一種新的h9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān)測(cè)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于卵黃抗體監(jiān)測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān)測(cè)的方法。利用卵黃樣品代替血清樣品，利用水溶性處理液提取卵黃液和氯仿提取卵黃液進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)代替血清抗體監(jiān)測(cè)，抗體監(jiān)測(cè)過(guò)程中不需要采血，只需要收集禽蛋，不會(huì)對(duì)家禽產(chǎn)生應(yīng)激，不會(huì)影響家禽的健康和生產(chǎn)性能；抗體監(jiān)測(cè)過(guò)程中用兩種卵黃處理液的混合液H9亞型禽流感抗體效價(jià)經(jīng)修訂后代替血清抗體效價(jià)，主要用于蛋禽和種禽的H9亞型禽流感抗體監(jiān)測(cè)，也可用于評(píng)估雛禽疫病母源抗體水平以確定首免時(shí)間。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān)測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及卵黃抗體監(jiān)測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體 代替血清抗體監(jiān)測(cè)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] H9亞型禽流感屬于低致病性禽流感，是常見(jiàn)的家禽傳染病之一，容易與其它疫病 發(fā)生混合感染，可造成養(yǎng)禽業(yè)(包括雞、鴨、鴿、鵪鶉等)的一定經(jīng)濟(jì)損失，通過(guò)疫苗免疫是我 國(guó)最主要的防控措施，免疫產(chǎn)生的抗體效價(jià)高低直接決定著免疫質(zhì)量和防控成敗。由于免 疫接種容易受到多種因素的影響，如疫苗因素、動(dòng)物因素、飼養(yǎng)管理因素、疾病因素等，而且 動(dòng)物的免疫反應(yīng)看不見(jiàn)、摸不著，所以免疫質(zhì)量存在很大的不確定性，這給疫病防控帶來(lái)極 大的困難?？贵w監(jiān)測(cè)是檢驗(yàn)免疫質(zhì)量最直接、最有效的方法，通過(guò)抗體監(jiān)測(cè)可以確定科學(xué)的 免疫程序、合理的免疫時(shí)間，選擇優(yōu)質(zhì)的疫苗、準(zhǔn)確的免疫劑量，從而確保免疫效果?？贵w監(jiān) 測(cè)還可以提示H9亞型禽流感發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，如果抗體效價(jià)低于41og2,雞群的抗體不足以抵抗 病毒的侵襲，發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)增大，定期進(jìn)行H9亞型禽流感抗體監(jiān)測(cè)可以評(píng)估疫苗免疫質(zhì)量和 預(yù)警疫病的發(fā)生，是預(yù)防控制即亞型禽流感的重要措施。
[0003] 抗體監(jiān)測(cè)是利用免疫學(xué)試驗(yàn)的原理，用已知抗原檢測(cè)相應(yīng)特異性抗體的方法，其 在免疫質(zhì)量評(píng)估、疫病診斷、疫病監(jiān)測(cè)、疫情預(yù)警、疫病控制等方面發(fā)揮重要作用，是動(dòng)物疫 病防控的主要技術(shù)手段?？贵w監(jiān)測(cè)主要以血清抗體效價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)，利用血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)血清 抗體，常用的方法有血凝試驗(yàn)(HA)、血凝抑制試驗(yàn)(HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等，其 中HA和HI是禽流感抗體監(jiān)測(cè)的最常用方法。血清抗體監(jiān)測(cè)具有結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的優(yōu)點(diǎn)，但同 時(shí)具有操作繁瑣、影響雞健康和生產(chǎn)性能的缺點(diǎn)。