一種聯(lián)合檢測(cè)hiv抗原抗體的診斷試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明的一種聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的診斷試劑盒采用雙抗體夾心法和雙抗原夾心法的免疫吸附試驗(yàn)原理，結(jié)合時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)定性檢測(cè)HIV?1型p24抗原和HIV?1/2型抗體；可以將目前HIV檢測(cè)的窗口期縮短至2～3周，有助于HIV的早期診斷，還可以作為預(yù)后判斷、評(píng)價(jià)抗病毒治療效果的依據(jù)；同時(shí)本發(fā)明的試劑盒還具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性優(yōu)異、可測(cè)定范圍寬、檢測(cè)自動(dòng)化程度高和無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的診斷試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及病毒蛋白免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的 診斷試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是一種感染人類免疫 系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒(Lenti virus )，屬反轉(zhuǎn)錄RNA病毒的一種，主要通過性、血液及母嬰進(jìn)行 傳播。該病毒破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失去抵抗力，發(fā)展到最后，導(dǎo)致艾滋病(獲 得性免疫缺陷綜合征）。
[0003] 到目前為止尚無(wú)有效的抗HIV藥物和預(yù)防用HIV疫苗，因此篩查控制傳染源、切斷 HI V傳播途徑，是防止HIV傳播感染的重要手段。在HIV感染早期，感染者血液中首先出現(xiàn)HI V 的核心抗原P24,且p24的水平隨著病毒RNA水平的發(fā)展而發(fā)展，并在急性感染期即可出現(xiàn)， 通常被認(rèn)為是病毒復(fù)制的間接標(biāo)志，此后的1~2個(gè)月內(nèi)才能產(chǎn)生特異性抗體。目前檢測(cè)HIV 抗原抗體的方法主要有:核酸PCR法、酶免ELI SA法以及化學(xué)發(fā)光CLIA法。核酸PCR法的優(yōu)點(diǎn) 是靈敏度及特異性均較高，但缺點(diǎn)也比較明顯就是檢測(cè)需要配備較復(fù)雜的儀器、操作人員 需要進(jìn)行培訓(xùn)，導(dǎo)致檢測(cè)成本高、操作復(fù)雜。酶免ELISA法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、不需要復(fù)雜的 儀器、只需要進(jìn)行簡(jiǎn)單的培訓(xùn)即可進(jìn)行操作，但是由于平臺(tái)所限，其靈敏度相對(duì)較低，測(cè)定 范圍相對(duì)較窄，而且一般檢測(cè)窗口期較長(zhǎng)?；瘜W(xué)發(fā)光CLIA法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度、特異性較高，檢 測(cè)范圍較寬;缺點(diǎn)是由于大多數(shù)板式CLIA試劑盒仍采用EIA相同的酶促反應(yīng)，以辣根酶或堿 性磷酸酶交聯(lián)抗體，使用魯米諾或金剛烷等作為底物，檢測(cè)的是動(dòng)態(tài)發(fā)光，導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)值 衰減較快、高濃度和低濃度信號(hào)衰減速度不一致，限制了其在免疫定量分析中的低端檢測(cè) 靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的一種兼具靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定 性好、可測(cè)定范圍寬、試劑有效期長(zhǎng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)的聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的時(shí)間分辨 免疫熒光診斷試劑盒及其制備方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：
