的形式或腸胃外施用的形式。通常，優(yōu)選 腸胃外施用的形式。腸胃外施用的形式的例子包括皮下注射、肌內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射和栓 劑。
[0290] 當(dāng)本發(fā)明的癌疫苗是經(jīng)口施用的形式時(shí)，本發(fā)明的肽可與可藥用、并且不干擾作 為癌抗原的本發(fā)明的肽的活性的賦形劑一起制備成癌疫苗。此類賦形劑的例子包括淀粉、 甘露醇、乳糖、硬脂酸鎂、纖維素、聚合的氨基酸和白蛋白。
[0291] 當(dāng)本發(fā)明的癌疫苗是腸胃外施用的形式時(shí)，本發(fā)明的肽可以與可藥用、并且不干 擾作為癌抗原的本發(fā)明的肽的活性的載體一起制備成癌疫苗。此類載體的例子包括水、常 見的鹽、右旋糖、乙醇、甘油和DMS0。
[0292] 根據(jù)需要，本發(fā)明的癌疫苗還可含有白蛋白、潤濕劑和/或乳化劑等材料。
[0293] 本發(fā)明的肽還可與合適的佐劑一起使用，以活化細(xì)胞免疫性。本發(fā)明的癌疫苗可 含有此類佐劑。
[0294] 本發(fā)明的肽還可與增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL)的肽識別的化合物一起使用，或例 如與能免疫識別所述肽的抗體一起使用。本發(fā)明的癌疫苗可含有此類化合物和/或抗體。
[0295] 本發(fā)明的癌疫苗可使用適合于所述劑型的常用方法來制造。
[0296] 優(yōu)選地，本發(fā)明的癌疫苗用于預(yù)防或治療癌，或用于遏制癌轉(zhuǎn)移或癌復(fù)發(fā)。
[0297] 可通過使用適合于所述劑型的施用方法，將本發(fā)明的癌疫苗施用給人。
[0298] 本發(fā)明的癌疫苗可以以例如大約0.0 lmg至IOOmg/天的劑量、優(yōu)選大約0.1 mg至 30mg/天的劑量施用給成年人（按本發(fā)明的活性組分肽計(jì)）。給藥間隔可根據(jù)癥狀和施用 目的等因素合適地選擇。
[0299] 制誥討繼件免痔細(xì)朐的方法
[0300] 本發(fā)明的制造過繼性免疫細(xì)胞的方法包括下述步驟：
[0301] 用DDX3X或其部分肽對具有抗原呈遞能力的細(xì)胞進(jìn)行脈沖的步驟。
[0302] 具有抗原呈遞能力的細(xì)胞的例子包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。
[0303] 脈沖可通過例如下述方式來進(jìn)行：將具有抗原呈遞能力的細(xì)胞在含有大約1至 10 μ g/ml的DDX3X或其部分肽的培養(yǎng)基中于大約20至30°C的溫度下孵育大約30分鐘至 大約1小時(shí)。以這種方式，可獲得將癌抗原肽呈遞到細(xì)胞表面以被DDX3X特異性CTL識別 的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是分離的細(xì)胞。
[0304] 優(yōu)選地，DDX3X的部分肽是本發(fā)明的肽。
[0305] 將癌抗原肽呈遞到細(xì)胞表面以被DDX3X特異性CTL識別的細(xì)胞可以是呈遞本發(fā)明 的肽的抗原呈遞細(xì)胞（APC)。
[0306] 經(jīng)DDX3X或其部分肽脈沖的APC可以是呈遞源于DDX3X的肽的APC，其可用作為 DDX3X特異性T細(xì)胞誘導(dǎo)劑。
[0307] APC可作為過繼性免疫細(xì)胞被施用給需要過繼性免疫治療的人。
[0308] 可使用已知的方法，在將APC在施用給人之前對其進(jìn)行培養(yǎng)。
[0309] 可通過將具有分化為CTL的潛能的前體細(xì)胞與上文所述經(jīng)DDX3X或其部分肽脈沖 的APC -起孵育，而離體誘導(dǎo)DDX3X特異性CTL。所述DDX3X特異性CTL可以是分離的細(xì) 胞。