因?yàn)樾枰裳头蛛x血清，操作過(guò)程繁 瑣，浪費(fèi)人力和時(shí)間，同時(shí)采血引起的應(yīng)激會(huì)給養(yǎng)雞生產(chǎn)造成不良影響，從而導(dǎo)致血清抗體 監(jiān)測(cè)在實(shí)踐應(yīng)用中受到一定的限制。然而，與血清制備相比，卵黃制備更加簡(jiǎn)便和安全，只 需要收集雞蛋，不需要采血，所以用卵黃代替血清進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)具有一定的優(yōu)勢(shì)和推廣價(jià) 值，我國(guó)早在20世紀(jì)80年代就有用卵黃抗體代替血清抗體進(jìn)行新城疫抗體監(jiān)測(cè)的報(bào)道。
[0004] 卵黃抗體（I g Y)是禽類(lèi)在抗原刺激下產(chǎn)生的沉積于卵黃中的針對(duì)特定抗原的抗 體，是禽類(lèi)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的用于提高雛禽抵抗力的物質(zhì)。當(dāng)家禽受到外來(lái)抗原刺 激后，法氏囊內(nèi)的B細(xì)胞分化成為漿細(xì)胞，分泌特異性抗體進(jìn)入血液循環(huán)；當(dāng)血液流經(jīng)卵巢 時(shí)，特異性抗體選擇性地(主要是IgG)轉(zhuǎn)移并沉積到卵黃，形成卵黃抗體;IgG在卵細(xì)胞中具 有蓄積作用，所以卵黃抗體的濃度高于血清中的抗體濃度。自1893年Klemperer首次報(bào)道雞 蛋中存在抗體以來(lái)，人們對(duì)卵黃抗體的認(rèn)識(shí)不斷加深，相關(guān)研究也愈來(lái)愈受到關(guān)注，其中用 卵黃抗體代替血清抗體進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)是其中內(nèi)容之一。當(dāng)前用于檢測(cè)禽流感卵黃抗體的方 法有多種，如氯仿提取法、生理鹽水提取法、磷酸鹽緩沖液提取法等，其中氯仿提取法使用 最多。雖然氯仿提取法是最接近血清抗體的方法，但是結(jié)果仍然存在準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的問(wèn) 題，這是卵黃抗體代替血清抗體進(jìn)行禽流感抗體監(jiān)測(cè)最大的難題。卵黃抗體監(jiān)測(cè)雖然具有 操作簡(jiǎn)便、安全的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)具有結(jié)果不準(zhǔn)確、不可靠的缺點(diǎn)。
[0005] 卵黃抗體是指禽類(lèi)經(jīng)免疫后卵黃內(nèi)含有的特異性抗體;血清抗體是禽類(lèi)經(jīng)免疫后 血清內(nèi)含有的特異性抗體;血凝抑制試驗(yàn)是指某些具有凝集紅細(xì)胞能力的病毒(或抗原)能 被相應(yīng)抗體抑制，原理是相應(yīng)抗體與病毒(或抗原)結(jié)合后，阻止病毒(或抗原)表面血凝素 與紅細(xì)胞結(jié)合，常用于正粘病毒、副粘病毒的診斷和抗體監(jiān)測(cè);抗體監(jiān)測(cè)是通過(guò)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 的方法，即用已知抗原檢測(cè)被檢樣品中有無(wú)相應(yīng)的特異性抗體，其主要作用是檢驗(yàn)免疫性 與免疫效果，對(duì)于抗體監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)免疫效果不好則可提示需要加強(qiáng)免疫或調(diào)整免疫程序， 是動(dòng)物疫病預(yù)防控制工作中重要的技術(shù)手段，具備重要的參考價(jià)值，并非疾病的診斷與治 療方法。
[0006] 在禽類(lèi)疫病的抗體監(jiān)測(cè)中，血清抗體檢測(cè)結(jié)果可靠眾所周知，但是血清抗體監(jiān)測(cè) 需要采血，在生產(chǎn)中有一定的技術(shù)難度，還會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激，影響家禽的健康和生產(chǎn)性能；卵黃 抗體檢測(cè)不需要采血，只需要提供禽蛋，不會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激，不會(huì)影響家禽的健康和生產(chǎn)性能。 禽流感病毒的抗體監(jiān)測(cè)一直以血清抗體效價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)，而卵黃抗體效價(jià)與血清抗體效價(jià)存在 一定的差距，致使卵黃抗體檢測(cè)在生產(chǎn)中得不到推廣應(yīng)用。卵黃抗體的效價(jià)的確定是卵黃 代替血清的關(guān)鍵點(diǎn)，相較于血清抗體的效價(jià)檢測(cè)技術(shù)非常成熟，卵黃抗體存在于卵黃中，屬 于非均相液態(tài)物混合，現(xiàn)有的技術(shù)很難保證卵黃抗體檢測(cè)結(jié)果的可靠性，往往不是偏低就 是偏高，單一方法很難保證所得的卵黃抗體效價(jià)的可靠性。