[0006] 一種聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的診斷試劑盒，包括包被反應(yīng)板，還包括鑭系元素離子 標(biāo)記的HIV重組抗原、生物素標(biāo)記的p24抗體、鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體;所述包被 反應(yīng)板為吸附有HIV重組抗原和抗p24單抗的微孔板，所述HIV重組抗原包括HIV-1型抗原和 HIV-2型抗原。
[0007] 為了優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明采取的技術(shù)措施還包括：
[0008] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的診斷試劑盒還包括陰陽(yáng)性對(duì)照、緩沖 液、洗滌液、熒光增強(qiáng)液。
[0009] 優(yōu)選地，本發(fā)明中所述鑭系元素離子為￡1!3+、1133+、5111 3+、073+中的至少一種，更優(yōu)選 為為Eu3+。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明使用的熒光增強(qiáng)液含有二酮類化合物或芳香胺類化合物。
[0011] 另一方面，本發(fā)明還提供制備上述聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的診斷試劑盒的方法，包 括下述步驟：
[0012]步驟1:制備預(yù)處理包被反應(yīng)板
[0013] 使用黑色聚苯乙烯制備板架，預(yù)留與酶標(biāo)板相互配合的通孔;酶標(biāo)板經(jīng)過鈷60輻 照30天后，與板架配合組裝，獲得預(yù)處理包被反應(yīng)板，備用；
[0014] 步驟2:包被板的獲得
[0015] 用碳酸鹽緩沖液將HIV-1和HIV-2重組抗原稀釋至0.2-lyg/mL，抗-p24單抗稀釋至 2-lOyg/mL，以100此/孔包被過夜，然后洗滌、封閉、干燥，將微孔板真空密封于鋁箱袋內(nèi)，冷 減備用；
[0016]步驟3:制備鑭系元素離子標(biāo)記的HIV重組抗原和鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗 體
[0017] HIV-1型抗原、HIV-2型抗原經(jīng)碳酸鹽緩沖液透析后，與鑭系元素離子按3:1比例混 合，靜置24-48小時(shí)，用Sephracry G-50分離柱純化，得到鑭系元素離子標(biāo)記的HIV-1型抗 原、鑭系元素離子標(biāo)記HIV-2型抗原;抗生物素抗體經(jīng)碳酸鹽緩沖液透析后，與鑭系元素離 子按3:1比例混合，靜置24-48小時(shí)，用Sephadex G-50分離柱純化，得到鑭系元素離子標(biāo)記 的抗生物素抗體，用保存液將上述鑭系元素離子標(biāo)記的HIV-1型抗原、鑭系元素離子標(biāo)記的 HIV-2型抗原及鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體混合保存?zhèn)溆茫?br>[0018]步驟4:制備生物素標(biāo)記的p24抗體
[0019] 將抗-P24抗體經(jīng)磷酸鹽緩沖液透析后，與生物素按1:1比例混合，靜置2-4小時(shí)，再 用磷酸鹽緩沖液透析，得到生物素標(biāo)記抗_p24抗體，用稀釋液稀釋生物素標(biāo)記抗-p24抗體 保存?zhèn)溆茫?br>[0020] 步驟5:熒光增強(qiáng)液的配制
[0021]以無(wú)水乙醇溶解P-NTA、T0P0，再加入令苯二甲酸氫鉀和三蒸水，40 °C溶解后，加入 乙酸、Ttiton X-100，調(diào)PH至3? 2，定容后保存?zhèn)溆茫?br>[0022]步驟6:組裝各個(gè)組分，獲得聯(lián)合檢測(cè)HI V抗原抗體的診斷試劑盒。
[0023] 優(yōu)選地，上述鑭系元素離子為Eu3+。
[0024] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
[0025] 本試劑盒采用的是時(shí)間分辨免疫熒光分析法，應(yīng)用鑭系元素作為示蹤劑，標(biāo)記抗 原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光。