一種唾液酸酶Neu1在制備藥物方面的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種唾液酸酶Neul在制備藥物方面的用途，屬于藥物制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。全球每年大 約有43萬人被診斷為膀胱癌，其中約17萬人死于膀胱癌，其致死率約為38%。膀胱癌在我國 泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率中高居榜首，膀胱癌的發(fā)病率隨年齡增長而增加，高發(fā)年齡段為50-70歲。男性膀胱癌發(fā)病率高于女性。膀胱癌患者經(jīng)尿道電切術(shù)后，其復(fù)發(fā)率約為70%，一般 術(shù)后膀胱內(nèi)灌注卡介苗或化療藥物可降低其復(fù)發(fā)率。常用的灌注化療藥物有絲裂霉素、阿 霉素、噻替派、羥基喜樹堿等。
[0003] 目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了4種唾液酸酶(Neuraminidases，NA)，其中Neul最為 保守，主要定位于溶酶體，其功能是特異識別低聚糖和糖蛋白中的糖苷鍵，并對其進(jìn)行剪 切。唾液酸酶抑制劑可抑制人皮膚成纖維細(xì)胞、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞金額耳軟骨細(xì)胞中彈性 纖維的組裝，并引起彈性纖維的合成受損。在過去的40年中，細(xì)胞表面糖蛋白唾液酸的修飾 情況常作為區(qū)分不同腫瘤的標(biāo)志，因此唾液酸也被認(rèn)為是潛在的癌癥治療靶點(diǎn)，Neul作為 可水解唾液酸的酶也受到高度關(guān)注。有研究者對多株小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞分析，發(fā)現(xiàn)惡性程 度較高的細(xì)胞株中Neul表達(dá)明顯低于良性細(xì)胞株，然而該研究僅限于表達(dá)量的分析，并沒 有進(jìn)一步數(shù)據(jù)表面其與結(jié)腸腺癌之間的關(guān)系，由于生物機(jī)體的性能受到大量基因的相互作 用與影響，所以Neu 1與結(jié)腸腺癌的關(guān)系尚未可知。
[0004] 由于膀胱癌的發(fā)病率居高不下，并且復(fù)發(fā)率很高，開發(fā)有效治療膀胱癌的藥物是 目前亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述問題，本發(fā)明提供了一種唾液酸酶Neul的新用途，是首次報(bào)道Neul 在有效治療膀胱癌中的應(yīng)用。本發(fā)明的有效的蛋白Neul，通過質(zhì)粒構(gòu)建，轉(zhuǎn)染至膀胱癌細(xì)胞 中，引起相關(guān)通路的激活或抑制，并用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明該蛋白對膀胱癌的治療具有一定的治 療效果。
[0006] 本發(fā)明的唾液酸酶Neul，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：
[0007] (a)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0008] (b)在(a)的基礎(chǔ)上發(fā)生氨基酸插入、缺失或者替換得到的氨基酸序列，且編碼有 活性的唾液酸酶。
[0009] 所述唾液酸酶Neul的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010] 本發(fā)明提供了所述唾液酸酶Neul在制備藥物方面的應(yīng)用;是用來制備抑制膀胱癌 細(xì)胞迀移或者增殖的藥物。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物是抗體。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是先將編碼氨基酸序列如SEQ ID NO. 1的 唾液酸酶Neul基因，采用適合的表達(dá)載體和/宿主進(jìn)行表達(dá)得到唾液酸酶Neul，然后再用于 制備藥物。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體為真核表達(dá)載體。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物，可以在膀胱癌的治療中可通過膀胱灌注 的方法使用，以達(dá)到抑制膀胱癌的效果。
[0015] 本發(fā)明還提供表達(dá)唾液酸酶的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或者基因工程菌在制備抑制膀胱癌 細(xì)胞迀移和/或增殖的藥物方面的應(yīng)用。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述唾液酸酶Neul的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 不。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：發(fā)現(xiàn)了一種唾液酸酶Neul的新用途，是首次報(bào)道Neul在有效 治療膀胱癌中的應(yīng)用。本發(fā)明的唾液酸酶對α2，3及α2，6連接形式的底物均能進(jìn)行水解，對 細(xì)胞表明的FN進(jìn)行轉(zhuǎn)化，同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)該酶能夠通過將癌細(xì)胞表面因子纖連蛋白FN的唾液 酸去掉導(dǎo)致FN的降解，而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力。本發(fā)明的有效的蛋白Neul轉(zhuǎn)染至膀 胱癌細(xì)胞中，可引起相關(guān)通路的激活或抑制，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明該蛋白對膀胱癌的治療具有一 定的治療效果。
【附圖說明】
[0018] 圖1為YTS-1/Neul和YTS-1中Neul的表達(dá)情況；
[0019] 圖2為YTS-1/Neul和YTS-1細(xì)胞中唾液酸水平的差異；
[0020] 圖3為YTS-1/Neul和YTS-1細(xì)胞中唾液酸酶活性的差異；
[0021]圖4為膀胱癌細(xì)胞YTS-1中過表達(dá)Neul蛋白后FN蛋白表達(dá)的變化；
[0022]圖5為膀胱癌細(xì)胞YTS-1中過表達(dá)Neul蛋白后細(xì)胞增殖能力的變化；
[0023] 圖6為YTS-1/Neul和YTS-1的腫瘤組織重量比較；
[0024] 圖7為YTS-1/Neul和YTS-1的腫瘤組織生長趨勢比較；
[0025]圖8為腫瘤組織照片。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0027] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028] 實(shí)施例1:過表達(dá)YTS-1細(xì)胞株的構(gòu)建
[0029] 1、唾液酸酶Neul基因的克隆
[0030] Neul基因的序列信息通過網(wǎng)站http: //avermitilis · Is · kitasato-u · ac · jp/獲 得，并通過SignalP 4.1 Server網(wǎng)站對該酶的信號肽情況進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示該酶為不含 有信號肽的胞內(nèi)酶，大小約為45kDa的唾液酸酶。在neul基因的編碼區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由公 司合成如下引物Neul-F/Neul-R(序列分別如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示）。引物序列如 下：
[0031 ] Neul-F:CCCAAGCTTATGACTGGGGAGCGACC；
[0032] Neul-R:GGAATTCCAGTGGCACAGCTCAGAGTG
[0033]以人細(xì)胞基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：95°C10min，96°Clmin，65°C 45s，72°Clmin 30s重復(fù)34個(gè)循環(huán)，72°ClOmiruPCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離， 并采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，獲得neul基因片段(核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示）。 [0034] neul基因片段與載體質(zhì)粒pcDNA3.1分別經(jīng)過EcoRI和Hindlll酶切后16°C連接過 夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑取氨芐霉素抗性的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證和測 序驗(yàn)證，獲得構(gòu)建正確的neul表達(dá)質(zhì)粒。
[0035] 2、唾液酸酶Neul過表達(dá)YTS-1細(xì)胞株(YTS-1/Neul)的構(gòu)建 [0036] 將細(xì)胞接板于12孔板，37