多重實(shí)時(shí)熒光定量pcr對(duì)立克次體分型檢測(cè)的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)立克次體分型的檢測(cè)的核酸組、試劑盒及檢測(cè)方法，具體用于對(duì)貝利群立克次體、斑點(diǎn)熱群立克次體和斑疹傷寒立克次體的測(cè)定。本發(fā)明提供的試劑盒，使用方便，所用的試劑少，成本低，檢測(cè)的特異性強(qiáng)，靈敏度高；檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一個(gè)樣本，實(shí)現(xiàn)對(duì)立克次體的基因分型的檢測(cè)，大大簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，減少了重復(fù)操作的步驟，節(jié)省時(shí)間，減輕重復(fù)操作消耗的勞動(dòng)力，并有效節(jié)約成本，實(shí)現(xiàn)了對(duì)立克次體基因型的快速篩查。
【專利說(shuō)明】
多重實(shí)時(shí)黃光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè)的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及用于多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)立克次體 分型的檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 立克次體病乃立克次體目中某些致病微生物所引起的多種急性感染的統(tǒng)稱，是經(jīng) 節(jié)肢動(dòng)物如婢、風(fēng)、圣、蛾等傳播的人畜共患傳染病，也可因家畜如貓、犬抓咬而發(fā)生。立克 次體病呈世界性或地方性流行，臨床表現(xiàn)輕重不一，主要包括流行性斑疹傷寒、斑點(diǎn)熱和戰(zhàn) 壞熱等。立克次體根據(jù)基因分析主要分為S大群，貝利群（Belli),斑點(diǎn)熱群（Spotted fever群)和斑疹傷寒群(Typhus群）。
[0003] 立克次體病早期癥狀多樣，無(wú)特異性臨床特征，臨床誤診率極高。延誤治療可引起 嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至死亡。但是若能在感染早期做出正確的診斷，低廉、有效的強(qiáng)力霉素及 四環(huán)素即可對(duì)立克次體有效。因此快速、準(zhǔn)確的早期診斷是控制立克次體病的關(guān)鍵。
[0004] 傳統(tǒng)的立克次體檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)、PCR和免疫學(xué)診斷。但分離培養(yǎng)耗時(shí) 長(zhǎng)，操作復(fù)雜;PCR和免疫學(xué)方法只能檢測(cè)一種或幾種病原體，不能完全滿足檢測(cè)種類多樣 的立克次體的需要。
[0005] 現(xiàn)有專利公開(kāi)號(hào)為CN105543346A，公開(kāi)了立克次體多重巧光PCR檢測(cè)方法，建立了 流行性斑疹傷寒、地方性斑疹傷寒、Q熱3種病原的多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR方法，該方法僅能 用于斑疹傷寒立克次體和已在系統(tǒng)分類學(xué)上不屬于立克次體屬的Q熱的分型檢測(cè)，不能系 統(tǒng)的將立克次體屬的貝利群(Belli)，斑點(diǎn)熱群（Spotted fever群)和斑疹傷寒群(Typhus 群)=種基因群進(jìn)行分析，且從操作上，每種立克次體需要分別采用3對(duì)引物及探針，檢測(cè) 體系復(fù)雜，用于對(duì)立克次體種的檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度低，易發(fā)生假陰性的檢測(cè)結(jié)果。
[0006] 目前對(duì)于是屬于立克次體屬，但具體屬于哪個(gè)群的檢測(cè)方法還未見(jiàn)到，具體區(qū)分 開(kāi)是屬于哪個(gè)群的立克次體，有助于針對(duì)性預(yù)防，控制，具有重要的研究意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一組用于多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè) 的核酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè)的試 劑盒及其檢測(cè)方法，具體提供了用于實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)立克次體進(jìn)行分型檢測(cè)的試劑及 檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法用于解決了檢測(cè)是否屬于立體次體屬，具體屬于貝利群，斑點(diǎn) 熱群和斑疹傷寒群立克次體群的基因分型問(wèn)題。
[000引為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0009] -組用于多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè)的核酸，該核酸用于分型檢 測(cè)立克次體的貝利群、斑點(diǎn)熱群、斑疹傷寒群，包括立克次體巧光PCR檢測(cè)的上、下游引物， 貝利群探針，斑點(diǎn)熱群探針和斑疹傷寒群探針，其中，