同時(shí)檢測(cè)HIV抗體 及P24抗原，可以將目前HIV檢測(cè)的窗口期縮短至2~3周，有助于HIV的早期診斷，還可以作 為預(yù)后判斷、評(píng)價(jià)抗病毒治療效果的依據(jù);利用時(shí)間分辨免疫熒光分析法同時(shí)檢出波長(zhǎng)和 時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異性熒光的干擾，極大的提高了靈敏度;另 外，本發(fā)明的包被反應(yīng)板的為完全不透光的板架和相應(yīng)配合的酶標(biāo)板組成，使得陰性樣本 與Blank的熒光本底大大降低，信噪比顯著提高，酶標(biāo)板包被采用特殊輻照，使得包被效果 顯著提高，進(jìn)而進(jìn)一步地提高了試劑盒的靈敏度;所述本發(fā)明試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度 高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性優(yōu)異、可測(cè)定范圍寬、檢測(cè)自動(dòng)化程度高和無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0026] 圖1為利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行HIV抗體抗原檢測(cè)的檢測(cè)原理示意圖；
[0027] 圖2為本發(fā)明的試劑盒中包被反應(yīng)板的板架示意圖；
[0028] 圖3為發(fā)明的試劑盒中包被反應(yīng)板的整體示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明提供了一種聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的診斷試劑盒，包括包被反應(yīng)板，還包括 鑭系元素離子標(biāo)記的HIV重組抗原、生物素標(biāo)記的p24抗體、鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素 抗體;所述包被反應(yīng)板為吸附有HIV重組抗原和抗p24單抗的微孔板，所述HIV重組抗原在包 被前需先用處理劑進(jìn)行處理，所述HIV重組抗原包括HIV-1型抗原和HIV-2型抗原。
[0030] 本發(fā)明的一種聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的診斷試劑盒采用雙抗體夾心法和雙抗原夾 心法的免疫吸附試驗(yàn)原理，結(jié)合時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)定性檢測(cè)HIV-1型p24抗原和HIV-1/ 2型抗體。測(cè)定程序如附圖1所示，微孔表面預(yù)包被HIV重組抗原和抗p24單抗，配以生物素標(biāo) 記P24抗體、鑭系元素離子標(biāo)記HIV重組抗原、鑭系元素離子標(biāo)記抗生物素抗體、增強(qiáng)液等其 他試劑。當(dāng)待檢樣本中存在p24抗原時(shí)，在微孔表面反應(yīng)形成"固相抗p24單抗-p24抗原-生 物素標(biāo)記P24抗體-鑭系元素離子標(biāo)記抗生物素抗體"的免疫復(fù)合物；當(dāng)待檢樣本中存在HIV 抗體時(shí)，在微孔表面反應(yīng)形成"固相HIV重組抗原-HIV抗體-鑭系元素離子標(biāo)記HIV重組抗 原"的免疫復(fù)合物。然后加入增強(qiáng)液，將固相表面復(fù)合物上的鑭系元素離子解離至溶液中。 鑭系元素離子與增強(qiáng)液中的組分形成強(qiáng)熒光絡(luò)合物，其熒光強(qiáng)度與樣本中的HIV-1型p24抗 原和HIV-1/2型抗體的濃度成正相關(guān)。
[0031 ]下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的試劑盒及其制備方法進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以 使更好的理解本發(fā)明，但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0032]實(shí)施例一聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的診斷試劑盒的制備 [0033]本實(shí)施例中，使用Eu3+作為熒光標(biāo)記物，具體操作如下：
[0034] 1.包被板的獲得：
[0035]本發(fā)明的包被反應(yīng)板和現(xiàn)有技術(shù)中的包被反應(yīng)板均不同，在制備過程中使用特制 模具，整體的板架采用完全不透光的黑色聚苯乙烯制作，底部設(shè)有和酶標(biāo)板相應(yīng)孔徑的通 孔(如圖2所示）；酶標(biāo)板則采用透光優(yōu)秀的材料制備，在包被抗體前，經(jīng)鈷60輻照30天，獲得 高吸附性后，與板架組裝，獲得僅僅微孔底部透光的高吸附性預(yù)處理包被反應(yīng)板備用，如附 圖3所示。
[0036] 所述處理劑型號(hào)為HM，購(gòu)自深圳市菲鵬生物股份有限公司。所述處理過程為：將 HI V重組抗原與處理劑HM按體積比為19:1進(jìn)行混合，處理溫度為18 °C~28 °C，處理0.5-1小 時(shí)。