[0310] 對前體細(xì)胞沒有特別限制，只要它們能分化為CTL即可。例子包括外周血單核細(xì) 胞（PBMC)、幼稚細(xì)胞（naive cells)和記憶型細(xì)胞（memory cells)。
[0311] 如前文所述的DDX3X特異性CTL也可作為過繼性免疫細(xì)胞施用給需要過繼性免疫 治療的人。
[0312] 可使用已知的方法，在將DDX3X特異性CTL在施用給人之前對其進(jìn)行培養(yǎng)。
[0313] 特別地，在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的過繼性免疫細(xì)胞制造方法包括下 述步驟：
[0314] 將具有抗原呈遞能力的細(xì)胞暴露給DDX3X或其部分肽、以獲得呈遞源于DDX3X或 其部分肽的抗原的細(xì)胞的步驟；和
[0315] 用所述抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)DDX3X特異性T細(xì)胞的步驟。
[0316] 優(yōu)選地，DDX3X特異性T細(xì)胞是DDX3X特異性⑶4陽性T細(xì)胞。
[0317] 如上所述獲得的過繼性免疫細(xì)胞可被直接或與各種載體一起被制備成過繼性免 疫細(xì)胞組合物。
[0318] 本發(fā)明的過繼性免疫細(xì)胞組合物的劑型可以是經(jīng)口施用的形式或腸胃外施用的 形式。通常，優(yōu)選腸胃外施用的形式。腸胃外施用的形式的例子包括皮下注射、肌內(nèi)注射、 靜脈內(nèi)注射和栓劑。
[0319] 當(dāng)本發(fā)明的過繼性免疫細(xì)胞組合物是經(jīng)口施用的形式時(shí)，本發(fā)明的過繼性免疫細(xì) 胞可與可藥用、并且不干擾過繼性免疫細(xì)胞的活性的賦形劑一起制備成過繼性免疫細(xì)胞組 合物。此類賦形劑的例子包括淀粉、甘露醇、乳糖、硬脂酸鎂、纖維素、聚合的氨基酸和白蛋 白。
[0320] 當(dāng)本發(fā)明的過繼性免疫細(xì)胞組合物是腸胃外施用的形式時(shí)，本發(fā)明的過繼性免疫 細(xì)胞可以與可藥用、并且不干擾過繼性免疫細(xì)胞的活性的載體一起制備成過繼性免疫細(xì) 胞。此類載體的例子包括水、常見的鹽、右旋糖、乙醇、甘油和DMS0。
[0321] 癌預(yù)防、癌治療、癌轉(zhuǎn)務(wù)遏制或癌復(fù)發(fā)遏制劑
[0322] 本發(fā)明的癌預(yù)防、癌治療、癌轉(zhuǎn)移遏制或癌復(fù)發(fā)遏制劑含有抑制DDX3X表達(dá)或活 性的化合物。
[0323] 抑制DDX3X表達(dá)的化合物的例子包括：包含與DDX3X基因正義鏈的全部區(qū)域或部 分區(qū)域中的序列（下文中也簡稱為"靶序列"）互補(bǔ)的堿基序列（下文中也簡稱為"反義序 列"）的多核苷酸。
[0324] 此類多核苷酸的例子包括反義核苷酸、siRNA(小干擾RNA)和shRNA(小發(fā)卡 RNA) 〇
[0325] 靶序列可通過進(jìn)行NCBI BLAST檢索來確定。優(yōu)選地，靶序列選自DDX3X基因的外 顯子區(qū)域。優(yōu)選地，靶序列對靶DDX3X基因序列呈高度特異性。
[0326] 靶序列例如為15至30個(gè)堿基長、優(yōu)選18至25堿基長、更優(yōu)選18至25個(gè)堿基長、 進(jìn)一步更優(yōu)選19至23個(gè)堿基長、特別優(yōu)選19至21個(gè)堿基長。
[0327] 反義核苷酸可以是RNA或DNA。此外，反義核苷酸可具有在反義序列的至少一個(gè)末 端連結(jié)一個(gè)至數(shù)個(gè)堿基（例如1至2個(gè)堿基、1至3個(gè)堿基、1至5個(gè)堿基）而成的序列，或 在反義序列內(nèi)一個(gè)至數(shù)個(gè)堿基被缺失、取代或添加而成的序列，只要反義核苷酸具有遏制 DDX3X基因表達(dá)的作用即可。