[0010] 所述立克次體巧光PCR檢測(cè)的上游引物序列如SEQ ID No.l所示，下游引物序列如 沈Q ID No.2所示；
[00川所述貝利群探針的序列如沈Q ID No.3所示，
[0012] 所述斑點(diǎn)熱群探針序列如SEQ ID No.4所示，
[0013] 所述斑疹傷寒群探針序列如SEQ ID No.5所示。
[0014] 如上所述的核酸，優(yōu)選地，該組核酸還包括包含立克次體巧光PCR檢測(cè)的陽(yáng)性擴(kuò)增 產(chǎn)物序列，其中，
[001引所述立克次體巧光PCR檢測(cè)的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列包括貝利群立克次體、斑點(diǎn)熱群 立克次體和斑疹傷寒群立克次體的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列，
[0016] 所述貝利群立克次體巧光PCR檢測(cè)的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列，包含如SEQ ID No.6所示 的序列；
[0017] 所述斑點(diǎn)熱群立克次體的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列，包含如SEQ IDNo.7所示的序列；
[001引所述斑疹傷寒群立克次體的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列，包含如SEQ IDNo.8所示的序列。
[0019] -種多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒包括:上述核 酸，其中，上述各條探針的5 '端和3 '端分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記FAM-B冊(cè)1、Texred-B冊(cè)2和CY5-B冊(cè)3。
[0020] 如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，還包括2XPremix EX TaqTM。
[0021] -種多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè)的方法，該方法是非診斷目的的 檢測(cè)方法，用于對(duì)立克次體進(jìn)行分型檢測(cè)，判斷是否為貝利群立克次體，斑點(diǎn)熱群立克次體 和斑疹傷寒群立克次體，具體包括W下步驟：
[0022] (1)從樣品中提取DNA;
[0023] (2)對(duì)上述提取的DNA進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增;其中，巧光定量PCR擴(kuò)增時(shí)，在反應(yīng)體 系中，采用立克次體巧光PCR檢測(cè)的上、下游引物的核巧酸序列如SEQ ID No.USEQ ID No.2所示，貝利群探針的核巧酸序列如SEQ ID No.3所示，其探針5'端和3'端分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記 尸八1和8朋1;斑點(diǎn)熱群探針的核巧酸序列如569 10齡.569 10齡.4所示，其探針5'端和3' 端分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記Texred和冊(cè)Q2;斑疹傷寒群探針的核巧酸序列如SEQ ID No.5所示，其探針 5 '端和3 '端分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記CY5和B冊(cè)3;
[0024] (3)收集巧光信號(hào)，選擇上述巧光基團(tuán)的巧光檢測(cè)模式，基線調(diào)整取3~15個(gè)循環(huán) 的巧光信號(hào)，W闊值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定闊值線；
[0025] (4)結(jié)果判定:待測(cè)樣品巧光增長(zhǎng)曲線超過(guò)闊值線，并呈現(xiàn)良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判 斷為陽(yáng)性，如無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。
[0026] 如上所述的方法，優(yōu)選地，所述步驟(2)中巧光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體如下：
[0027] IX Premix EX TaqTM,
[0028] 所述立克次體巧光PCR檢測(cè)的上、下游引物的終濃度為0.5皿ol/L，所述貝利群探 針的終濃度為O.lwnol/L，所述斑點(diǎn)熱群探針的終濃度為0.1皿ol/L，所述斑疹傷寒群探針 的終濃度為0.1皿ol/L，
[0029] 所述樣品的DM為化1，其余采用滅菌蒸饋水加至總體積25iU。
[0030] 如上所述的方法，優(yōu)選地，同時(shí)設(shè)置無(wú)核酸酶水為陰性對(duì)照；
[0031] 同時(shí)分別設(shè)置包含如SEQ ID No.9所示的序列、SEQ ID No. 10所示的序列、SEQ ID No. 11所示的序列的基因作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0032] 如上所述的方法，優(yōu)選地，所述步驟(2)中巧光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性 階段 94°C 5min，擴(kuò)增階段 94°C 30s，48 °C 30s，72 °C 30s 擴(kuò)增 45 個(gè)循環(huán)，72 °C 7min，4°C 保持。