[0037]用碳酸鹽緩沖液將HIV-1+2重組融合抗原稀釋至0.2-lyg/mL，抗-p24單抗稀釋至 2-10iig/mL，100iiL/孔，包被過夜后經(jīng)洗滌、封閉、干燥等程序，將微孔板條真空密封于鋁箱 袋內(nèi)，冷藏備用。
[0038] 2.銪標(biāo)記物的獲得:銪標(biāo)記物包括銪標(biāo)記HIV-1型抗原、銪標(biāo)記HIV-2型抗原及銪 標(biāo)記抗生物素抗體。HIV-1型抗原、HIV-2型抗原經(jīng)碳酸鹽緩沖液透析后，與銪按3:1比例混 合，靜置24-48小時(shí)，用Sephracry G-50分離柱純化，得到銪標(biāo)記HIV-1型抗原、銪標(biāo)記HIV-2 型抗原；抗生物素抗體經(jīng)碳酸鹽緩沖液透析后，與銪按3 :1比例混合，靜置24-48小時(shí)，用 Sephadex G-50分離柱純化，得到銪標(biāo)記抗生物素抗體。用保存液將上述銪標(biāo)記HIV-1型抗 原、銪標(biāo)記HIV-2型抗原及銪標(biāo)記抗生物素抗體混合得到銪標(biāo)記物。
[0039] 3.生物素試劑的獲得:將抗_p24抗體經(jīng)磷酸鹽緩沖液透析后，與生物素按1:1比例 混合，靜置2-4小時(shí)，再用磷酸鹽緩沖液透析，得到生物素標(biāo)記抗-p24抗體。用稀釋液稀釋生 物素標(biāo)記抗_p24抗體得到生物素試劑。
[0040] 4.陽(yáng)性對(duì)照的獲得:將抗HIV-1陽(yáng)性血清用稀釋液稀釋一定倍數(shù)后得到HIV-1抗體 陽(yáng)性對(duì)照;將抗HIV-2陽(yáng)性血清用稀釋液稀釋一定倍數(shù)后得到HIV-2抗體陽(yáng)性對(duì)照；將HIV-lp24重組抗原用稀釋液稀釋一定倍數(shù)后得到HIV-lp24抗原陽(yáng)性對(duì)照。
[00411 5.增強(qiáng)液的配制：以無(wú)水乙醇溶解P-NTA、T0P0,再加入令苯二甲酸氫鉀和三蒸水， 40°C溶解后，加入乙酸、Ttiton X-100，調(diào)PH至3 ? 2，定容。
[0042]上述組分制備完畢后，加入標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液、洗滌液等其他試劑盒組分，制備得到 聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的時(shí)間分辨免疫熒光診斷試劑盒。
[0043]實(shí)施例二利用聯(lián)合檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HIV抗原及抗體
[0044] 反應(yīng)板每板設(shè)置陰性對(duì)照3孔，HIV-1抗體陽(yáng)性對(duì)照2孔，HIV-2抗體及HIV-lp24抗 原陽(yáng)性對(duì)照各1孔，按順序分別在相應(yīng)孔中加入1〇〇此陰、陽(yáng)性對(duì)照及待測(cè)樣本，室溫（18°C ~28°C)于振蕩器慢檔反應(yīng)1小時(shí)；
[0045]用洗滌液清洗6遍，每孔加入lOOiiL銪標(biāo)記物工作液，室溫（18°C~28°C )于振蕩器 慢檔反應(yīng)30分鐘；
[0046]用洗滌液清洗6遍，每孔加入100iiL增強(qiáng)液，室溫（18°C~28°C)于振蕩器慢檔反應(yīng)5 分鐘；
[0047]將反應(yīng)板置于熒光檢測(cè)儀選擇相應(yīng)程序讀取數(shù)值。
[0048]實(shí)施例三本發(fā)明的試劑盒與酶免診斷試劑盒的比較實(shí)驗(yàn)
[0049] 利用本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的時(shí)間分辨免疫熒光診斷試劑盒與普通酶免 診斷試劑盒(萬(wàn)泰）同時(shí)檢測(cè)1025份HIV樣本，若樣本初測(cè)結(jié)果不一致，則用兩種檢測(cè)試劑盒 再檢測(cè)一遍。
[0050] 檢測(cè)結(jié)果顯示:有5份樣本的檢測(cè)結(jié)果不一致。以酶免ELISA法的檢測(cè)結(jié)果為參考， 則時(shí)間分辨免疫熒光法的靈敏度達(dá)到99.2 %，特異性達(dá)到100 %，符合率達(dá)到99.5 % (表1)。 [0051]表1兩種檢測(cè)方法檢測(cè)HIV樣本結(jié)果比較
[0053]特異性的比較
[0054]對(duì)上述5份初測(cè)結(jié)果不一致的樣本用確證試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示這5份樣本均 為陰性。證明本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的時(shí)間分辨免疫熒光診斷試劑盒在特異性方 面比現(xiàn)行酶免ELISA試劑盒高。