[0328] 例如，由包含靶序列（正義鏈）的多核苷酸和包含反義序列（反義鏈）的多核苷 酸構(gòu)成的雙鏈多核苷酸可作為siRNA使用。
[0329] 正義鏈和反義鏈可以比靶序列長一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基（例如1至2個(gè)堿基、1至3個(gè) 堿基、1至5個(gè)堿基），并且可具有例如，添加至末端（優(yōu)選地，3'端）的兩個(gè)尿嘧啶（U)堿 基。此外，反義鏈和/或正義鏈可具有在反義鏈或靶序列的至少一個(gè)末端連結(jié)一個(gè)至數(shù)個(gè) 堿基U、T、G、C或A (例如1至2個(gè)堿基、1至3個(gè)堿基、1至5個(gè)堿基）而成的序列，或在反 義序列或靶序列內(nèi)一個(gè)至數(shù)個(gè)此類堿基被缺失、取代或添加而成的序列，只要反義鏈和正 義鏈具有遏制DDX3X基因表達(dá)的作用即可。
[0330] shRNA (小發(fā)卡RNA)的例子包括含有通過調(diào)控部分（環(huán)部分）（其可以是核苷酸序 列、非核苷酸序列或它們的組合）互相連結(jié)的siRNA正義鏈和反義鏈的那些。
[0331] 當(dāng)調(diào)控部分是核苷酸序列時(shí)，核苷酸序列的例子包括至少一個(gè)堿基且小于IOkb 的核苷酸序列，優(yōu)選為一個(gè)堿基至數(shù)百個(gè)堿基的核苷酸序列，更優(yōu)選為一個(gè)堿基至數(shù)十個(gè) 堿基的核苷酸序列，特別優(yōu)選為1至20個(gè)堿基的核苷酸序列，以及由能通過剪接或其它細(xì) 胞內(nèi)機(jī)制在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生前述長度的多核苷酸的序列構(gòu)成的核苷酸序列。形成調(diào)控部分的 核苷酸序列可包括正義序列和反義序列。此外，形成調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列可以是下述序 列之一、或下述序列中兩條或多條的組合：
[0332] 胞質(zhì)定向的序列，例如多聚A、tRNA、Usn RNA、和源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的CTE序列；
[0333] 具有誘捕（decoy)活性的序列，例如NFk β結(jié)合序列、E2F結(jié)合序列、SSRE和 NF-AT ；
[0334] 干擾素誘導(dǎo)遏制序列，例如腺病毒VAl或VA2RNA ;
[0335] 具有RNase遏制活性、反義活性、核糖體活性等的序列；
[0336] 用于特定出tRNA或表達(dá)位點(diǎn)的標(biāo)志物序列；和
[0337] 用于用大腸桿菌進(jìn)行檢測的選擇標(biāo)志物序列。
[0338] 需要部分雙鏈以用于誘捕活性等的功能性序列可以以互補(bǔ)核苷酸來生產(chǎn)。調(diào)控部 分可被設(shè)計(jì)為包括剪接內(nèi)含子供體序列和受體序列所需的序列，以使得調(diào)控部分序列的一 部分能在具有剪接機(jī)制的細(xì)胞中被切掉并被再連結(jié)。如上所述的調(diào)控部分序列能更符合期 望地改善RNA功能遏制作用，以及使得正義鏈和反義鏈穩(wěn)定。
[0339] 當(dāng)調(diào)控部分是非核苷酸序列時(shí)，具體例子包括PNA (肽核酸），其是與核酸類似的 具有聚酰胺主鏈的化學(xué)合成類似物。
[0340] 在本發(fā)明中，還可將用于遏制DDX3X基因轉(zhuǎn)錄的、針對DDX3X基因的誘捕性核酸用 于遏制DDX3X基因表達(dá)。
[0341] 抑制DDX3X活性的已知化合物的例子包括W02011/039735中描述的化合物，具體 而言，下式所示的化合物：