[0033] 如上所述的方法，優(yōu)選地，所述步驟(4)結(jié)果判定中，所述闊值為35,當(dāng)Ct值《35 時(shí)，有明顯擴(kuò)增曲線為陽(yáng)性結(jié)果;Ct值>40時(shí)，無(wú)明顯擴(kuò)增曲線為陰性結(jié)果。
[0034] 如上所述的方法，優(yōu)選地，該方法還包括驗(yàn)證步驟，具體為將陽(yáng)性樣品進(jìn)行普通 PCR擴(kuò)增，采用立克次體常規(guī)檢測(cè)的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示;并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。
[0035] 本發(fā)明提供了檢測(cè)立克次體的貝利群、斑點(diǎn)熱群和斑疹傷寒群的核酸組，該組核 酸是用于立克次體的分型檢測(cè)。用于同步對(duì)=種立克次體分型檢測(cè)時(shí)，僅用一對(duì)引物對(duì)進(jìn) 行，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，相互探針之間不發(fā)生交叉反應(yīng)，且其檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)。
[0036] 本發(fā)明還提供了一種用于實(shí)時(shí)巧光定量PCR立克次體分型檢測(cè)的試劑盒，建立了 一種比較高效、靈敏的，可同時(shí)立克次體的貝利群、斑點(diǎn)熱群和斑疹傷寒群的方法。該方法 能有效提高檢測(cè)的靈敏度，避免假陰性。提供的檢測(cè)試劑盒使用方便，操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程 度高，有效替代傳統(tǒng)檢測(cè)需要培養(yǎng)、血清分型來(lái)獲得檢測(cè)結(jié)果，且試劑盒所用的試劑少，成 本低，并大大簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，減少了重復(fù)操作的過(guò)程，也就減少了在操作過(guò)程的污染，避 免重復(fù)操作而消耗過(guò)多的勞動(dòng)力，節(jié)省時(shí)間，有效節(jié)約成本，實(shí)現(xiàn)了快速篩查，所用試劑盒 的檢測(cè)效果好，特異性強(qiáng)，靈敏度高。
[0037] 提供的檢測(cè)方法采用完全閉管操作，操作簡(jiǎn)單、方便快捷、通過(guò)直接探測(cè)PCR過(guò)程 中巧光信號(hào)的變化來(lái)獲得定量的結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測(cè)，克服了常規(guī)PCR技術(shù) 的易污染、出現(xiàn)假陽(yáng)性，能有效避免非特異性擴(kuò)增難題，并且適合大批量樣本的篩查檢測(cè)。 [003引被立克次體感染后，在潛伏期和隱性階段，沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)病理病癥、疾病癥狀時(shí)， 一般很難發(fā)現(xiàn)和控制，而本發(fā)明提供的試劑盒具有較高的檢測(cè)靈敏度，且對(duì)1個(gè)樣本的檢測(cè) 可實(shí)現(xiàn)對(duì)立克次體具體屬于哪種基因型，即具體屬于貝利群、斑點(diǎn)熱群和斑疹傷寒群的排 查，且主要是檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有貝利群、斑點(diǎn)熱群和斑疹傷寒群立克次體的核酸，并 不是針對(duì)疾病的診斷，疾病的診斷應(yīng)對(duì)病人的病癥綜合評(píng)價(jià)，才能確診，該檢測(cè)方法只是檢 查是否有相應(yīng)立克次體的核酸，屬于非診斷性的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)立克次體分型的檢測(cè)，可W有 助于提前發(fā)現(xiàn)是否感染立克次體，或是否為立克次體隱性攜帶者，為能及時(shí)有效控立克次 體的傳播與擴(kuò)散，提供有效的技術(shù)支持。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)貝利群陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒靈敏度的擴(kuò)增曲線。
[0040] 圖2為本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)斑點(diǎn)熱群陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒靈敏度的擴(kuò)增曲線。
[0041] 圖3為本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)斑疹傷寒群陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒靈敏度的擴(kuò)增曲線。