[0055]靈敏度的比較
[0056]選取5份覆蓋低中高濃度的陽(yáng)性樣本進(jìn)行倍比稀釋，同時(shí)用兩種試劑盒檢測(cè)，分別 記錄兩種試劑盒各自到達(dá)陽(yáng)性的最低滴度，從而比較兩種檢測(cè)方法的靈敏度。
[0057]結(jié)果表明：本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的時(shí)間分辨免疫熒光診斷試劑盒是普 通酶免ELISA試劑盒的2~4倍(表2)。
[0058]表2兩種檢測(cè)方法的靈敏度比較
[0060]從上表的結(jié)果可見本發(fā)明的本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的時(shí)間分辨免疫熒光 診斷試劑盒靈敏度高于普通酶免ELISA法試劑盒。采用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)HIV能提高檢測(cè) 靈敏度，縮短HIV檢測(cè)窗口期，有效防止因漏檢導(dǎo)致的傳染，在臨床上具有重要的意義。
[0061 ]時(shí)間分辨免疫熒光法的重復(fù)性分析
[0062]選取低中高3份不同的陽(yáng)性樣品，用同一批本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的時(shí)間 分辨免疫熒光診斷試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品分別平行檢測(cè)10孔，進(jìn)行試劑盒批內(nèi)重復(fù)性 分析;選取低中高3份不同的陽(yáng)性樣品，用3批不同批次的時(shí)間分辨免疫熒光法診斷試劑盒 進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品平行檢測(cè)2孔，進(jìn)行試劑盒批間重復(fù)性分析。
[0063]檢測(cè)結(jié)果為:本發(fā)明的試劑盒的批內(nèi)平均變異系數(shù)為3.96% (表3);批間平均變異 系數(shù)為7.64 % (表4)，由此可以確定，本發(fā)明的試劑盒批內(nèi)及批間重復(fù)性均較好。
[0064]表3時(shí)間分辨免疫熒光法診斷試劑盒批內(nèi)重復(fù)性分析
[0066]表4時(shí)間分辨免疫熒光法診斷試劑盒批間重復(fù)性分析

[0068] 時(shí)間分辨免疫焚光法的穩(wěn)定性分析
[0069] 將本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的時(shí)間分辨免疫熒光診斷試劑盒于37°C環(huán)境中 保存7天后取出，與4°C環(huán)境中保存的試劑盒同時(shí)檢測(cè)低中高3份不同的陽(yáng)性樣品，結(jié)果顯 示:37°C的檢測(cè)結(jié)果與4°C的檢測(cè)結(jié)果相比較沒有明顯的差異，偏差在10%以內(nèi)（表5)，說明 本發(fā)明的試劑盒至少在4°C能穩(wěn)定保存12個(gè)月，其穩(wěn)定性較好。
[0070] 表5時(shí)間分辨免疫熒光法診斷試劑盒穩(wěn)定性分析
[0072]從上述對(duì)比可知，相較于現(xiàn)行的普通酶免ELISA法試劑盒，本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)HIV 抗原抗體的時(shí)間分辨免疫熒光診斷試劑盒的靈敏度更高、特異性更好;相較于現(xiàn)行的化學(xué) 發(fā)光CLIA法，本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的時(shí)間分辨免疫熒光診斷試劑盒的重復(fù)性、穩(wěn) 定性更好，所以本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的時(shí)間分辨免疫熒光診斷試劑盒能更好地 滿足臨床檢測(cè)的要求。
[0073] 綜上所述，本試劑盒采用的是時(shí)間分辨免疫熒光分析法，應(yīng)用鑭系元素作為示蹤 劑，標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光。同時(shí)檢 測(cè)HIV抗體及p24抗原，可以將目前HIV檢測(cè)的窗口期縮短至2~3周，有助于HIV的早期診斷， 還可以作為預(yù)后判斷、評(píng)價(jià)抗病毒治療效果的依據(jù);利用時(shí)間分辨免疫熒光分析法同時(shí)檢 出波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異性熒光的干擾，極大的提高了 靈敏度;所述本發(fā)明試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性優(yōu)異、可測(cè)定范圍 寬、檢測(cè)自動(dòng)化程度高和無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。