[0342]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 癌惡性程度評估方法，所述方法包括下述步驟： 測量癌組織中的DDX3X表達(dá)水平的步驟；和 通過使用所述DDX3X表達(dá)水平來評估癌組織的惡性程度的步驟。
2. 癌惡性程度評估試劑盒，所述試劑盒包含： 針對DDX3X的抗體、或者 與DDX3XmRNA或相應(yīng)的cDNA特異性結(jié)合的多核苷酸， 其中，所述抗體或多核苷酸用于測量癌組織中DDX3X的表達(dá)水平。
3. 癌預(yù)后評估方法，所述方法包括下述步驟： 檢測癌患者的血液中DDX3X特異性T細(xì)胞的步驟；和 通過使用檢測結(jié)果評估癌預(yù)后的步驟。
4. 癌預(yù)后評估試劑盒，所述試劑盒包含： DDX3X或其部分肽， 其中，所述DDX3X或其部分肽用于檢測癌患者血液中的DDX3X特異性T細(xì)胞。
5. -種肽，其由： SEQIDNO: 1的氨基酸序列中、包含SEQIDNO:2至87中任一所示的氨基酸序列的 9~20個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，或 與上述氨基酸實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列 構(gòu)成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的肽，其中，所述肽為癌抗原肽。
7. 癌疫苗，其包含權(quán)利要求5所述的肽。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的癌疫苗，其中，所述疫苗用于預(yù)防或治療癌，或用于遏制癌轉(zhuǎn) 移或癌復(fù)發(fā)。
9. 制造過繼性免疫細(xì)胞的方法，所述方法包括下述步驟： 用DDX3X或其部分肽對具有抗原呈遞能力的細(xì)胞進(jìn)行脈沖的步驟。
10. 經(jīng)DDX3X或其部分肽脈沖的抗原呈遞細(xì)胞。 11. DDX3X特異性細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其包含權(quán)利要求10所述的抗原呈遞細(xì)胞作為活性組分。
12. 制造過繼性免疫細(xì)胞組合物的方法，所述方法包括下述步驟： 將具有抗原呈遞能力的細(xì)胞暴露給DDX3X或其部分肽、以獲得呈遞源于DDX3X或其部 分肽的抗原的細(xì)胞的步驟；和 用所述抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)DDX3X特異性T細(xì)胞的步驟。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述DDX3X特異性T細(xì)胞是DDX3X特異性⑶4 陽性T細(xì)胞。
14. 抑制DDX3X表達(dá)或活性的化合物，所述化合物用于預(yù)防或治療癌、或用于遏制癌的 轉(zhuǎn)移或癌的復(fù)發(fā)。
【專利摘要】本發(fā)明提供用于確定癌惡性程度的新方法、用于癌診斷的新方法、用于確定預(yù)后的新方法、用于癌治療的新疫苗和用于遏制癌轉(zhuǎn)移的新疫苗。具體地，本發(fā)明提供一種癌惡性程度評估方法，所述方法包括測量癌組織中DDX3X表達(dá)水平的步驟、以及通過使用DDX3X表達(dá)水平來評估癌組織惡性程度的步驟。
【IPC分類】G01N33-574
【公開號】CN104769431
【申請?zhí)枴緾N201380057658
【發(fā)明人】各務(wù)博, 成田一衛(wèi), 后藤義博, 林隆史
【申請人】國立大學(xué)法人新潟大學(xué), 大塚制藥株式會社
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2013年9月3日
【公告號】CA2883577A1, EP2893352A2, WO2014038682A2, WO2014038682A3