[0042] 圖4為本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)貝利群陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0043] 圖5為本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)斑點(diǎn)熱群陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0044] 圖6為本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)斑疹傷寒群陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0045] 圖7為本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)特異性檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046] W下結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明的 實(shí)施方式并不限于此，本發(fā)明提供的核巧酸序列的互補(bǔ)序列也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，如無(wú)特殊說(shuō) 明，所用試劑為常規(guī)試劑，因此凡依照本公開(kāi)內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
[0047]實(shí)施例1引物、探針的設(shè)計(jì)
[004引根據(jù)Genbank檢索立克次體的貝利群、斑點(diǎn)熱群和斑疹傷寒群S群菌株的gltA基 因片段，利用Primer Premie巧.0軟件設(shè)計(jì)巧光PCR上、下游引物分別為RA-F、RA-R，探針?lè)?另IJ為RAb-P(貝利群）、RAs-P(斑點(diǎn)熱群）、Rat-P(斑疹傷寒群），序列如下。
[0049] 立克次體巧光PCR檢測(cè)的上、下游引物(RA-F、RA-R)，具體如下：
[0050] RA-F(SEQ IDNo.1):5' -TTTATGTCYACTGCTTCTTG-3'
[0051 ] RA-R(SEQ IDNo.2):5' -TAATAGCCATAGGATGAGAAG-3'
[0052] 貝利群探針(RAb-P)，斑點(diǎn)熱群探針(RAs-P)和斑疹傷寒群探針(RAt-P)，具體如 下：
[0053] RAb-P(SEQ IDNo.3)：
[0054] 5'-AACCTACATAGACGGTGATAAAGGAATCCTACGAC-3'
[0055] RAs-P(SEQ IDNo.4)：
[0056] 5'-CACCTATATAGACGGTGATAAAGGAATCTTGCGGC-3'
[0057] RAt-P(SEQ IDNo.5)：
[005引 日'-CACATATATAGACGGTGATAAAGGCATATTATGGT-3'。
[0059] 本發(fā)明中，探針的設(shè)計(jì)尤為關(guān)鍵，探針可W在引物擴(kuò)增的片段之間進(jìn)行選擇，但自 身不可形成引物二聚體，否則會(huì)導(dǎo)致假陰性檢測(cè)結(jié)果，用于多重病原菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，不可進(jìn) 行多重檢測(cè)的片段之間有交叉反應(yīng)，否則會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。設(shè)計(jì)探針時(shí)要使哪種立體次 體群探針的報(bào)告基團(tuán)的巧光發(fā)射最大波長(zhǎng)處于不同的光譜范圍，W確保巧光定量PCR儀的 檢測(cè)通道能區(qū)分哪種立體次體群的探針。所W設(shè)計(jì)中，除了用軟件進(jìn)行評(píng)估，確保理論上的 盡可能符合多重反應(yīng)W外，還應(yīng)根據(jù)反應(yīng)的擴(kuò)增曲線進(jìn)行引物和探針濃度的適當(dāng)調(diào)整，直 至擴(kuò)增出最佳擴(kuò)增曲線。
[0060] 本發(fā)明選用的FAM、Texred和CY5^種巧光染料，其波長(zhǎng)處于不同光譜范圍，相互間 不能干擾，具有明顯的區(qū)分效果和信號(hào)強(qiáng)度。
[0061] 經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用上述引物、探針時(shí)，可單獨(dú)用于檢測(cè)各對(duì)應(yīng)的病原菌的檢 ，其探針的5'端和3'端分別可選用標(biāo)記FAM-B冊(cè)1、Texred-BHQ2和CY5-BHQ3。但進(jìn)行同時(shí) 檢測(cè)=種立克次體分型時(shí)，各探針標(biāo)記則應(yīng)對(duì)應(yīng)標(biāo)記運(yùn)=種組合關(guān)系，也就是說(shuō)采用FAM- B冊(cè)1、Texred-B冊(cè)巧日CY5-B冊(cè)3分別標(biāo)記貝利群探針，斑點(diǎn)熱群探針，斑疹傷寒群探針，各探 針5/端和y端標(biāo)記是不重合的，但是可隨意進(jìn)行組合，檢測(cè)結(jié)果不受影響。
[0062] 具體在本發(fā)明中，當(dāng)?shù)奶结?/巧光染料標(biāo)記根據(jù)所采用的實(shí)時(shí)巧光PCR儀的配置 而定，WAB口500巧光定量PCR儀為例，第一到第S條的檢測(cè)通道分別WFAM、Texred和切5標(biāo) 記。第一條檢測(cè)通道檢測(cè)貝利群，其巧光染料的檢測(cè)波長(zhǎng)約為520nm;第二條檢測(cè)通道檢測(cè) 斑點(diǎn)熱群，其巧光染料的檢測(cè)波長(zhǎng)約為580nm;第S條檢測(cè)通道檢測(cè)斑疹傷寒群，其巧光染 料的檢測(cè)波長(zhǎng)約為650nm。
