一種基于血清及共同基于血清和唾液中蛋白檢測糖鏈標(biāo)志物的凝集素芯片和試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測糖鏈標(biāo)志物的凝集素芯片，具體涉及一種基于血清及共 同基于血清和唾液中蛋白檢測糖鏈標(biāo)志物的凝集素芯片及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 重型乙型肝炎是指肝細(xì)胞發(fā)生大塊變性壞死，肝功能衰竭，肝臟的生物合成、轉(zhuǎn) 化、解毒功能喪失，體內(nèi)代謝產(chǎn)物累積，體內(nèi)環(huán)境嚴(yán)重紊亂，一般發(fā)病后10日或28日內(nèi)發(fā)展 為肝性腦病，有明顯出血現(xiàn)象，或繼發(fā)感染，出現(xiàn)腦水腫、急性腎功能衰竭等。所以臨床上有 病情重、發(fā)展快、來勢兇險的特點，如未積極救治，預(yù)后極差。重型肝炎的發(fā)病機(jī)制可能與宿 主的免疫反應(yīng)亢進(jìn)及內(nèi)毒素的作用有關(guān)，其發(fā)病率約占乙型肝炎的1%左右，以青年居多，勞 累、酗酒、感染、營養(yǎng)不良、末期妊娠、病毒重疊感染等均可促使急、慢性肝炎的病情轉(zhuǎn)重，重 型乙型肝炎臨床上主要分為三類:慢性重型乙肝、亞急性重型乙肝和急性重型乙肝。
[0003] 慢性重型乙肝，在慢性活動性肝炎或肝炎后肝硬變的基礎(chǔ)上病情急劇惡化，主要 表現(xiàn)為黃疸進(jìn)行性加深，凝血酶原活動度進(jìn)行性下降，出現(xiàn)難以消退的大量腹水、反復(fù)嚴(yán)重 感染，難以糾正的電解質(zhì)紊亂。此型病人常有低氧血癥，存在通氣換氣障礙，近年由于治療 的加強(qiáng)，半數(shù)以上病人不出現(xiàn)肝性腦病，或僅在臨終前出現(xiàn)，常因上消化道出血、肝-腎綜合 征及嚴(yán)重感染而死亡，臨床表現(xiàn)同亞急性、急性重型乙肝，病死率極高。
[0004] 亞急性重型乙肝，此病在發(fā)病10天以上及8周以內(nèi)，會出現(xiàn)極度乏力、厭油、重度腹 脹、食欲明顯減退、惡心及出現(xiàn)腹水。當(dāng)病情不斷加重時，黃疸進(jìn)行性加深，慢慢的會出現(xiàn)肝 臭、凝血酶原時間延長，還會出現(xiàn)明顯出血傾向和精神神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，查血清白蛋白降低， 白球蛋白倒置，電解質(zhì)紊亂，血氨升高，尿少，肝腎功能趨向衰竭，還會并發(fā)各種感染，預(yù)后 甚差。部分患者經(jīng)搶救可望恢復(fù)，容易發(fā)展為壞死后肝硬化。
[0005] 急性重型乙肝，又叫爆發(fā)性肝壞死。在發(fā)病10天內(nèi)會出現(xiàn)煩燥、神智不清到濃度昏 迷。肝臟進(jìn)行性縮小，凝血酶原時間明顯延長，活動度驟降，血氨增高，轉(zhuǎn)氨酶隨黃疸上升反 而下降，即所謂酶膽分離現(xiàn)象。在后期可出現(xiàn)腹膜炎、出血、腦水腫及腦疝。病情危急，預(yù)后 甚差。
[0006] 目前，原位肝移植是治療重型肝炎最有效的治療方法，術(shù)后5年內(nèi)存活率達(dá)85%左 右。但由于術(shù)后可能出現(xiàn)感染性并發(fā)癥，很多患者并沒有成功接受肝移植手術(shù)，甚至有些患 者在等待合適供體期間就已死亡。抗病毒治療可以在一定程度上維系患者生命，即使部分 患者體內(nèi)乙肝病毒DNA顯著降低，但其存活時間仍舊較短，由于一些其他因素，如:凝血酶原 延時、高含量膽紅素、血液中低白蛋白水平、血小板數(shù)過少以及肝性腦病、腹水等都是導(dǎo)致 患者死亡的危險因素。
[0007] 由于重型肝炎的病情重，變化快，病死率高，因此，重型肝炎早診斷，早治療，是防 控重型肝炎的關(guān)鍵。
[0008] 蛋白質(zhì)糖基化是一種最常見的蛋白翻譯后修飾，是在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下將糖類轉(zhuǎn) 移至蛋白質(zhì)，和蛋白質(zhì)上特殊的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。研究表明，70%人類蛋白包 含一個或多個糖鏈，1%的人類基因組參與了糖鏈的合成和修飾。哺乳動物中蛋白質(zhì)的糖基 化類型可分為三種:N-糖基化、0-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇錨。大多數(shù)糖蛋白質(zhì)只含 有一種糖基化類型，但是有些蛋白多肽同時連有N-糖鏈、0-糖鏈或糖氨聚糖。
[0009] 目前在糖基化研究多在其他肝?。ㄒ腋巍⒏斡不?、肝癌）中報道，如在乙肝病毒 (HBV)感染后肝纖維化患者血清中Gal化雙天線型N-糖鏈水平明顯高于健康志愿者，同時血 清中雙天線型和三天線型N-糖鏈水平伴隨肝纖維化程度的加重而降低，另有研究表明隨著 肝纖維化的發(fā)展，血清中平分型核心a(l，6)Fuc化雙天線型N-糖鏈水平升高，而三天線型N-糖鏈降低，表明血清中特定N-糖鏈水平的變化可以用來監(jiān)測纖維化的發(fā)展，但在重型乙型 肝炎中未見報道。
