一種定量檢測(cè)樣本中髓過(guò)氧化物酶濃度的液態(tài)芯片試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種檢測(cè)樣本中髓過(guò)氧化物酶濃度 測(cè)定的試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)世界屯、臟聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，屯、血管疾病引起的死亡人數(shù)約占世界總死亡人數(shù)的1/3， 屯、腦血管疾病的患病率、發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為人類健康的"頭號(hào)殺 手"，嚴(yán)重威脅人類的生命。對(duì)于屯、血管疾病的準(zhǔn)確診斷預(yù)測(cè)有著重要的意義。
[0003] 髓過(guò)氧化物酶（MPO)是一種相對(duì)分子質(zhì)量為144KD的白細(xì)胞酶，是糖基化的血紅 素蛋白。在特定條件下，它能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和組織損傷，作為系統(tǒng)炎癥和氧化應(yīng)激的標(biāo)志 物。大量流行病學(xué)研究顯示MPO濃度的增高與冠屯、病密切相關(guān)，因此檢測(cè)病人血漿中MPO 的濃度對(duì)于冠屯、病患者具有十分重要的參考價(jià)值。
[0004] 目前對(duì)于屯、血管疾病的免疫診斷方法，只能對(duì)一種單一的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，由于不 同指標(biāo)存在的靈敏度、精確度W及特異性的差別，在臨床診斷中經(jīng)常出現(xiàn)高的假陰性率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明相對(duì)于傳統(tǒng)的免疫測(cè)定法，旨在提供高通量、快速、準(zhǔn)確的可同時(shí)檢測(cè)多種 屯、血管標(biāo)志物的技術(shù)平臺(tái)和試劑盒，該試劑盒同時(shí)還能降低假陰性率。
[0006] 一種定量檢測(cè)樣本中髓過(guò)氧化物酶濃度的液態(tài)巧片試劑盒，包括包被有抗髓過(guò)氧 化物酶的單克隆抗體的微球、帶孔的平臺(tái)載體、髓過(guò)氧化物酶的濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品、髓過(guò)氧化 物酶質(zhì)控品、巧光標(biāo)記試劑標(biāo)記的髓過(guò)氧化物酶抗體、樣本緩沖液、洗液。
[0007] 作為優(yōu)選方案，所述微球?yàn)楸砻鎺в星晒馍摹⒖蒞實(shí)現(xiàn)巧光編碼的聚苯己締磁 微球，帶孔的平臺(tái)載體每孔里面包被有1000-5000個(gè)微球，而每個(gè)微球含有2*l〇-6-5*l〇-Sg 抗髓過(guò)氧化物酶的單克隆抗體。
[000引作為優(yōu)選方案，所述帶孔的平臺(tái)載體為微孔反應(yīng)板。
[0009] 作為優(yōu)選方案，所述髓過(guò)氧化物酶的濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品和髓過(guò)氧化物酶質(zhì)控品為凍 干粉末，所述髓過(guò)氧化物酶的濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品是將6個(gè)、濃度分別為0、50、100、200、400、 800ng/ml的髓過(guò)氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品制成凍干粉末；髓過(guò)氧化物酶質(zhì)控品是將2個(gè)，濃度為80、 500ng/ml的髓過(guò)氧化物酶質(zhì)控品制成凍干粉末。
[0010] 作為優(yōu)選方案，所述髓過(guò)氧化物酶的濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品和髓過(guò)氧化物酶質(zhì)控品都是 用髓過(guò)氧化物酶純品與自制的髓過(guò)氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照1:200000-1:1000稀釋而 成，所述髓過(guò)氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品不少于2個(gè)，所述髓過(guò)氧化物酶質(zhì)控品和所述髓過(guò)氧化物酶 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度不同，所述髓過(guò)氧化物酶質(zhì)控品的作用是在試劑盒使用過(guò)程中起到核準(zhǔn)校對(duì) 的作用，即通過(guò)髓過(guò)氧化物酶質(zhì)控品測(cè)值是否在質(zhì)控范圍內(nèi)來(lái)對(duì)髓過(guò)氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品擬合 出來(lái)的曲線進(jìn)行核準(zhǔn)校對(duì)，若髓過(guò)氧化物酶質(zhì)控品測(cè)值合格，則可W利用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)擬合 出樣本中的髓過(guò)氧化物酶的濃度值。
[0011] 作為優(yōu)選方案，所述的髓過(guò)氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，是在PH7. 0-7. 4、濃度為 lO-lOOmM磯酸鹽緩沖液中，分別加入1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)物血清、0. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 防腐劑、1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白保護(hù)劑、0.05-1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性劑混合而成。
[0012] 作為優(yōu)選方案，所述巧光標(biāo)記試劑標(biāo)記的髓過(guò)氧化物酶抗體為單克隆抗體。
[0013] 作為優(yōu)選方案，所述巧光標(biāo)記試劑為藻紅蛋白。
[0014]作為優(yōu)選方案，所述樣本緩沖液為含有蛋白保護(hù)劑的磯酸鹽緩沖液，是在 lO-lOOmM磯酸鹽緩沖液中，分別加入1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白保護(hù)劑、0. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù) 的防腐劑混合而成。
[0015] 作為優(yōu)選方案，所述的表面活性劑為曲達(dá)通X-100、吐溫20、布里杰-35、吐溫40、 吐溫60、吐溫80、十二烷基橫酸鋼、斯盤20、烷基酪聚氧己締4離、聚己二醇2000、聚己二醇 4000。
[0016] 作為優(yōu)選方案，所述的防腐劑為Proclin300、疊氮鋼、硫柳隸、硫酸慶大霉素。