[0007]
【申請(qǐng)人】通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針對(duì)卵黃進(jìn)行H9亞型禽流感抗體效價(jià)監(jiān)測(cè)，用氯仿處理一 般效價(jià)偏低，而用水處理一般效價(jià)偏高，
【申請(qǐng)人】認(rèn)為其基于以下的機(jī)理：
[0008] 卵黃中含有水分約48.0%、蛋白質(zhì)約17.8%和脂肪約30.5%，其中大部分蛋白質(zhì) 與脂肪結(jié)合以脂蛋白的形式存在，其中包括卵黃抗體。正因?yàn)槁腰S抗體不易簡(jiǎn)單分離，所以 在實(shí)際測(cè)定中很難測(cè)準(zhǔn)卵黃抗體效價(jià)。
[0009] 對(duì)于常用的氯仿法提取測(cè)效價(jià)，氯仿能夠溶解卵黃中的脂肪，用它處理的卵黃經(jīng) 離心后分為3層，最下層淡黃色，為氯仿層；中間層為凝固的脂肪層;最上層澄清透明，為提 純的卵黃抗體溶液。處理過(guò)程中，會(huì)丟失部分卵黃抗體，丟失在脂肪層或者是氯仿層中溶解 的脂肪中，所以會(huì)導(dǎo)致血凝抑制抗體效價(jià)偏低。
[0010] 而另一種處理路線，水溶性處理液，如生理鹽水、枸櫞酸鈉溶液、磷酸鹽緩沖液等， 處理卵黃主要起到單純的稀釋作用，于是，在實(shí)際測(cè)定中，除抗體和抗原發(fā)生特異性結(jié)合以 外，卵黃其它成份也和抗原發(fā)生了非異性結(jié)合，所以會(huì)導(dǎo)致血凝抑制抗體效價(jià)測(cè)定值偏高。
[0011] 而現(xiàn)有技術(shù)中，針對(duì)血清抗體效價(jià)的監(jiān)測(cè)一般比較準(zhǔn)確，因?yàn)檠逯锌贵w的分離 技術(shù)成熟，準(zhǔn)確，可重現(xiàn)性強(qiáng)，但用卵黃抗體監(jiān)測(cè)雖然樣本收集簡(jiǎn)單，不影響禽只的優(yōu)點(diǎn)，但 有測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，不克服這一缺點(diǎn)是很難替代血清抗體監(jiān)測(cè)的。
[0012] 本發(fā)明因此想到了將氯仿處理的卵黃提取液與水溶性處理液處理的卵黃提取液 合并，由此抵沖兩者分別偏高和偏低的技術(shù)偏差，從而得到比較可靠的卵黃抗體效價(jià)，抗體 效價(jià)再經(jīng)修訂可以更接近血清的抗體效價(jià)?？贵w監(jiān)測(cè)在防控中具有重要作用，在生產(chǎn)中將 得到越來(lái)越多的應(yīng)用，本發(fā)明是對(duì)應(yīng)采集商品蛋雞的血液和雞蛋，分別檢測(cè)血清、水溶性處 理液提取卵黃液和氯仿提取卵黃液的！19亞型禽流感血凝抑制抗體效價(jià)，在水溶性處理液提 取卵黃液和氯仿提取卵黃液效價(jià)數(shù)值相對(duì)于血清抗體偏離方向客觀分析的基礎(chǔ)上，建立一 種卵黃抗體代替血清抗體進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)的方法，解決了卵黃抗體結(jié)果不準(zhǔn)確、不可靠的問(wèn) 題。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便、安全，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可以用卵黃取代血清進(jìn)行蛋禽、種禽的 H9亞型禽流感抗體禽流感病毒抗體監(jiān)測(cè)，避免了采血的麻煩和影響，易于推廣和應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的方法是基于這樣的客觀情況的分析，即使得兩種常用方法處理卵黃以監(jiān) 測(cè)效價(jià)的方法予以互補(bǔ)，這里指的是用氯仿和用水溶性處理液。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān) 測(cè)的方法?？贵w監(jiān)測(cè)過(guò)程中不需要采血，只需要收集禽蛋，不會(huì)對(duì)家禽產(chǎn)生應(yīng)激，不會(huì)影響 家禽的健康和生產(chǎn)性能;通過(guò)該方法，抗體監(jiān)測(cè)操作更簡(jiǎn)便、更安全，結(jié)果更準(zhǔn)確、更可靠， 大大提高H9亞型禽流感抗體監(jiān)測(cè)在生產(chǎn)中的適用性。
