖溶液采用0.01MPBS。
[0032] 所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試劑盒中，優(yōu)選所述盒體6上設(shè)有觀察窗8和加 樣孔9。觀察窗8和加樣孔9的具體結(jié)構(gòu)不作限定，根據(jù)實(shí)際使用情況確定。優(yōu)選所述加樣孔9 對(duì)應(yīng)設(shè)置在所述樣品墊1上方，通過加樣孔9加入樣品，所述觀察窗8對(duì)應(yīng)設(shè)置在所述硝酸纖 維素膜3上方，用于觀察檢測(cè)帶10是否形成紅色條帶。
[0033]試紙條的制備 [0034] 一、膠體金制備
[0035] 1)將制備專用燒瓶用重鉻酸鉀洗液浸泡過夜，用自來水沖洗干凈，去離子水潤(rùn)洗 后再用0 ? 22um過濾去離子水潤(rùn)洗三次，備用。其它玻璃器皿也都需清潔干凈后再用0 ? 22um 過濾去離子水潤(rùn)洗；
[0036] 2)取一定量去離子水加入1 %體積的1 %氯金酸（用前0.22um過濾)溶液到專用燒 瓶中；裝上攪拌器和冷凝管；
[0037] 3)打開冷凝水和油浴加熱套，同時(shí)緩慢攪拌，加熱至90攝氏度；
[0038] 4)5min后按照1%檸檬酸鈉：1/萬氯金酸= 1.8:100的比例，一次性迅速加入相應(yīng) 量的1%檸檬酸鈉溶液，同時(shí)加快攪拌速度至300rpm，30秒后降低攪拌數(shù)度至lOOrpm，再保 持20min后關(guān)閉加熱裝置，水浴冷卻。
[0039] 5)分別在520謹(jǐn)、525謹(jǐn)、53011111測(cè)定其00值，最大吸收峰應(yīng)為52511111，且00應(yīng)在 1.00 - 0.95之間。否則，棄用。
[0040] 二、單抗標(biāo)記
[0041 ] 1)用0.邡1(2〇)3調(diào)節(jié)膠體金溶液的?11至7.2 ;
[0042] 2)按照10ug/ml濃度，計(jì)算標(biāo)記所需抗原量，然后將抗原用D. I稀釋至0.5mg/ml，攪 拌下緩慢滴加入空白膠體金，室溫保持?jǐn)嚢?0min;
[0043] 3)攪拌下同樣緩慢滴加入10 %的BSA，使其BSA終濃度為1 %，保持?jǐn)嚢?0min后再 室溫靜置1小時(shí)；
[0044] 4)4°C下，12000rpm離心45min，去上清液。沉淀用0.01M PH7.2PB復(fù)溶至原1/40體 積；
[0045] 5)4°C下，1500rpm離心10min，去沉淀后完成標(biāo)記。
[0046] 三、膠體金墊制備
[0047] 1)用0.01M PH7.溶液將膠體金復(fù)合物稀釋到批生產(chǎn)指定濃度;加入50 %海藻 糖（用前〇.2211111過濾），使其終濃度達(dá)到25%;
[0048] 2)將所用玻纖用5mM PH7.2PB溶液(含0.2%酪蛋白和0.3%Tween-20)浸泡2小時(shí)， 后自然涼干備用；
[0049] 3)將金標(biāo)液加入BIODIT相應(yīng)樣品瓶;打開BIODOT儀和氮?dú)馄块y門，將玻璃纖維平 鋪于膜板上，開始噴涂；
[0050] 4)噴涂完畢玻纖在相對(duì)濕度40%以下，室溫涼干(8小時(shí)以上）；用專用裁刀裁去膠 體金墊邊緣至指定規(guī)格后完成制備。
[0051] 四、噴膜
[0052]用0.01M pH7.2PBS溶液將布魯氏菌病抗體和羊抗鼠二抗稀釋至所需濃度， lOOOOrpm離心5min，去沉淀，同時(shí)加入1/萬疊氮鈉;將合格NC膜裁切成300mm長(zhǎng)，正面朝上平 鋪與膜板上，用磁條壓定，開始畫膜;在NC膜的相應(yīng)位置進(jìn)行標(biāo)注，正面朝上，相對(duì)濕度35 % 以下室溫干燥2小時(shí)后于干燥器中密封保存。
[0053] 五、樣品墊制備
[0054] 將布魯氏菌抗原用0.01MPBS溶液稀釋至lug/ml，將玻纖浸泡其中30min后，撈出晾 干，并裁切成1 ? 5cm*30cm備用。
[0055] 六、紙條組裝
[0056]首先揭去PVC板上NC膜粘貼位置的封膠紙，使其膠面暴露出來，將NC膜正面向上， 端正、平整的貼于PVC板的標(biāo)定位置;揭去PVC板上膠體金復(fù)合物墊粘貼位置的封膠紙，將裁 切好的膠體金復(fù)合物墊一端對(duì)齊PVC板，貼于標(biāo)定位置，用手輕壓，使其粘和完全;將裁切好 的樣品墊貼于PVC板的標(biāo)定位置，用手輕壓，使其粘和完全;揭去PVC板上吸水墊粘貼位置的 封膠紙，將吸水墊裁切為2cm寬，貼于PVC板的標(biāo)定位置，用手輕壓，使其粘和完全，完成裝 裱。然后將PVC板正面朝上送入切條機(jī)裁切成4mm寬紙條后裝入塑料卡盒內(nèi)密封干燥保存。 [0057] 檢測(cè)步驟：
[0058] 1.采血0.5-lmL，3000轉(zhuǎn)/分，離心3-5分鐘分離血清。也可4°C靜置過夜，使血清自 然析出得到檢測(cè)樣品，或采用全血直接檢測(cè)。
[0059] 2.取出本發(fā)明試紙條或試劑盒中的檢測(cè)卡(若冷藏保存，需恢復(fù)至室溫再打開包 裝），開封后平放于桌面上。
[0060] 3.取5ul(毛細(xì)管黑色刻度處)血清或全血作為樣品加入加樣孔，然后立刻用裝有 緩沖稀釋液的滴瓶滴加一滴緩沖稀釋液。
[0061 ] 4.請(qǐng)等待5分鐘。
[0062] 5.再滴加兩滴緩沖稀釋液。