[0074] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的診斷試劑盒，包括包被反應(yīng)板，其特征在于，還包括鑭 系元素離子標(biāo)記的HIV重組抗原、生物素標(biāo)記的p24抗體、鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗 體;所述包被反應(yīng)板為吸附有HIV重組抗原和抗p24單抗的微孔板，所述HIV重組抗原包括 HIV-I型抗原和HIV-2型抗原。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括陰陽(yáng)性對(duì)照、緩沖液、洗滌液、熒 光增強(qiáng)液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+、Tb3+、Sm 3+、Dy3+ 中的至少一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光增強(qiáng)液含有β-二酮類化合物或 芳香胺類化合物。6. -種制備如權(quán)利要求1所述的試劑盒的方法，其特征在于，包括下述步驟： 步驟1:制備預(yù)處理包被反應(yīng)板 使用黑色聚苯乙烯制備板架，預(yù)留與酶標(biāo)板相互配合的通孔;酶標(biāo)板經(jīng)過鈷60輻照30 天后，與板架配合組裝，獲得預(yù)處理包被反應(yīng)板，備用； 步驟2:包被板的獲得 用碳酸鹽緩沖液將HIV-I和HIV-2重組抗原稀釋至0.2-lyg/mL，抗-ρ24單抗稀釋至2-10 yg/mL，以lOOyL/孔包被過夜，然后洗滌、封閉、干燥，將微孔板真空密封于鋁箱袋內(nèi)，冷藏備 用； 步驟3:制備鑭系元素離子標(biāo)記的HIV重組抗原和鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體 HIV-I型抗原、HIV-2型抗原經(jīng)碳酸鹽緩沖液透析后，與鑭系元素離子按3:1比例混合， 靜置24-48小時(shí)，用Sephracry G-50分離柱純化，得到鑭系元素離子標(biāo)記的HIV-I型抗原、鑭 系元素離子標(biāo)記HIV-2型抗原;抗生物素抗體經(jīng)碳酸鹽緩沖液透析后，與鑭系元素離子按3: 1比例混合，靜置24-48小時(shí)，用Sephadex G-50分離柱純化，得到鑭系元素離子標(biāo)記的抗生 物素抗體，用保存液將上述鑭系元素離子標(biāo)記的HIV-I型抗原、鑭系元素離子標(biāo)記的HIV-2 型抗原及鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體混合保存?zhèn)溆茫? 步驟4:制備生物素標(biāo)記的ρ24抗體 將抗-ρ24抗體經(jīng)磷酸鹽緩沖液透析后，與生物素按1:1比例混合，靜置2-4小時(shí)，再用磷 酸鹽緩沖液透析，得到生物素標(biāo)記抗_ρ24抗體，用稀釋液稀釋生物素標(biāo)記抗-ρ24抗體保存 備用； 步驟5:熒光增強(qiáng)液的配制 以無(wú)水乙醇溶解β-ΝΤΑ、Τ0Ρ0,再加入令苯二甲酸氫鉀和三蒸水，40°C溶解后，加入乙 酸、Ttiton X-100，調(diào)PH至3 · 2，定容后保存?zhèn)溆茫? 步驟6:組裝各個(gè)組分，獲得聯(lián)合檢測(cè)HIV抗原抗體的診斷試劑盒。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，HIV-I和HIV-2重組抗原在包被前需先用處 理劑進(jìn)行處理。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的處理劑的處理過程為:將HIV重組抗 原與處理劑進(jìn)行混合，置于室溫下處理0.5-1小時(shí)。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的混合過程中HIV重組抗原與處理劑 的體積比為19:1。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK105929157SQ201610355304
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年5月25日
【發(fā)明人】張巍, 王登瞻, 黃加喜, 于春紅
【申請(qǐng)人】蘇州新波生物技術(shù)有限公司