[0010] 凝集素由于其可特異性識別不同糖鏈結(jié)構(gòu)并可以多價形式與糖鏈高親和性結(jié)合 的特性被廣泛用于糖組學(xué)的研究，凝集素芯片通過固定于芯片上的凝集素探針與樣品中糖 蛋白糖鏈特異性結(jié)合，可以高通量地檢測出樣品中糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)和連接方式的變化，是 研究糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)變化最有效的分析工具之一，其有助于發(fā)展新的診斷和監(jiān)測疾病的方 法。
[0011]申請?zhí)枮?01110021447.3發(fā)明專利，是采用芯片點樣儀將凝集素點制于環(huán)氧衍生 化的玻片載體上，經(jīng)固定化處理，制備出高覆蓋率凝集素芯片，采用凝集素芯片技術(shù)對臨床 樣本中糖蛋白糖鏈與凝集素進(jìn)行特異性結(jié)合的研究，分析各種樣本中的糖蛋白糖鏈譜及其 識別的凝集素，并借鑒基因芯片數(shù)據(jù)分析方法對糖蛋白糖鏈的表達(dá)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析， 確定臨床樣本和正常對照組中糖蛋白糖鏈的差異結(jié)構(gòu)，該方法首先采用標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白RNase B和Fetuin，驗證了凝集素芯片在檢測糖蛋白糖鏈方面的可行性和可靠性，并應(yīng)用凝集素 芯片對Chang's liver正常肝細(xì)胞總蛋白中的糖蛋白進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)糖蛋白上有多 價Sia或GlcNAc、末端a-l，3 man、GalNAc和Gaim_4GlcNAc糖鏈結(jié)構(gòu)，然后應(yīng)用高覆蓋率 凝集素芯片研究轉(zhuǎn)錄生長因子活化的肝星狀細(xì)胞(LX-2)中糖蛋白糖鏈譜的變化，發(fā)現(xiàn)AAL， PHA-E和ECA識別的Fuc、N-GlcNAC和Gal糖鏈結(jié)構(gòu)在活化態(tài)細(xì)胞的胞膜上表達(dá)明顯增強(qiáng)應(yīng)用 芯片技術(shù)研究CC14誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型中糖基因表達(dá)與肝細(xì)胞表面糖鏈譜之間的關(guān)聯(lián) 性，發(fā)現(xiàn)纖維化肝臟中有10個糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，首次揭示在肝纖維化發(fā) 生過程中〇-Glycan的合成通路" Tn antigen - T antigen (core-1) - sialyl-T ant igen"被激活，從糖組學(xué)角度揭示了肝纖維化形成過程中蛋白糖基化發(fā)生變化的分子機(jī) 理。
[0012] 該分子機(jī)理并未在重型乙型肝炎上應(yīng)用，并發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的糖蛋白糖鏈變化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的在于提供一種非損傷，通過鑒別唾液或血清中蛋白檢測糖鏈標(biāo)志物 的凝集素芯片及其方法。
[0014] 本發(fā)明提供一種基于血清糖結(jié)合蛋白檢測糖鏈標(biāo)志物的凝集素芯片，包括測試凝 集素探針組，所述測試凝集素探針組至少包括PTL-I、PNA、AAL、LTL、STL、BS-I、PTL- II、 SBA、ACA、UEA-I、MAL- I、PHA-E+L。
[0015] 所述測試凝集素探針組還包括WFA、GSL- II、MAL- II、SJA、EEL、LEL、Pmi、BPL。
[0016] 本發(fā)明還提供一種共同基于血清和唾液中糖蛋白檢測糖鏈標(biāo)志物的凝集素芯片， 包括測試凝集素探針組，所述測試凝集素探針組至少包括STL、SBA、ACA、WFA、GSL-II。
[0017] 本發(fā)明提供上述凝集素芯片在檢測糖蛋白檢測糖鏈標(biāo)志物的應(yīng)用。
[0018]更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供含有上述凝集素探針組的試劑盒。
[0019] 應(yīng)用上述凝集素時，以經(jīng)過醫(yī)學(xué)檢測健康人群為對照，采用凝集素芯片對樣本和 健康人的血清或唾液樣本進(jìn)行檢測，通過軟件獲取芯片數(shù)據(jù)病歸一化處理后，將樣本和健 康人對照組的結(jié)果進(jìn)行對比，即每個凝集素對應(yīng)的歸一化后熒光強(qiáng)度(NFI)的樣本分別比 對照組得到Fold-change值，確定焚光圖像中值分析的Fold-change >2和Fold-change < 〇. 5分別為上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的糖鏈，F(xiàn)old-change在0.5-2之間表示無變化。