[0015]本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0016] 一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān)測(cè)的方法，其步驟如下：
[0017] (1)卵黃原料采集
[0018]雞蛋采集是在養(yǎng)禽場(chǎng)中隨機(jī)采集雞蛋20枚或以上，保證采集的雞蛋來(lái)自整個(gè)雞群 的分散度;將禽蛋用鑷子在殼上輕輕敲開(kāi)直徑約lcm的小洞，撕開(kāi)殼膜將蛋清完全倒出，再 打開(kāi)蛋殼將蛋黃完整倒入培養(yǎng)皿，進(jìn)而挑開(kāi)卵黃囊，用注射器直接避開(kāi)表面蛋清抽取卵黃， 將抽取到的卵黃注入到小燒杯中，玻棒攪勻使全部提取卵黃充分混勻，備用；
[0019] (2)卵黃抗體提取
[0020] A、水溶性處理液提取卵黃中抗體
[0021]吸取2ml提取卵黃加入離心管中，再加入2ml水溶性處理液，充分振蕩混勻，室溫放 置lh，得到渾濁的卵黃抗體提取液A，備用；
[0022] B、氯仿提取卵黃中抗體
[0023] 吸取2ml提取卵黃加入離心管中，加入2ml磷酸鹽緩沖液，混合后加入4ml氯仿，充 分振蕩混勾，室溫放置lh，期間攪拌混勾3次，再通過(guò)3000r/min離心10min，出現(xiàn)分層，上層 為卵黃抗體提取液B，分離備用；
[0024] (3)兩種提取方式卵黃液的混合
[0025] 將步驟2所得到的卵黃抗體提取液A與B按等量比例混合得混合液，即為監(jiān)測(cè)用卵 黃抗體樣品；
[0026] (4)血凝試驗(yàn)
[0027]在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25iil PBS，吸取一定倍數(shù)稀釋的 H9亞型禽流感抗原25yl加于第1列孔，充分混合后移出25yl至第2列孔，依次類(lèi)推做等量倍 比稀釋至第11列孔，第11列孔棄去25此;設(shè)立第12列孔為紅細(xì)胞對(duì)照；每孔再加25iil PBS; 每孔各加入0.75 %雞紅細(xì)胞懸液25iil;立即置微型振蕩器上混合lmin，或手持血凝板繞圓 圈混勾lmin;在室溫下作用30min，或在4°C下作用60min;觀察數(shù)次，直至對(duì)照的紅細(xì)胞全部 沉淀為一個(gè)圓點(diǎn)，將血凝板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無(wú)淚珠樣流掛，根據(jù)血凝圖像判定結(jié)果；
[0028]血凝效價(jià)高于211時(shí)可繼續(xù)增加稀釋的孔數(shù)，以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為 該抗原的血凝效價(jià)，此時(shí)血凝效價(jià)為2n，n>ll，再根據(jù)初始稀釋度計(jì)算抗原的血凝單位;并 根據(jù)測(cè)定的抗原的血凝效價(jià)，計(jì)算4個(gè)血凝單位抗原的稀釋倍數(shù)，制備4個(gè)血凝單位抗原； [0029] (5)血凝抑制試驗(yàn)與效價(jià)確認(rèn)
[0030] 在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25iil PBS;
[0031]將步驟3的混合液，取體積25iil于第1列孔，混勻后由左向右順序倍比稀釋至第11 列孔，最后棄去25iil;第1列孔至第12列孔分別加25iil含4個(gè)血凝單位的H9亞型禽流感抗原； 立即置微型振蕩器上混合lmin，或手持血凝板繞圓圈混勻lmin;在室溫下作用30min，或在4 °C下作用60min;每孔加0.75%雞紅細(xì)胞懸液25yl;混合后置室溫下作用40min或在4°C下作 用60min，此時(shí)對(duì)照的紅細(xì)胞已沉淀為一個(gè)圓點(diǎn);血凝抑制效價(jià)高于2 11時(shí)可繼續(xù)增加稀釋的 孔數(shù)，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為該混合液的血凝抑制效價(jià)，測(cè)定抗體效價(jià) 加上修訂系數(shù)即為卵黃抗體替代血清抗體的血凝抑制效價(jià)；