[0063] 實(shí)施例2質(zhì)粒的構(gòu)建
[0064] 立克次體的陽(yáng)性樣本由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)生檢疫研究所保存，編號(hào)為 畑38 (貝利群）、LB69 (斑點(diǎn)熱群）、皿83 (斑疹傷寒群）。
[00化]按照Qiagen DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取上述S個(gè)陽(yáng)性樣本的DNA，保存于-80°C， 采用巧光PCR引物RA-F、RA-R分別擴(kuò)增S個(gè)陽(yáng)性樣本的核酸DM，擴(kuò)增體系為50山，體系中包 括lOXBuffer 5iil、dNTP化Url'aq 0.化1、上下游引物各化l、dd出037.祉1、DNA模板化1。 反應(yīng)條件為94°C5min，94°C30s一48°C30s一72°C30s 35個(gè)循環(huán)，72°C7min，4°C保持。PCR產(chǎn) 物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。取30iU的PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序由英驗(yàn)公司完成。室溫條件 下，按照Invitrogen TA克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)分別克隆，命名為RAb-T、RAs-T、RAt-T作為巧光 定量PCR的質(zhì)粒模板標(biāo)準(zhǔn)品。
[0066] 測(cè)序的結(jié)果，RAb-T即貝利群立克次體的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列如SEQ IDNo.6所示。
[0067] SEQ IDNo.6：
[006引 TTTATGTCCACTGCTTCTTGTAGATCCACAATAACCTACATAGACGGTGATAAAGGAATCCTACGACATCGAGGATA TGATATTAAGGATTTAGCCGAGAAAAGCGATTTTTTAGAGGTAGCATATTTATTGATTTACGGAGAATTACCAAGTA GTGAGCAGTATAATAATTTTACTAAAAAAGTCGCTGTTCATTCACTAATGAATGAACGACTACATTATCTGTTTCAA ACATTTTGTAACTCTTCTCATCCTATGGCTATTA。
[0069] 斑點(diǎn)熱群立克次體的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列如SEQ IDNo.7所示。
[0070] SEQ IDNo.7：
[0071] TTTATGTCTACTGCTTCTTGTCAGTCTACTATCACCTATATAGACGGTGATAAAGGAATCTTGCGGCATCGAGGATA TGATATTAAAGACTTAGCTGAGAAAAGTGATTTTTTAGAAGTGGCATATTTACTGATTTATGGGAAACTACCAAGTG GCGAGCAGTATAATAATTTCACTAAACAGGTTGCTCATCATTCATTAGTGAATGAAAGATTACACTATTTATTTCAA ACCTTTTGTAGCTCTTCTCATCCTATGGCTATTA。
[0072] 斑疹傷寒群立克次體的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列，如SEQ IDNo.8所示。
[0073] 沈Q IDNo.8:
[0074] TTTATGTCTACTGCTTCTTGTCAATCTACTATCACATATATAGACGGTGATAAAGGCATATTATGGTATCGAGGATA TGATATTAAAGACTTAGCTGAGAAAAGTGATTTTTTAGAAGTGGCATATTTGATGATTTATGGGGAGCTACCAAGTA GTGATCAGTATTGTAATTTTACTAAAAAGGTTGCTCATCATTCATTAGTGAATGAAAGATTACACTATTTATTTCAA ACCTTTTGTAGTTCTTCTCATCCTATGGCTATTA。
[0075] 實(shí)施例3多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè)的方法
[0076] 本發(fā)明建立的方法中為了避免所用試劑失效或受到污染，設(shè)置有作為陽(yáng)性對(duì)照及 陰性對(duì)照試劑，陰性對(duì)照采用無(wú)核酸酶水；
[0077] 陽(yáng)性對(duì)照采用攜帶有擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的核巧酸序列分別含有 如沈9 10齡.6、569 10齡.7、569 10齡.8所示的序列。
[0078] 陰性對(duì)照的設(shè)計(jì)能有效驗(yàn)證所用試劑是否受到污染，避免假陽(yáng)性發(fā)生，陽(yáng)性對(duì)照 的設(shè)計(jì)能有效驗(yàn)證受用試劑的有效性，避免假陰性的發(fā)生。