[0020] 基于血清檢測時，當(dāng) PTL-I、PNA、AAL、LTL、STL、BS-I、PTL-II、SBA、UEA-I、MAL-I、 PHA-E+L都上調(diào)，同時ACA下調(diào)時可以將其與健康人區(qū)別，即患有肝病;在此基礎(chǔ)上，當(dāng)WFA、 GSL- II、MAL- II、SJA、LEL、PWM、BPL都上調(diào)，同時EEL下調(diào)時，可以確定樣品對應(yīng)的人群患 有重型乙型肝炎。
[0021] 基于血清和唾液共同檢測時，當(dāng)311、384、1?4、631^-11都上調(diào)，同時404下調(diào)時可以 將其與健康人區(qū)別，即患有肝病。
[0022]本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明通過固定于芯片上的特定凝集素探針與樣品中糖蛋白糖鏈特異性結(jié)合，可以快 速檢測出血清和共同基于血清和唾液樣品中特有的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)，可以迅速判斷出樣品 中糖鏈的特異性結(jié)合，確定對應(yīng)的人群是否患有肝炎，并確定是否為重型乙型肝炎。
【附圖說明】
[0023] 圖1為凝集素芯片點樣陣列圖及應(yīng)用于糖蛋白糖鏈的熒光檢測圖，圖中A為凝集素 芯片點樣陣列圖，B為健康人(HC)、慢乙肝(cHB)、重型乙肝(ACHBLF)患者血清糖蛋白糖鏈熒 光檢測結(jié)果圖； 圖2為健康人(HC)、慢乙肝(cHB)、重型乙肝(ACHBLF)患者唾液糖蛋白糖鏈熒光檢測結(jié) 果； 圖3為驗證結(jié)果圖，圖中A為lectin blotting圖，B左側(cè)為凝集素 WFA與血清芯片結(jié)合 的熒光檢測結(jié)果圖，右側(cè)為WFA對應(yīng)健康人、慢乙肝、重型乙肝血清結(jié)合強(qiáng)度比較。
【具體實施方式】
[0024] 下面通過給出的具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。
[0025] 本發(fā)明中采用如表1所示的凝集素進(jìn)行測試。
[0026] 表 1

術(shù)州tfj IX食'EiJi?:電恐奴八卞妹相：7C伴茶別'付公口J ;同壓X困謂1: 1=1奪1UM1ΤΛ'?口j ; @速 冷凍離心機(jī)5804R:德國Eppendorf公司；微量核酸蛋白測定儀:德國Implen公司；生物芯片 掃描儀4000B:美國Axon公司；芯片點樣儀:博奧晶芯SmartArrayer48點樣儀；芯片雜交箱 HL-2000:美國UVP公司。
[0027]具體測試步驟如下： (1)研究人群和全血清/唾液采集 志愿者無其它疾病，一周之內(nèi)沒有服用任何藥物。已確診的ACHBLF炎患者40例，cHB患 者30例，HC 80例，如表2所示，由于肝病患者年齡為42 ± 10歲，20例健康志愿者年齡為40 土 5.5歲。全血、唾液采集至少1 ml并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制劑(每毫升唾液加入lyL) 防止蛋白降解。
[0028] 表2重型乙型肝炎，慢乙肝患者臨床情況表

The data are shown as meanstandard deviation (SD). ACHBLF=acute-〇n_ chronic hepatitis B liver failure, AFP=alpha_fetoprotein，ALB=albumin，ALP= alkaline phosphatase，ALT=alanine transaminase，AST=aspartate transaminase， CHB = chronic hepatitis B，DBIL=direct bilirubin，GGT = gamma glutamyl transpeptidase, GLB=globulin，HBeAg=Hepatitis B e Antigen, HBsAg=hepatitis B surface antigen, HBV=hepatitis B virus, HC=healthy controls, IBIL=indirect bilirubin, INR =international normalized ratio, MELD=model for end-stage liver disease , NA=not available , PT=pr〇-thrombin time , PTA= prothrombin activity, TBIL=total bilirubin, TP =total protein, - = Not (2)血清、唾液蛋白處理和熒光標(biāo)記 收集到的全血經(jīng)12 000 rpm 4°C離心10 min后吸取上清血清，收到的全唾液經(jīng)12 000 rpm4°C離心10 min后吸取上清棄去不溶沉淀物，上清再經(jīng)0.22μπι孔徑的濾膜過濾掉細(xì)菌和 其他微生物，為了減小個體差異并歸一化個體樣本，按照不同分組每例樣本各取100 yL混 合，BCA法蛋白定量，混合樣本經(jīng)Cy3熒光染料標(biāo)記后用S