[0032] 主要試劑及配制：
[0033] PBS:配制20倍PB:稱(chēng)量5.157g Na2HP〇4 ? 12H20和0.874g NaH2P〇4 ? 2H20,加蒸餾水 至100ml;配制1倍PBS:量取50ml 20倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸餾水至1000ml;用NaOH或HC1 調(diào)pH值至7.2; 121°C高壓蒸汽滅菌15min;
[0034] 0.75%雞紅細(xì)胞懸液:采集至少3只SPF公雞或無(wú) H9亞型禽流感抗體的健康公雞的 血液與等體積紅細(xì)胞保存阿氏液混合，用前述PBS液洗滌3次，每次均以1000r/min離心 lOmin，洗滌后用前述PBS配成0.75 %紅細(xì)胞懸液，4°C保存?zhèn)溆?，所?.75 %均為體積比。 [0035]所述阿氏液配方為：紅細(xì)胞保存阿氏液：稱(chēng)葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸 0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100ml，溶解后調(diào)pH值至6.1，115°C高壓蒸汽滅菌20min，4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0036]進(jìn)一步地，步驟(2)中所述的水溶性處理液為生理鹽水、枸櫞酸鈉溶液或磷酸鹽緩 沖液中的任意一種。
[0037]進(jìn)一步地，所述步驟(3)中的按等量比例，是卵黃抗體提取液A: 50 %，卵黃抗體提 取液B: 50 %。
[0038] 進(jìn)一步地，所述步驟(5)得到的血凝抑制效價(jià)，加上修訂系數(shù)，修訂系數(shù)受疫苗、免 疫時(shí)期、免疫程序等影響，修訂后的效價(jià)作為卵黃抗體替代血清抗體的H9亞型禽流感血凝 抑制效價(jià)。
[0039] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明以禽蛋作為檢測(cè)樣品，用水溶性處理液提取卵黃液 和氯仿提取卵黃液，兩種提取液進(jìn)行等量混合，進(jìn)行混合液的!19亞型禽流感抗體效價(jià)測(cè)定， 經(jīng)適當(dāng)修訂后代替血清抗體效價(jià)。修訂系數(shù)為〇-〇. 5，是受疫苗種類(lèi)、免疫時(shí)期、免疫程序等 因素影響。通過(guò)該方法，抗體監(jiān)測(cè)操作更簡(jiǎn)便、更安全，結(jié)果更準(zhǔn)確、更可靠，大大提高H9亞 型禽流感抗體監(jiān)測(cè)在生產(chǎn)中的適用性。本發(fā)明利用卵黃樣本代替血清樣本，利用水溶性處 理液提取卵黃液和氯仿提取卵黃液進(jìn)行H9亞型禽流感抗體監(jiān)測(cè)代替血清抗體監(jiān)測(cè)，抗體監(jiān) 測(cè)過(guò)程中不需要采血，只需要收集禽蛋，不會(huì)對(duì)家禽產(chǎn)生應(yīng)激，不會(huì)影響家禽的健康和生產(chǎn) 性能。
【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1是本發(fā)明提供的替代H9亞型禽流感血清抗體監(jiān)測(cè)的卵黃抗體混合液的制備方 法的流程圖。
[0041] 圖2是本發(fā)明提供的替代H9亞型禽流感血清抗體監(jiān)測(cè)的卵黃抗體樣品的計(jì)算方法 的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042]以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式 限制本發(fā)明。
[0043] 一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān)測(cè)的方法，其步驟如下：
[0044] (1)卵黃原料采集
[0045]雞蛋采集是在養(yǎng)禽場(chǎng)中隨機(jī)采集雞蛋20枚或以上，保證采集的雞蛋來(lái)自整個(gè)雞群 的分散度;將禽蛋用鑷子在殼上輕輕敲開(kāi)直徑約lcm的小洞，撕開(kāi)殼膜將蛋清完全倒出，再 打開(kāi)蛋殼將蛋黃完整倒入培養(yǎng)皿，進(jìn)而挑開(kāi)卵黃囊，用注射器直接避開(kāi)表面蛋清抽取卵黃， 將抽取到的卵黃注入到小燒杯中，玻棒攪勻使全部提取卵黃充分混勻，備用；