[0063] 6.這時(shí)會(huì)看見有酒紅色的液體流過觀察窗。等待10-15分鐘判斷結(jié)果，15分鐘后的 結(jié)果無效。
[0064]結(jié)果判定：
[0065] 1.陰性:如圖3所示，檢測(cè)線(T線)和對(duì)照線(C線)都顯示酒紅色的反應(yīng)。
[0066] 2.陽性：如圖4所示，檢測(cè)線（T線）上沒有顏色反應(yīng)，只是在對(duì)照線（C線）上顯示酒 紅色的反應(yīng)。
[0067] 3.失效:如圖5、6所示，在觀察孔內(nèi)，對(duì)照線區(qū)（C)和檢測(cè)線區(qū)（T)都不出現(xiàn)色線;或 僅檢測(cè)線區(qū)(T)出現(xiàn)色線。
[0068] 對(duì)比試驗(yàn)：
[0069] 1、本發(fā)明與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法(虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集實(shí)驗(yàn)）的符合性比 對(duì)：
[0070] 實(shí)驗(yàn)方法：用本發(fā)明的試紙條檢測(cè)虎紅平板凝集和試管凝集雙陽性血清98份，雙 陰性血清104份，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果。
[0071] 對(duì)比實(shí)驗(yàn)圖表：
[0073] 結(jié)論：
[0074] 敏感性：100%;98/98
[0075] 特異性：99 %; 103/104
[0076] 總符合率:99.5%; 201/202
[0077] 本發(fā)明的試紙條檢測(cè)結(jié)果符合國(guó)標(biāo)要求。
[0078] 2、本發(fā)明檢測(cè)靈敏度與國(guó)標(biāo)方法(虎紅平板凝集試驗(yàn))的比較：
[0079] 實(shí)驗(yàn)方法：將中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所標(biāo)準(zhǔn)陽性血清倍比稀釋后分別檢測(cè)各稀釋倍 數(shù)，對(duì)比呈現(xiàn)陽性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)。
[0081]結(jié)論:可見虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)被比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清呈陽性的最大稀釋倍 數(shù)是1:8,而同時(shí)本發(fā)明阻斷法膠體金試紙條是1:16,靈敏度高于國(guó)標(biāo)方法。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條，其特征在于，包括底板(5)，在底板(5)的板 面上沿其長(zhǎng)度方向順次設(shè)置有噴涂布魯氏菌抗原的樣品墊（1)、帶有布魯氏菌單克隆抗體 的膠體金復(fù)合物墊(2)、硝酸纖維素膜(3)以及吸水墊(4);所述硝酸纖維素膜(3)上設(shè)有檢 測(cè)帶（10)和對(duì)照線（11)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條，其特征在于，所述硝酸纖 維素膜(3)設(shè)有一條由布魯氏菌多克隆抗體包被而成的檢測(cè)帶（10)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條，其特征在于，所述硝酸纖 維素膜(3)設(shè)有一條由羊抗鼠抗體包被而成的對(duì)照線（11)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試紙條，其特征在于，所述膠體金 復(fù)合物墊(2)是采用布魯氏菌單克隆抗體與膠體金顆粒標(biāo)記后干燥于玻璃纖維制成。5. -種快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試劑盒，其特征在于，包括膠體金試紙卡和樣品稀 釋機(jī)構(gòu)； 其中，所述膠體金試紙卡包括封閉的盒體(6)，在盒體(6)內(nèi)設(shè)置有權(quán)利要求1-4所述的 試紙條(100); 所述樣品稀釋機(jī)構(gòu)包括用于樣品稀釋的容器、磷酸鹽緩沖溶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試劑盒，其特征在于，所述盒體 (6)上設(shè)有觀察窗(8)和加樣孔(9)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速檢測(cè)布魯氏菌病抗體的試劑盒，其特征在于，所述加樣孔 (9)對(duì)應(yīng)設(shè)置在所述樣品墊（1)上方，所述觀察窗（8)對(duì)應(yīng)設(shè)置在所述硝酸纖維素膜(3)上 方。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK105929154SQ201610259519
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月22日
【發(fā)明人】饒樂
【申請(qǐng)人】深圳真瑞生物科技有限公司