[0079] 巧光擴(kuò)增試劑可購(gòu)自輝眷生物科技有限公司；引物、探針、質(zhì)粒委托英濰捷基（上 海）貿(mào)易有限公司合成，其中RAb-P的5 '端和3 '端分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記FAM-B冊(cè)1，RAs-P的5 '端和3 ' 端分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記Texred-B冊(cè)2，RAt-P的5 '端和3 '端分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記CY5-B冊(cè)3。
[0080]經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定采用W下方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0081 ]采用實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè)的方法包括W下步驟：
[00劇 （1)樣品0臟提取
[0083] 樣品DNA提取可選用QiagenDNA提取試劑(如可購(gòu)Qiagen試劑公司）進(jìn)行提取。
[0084] (2)巧光定量PCR擴(kuò)增
[0085] 采用反應(yīng)體系：RA-F、RA-R的終濃度為0.5皿〇1/1，3413斗、1?43斗、1?41斗探針各 的終濃度為0.1皿〇l/L，lXPremix EX haTM，樣品DNA為化1，其余用d地2〇補(bǔ)足總體積25y 1〇
[0086] 設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，分別采用含有立克次體分型的陽(yáng)性擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，即立克次 體的貝利群、斑點(diǎn)熱群和斑疹傷寒群的陽(yáng)性擴(kuò)增序列的質(zhì)粒替換樣本DNA，設(shè)置陰性對(duì)照 時(shí)，采用無(wú)核酸酶水替換樣本DNA。
[0087] 擴(kuò)增條件:優(yōu)選W下擴(kuò)增條件：
[0088] 預(yù)變性階段 94°C5min，擴(kuò)增階段 941：3〇3,481：3〇3,721：3〇3擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，721： 7min，4°C 保持。
[0089] (3)收集巧光信號(hào)信號(hào)，分別選擇FAM、Texred、切5的巧光檢測(cè)模式，基線調(diào)整取3 ~15個(gè)循環(huán)的巧光信號(hào)，W闊值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定闊值線；
[0090] (4)結(jié)果判定:待測(cè)樣品巧光增長(zhǎng)曲線超過(guò)闊值線，并呈現(xiàn)良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判 斷為陽(yáng)性，如無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。
[0091] 具體在本實(shí)施例中，闊值為35,當(dāng)Ct值《35,有明顯擴(kuò)增曲線為陽(yáng)性結(jié)果;抗值> 40無(wú)明顯擴(kuò)增曲線為陰性結(jié)果。
[0092] 實(shí)施例4本發(fā)明檢測(cè)方法的靈敏度
[0093] 將實(shí)施例2中制備的RAb-T、RAs-T、RAt-T質(zhì)粒模板標(biāo)準(zhǔn)品，即陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作 10^1~梯度倍比稀釋，采用實(shí)施例3中的多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè)的 方法來(lái)驗(yàn)證該方法的靈敏度，對(duì)每一個(gè)濃度的樣本，都做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，通過(guò)計(jì)算Ct值的差 異來(lái)驗(yàn)證方法的重現(xiàn)性，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0094] 實(shí)施例2中制備的原質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品RAb-T、RAs-T、RAt-T的濃度分別為274ngAU、 264ngA^l、270ngA^l，按照拷貝數(shù)copies/山 = (ng/山X 10-9)X(6.02X 1023V(660XDNA長(zhǎng) 度）公式計(jì)算，原質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品RAb-T、RAs-T、RAt-T的拷貝數(shù)分別為6.0Xl〇WcopiesAU、 5.78X l〇Wcopies/]il、5.85X 10…copies/山。
[00M]采用多重巧光定量PCR方法的靈敏度測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3，其中：該方法檢測(cè) S種立克次體質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品RAb-T、RAs-T、RAt-T的靈敏度分別為60copiesAil、58copiesAU 和 58copies/]il。