[0046] (2)卵黃抗體提取
[0047] A、磷酸鹽緩沖液提取卵黃中抗體
[0048]吸取2ml提取卵黃加入離心管中，再加入2ml磷酸鹽緩沖液，充分振蕩混勻，室溫放 置lh，得到渾濁的卵黃抗體提取液A，備用；
[0049] B、氯仿提取卵黃中抗體
[0050] 吸取2ml提取卵黃加入離心管中，加入2ml磷酸鹽緩沖液，混合后加入4ml氯仿，充 分振蕩混勾，室溫放置lh，期間攪拌混勾3次，再通過(guò)3000r/min離心10min，出現(xiàn)分層，上層 為卵黃抗體提取液B，分離備用；
[0051] (3)兩種提取方式卵黃液的混合
[0052] 將步驟2所得到的卵黃抗體提取液A與B按等量比例混合得混合液，其中，卵黃抗體 提取液A:50%，卵黃抗體提取液B:50%，即為監(jiān)測(cè)用卵黃抗體樣品；
[0053] (4)血凝試驗(yàn)
[0054]在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25iil PBS，吸取一定倍數(shù)稀釋的 H9亞型禽流感抗原25yl加于第1列孔，充分混合后移出25yl至第2列孔，依次類(lèi)推做等量倍 比稀釋至第11列孔，第11列孔棄去25此;設(shè)立第12列孔為紅細(xì)胞對(duì)照；每孔再加25iil PBS; 每孔各加入0.75 %雞紅細(xì)胞懸液25iil;立即置微型振蕩器上混合lmin，或手持血凝板繞圓 圈混勾lmin;在室溫下作用30min，或在4°C下作用60min;觀察數(shù)次，直至對(duì)照的紅細(xì)胞全部 沉淀為一個(gè)圓點(diǎn)，將血凝板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無(wú)淚珠樣流掛，根據(jù)血凝圖像判定結(jié)果； [0055]血凝效價(jià)高于2 11時(shí)可繼續(xù)增加稀釋的孔數(shù)，以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為 該抗原的血凝效價(jià)，此時(shí)血凝效價(jià)為2n，n>ll，再根據(jù)初始稀釋度計(jì)算抗原的血凝單位;并 根據(jù)測(cè)定的抗原的血凝效價(jià)，計(jì)算4個(gè)血凝單位抗原的稀釋倍數(shù)，制備4個(gè)血凝單位抗原； [0056] (5)血凝抑制試驗(yàn)與效價(jià)確認(rèn)
[0057] 在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25yl PBS;
[0058]將步驟3的混合液，取體積25iil于第1列孔，混勻后由左向右順序倍比稀釋至第11 列孔，最后棄去25iil;第1列孔至第12列孔分別加25iil含4個(gè)血凝單位的H9亞型禽流感抗原； 立即置微型振蕩器上混合lmin，或手持血凝板繞圓圈混勻lmin;在室溫下作用30min，或在4 °C下作用60min;每孔加0.75%雞紅細(xì)胞懸液25yl;混合后置室溫下作用40min或在4°C下作 用60min，此時(shí)對(duì)照的紅細(xì)胞已沉淀為一個(gè)圓點(diǎn);血凝抑制效價(jià)高于2 11時(shí)可繼續(xù)增加稀釋的 孔數(shù)，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為該混合液的血凝抑制效價(jià)，測(cè)定抗體效價(jià) 加上修訂系數(shù)即為卵黃抗體替代血清抗體的血凝抑制效價(jià);血凝抑制效價(jià)，加上修訂系數(shù)， 修訂系數(shù)受疫苗、免疫時(shí)期、免疫程序等影響，修訂后的效價(jià)作為卵黃抗體替代血清抗體的 H9亞型禽流感血凝抑制效價(jià)。
[0059] 主要試劑及配制：
[0060] PBS:配制20倍PB:稱(chēng)量5.157g Na2HP〇4 ? 12H20和0.874g NaH2P〇4 ? 2H20,加蒸餾水 至100ml;配制1倍PBS:量取50ml 20倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸餾水至1000ml;用NaOH或HC1 調(diào)pH值至7.2; 121°C高壓蒸汽滅菌15min;
[00611 0.7 5 %雞紅細(xì)胞懸液:采集至少3只SPF公雞或H9亞型禽流感抗體的健康公雞的血 液與等體積紅細(xì)胞保存阿氏液混合，用前述PBS液洗滌3次，每次均以1000r/min離心10min， 洗滌后用前述PBS配成0.75 %紅細(xì)胞懸液，4 °C保存?zhèn)溆?，所?.75 %均為體積比。