[0017] 作為優(yōu)選方案，所述的蛋白保護(hù)劑為牛血清白蛋白、牛丫蛋白、海藻糖、甘油、庶 糖。
[0018] 制備所述試劑盒的方法，包括W下制備過(guò)程，所述制備過(guò)程不分先后：
[0019] 包被有抗髓過(guò)氧化物酶的單克隆抗體的微球的制備；將未包被的微球中加入磯酸 二氨鋼緩沖液、N-哲基硫代班巧酷亞胺溶液和碳二亞胺溶液進(jìn)行活化；然后加入特異性的 抗髓過(guò)氧化物酶的單克隆抗體1-125yg在4-8°C進(jìn)行包被；洗漆；再加入含1-10%質(zhì)量分 數(shù)的動(dòng)物血清蛋白的封閉液過(guò)夜封閉；最后在lO-lOOmM磯酸鹽緩沖液中避光、4-8°C存放；
[0020] 髓過(guò)氧化物酶的濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品和髓過(guò)氧化物酶質(zhì)控品的制備：先在PH 7. 0-7. 4、濃度為lO-lOOmM磯酸鹽緩沖液中，分別加入1-10 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)物血清、 0. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑、1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白保護(hù)劑、0. 05-1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面 活性劑混合而成標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液；再將純品與自制的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照1:200000-1:1000稀 釋而成標(biāo)示濃度為〇-8(K)ng/ml的濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品W及60-250ng/ml的髓過(guò)氧化物酶質(zhì)控 品；
[0021] 巧光標(biāo)記試劑標(biāo)記的髓過(guò)氧化物酶抗體；將巧光標(biāo)記試劑通過(guò)偶聯(lián)劑進(jìn)行衍生 化，然后與髓過(guò)氧化物酶抗體進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，反應(yīng)后用終止劑終止反應(yīng)，即可獲得巧光標(biāo)記 試劑標(biāo)記的抗體，將巧光標(biāo)記試劑標(biāo)記的髓過(guò)氧化物酶抗體于含有保護(hù)劑的磯酸鹽緩沖液 中，4-8 °C保存；
[0022] 樣本緩沖液的制備；在10-200mM磯酸鹽緩沖液中，加入1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白保 護(hù)劑，0. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑混合而成；
[0023] 洗液的制備；在lO-lOOmM磯酸鹽緩沖液中，加入1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性劑混合 而成。
[0024] 作為優(yōu)選方案，所述N-哲基硫代班巧酷亞胺溶液和碳二亞胺溶液購(gòu)買于Pierce 公司，所述動(dòng)物血清蛋白為牛血清白蛋白。
[0025] 本發(fā)明基于LuminexxMAP技術(shù)平臺(tái)，把直徑為6. 5um的聚苯己締小磁球用巧光染 色的方法進(jìn)行編碼，通過(guò)調(diào)節(jié)兩種巧光染料的不同配比獲得最多可達(dá)100種具有不同特征 巧光譜的微球，然后將每種編碼微球共價(jià)交聯(lián)上針對(duì)特定檢測(cè)物的抗原、抗體或核酸探針 等捕獲分子。檢測(cè)時(shí)微球被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列通過(guò)兩束激光，一束判定顆粒的顏 色從而決定被測(cè)物的特異性（定性測(cè)試）；另一束測(cè)定微粒上的巧光標(biāo)記強(qiáng)度對(duì)被檢測(cè)測(cè) 物定量，所得的數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理后可W直接用來(lái)判斷結(jié)果。Luminex xMAP技術(shù)具有自由組 合、高通量、高速度、低成本、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、靈敏度高、線性范圍廣、無(wú)需洗漆、操作簡(jiǎn) 便的優(yōu)點(diǎn)。在臨床診斷中引進(jìn)液態(tài)巧片技術(shù)和產(chǎn)品，將極大地提高檢測(cè)效率和降低檢測(cè)成 本。
[0026] 本發(fā)明是在Luminex xMAP技術(shù)平臺(tái)上，通過(guò)雙抗夾屯、法對(duì)MPO的濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定 量，同時(shí)能夠與不同的標(biāo)志物進(jìn)行自由組合，達(dá)到多種標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)，提高屯、血管疾病 檢測(cè)的準(zhǔn)確性，降低臨床檢測(cè)中的假陰性率。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為實(shí)施例4標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[002引圖2為實(shí)施例5標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0029] 圖3為實(shí)施例6標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0030] 圖4為實(shí)施例7標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0031] 圖5為實(shí)施例8標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0032] 圖6為實(shí)施例9標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0033] 圖7為實(shí)施例10標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[003引 實(shí)施例1 ;
[0036] 通過(guò)W下方法制備該試劑盒中的巧光標(biāo)記試劑標(biāo)記的髓過(guò)氧化物酶抗體，其中 所述的巧光標(biāo)記試劑標(biāo)記的髓過(guò)氧化物酶抗體為藻紅蛋白標(biāo)記的髓過(guò)氧化物酶單克隆抗 體：
[0037] 1)藻紅蛋白的衍生化
[003引取4. 5mg藻紅蛋白溶于1.0血磯酸鹽緩沖液中，加入10化3-(2-化晚二琉基）丙 酸N-哲基班巧酷亞胺醋（SPD巧無(wú)水甲醇溶液（4mg/mL)，使得SPDP與藻紅蛋白摩爾比約為 10,常溫反應(yīng)50min，經(jīng)葡聚糖凝膠層析脫鹽，磯酸鹽緩沖液平衡和洗脫，收集藻紅蛋白溶液 峰。
[0039] 2)單克隆抗體的琉