[0096] 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4、圖5、圖6，S個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)值(r2)分別為0.998、0.990、0.999， 呈明顯的線性相關(guān)，7個(gè)濃度梯度各組內(nèi)Ct值基本保持一致，說(shuō)明本發(fā)明建立的方法體系的 重復(fù)性佳。
[0097] 實(shí)施例5本發(fā)明特異性的檢測(cè)
[0098] 參照Qiagen DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取S種立克次體群陽(yáng)性樣本的DNA，并用 優(yōu)化好的多重PCR檢測(cè)體系和條件即實(shí)施例3來(lái)評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的特異性，對(duì)伯氏疏螺旋 體、貝氏柯克斯體(Q熱）、±拉菌、=種立克次體群陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7所示， 對(duì)伯氏疏螺旋體、貝氏柯克斯體(Q熱）、±拉菌的檢測(cè)均為陰性，說(shuō)明本發(fā)明建立的方法即 采用的引物及探針的特性強(qiáng)，可同時(shí)檢測(cè)=種立克次體，與其他病原不發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0099] 實(shí)施例6:對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)
[0100] 采用黑龍江采集的100只婢作為檢測(cè)樣本來(lái)進(jìn)行立克次體分型檢測(cè)，按照Qiagen DNA提取說(shuō)明書(shū)提取婢的基因組DM,作為模板用實(shí)施例3的多重PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā) 現(xiàn)3個(gè)斑點(diǎn)熱群立克次體陽(yáng)性，2個(gè)貝利立克次體陽(yáng)性。為了驗(yàn)證檢測(cè)樣品的準(zhǔn)確性，對(duì)陽(yáng)性 樣品還進(jìn)行了常規(guī)立克次體的檢測(cè)，采用的立克次體常規(guī)檢測(cè)的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No. 10所示;進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系其它試劑可采用實(shí) 施例2中的擴(kuò)增體系，擴(kuò)增條件采用:預(yù)變性階段95°C，5min;擴(kuò)增階段94°C，15sec;60°C， 30sec; 72°C，Imin，45個(gè)循環(huán);72°C，lOmin; 4°C保溫。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，與多重實(shí)時(shí) 巧光定量PCR方法檢測(cè)的結(jié)果一致，證明該方法具有可行性、科學(xué)性、應(yīng)用性。
[0101] 其中；
[0102] 沈Q IDNo. 9: 5^GGGGGCCTGCTCACGGCGG-3'
[0103] SEQ IDNo.10:5' -ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA-3'。
[0104] 采用的立克次體常規(guī)檢測(cè)的上、下游引物序列對(duì)陽(yáng)性樣品的驗(yàn)證，有效避免假陽(yáng) 性結(jié)果的出現(xiàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一組用于多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè)的核酸，其特征在于，該核酸用 于分型檢測(cè)立克次體的貝利群、斑點(diǎn)熱群、斑疹傷寒群，包括立克次體熒光PCR檢測(cè)的上、下 游引物，貝利群探針，斑點(diǎn)熱群探針和斑疹傷寒群探針，其中， 所述立克次體熒光PCR檢測(cè)的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示； 所述貝利群探針的序列如SEQ ID No.3所示， 所述斑點(diǎn)熱群探針序列如SEQ ID No.4所示， 所述斑疹傷寒群探針序列如SEQ ID No.5所示。2. 如權(quán)利要求1所述的核酸，其特征在于，該組核酸還包括包含立克次體熒光PCR檢測(cè) 的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列，其中， 所述立克次體熒光PCR檢測(cè)的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列包括貝利群立克次體、斑點(diǎn)熱群立克 次體和斑疹傷寒群立克次體的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列， 所述貝利群立克次體熒光PCR檢測(cè)的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列，包含如SEQ ID No.6所示的序 列； 所述斑點(diǎn)熱群立克次體的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列，包含如SEQ IDNo.7所示的序列； 所述斑疹傷寒群立克次體的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物序列，包含如SEQ IDNo. 8所示的序列。