[0062]所述阿氏液配方為：紅細(xì)胞保存阿氏液：稱(chēng)葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸 0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100ml，溶解后調(diào)pH值至6.1，115°C高壓蒸汽滅菌20min，4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0063]為了證實(shí)本發(fā)明方法的有效性，特將實(shí)測(cè)單用氯仿法以及單用磷酸緩沖液提取測(cè) 定的卵黃數(shù)值與本發(fā)明數(shù)值產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行簡(jiǎn)單比較。列表如下：
[0064]表1 H9亞型禽流感3種卵黃抗體效價(jià)及對(duì)應(yīng)血清抗體效價(jià)結(jié)果（以log2表示）
[0066]表1為H9亞型禽流感的卵黃抗體及對(duì)應(yīng)血清抗體結(jié)果，磷酸鹽緩沖液提取卵黃液 和氯仿提取卵黃液抗體效價(jià)與血清抗體效價(jià)偏差較大，符合度較低，而磷酸鹽緩沖液、氯仿 提取卵黃液的等量混合液抗體效價(jià)加上修訂系數(shù)與血清抗體效價(jià)偏差較小，符合度較高， 明顯優(yōu)于磷酸鹽緩沖液提取卵黃液抗體效價(jià)或氯仿提取卵黃液抗體效價(jià)，其效價(jià)值比較接 近血清效價(jià)測(cè)算結(jié)果，而其操作起來(lái)又沒(méi)有血清效價(jià)檢測(cè)的儀器要求和繁瑣步驟，是一種 可信度較高的，可在一定程度上代替亞型禽流感血清抗體監(jiān)測(cè)的方法。
[0067] 本發(fā)明在實(shí)際測(cè)定中的注意事項(xiàng)：
[0068] (1)試驗(yàn)所用抗原的效價(jià)一定得標(biāo)定準(zhǔn)確，每次監(jiān)測(cè)之前一定先準(zhǔn)確測(cè)定抗原的 效價(jià)，應(yīng)該是同時(shí)測(cè)2-3遍取其平均值，然后根據(jù)其準(zhǔn)確效價(jià)配制所需抗原液(4單位抗原）。 抗原液配制好后，要自測(cè)一次，即在不加血清的情況下，第1、第2孔的血球完全凝集，第3孔 部分凝集(血球在孔壁凝成一紅圈而不是均勻的凝集），說(shuō)明4單位抗原的配制沒(méi)有問(wèn)題，可 以使用。
[0069] (2)紅細(xì)胞應(yīng)采自沒(méi)有免疫過(guò)的成熟公雞，未成熟的公雞紅細(xì)胞較脆弱，易溶血， 不能用。紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)反復(fù)離心洗滌后配成0.75 %為更好，實(shí)踐證明，1 %的紅細(xì)胞都不如 0.75%的好。紅細(xì)胞懸浮液最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)紅細(xì)胞發(fā)生破裂，會(huì)影響試驗(yàn)結(jié) 果。
[0070] (3)修訂系數(shù)通常為0-0.5，實(shí)施例中確定為0.4，修訂系數(shù)與疫苗、免疫時(shí)期、免疫 程序等有關(guān)，需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，可靠的修訂系數(shù)可進(jìn)一步提高抗體效價(jià)的準(zhǔn)確性。
[0071]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本 發(fā)明所涉及的組成成分和制備方法均可根據(jù)實(shí)施方式進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，但不能超出該發(fā)明保 護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān)測(cè)的方法，其特征在于，步驟如下： (1) 卵黃原料采集 雞蛋采集是在養(yǎng)禽場(chǎng)中隨機(jī)采集雞蛋20枚或以上，保證采集的雞蛋來(lái)自整個(gè)雞群的分 散度;將禽蛋用鑷子在殼上輕輕敲開(kāi)直徑Icm的洞，撕開(kāi)殼膜將蛋清完全倒出，再打開(kāi)蛋殼 將蛋黃完整倒入培養(yǎng)皿，進(jìn)而挑開(kāi)卵黃囊，用注射器直接避開(kāi)表面蛋清抽取卵黃，將抽取到 的卵黃注入到小燒杯中，玻棒攪勻使全部提取卵黃充分混勻，備用； (2) 卵黃抗體提取 A、 水溶性處理液提取卵黃中抗體 吸取2ml提取卵黃加入離心管中，再加入2ml水溶性處理液，充分振蕩混勻，室溫放置 Ih，得到渾濁的卵黃抗體提取液A，備用； B、 氯仿提取卵黃中抗體 吸取2ml提取卵黃加入離心管中，加入2ml磷酸鹽緩沖液，混合后加入4ml氯仿，充分振 蕩混勾，室溫放置Ih，期間攪拌混勾3次，再通過(guò)3000r/min離心10min，出現(xiàn)分層，上層為卵 黃抗體提取液B，分離備用； (3) 兩種提取方式卵黃液的混合 將步驟2所得到的卵黃抗體提取液A與B按等量比例混合得混合液，即為監(jiān)測(cè)用卵黃抗 體樣品； (4) 血凝試驗(yàn) 在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μ1 PBS，吸取一定倍數(shù)稀釋的H9亞 型禽流感抗原25μ1加于第1列孔，充分混合后移出25μ1至第2列孔，依次類(lèi)推做等量倍比稀 釋至第11列孔，第11列孔棄去25yL;設(shè)立第12列孔為紅細(xì)胞對(duì)照;每孔再加25μ1 I3BS;每孔 各加入0.75 %雞紅細(xì)胞懸液25μ1;立即置微型振蕩器上混合Imin，或手持血凝板繞圓圈混 勾Imin;在室溫下作用30min，或在4°C下作用60min;觀察數(shù)次，直至對(duì)照的紅細(xì)胞全部沉淀 為一個(gè)圓點(diǎn)，將血凝板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無(wú)淚珠樣流掛，根據(jù)血凝圖像判定結(jié)果； 血凝效價(jià)高于211時(shí)可繼續(xù)增加稀釋的孔數(shù)，以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為該抗 原的血凝效價(jià)，此時(shí)血凝效價(jià)為2η，η>11，再根據(jù)初始稀釋度計(jì)算抗原的血凝單位;并根據(jù) 測(cè)定的抗原的血凝效價(jià)，計(jì)算4個(gè)血凝單位抗原的稀釋倍數(shù)，制備4個(gè)血凝單位抗原； (5) 血凝抑制試驗(yàn)與效價(jià)確認(rèn) 在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μ1 PBS; 將步驟3的混合液，取體積25μ1于第1列孔，混勻后由左向右順序倍比稀釋至第11列孔， 最后棄去25μ1;第1列孔至第12列孔分別加25μ1含4個(gè)血凝單位的Η9亞型禽流感抗原;立即 置微型振蕩器上混合lmin，或手持血凝板繞圓圈混勻Imin;在室溫下作用30min，或在4°C下 作用60min;每孔加0.75 %雞紅細(xì)胞懸液25μ1;混合后置室溫下作用40min或在4°C下作用 60min，此時(shí)對(duì)照的紅細(xì)胞已沉淀為一個(gè)圓點(diǎn);血凝抑制效價(jià)高于2 11時(shí)可繼續(xù)增加稀釋的孔 數(shù)，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為該混合液的血凝抑制效價(jià)，測(cè)定抗體效價(jià)加 上修訂系數(shù)即為卵黃抗體替代血清抗體的血凝抑制效價(jià)。2. 如權(quán)利要求1所述的一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān)測(cè)的方法，其 特征在于:步驟(2)中所述的水溶性處理液為生理鹽水、枸櫞酸鈉溶液或磷酸鹽緩沖液中的 任意一種。3. 如權(quán)利要求1所述的一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān)測(cè)的方法，其 特征在于:步驟(3)中的按等量比例，是卵黃抗體提取液A: 50%，卵黃抗體提取液B: 50%。4. 如權(quán)利要求1所述的一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān)測(cè)的方法，其 特征在于:所述步驟(5)得到的血凝抑制效價(jià)，加上修訂系數(shù)，修訂系數(shù)受疫苗、免疫時(shí)期、 免疫程序等影響，修訂后的效價(jià)作為卵黃抗體替代血清抗體的H9亞型禽流感血凝抑制效 價(jià)。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK105929159SQ201610486096
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】孫培明
【申請(qǐng)人】臨沂大學(xué)