3. -種多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包 括：如權(quán)利要求1或2所述的核酸，其中，所述各條探針的5'端和3'端分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記FAM-BHQ1、Texred-BHQ2和CY5-BHQ3〇4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括2 XPremix EX TaqTM。5. -種多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)立克次體分型檢測(cè)的方法，其特征在于，該方法是非診 斷目的的檢測(cè)方法，用于對(duì)立克次體進(jìn)行分型檢測(cè)，判斷是否為貝利群立克次體，斑點(diǎn)熱群 立克次體和斑疹傷寒群立克次體，具體包括以下步驟： (1) 從樣品中提取DNA; (2) 對(duì)所述述提取的DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增;其中，熒光定量PCR擴(kuò)增時(shí)，在反應(yīng)體系 中，采用立克次體熒光PCR檢測(cè)的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1、SEQ ID No.2 所示，貝利群探針的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其探針5'端和3'端分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記FAM 和BHQ1;斑點(diǎn)熱群探針的核苷酸序列如SEQ ID No. SEQ ID No.4所示，其探針5'端和3'端分 別對(duì)應(yīng)標(biāo)記Texred和BHQ2;斑疹傷寒群探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示，其探針5 '端 和3 '端分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記CY5和BHQ3; (3) 收集熒光信號(hào)，選擇上述熒光基團(tuán)的熒光檢測(cè)模式，基線調(diào)整取3~15個(gè)循環(huán)的熒 光信號(hào)，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線； (4) 結(jié)果判定:待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值線，并呈現(xiàn)良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷為 陽(yáng)性，如無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系 具體如下： lXPremix EX TaqTM， 所述立克次體熒光PCR檢測(cè)的上、下游引物的終濃度為0.5ymol/L，所述貝利群探針的 終濃度為O.lymol/L，所述斑點(diǎn)熱群探針的終濃度為O.lymol/L，所述斑疹傷寒群探針的終 濃度為0. lymol/L， 所述樣品的DNA為ΙμL，其余采用滅菌蒸餾水加至總體積25μ1。7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，該方法同時(shí)設(shè)置無(wú)核酸酶水為陰性對(duì)照； 同時(shí)分別設(shè)置包含如SEQ ID No.9所示的序列、SEQ ID No. 10所示的序列、SEQ ID No. 11所示的序列的基因作為陽(yáng)性對(duì)照。8. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序 為：預(yù)變性階段 94°C5min，擴(kuò)增階段 941€3〇8,481€3〇8,721€3〇8擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，72 1€71^11，4 °C保持。9. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)結(jié)果判定中，所述閾值為35,當(dāng) Ct值<35時(shí)，有明顯擴(kuò)增曲線為陽(yáng)性結(jié)果;Ct值>40時(shí)，無(wú)明顯擴(kuò)增曲線為陰性結(jié)果。10. 如權(quán)利要求5-9任一所述的方法，其特征在于，該方法還包括驗(yàn)證步驟，具體為將陽(yáng) 性樣品進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，采用立克次體常規(guī)檢測(cè)的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下 游引物序列如SEQ ID No.2所示;并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK106048026SQ201610461678
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】楊宇, 方志強(qiáng), 王建成, 徐寶梁, 趙婷婷, 富英群, 侯詠
【申請(qǐng)人】中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院